Ứng Dụng Nấm Mốc Aspergillus Oryzae Enzyme Papain Thô Và Bromelin Thô Để Làm Nước Mắm Từ Cá Tra

Kết quả khảo sát khi bổ sung riêng lẻ từng loại chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae, papain thô, bromelin thô vào cá tra, nhận thấy lượng nitơ formol, nitơ amin sinh ra cao trong dịch thủ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE

ENZYME PAPAIN THÔ VÀ BROMELIN THÔ

ĐỂ LÀM NƯỚC MẮM TỪ CÁ TRA

LỚP:CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 06/2010

Trang 2

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

ii

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Trang 3

iii

LỜI CẢM TẠ

Chân thành biết ơn Ts Nguyễn Văn Thành đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, tạo điều kiện thuận lợi nhất, đóng góp những ý kiến quý báu, khích lệ tôi hoàn thành đề tài này

Chân thành cám ơn quý Thầy, Cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp kiến thức, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại Trường

Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ về cơ

sở vật chất, trang thiết bị, điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Xin cám ơn các bạn cùng khóa, các anh chị làm việc trong phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học thực phẩm, phòng thí nghiệm Protein & enzyme, phòng thí nghiệm Sinh hóa Thực phẩm đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, và thực hiện đề tài này

Xin cám ơn anh Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong trong quãng thời gian tôi làm việc trong phòng thí nghiệm và quá trình thực hiện luận văn

Chân thành biết ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình về tinh thần và vật chất

để tôi hoàn thành khóa học, cũng như đề tài luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn với tấm lòng trân trọng

Ngô Sĩ Tài Huy

Trang 4

i

TÓM LƯỢC

Nhằm khảo sát khả năng lên men nước mắm từ cá tra khi bổ sung chế phẩm enzyme protease, thực hiện thí nghiệm khảo sát khả năng thủy phân protein cá của chế phẩm enzyme protease và khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ủ (nhiệt độ, nồng độ muối) đến quá trình lên men nước mắm

Kết quả khảo sát khi bổ sung riêng lẻ từng loại chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae, papain thô, bromelin thô vào cá tra, nhận thấy lượng nitơ formol, nitơ amin sinh ra cao trong dịch thủy phân thu được theo thời gian và tỉ lệ enzyme protease/ nguyên liệu được bổ sung, tốc độ thủy phân protein cá diễn ra nhanh Trong đó, mẫu

bổ sung chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae với tỉ lệ 5%; mẫu bổ sung 0,45% papain thô; mẫu bổ sung 0,35% bromelin thô cho kết quả thủy phân protein cá tra tốt hơn khi

bổ sung các chế phẩm protease theo các tỉ lệ còn lại mà đề tài bố trí Khi tiến hành phối hợp chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae, papain thô, bromelain thô bổ sung vào nguyên liệu, tốc độ thủy phân protein cá tra diễn ra nhanh hơn khi bổ sung riêng lẻ từng loại chế phẩm protease Trong đó, tỉ lệ bổ sung 5% chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae kết hợp với 0,45% papain thô và 0,35% bromelin thô cho kết quả thủy phân protein cá tốt nhất

Qua khảo sát ảnh hưởng của điều kiện ủ (nhiệt độ, nồng độ muối) đến quá trình lên men nước mắm khi bổ sung 5% chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae kết hợp với 0,45% papain thô và 0,35% bromelin thô, thì khi bổ sung muối với tỉ lệ 25%, tiến hành

ủ ở 50 o C, tốc độ thủy phân protein cá tăng nhanh, thời gian lên men nước mắm được rút ngắn (thời gian ủ chỉ còn 24 ngày) nhưng sản phẩm vẫn có mùi đặc trưng của nước mắm truyền thống, chất lượng dinh dưỡng của nước mắm thu được đạt tiêu chuẩn nước mắm loại I theo TCVN 5107-1993 về chất lượng nước mắm của Việt Nam

Từ khóa: nước mắm, chế phẩm enzyme Aspergillus oryzae, papain, bromelin

Trang 5

ii

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG……… vii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Nước mắm 2

2.1.1 Các chất đạm 3

2.1.2 Các chất bay hơi 3

2.1.3 Các chất khác 3

2.2 Enzyme protease 4

2.2.1 Tính đặc hiệu của protease 5

2.2.2 Phân loại protease 5

2.2.3 Papain thô trong mủ đu đủ 6

2.2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae 7

2.2.5 Bromelin thô trong khóm 9

2.3 Sơ lược về cá tra……… 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

3.1 Phương tiện thí nghiệm 13

3.1.1 Dụng cụ thí nghiệm 13

Trang 6

iii

3.1.2 Nguyên vật liệu 13

3.1.3 Hóa chất 13

3.2 Phương pháp thí nghiệm 13

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải protein cá bằng nấm Aspergillus oryzae 13

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ papain thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất 14

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ bromelin thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất 14

3.2.4 Thí nghiệm 4: Phối hợp nấm Aspergillus oryzae và enzyme papain thô, enzyme bromelin thô bổ sung phân giải protein cá tốt nhất 15

3.2.5 Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa quy trình phân giải protein cá cho ra sản phẩm nước mắm 16

3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu cơ bản 17

3.4 Phương pháp xử lý nguyên liệu 17

3.5 Phương pháp phân tích số liệu 17

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải protein cá bằng nấm Aspergillus oryzae 18

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ papain thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất 21

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ bromelin thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất 25

4.4 Thí nghiệm 4: Phối hợp nấm Aspergillus oryzae và enzyme papain thô, enzyme bromelin thô bổ sung phân giải protein cá tốt nhất 28

4.5 Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa quy trình phân giải protein cá cho ra sản phẩm nước mắm 31

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

Trang 7

Bảng 17: Ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm A oryzae bổ sung đối với hàm lượng nitơ

formol sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 18: Ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol

sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 19: Ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol

sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 20: Ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm A oryzae bổ sung đối với hàm lượng nitơ

amin sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 21: Ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ amin sinh

ra theo thời gian thủy phân

Bảng 22: Ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ amin

sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 23: Hàm lượng nitơ tổng ở ngày ủ 27 trong những mẫu cho lượng formol cao

nhất của thí nghiệm I, II, III

Bảng 24: Ảnh hưởng của tỉ lệ nghiệm thức phối hợp chế phẩm protease bổ sung đối

với hàm lượng nitơ formol sinh ra theo thời gian thủy phân

với hàm lượng nitơ amin sinh ra theo thời gian thủy phân

với hàm lượng nitơ amoniac sinh ra theo thời gian thủy phân

với hàm lượng nitơ tổng sinh ra theo thời gian thủy phân

Bảng 28: Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với hàm lượng nitơ formol sinh ra theo

thời gian thủy phân ở nhiệt độ phòng

Trang 8

v

Bảng 29: Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với hàm lượng nitơ amin sinh ra theo

Bảng 30: Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với hàm lượng nitơ amoniac sinh ra

theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ phòng

Bảng 31: Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với hàm lượng nitơ tổng sinh ra theo

thời gian thủy phân ở nhiệt độ ngoài trời

theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ ngoài trời

thời gian thủy phân ở nhiệt độ 500C

theo thời gian thủy phân ở nhiệt độ 500C

Phụ lục 4: Kết quả thống kê

1 Thí nghiệm 1

Nitơ formol sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của chế phẩm enzyme A oryzae

So sánh formol ngày 18, 21, 24 mẫu bổ sung 5,0% chế phẩm enzyme A oryzae

Nitơ amin ngày 0, 9, 18, 27 dưới ảnh hưởng của chế phẩm enzyme A Oryzae

Trang 9

vi

Nitơ formol sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của papain thô

So sánh formol ngày 18, 21, 24 mẫu bổ sung 5,0%

Nitơ amin ngày 0, 9, 18, 27 dưới ảnh hưởng của papain thô

Nitơ formol sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của bromelin

So sánh formol ngày 18, 21, 24 mẫu bổ sung 5,0%

Nitơ amin ngày 0, 9, 18, 27 dưới ảnh hưởng của bromelin thô

Nitơ formol sinh ra dưới ảnh hưởng của phối hợp chế phẩm A oryzae, papain thô,

bromelin thô thời gian ủ

Nitơ amin sinh ra dưới ảnh hưởng của phối hợp chế phẩm A oryzae, papain thô,

Nitơ tổng sinh ra dưới ảnh hưởng của phối hợp chế phẩm A oryzae, papain thô,

Nitơ amin sinh ra dưới ảnh hưởng của nồng độ muối ở nhiệt độ phòng

Nitơ amin sinh ra dưới ảnh hưởng của nồng độ muối ở nhiệt độ ngoài trời

Nitơ amin sinh ra dưới ảnh hưởng của nồng độ muối ở 500C

Thống kê phương sai 2 nhân tố nhiệt độ , nồng độ muối ảnh hưởng đến hàm lượng nitơ amin sinh ra trong quá trình lên men nước mắm cá tra

Nitơ amin theo ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ muối

Nitơ amoniac theo ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ muối

Phụ lục 5: TCVN 5107-1993 về chất lượng nước mắm của Việt Nam

1 Tiêu chuẩn hóa học

2 Tiêu chuẩn vi sinh vật

Trang 10

vii

DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của các protease lên các cơ chất khác nhau 5

Bảng 2: Phạm vi pH của một số loại enzyme protease có trong chế phẩm enzyme A oryzae 9

Bảng 3: Thành phần dinh dưỡng của cá Tra 11

Bảng 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ sung đối với hàm lượng

nitơ formol sinh ra theo thời gian thủy phân (ngày) 18

Bảng 5: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra theo thời gian (ngày) dưới ảnh hưởng của

việc bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu 20

Bảng 6: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra dưới ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung chế phẩm

enzyme A oryzae vào nguyên liệu theo thời gian ủ (ngày) 20

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol sinh ra

theo thời gian thủy phân (ngày) 22

Bảng 8: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của việc bổ

sung papain thô vào nguyên liệu 24

Bảng 9: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra dưới ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung papain thô

vào nguyên liệu theo thời gian ủ (ngày) 24

Bảng 10: Ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol

sinh ra theo thời gian thủy phân (ngày) 25

Bảng 11: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của việc bổ

sung bromelin thô vào nguyên liệu 27

Bảng 12: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra dưới ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung bromelin

thô vào nguyên liệu theo thời gian ủ (ngày) 27

Bảng 13:Ảnh hưởng của các dạng phối hợp chế phẩm enzyme A oryzae, papain thô,

bromelin thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ amin sinh ra theo thời gian thủy phân

(ngày) 29

Bảng 14: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ muối bổ sung đến hàm lượng nitơ amin

(g/l) sinh ra theo theo thời gian ủ (ngày) 31

Trang 11

viii

Bảng 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ muối bổ sung đến hàm lượng nitơ

amoniac (g/l) sinh ra theo theo thời gian ủ (ngày) 32

Bảng 16: Hàm lượng dinh dưỡng trong nước mắm cá tra có bổ sung 5% chế phẩm

enzyme A oryzae kết hợp với 0,45% papain thô và 0,35% bromelin thô, 25% muối ủ ở

50oC so sánh với tiêu chuẩn chất lượng nước mắm TCVN 5107-1993 34

Trang 12

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Quy trình công nghệ chế biến sản phẩm nước mắm cổ truyền 2

Hình 2: Cấu trúc enzyme papain 6

Hình 3: Aspergillus oryzae 7

Hình 4: Cá tra 11

Hình 5: Đồ thị sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL (1999-2006) 12

Hình 6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày) 19

Hình 7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày) 23

Hình 8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày) 26

Hình 9: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của phối hợp chế phẩm enzyme A oryzae và enzyme papain thô, enzyme bromelin thô bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày) 28

Hình 10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của phối hợp enzyme protease bổ sung vào nguyên liệu đến hàm lượng nitơ amin (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày) 30

Trang 13

x

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

A oryzae: Aspergillus oryzae

EDTA: Ethylene diamine tetra-acetic acid

Viện NC và PT CNSH: Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học

TCVN 5107-1993: Tiêu chuẩn Việt Nam 5107-1993

BAEE: -N-benzoyl-L-arginineethyl ester

BAA: -N-benzoyl-L-argininamide

Trang 14

Hiện nay, nghề nuôi cá tra đang rất được phát triển, đặc biệt là ở vùng Đồng Bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Năm 2004, tổng sản lượng cá tra của các tỉnh ĐBSCL

là 264,4 nghìn tấn, thì năm 2006 là 825 nghìn tấn, sản lượng cá tra toàn vùng năm

2008 khoảng 1,2 triệu tấn Sản lượng cá tra thu hoạch năm 2009 ước tính đạt 1,006 triệu tấn (Nguồn: http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=9458 , ngày 03/02/2010). Đây là nguồn nguyên liệu có thể dùng để sản xuất nước mắm với sản lượng lớn

Nhận thấy, cá tra sẽ là nguồn nguyên liệu tại chỗ có thể dùng để sản xuất nước

mắm với sản lượng lớn Từ đó, đề tài “Ứng dụng nấm mốc Aspergillus oryzae, enzyme

papain thô và bromelin thô để làm nước mắm từ cá tra” được thực hiện

Trang 15

Ngoài ra, nước mắm còn dùng để chữa một số bệnh như đau dạ dày, cơ thể suy nhược, cung cấp năng lượng Nước mắm được sản xuất ở hầu hết các nước Châu Á Mỗi nước có kiểu sản xuất khác nhau tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Hình 1: Quy trình công nghệ chế biến sản phẩm nước mắm cổ truyền

(Nguồn: Phan Thị Thanh Quế, 2005.)

Trang 16

- Đạm amoniac: càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng

Ngoài ra, trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin Đặc biệt là các acid amin không thay thế: valine, leucine, methionine, isoleucine, phenylalanine, alanine.v.v Các thành phần khác có kích thước phân tử lớn như: tripeptide, peptol, dipeptide Chính những thành phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng

do hoạt động của vi sinh vật có hại

Thành phần dinh dưỡng của nước mắm còn phụ thuộc vào loại nguyên liệu đem

đi chế biến

2.1.2 Các chất bay hơi

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) thành phần các chất bay hơi trong nước mắm rất phức tạp, và quyết định hương vị của nước mắm Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm (mg/100g):

- Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde)

- Các acid bay hơi: 404-533 (propionic)

- Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin)

- Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde)

khí trong quá trình sản xuất nước mắm tạo ra

2.1.3 Các chất khác

Theo Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng (1990) trong nước mắm có :

Trang 17

do hoặc các peptide phân tử thấp Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus Những enzyme này có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua 2 bước chính: a) Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine

b) Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme

Các ứng dụng của enzyme protease:

- Chất tẩy rửa: protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất

cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng

- Công nghiệp thuộc da: protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại

bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả…

- Công nghiệp thực phẩm: việc sử dụng trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng

có tính truyền thống Nhân dân ta từ rất lâu đã dùng thơm để nấu canh thịt bò; dùng rau sống là chuối chát, vả kết hợp thức ăn nhiều thịt; đu đủ trong chống táo bón…mà thực chất là sử dụng papain, bromelin, fixin Người Nga còn dùng protease từ hạt đậu tương nẫy mầm để làm mềm thịt

Trang 18

5

2.2.1 Tính đặc hiệu của protease

Bảng 2: Ảnh hưởng của các protease lên các cơ chất khác nhau

Hemoglobin Gelatin Casein Protein đậu

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.2 Phân loại protease

Hầu hết, các enzyme thủy phân protein được phân loại dựa vào đặc tính hóa học trong tâm hoạt động Protease được chia thành 4 nhóm:

- Serin protease: serine hay alkaline protease cần có nhóm –OH (hydroxyl) trong tâm hoạt động Nhóm protease này hoạt động ở pH kiềm, thường khoảng 7,5 – 10,5 Trypsin là enzyme đại diện cho nhóm này

- Cystein protease: có nhóm chức năng sulfuryl –SH trong tâm hoạt động Các thiol protease thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng Đại diện cho nhóm này là papain, bromelin

- Metallo protease: cần có sự hiện diện của ion kim loại trong tâm hoạt động Nhóm này có xu hướng hoạt động mạnh ở pH khoảng 7.0 nên được gọi là protease trung tính

- Asparatic protease: thông thường cần nhóm chức năng carboxylic acid trong tâm hoạt động Các Asparatic protease thường hoạt động ở pH acid Một điển hình cho nhóm này là pepsin (EC 3.4.23.4) được trích từ hệ thống tiêu hóa của bê non và dê

Protease từ vi sinh vật thuộc nhóm này được lấy từ Asperillus niger Enzyme hoạt

động ở pH tối ưu từ 2,5 – 3,5

Trang 19

6

(Nguồn: http://svdanang.com/@pbkok/showthread.php?t=17432 , ngày 23/06/2010)

2.2.3 Papain thô trong mủ đu đủ

Hình 2: Cấu trúc enzyme papain

(Nguồn: httpwpcontent.answers.comwikipediacommonsthumb006Papain_cartoon.png240px-apain_ cartoon.png, ngày 16/06/2009)

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) mủ đu đủ xanh là hỗn hợp các enzyme cystein protease bao gồm: papain, chymopapain A, chymopapain B, proteinase III, proteinase

IV, thiolprotease Trong đó, papain là protease có hàm lượng cao nhất tới 95% tổng hàm lượng protease có trong mủ và là enzyme có ý nghĩa quan trọng nhất

Papain là một sulfhydryl hay cystein protease được trích từ mủ cây đu đủ Cấu trúc lập thể bình thường của papain không hoạt động cho tới khi nó được hoạt hóa bởi một lượng nhỏ các tác nhân khử như cysteine hoặc cyanide Papain có trọng lượng phân tử: 23,000 dalton Papain là một chuỗi peptide mạch đơn chứa 211 đơn vị acid amine cuộn lại thành hai phần tạo thành một khe hở Nhóm -SH tự do trong phân tử là nhóm chức năng của papain

pH tối ưu: từ 6,0 – 7,0 Điểm đẳng điện: pI= 9,6

Nhiệt độ: papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (>100oC) thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch

Trang 20

7

Các nhân tố hoạt hóa: papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác Chất hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay papain nói riêng Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25

và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain là chất có tính khử như: cysteine, glutation acid, hydrocyanic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate… trong đó cysteine là chất thông dụng nhất Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Sự hoạt hóa càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại như EDTA N-bromosuccinimide làm tăng cường hoạt động của papain

Các chất ức chế: các chất có khả năng tương tác với nhóm sulfhydryl như: các kim loại nặng, các chất carbonyl sẽ gây ức chế hoạt động của papain Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng cách phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, ozon, hydroperoxide, iodur acetate, iodoacetamide Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazine, hydroxylamine,… cũng

ức chế papain

2.2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae

Nấm mốc A oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales lớp

Ascomycetes (nang khuẩn) Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 – 7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều bào tế bào (nấm đa bào)

Hình 3: Aspergillus oryzae

Trang 21

8

Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính

bào tử, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính Cuống đính bào tử của A oryzae thường dài

từ 1,0 – 2,0 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi

là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính

vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào tử của A oryzae có màu vàng lục, chính là

màu ta thường thấy ở mốc tương

Trong sản xuất tương, ta cần nuôi cấy nấm mốc A oryzae để thu được nhiều bào

tử làm mốc giống, hoặc để thu nhiều men thủy phân Các điều kiện nuôi cấy A oryzae

có thể tóm tắt như sau:

- Độ ẩm của môi trường: độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành

enzyme của nấm mốc là 55- 58% Độ ẩm môi trường thích hợp sự hình thành bào tử là khoảng 45% Cần giữ cho độ ẩm môi trưởng không bị giảm trong quá trình nấm phát triển

hợp cho nấm mốc Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi khô

- Ảnh hưởng của không khí: A oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát

triển bình thường khi đầy đủ oxy Để đáp ứng điều kiện nuôi này môi trường nuôi phải

xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5 – 3cm, phòng nuôi phải thoáng A oryzae phát

triển bình thường khi nồng độ CO2 trong khí quyển lên tới 8%

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành

thể bị nóng lên 40oC hoặc hơn Cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới

27oC và không cao quá 36oC

- Thời gian nuôi nấm mốc: hầu hết các chủng A oryzae có hoạt động cực đại

của amylase ở khoảng giờ thứ 30 – 36, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36 – 42 Một số chủng cho hai cực đại của enzyme, ví dụ cực đại amylase ở giờ thứ 36 và giờ 60 Thời gian nuôi mốc giống thường hết 60 – 70 giờ

Trang 22

9

- pH: thích hợp cho A oryzae là môi trường acid yếu 5,5 – 6,5 Các môi trường tự

nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc mất hẳn Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong một vài thế hệ

Bảng 2: Phạm vi pH của một số loại enzyme protease có trong chế phẩm

(Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 1983.)

2.2.5 Bromelin thô trong khóm

Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH 6-8

Hiện tại, người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có 8 thành phần cơ bản

có hoạt tính thủy phân protein Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5 Phân đoạn

có tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số Người ta ước tính rằng, khoảng 50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 không có glycosylate pH tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4,0-4,5 và của F9 thì gần với trung tính Dịch chiết bromelin toàn phần có hoạt tính trong khoảng pH 4,5-9,8

Trang 23

10

Bromelin được chiết tách từ các thành phần khác nhau trên cây dứa và bromelin

từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động sinh lý khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì giống nhau Bromelin không ổn định với nhiệt độ Do đó, các hoạt động sinh lý của nó sẽ giẩm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản không thích hợp

Cấu trúc không gian của bromelin:

Cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

-Gly – Cys – Lys -

Bromelin là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfide Ngoài ra, trong phân tử còn có chứa các ion Zn2+ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme Tâm hoạt động của bromelin có chứa nhóm –SH nên dễ dàng bị ức chế Trong phân tử bromelin than có chứa nhóm –SH nên dễ bị ức chế bởi chất oxy hóa như H2O2, methyl bromide, ion kim loại…và được hoạt hóa bởi chất khử như cystein, sulfide, cyanide…

- Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau thì bromelin có hoạt

tính khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì bromelin mạnh gấp 4 lần papain, với casein tương đương, với cơ chất như BAA, BAEE thì thấp hơn

- Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng của

nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

xúc tác của enzyme pH tối thích của bromelin không ổn định mà tùy thuộc nhiệt độ,

Trang 24

11

thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt

- Ảnh hưởng bởi ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của

enzyme do chúng thường gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin, do chúng kết hợp với nhóm –SH của trung tâm phản ứng của enzyme

2.3 Sơ lược về cá tra

Bảng 3: Thành phần dinh dưỡng của cá tra

Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được

Calo Calo từ chất

béo

Tổng lượng chất béo

Chất béo hòa tan

Cholesterol Natri Protein

124,52 cal 30,84 cal 3,42 g 1,64 g 25,2mg 70,6 mg 23,42 g

(Nguồn: http://www.truonghai.com.vn/?cid=3,3&chon=2 , ngày 02/03/2010)

Hình 4: Cá tra

(Nguồn: http://biendongseafood.com.vn/Product/29/0/Pangasius-Whole.aspx , ngày 05/11/2009)

Cá tra (tên tiếng Anh: shutchi catfish) trước đây được nuôi nhiều trong ao, ở đồng bằng Nam bộ Việt Nam, thuộc bộ cá nheo (siluriformes), họ cá tra (pangasidae),

loài pangasius Cá tra (pangasius hypophthalmus) là cá da trơn (không vẩy) Cá tra

sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10%) và nước phèn

Trang 25

12

(pH> 4) Cá tra có cơ quan hô hấp phụ, có thể hô hấp bằng bóng khí và da, nên chịu đựng được môi trường nước thiếu oxy hòa tan Ngoài ra, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn như mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp

(Nguồn: http://tienphatjsc.vn/daychuyen_sanxuat_mocatra.html , ngày 07/06/2010).

Hình 5: Đồ thị sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL (1999-2006)

(Nguồn: http://www.vnast.gov.vn/UploadFile/11.BC%20chung-%20Vien%20Thuy%20San%20II.pdf,

ngày 22/03/2010)

Diện tích nuôi thả cá tra năm nay ước tính đạt 9 nghìn ha, trong đó nuôi cá tra công nghiệp 6,6 nghìn ha (diện tích nuôi thả cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp là 1791 ha; Cần Thơ là 999 ha; Tiền Giang là 123 ha; An Giang là 1108 ha) Năm 2004, tổng sản lượng cá tra, ba sa của các tỉnh ĐBSCL là 264.436 tấn, thì năm 2006 là 825.000 tấn, sản lượng cá tra toàn vùng năm 2008 khoảng 1,2 triệu tấn Sản lượng cá tra thu hoạch năm 2009 ước tính đạt 1006,3 nghìn tấn Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào có thể dùng để sản xuất nước mắm Ngoài ra, các nhà máy chế biến cá tra mỗi năm thải

ra khoảng 600.000 tấn phụ phẩm Đây cũng được xem là một nguồn nguyên liệu dồi dào với giá thành rẻ, có thể được dùng trong lên men nước mắm Việc sử dụng phụ phẩm còn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do lượng phụ phẩm này bị thải ra ngoài môi trường, tăng thêm thu nhập cho nhà doanh nghiệp khi tận dụng nguồn nguyên liệu tại chỗ (Nguồn: http://www.gso.gov.vn/default.aspx?tabid=621&ItemID=9458 , 03/02/2010)

Trang 26

13

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Dụng cụ thí nghiệm

• Nhiệt kế, pH kế, tủ ủ, tủ cấy, lò vi sóng, tủ lạnh, micro pipet (1 ml, 5ml)

3.1.2 Nguyên vật liệu

• Nguồn nấm A.oryzae (dạng chế phẩm enzyme A oryzae), enzyme papain thô,

enzyme bromelin thô từ Viện NC và PT CNSH, trường Đại Học Cần Thơ

cá; chỉ lấy phần thịt cá, nội tạng và phần mang Đem thịt cá, nội tạng và phần mang đi xay nhỏ, trộn đều lại với nhau

vào nguyên liệu cá tra cho kết quả thủy phân protein cá tra tốt nhất

- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên Một nhân tố (tỉ lệ nấm mốc/nguyên liệu)

- Sơ đồ thí nghiệm:

Tỉ lệ nấm mốc bổ sung vào nguyên liệu (%)

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Tổng số nghiệm thức: 5 Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 3 = 15

Trang 27

14

- Thuyết minh sơ đồ thí nghiệm:

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu được lên men trong các keo thủy tinh Ở mỗi keo, cho vào 50g cá đã được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước Cho nguyên liệu,

nấm A oryzae (dạng chế phẩm enzyme A oryzae) trộn chung vào cùng lúc Bổ sung

5% muối sau 9 ngày ủ Ủ các keo ở nhiệt độ 500C Tiến hành lấy mẫu vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 và 27 ngày ủ, bảo quản mẫu ở 4oC, tiến hành phân tích các chỉ tiêu

- Các tiêu chí phân tích: nitơ formol, nitơ tổng, nitơ amoniac

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ papain thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất

- Mục đích: chọn tỉ lệ papain thô bổ sung vào nguyên liệu cá tra cho kết quả thủy phân protein cá tốt nhất

- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên Một nhân tố (tỉ lệ papain thô/nguyên liệu)

Tỉ lệ enzyme papain thô bổ sung vào nguyên liệu (%)

- Tổng số nghiệm thức: 7 Tổng số đơn vị thí nghiệm: 7 x 3 = 21

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu được lên men trong các keo thủy tinh Ở mỗi keo, ta cho vào 50g cá đã được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước Cho nguyên liệu, papain thô trộn chung vào cùng lúc Bổ sung 5% muối sau 9 ngày ủ Ủ các keo ở

500C Tiến hành lấy mẫu vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 và 27 ngày ủ, bảo quản mẫu

ở 4oC, tiến hành phân tích các chỉ tiêu

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ bromelin thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất

- Mục đích: chọn tỉ lệ bromelin thô bổ sung vào nguyên liệu cá tra cho kết quả thủy phân protein cá tốt nhất

Trang 28

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu được lên men trong các keo thủy tinh Ở mỗi keo, ta cho vào 50g cá đã được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước Ta cho nguyên liệu, bromelin thô trộn chung vào cùng lúc Bổ sung 5% muối sau 9 ngày ủ Ủ các keo

ở nhiệt độ 500C Tiến hành lấy mẫu vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 và 27 ngày ủ, bảo quản mẫu ở 4oC, tiến hành phân tích các chỉ tiêu

3.2.4 Thí nghiệm 4: Phối hợp nấm Aspergillus oryzae và enzyme papain thô,

enzyme bromelin thô bổ sung phân giải protein cá tốt nhất

- Mục đích: chọn nghiệm thức phối hợp nấm A oryzae (dạng chế phẩm enzyme

A oryzae), papain thô, bromelin thô bổ sung vào nguyên liệu cá tra cho kết quả thủy

phân protein cá tốt nhất

- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố (nồng độ enzyme

protease) Với 4 kiểu phối hợp enzyme protease có trong nấm A oryzae (dạng koji),

papain thô, bromelin thô Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

a) Papain thô kết hợp với bromelin thô

c) Nấm A oryzae kết hợp với bromelin thô

d) Nấm A oryzae kết hợp với papain thô và bromelin thô

Trang 29

16

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu được lên men trong các keo thủy tinh Ở mỗi keo, ta cho vào 50g cá đã được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước Ta cho nguyên

liệu, nấm A oryzae (dạng chế phẩm enzyme A oryzae), enzyme papain thô, enzyme

500C Tiến hành lấy mẫu vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21 và 24 ngày ủ, bảo quản mẫu ở

4oC, tiến hành phân tích các chỉ tiêu

3.2.5 Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa quy trình phân giải protein cá cho ra sản phẩm nước mắm

- Mục đích: tối ưu hóa quy trình lên men nước mắm

- Bố trí thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên, 2 nhân tố (nhiệt độ ủ và nồng độ muối) Mỗi nhân tố có 3 mức độ: nhiệt độ (nhiệt độ phòng; nhiệt độ ngoài trời; 500C)

và nồng độ muối (20%; 25%; 30% NaCl) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

- Tổng số nghiệm thức: 3 x 3 = 9; tổng số đơn vị thí nghiệm: 3 x3 x3= 27

+ Nhiệt độ ủ:

Nhiệt độ ủ ( 0 C) Nhiệt độ phòng Nhiệt độ ngoài trời 50 0 C

+ Tỉ lệ bổ sung muối:

Tỉ lệ muối (%)

Trong thí nghiệm này, nguyên liệu được lên men trong các keo thủy tinh Ở mỗi keo, ta cho vào 50g cá đã được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước Bổ sung dạng phối hợp chế phẩm enzyme protease được chọn ở thí nghiệm 4 vào mỗi keo Bổ sung 5% muối sau 24 giờ ủ, cho tiếp lượng muối còn lại sau 9 ngày ủ để đạt tỉ lệ muối theo

Trang 30

17

các nghiệm thức bố trí Ủ các keo ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ ngoài trời, 500C Tiến hành lấy mẫu vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21và 24 ngày ủ, bảo quản mẫu ở 40C, tiến hành phân tích các chỉ tiêu

3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu cơ bản

Hoạt tính bromelin thô Phương pháp KUNITZ

3.4 Phương pháp xử lý nguyên liệu

Cá tra đem về được rửa sạch, dùng dao cắt bỏ phần mở bụng (có thể dung phần

mở bụng này sản xuất nhiên liệu sinh học), cắt lấy phần: thịt cá, nội tạng, mang cá Sau đó, đem thịt cá, nội tạng, mang cá đem xay nhỏ ra, rồi trộn đều chúng lại với nhau, rồi đem tiến hành thí nghiệm

3.5 Phương pháp phân tích số liệu

Kết quả sau quá trình thí nghiệm được phân tích bằng Excel (vẽ đồ thị, phân tích Anova 2 nhân tố) và phần mềm phân tích Statgraphics 15 (phân tích Anova 1 nhân tố, Multiple Range Tests)

Trang 31

18

Hoạt tính enzyme protease trong các chế phẩm protease được sử dụng trong các thí nghiệm của đề tài:

Papain: 9,514 (U/ml) Bromelin: 8,536 (U/ml)

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải protein cá bằng nấm Aspergillus

oryzae

Trong thí nghiệm này, lên men trong các keo chao 50g cá đã được tách bỏ phần

mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước được trộn chung với nấm A oryzae (dạng chế phẩm enzyme

A oryzae) theo các tỉ lệ (3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%; 5,0%) cùng lúc Bổ sung 5% muối

sau 9 ngày ủ Ủ các keo ở nhiệt độ 50oC Sau khi lấy mẫu và phân tích vào 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21; 24 và 27 ngày sau ủ Kết quả được thống kê qua các bảng số liệu sau

Bảng 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ sung đối với

hàm lượng nitơ formol sinh ra theo thời gian thủy phân (ngày)

_ Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c , trong cùng một cột thì không khác biệt có

ý nghĩa thống kê ở mức 5%

Kết quả thu được cho thấy, thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hàm lượng nitơ

formol sinh ra, khi bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu theo các tỉ lệ

Trang 32

19

như thí nghiệm bố trí Lượng nitơ formol sinh ra trong quá trình thủy phân tăng dần theo thời gian thủy phân (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 0: 2,09 g/l đến ngày 24: 8,10 g/l), thời gian đầu tăng nhanh (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 0: 2,09 g/l đến ngày 9: 7,96 g/l), nhưng về sau thì tăng chậm (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 9: 7,96 g/l đến ngày 24: 8,10 g/l) Lượng nitơ formol sinh ra càng cao đồng nghĩa với lượng protein trong nguyên liệu bị phân cắt bởi enzyme protease cũng cao Đến ngày ủ thứ 24, hàm lượng nitơ formol trong các mẫu đã có dấu hiệu giảm nhưng vẫn còn giữ ở mức cao (trung bình: 8,10 g/l).Đồng thời, trong 9 ngày đầu của quá trình thủy phân, hàm lượng nitơ formol tăng nhanh, tăng chậm lại từ ngày 9-

phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại

Lượng nitơ formol sinh ra cao là nhờ sự phân cắt protein của enzyme protease

trong chế phẩm enzyme A oryzae Chứng tỏ hoạt tính phân giải protein trong cá tra của chế phẩm enzyme A oryzae là khá tốt Và khoảng thời gian thủy phân từ 18 ngày

đến 24 ngày cho lượng nitơ formol sinh ra khác biệt nhau không có ý nghĩa (ở độ tin

cậy 95%) Nên khi sử dụng chế phẩm enzyme A oryzae để thủy phân protein thì thời

gian thích hợp là 18 ngày nhằm tiết kiệm thời gian và công sức

Phân tích hàm lượng nitơ formol sinh ra khi bổ sung các tỉ lệ nấm mốc khác nhau vào nguyên liệu được kết quả sau

Hình 6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ

sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày)

Trang 33

20

Hình 6 cho thấy, khi bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu với tỉ

lệ 5% trong quá trình ủ cho kết quả hàm lượng nitơ formol sinh ra cao nhất ở ngày ủ

21 (9,25 g/l), khác biệt có ý nghĩa so với việc bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae vào

nguyên liệu theo các tỉ lệ còn lại trong thí nghiệm này (3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%) Kết luận: ủ ở 50oC, tỉ lệ muối 5%, chế phẩm enzyme A oryzae được bổ sung vào

nguyên liệu theo các tỉ lệ được thực hiện trong thí nghiệm, hàm lượng nitơ formol sinh

ra ở mẫu bổ sung 5% chế phẩm enzyme A oryzae cao hơn các tỉ lệ còn lại trong thí

ngày cho hiệu suất thủy phân protein tốt hơn cả

Tiến hành phân tích nitơ amin trong các mẫu bổ sung chế phẩm enzyme A

oryzae theo các tỉ lệ (3,0%; 3,5%; 4,0%; 4,5%; 5,0%) vào nguyên liệu, thu được các

kết quả được thống kê qua bảng 5 như sau

Bảng 5: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra theo thời gian (ngày) dưới ảnh

hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu

Thời gian ủ (ngày)

Tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ sung vào nguyên liệu (%)

Trang 34

21

Bảng 6: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra dưới ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung

chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu theo thời gian ủ (ngày)

Thời gian ủ (ngày)

Tỉ lệ chế phẩm enzyme A oryzae bổ sung vào nguyên liệu (%)

_ Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đi kèm a, b, c , trong cùng một hàng thì không khác biệt

có ý nghĩa thống kê ở mức 5%

Hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng nhanh (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 0: 1,84 g/l đến ngày 9: 4,21 g/l), tăng chậm lại vào những ngày sau (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 9: 4,21 đến ngày 27: 4,65 g/l) Khoảng thời gian thủy phân từ 9 ngày đến 27 ngày cho lượng nitơ amin sinh ra khác biệt nhau không có ý

nghĩa (ở độ tin cậy 95%) Trong đó, mẫu bổ sung 5% chế phẩm enzyme A oryzae có

hàm lượng nitơ amin sinh ra cao nhất và có ý nghĩa so với bổ sung chế phẩm enzyme

A oryzae vào nguyên liệu theo các tỉ lệ còn lại trong thí nghiệm này Lượng nitơ tổng

trung bình đo được ở mẫu bổ sung 5% chế phẩm enzyme A oryzae vào ngày ủ 27 là

20,01 g/l

Kết luận: khi bổ sung 5% chế phẩm enzyme A oryzae vào cá tra thì sau 27 ngày

ủ, sản phẩm dịch thủy phân thu được cho kết quả lượng nitơ formol, nitơ amin cao hơn

những mẫu bổ sung chế phẩm enzyme A oryzae theo các tỉ lệ còn lại trong thí nghiệm này Tiến hành sử dụng tỉ lệ bổ sung 5% chế phẩm enzyme A oryzae vào nguyên liệu

trong các thí nghiệm sau

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ papain thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất

Trong thí nghiệm này, lên men trong keo chao 50g cá được tách bỏ phần mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước được trộn chung với papain thô theo các tỉ lệ (0,2%; 0,25%; 0,3%;

Trang 35

22

nhiệt độ 50oC Sau khi lấy mẫu và phân tích vào ngày 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, và

27 sau ủ Kết quả ghi nhận qua thời gian ủ được thống kê theo các bảng số liệu sau

Bảng 7: Ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol sinh ra theo thời gian thủy phân (ngày)

Từ các kết quả nitơ formol thu được qua các ngày thủy phân cho thấy, thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến lượng đạm formol sinh ra khi bổ sung papain thô vào nguyên liệu cá tra theo các tỉ lệ mà thí nghiệm bố trí Hàm lượng nitơ formol sinh ra tăng dần theo thời gian thủy phân (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 0: 2,12 g/l đến ngày 21: 8,66 g/l), thời gian đầu tăng nhanh (trung bình lượng nitơ formol sinh

ra ngày 0: 2,12 g/l đến ngày 9: 8,06 g/l) nhưng về sau thì tăng chậm hơn (trung bình lượng nitơ formol sinh ra ngày 9: 8,06 g/l đến ngày 21: 8,66 g/l), điều này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Xuân Dung (2005) tốc độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại Lượng nitơ formol sinh ra càng cao đồng nghĩa với lượng protein trong cá tra bị phân cắt bởi enzyme papain thô

Trang 36

Hình 7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ papain thô bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày)

Từ hình 9 cho thấy, lượng nitơ formol tăng theo thời gian và đạt cao nhất ở ngày

ủ 21: 8,66 g/l, sau đó lượng nitơ formol có hiện tượng giảm Trong đó, mẫu bổ sung 0,45% papain thô vào nguyên liệu, trong quá trình ủ cho lượng nitơ formol sinh ra cao nhất (ở ngày ủ thứ 21 lượng nitơ formol đo được: 10,11 g/l), khác biệt có ý nghĩa so với việc bổ sung papain thô vào nguyên liệu theo các tỉ lệ còn lại được tiến hành trong thí nghiệm này (0,2%; 0,25%; 0,3%; 0,35%; 0,4%; 0,5%), kết quả thống kê lượng nitơ formol sinh ra khác biệt không ý nghĩa (ở độ tin cậy 95%) từ ngày ủ 15 đến ngày ủ 27 Khi tiến hành đo hàm lượng nitơ amin trong các mẫu bổ sung papain thô vào nguyên liệu, thu được các kết quả được thống kê qua bảng 7 như sau

Trang 37

Hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng nhanh trong khoảng từ ngày 0: 1,85 g/l đến ngày 9: 4,87 g/l, tăng chậm lại vào những ngày ủ sau (ngày 9: 4,87 g/l đến ngày 27: 5,73 g/l) Trong số các mẫu, mẫu bổ sung 0,45% papain thô cho lượng nitơ amin sinh

ra đo được cao nhất và có ý nghĩa so với bổ sung papain thô vào nguyên liệu theo các

tỉ lệ bổ sung vào nguyên liệu còn lại trong thí nghiệm này Lượng nitơ tổng trung bình

đo được ở mẫu bổ sung 0,45% papain thô vào ngày ủ 27 là 17,65 g/l

Trang 38

25

Kết luận: khi bổ sung 0,45% papain thô vào cá tra thì sau 27 ngày ủ, dịch thủy phân thu được cho kết quả lượng nitơ formol, nitơ amin cao hơn những mẫu bổ sung papain thô theo các tỉ lệ còn lại trong thí nghiệm này Nên tiến hành sử dụng tỉ lệ bổ sung 0,45% papain thô vào nguyên liệu cá tra trong các thí nghiệm sau

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ bromelin thô bổ sung cho phân giải protein cá tốt nhất

Trong thí nghiệm này, lên men trong các keo chao 50g cá đã được tách bỏ phần

mỡ, xay nhỏ, 25 ml nước được trộn chung với bromelin thô theo các tỉ lệ (0,2%; 0,25%; 0,3%; 0,35%; 0,4%; 0,45%; 0,5%) cùng lúc Bổ sung 5% muối sau 9 ngày ủ

Ủ các keo ở nhiệt độ 50oC Sau khi lấy mẫu và phân tích vào ngày 0, 3, 6, 9, 12, 15,

18, 21, 24, và 27 sau ủ Kết quả được thống kê qua các bảng số liệu sau

Bảng 10: Ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đối với hàm lượng nitơ formol sinh ra theo thời gian thủy phân (ngày)

Trang 39

Lượng nitơ formol sinh ra cao chứng tỏ hoạt tính phân giải protein trong cá tra của bromelin thô là khá tốt Khoảng thời gian thủy phân từ ngày 18 đến ngày 24, lượng nitơ formol sinh ra khác biệt nhau không có ý nghĩa (độ tin cậy 95%)

Hình 8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỉ lệ bromelin thô bổ sung đến hàm lượng nitơ formol (g/l) trong quá trình thủy phân theo thời gian ủ (ngày)

Từ hình 9 cho thấy, lượng nitơ formol tăng theo thời gian và đạt cao nhất ở ngày 21 sau ủ, sau đó lượng nitơ formol có dấu hiệu giảm Trong đó các tỉ lệ bromelin thô bổ sung vào nguyên liệu, mẫu bổ sung 0,3% bromelin thô, trong quá trình ủ cho lượng nitơ formol sinh ra cao nhất (ở ngày ủ thứ 21 lượng nitơ formol đo được trung

Trang 40

27

bình là 8,92 g/l), và khác biệt có ý nghĩa so với việc bổ sung bromelin thô vào nguyên liệu theo các tỉ lệ khác được tiến hành trong thí nghiệm này (0,2%; 0,25%; 0,4%; 0,45%; 0,5%)

Khi tiến hành khảo sát hàm lượng nitơ amin trong các mẫu bổ sung bromelin thô, các kết quả được thống kê qua bảng 10 như sau

Bảng 11: Hàm lượng nitơ amin (g/l) sinh ra theo thời gian dưới ảnh hưởng của việc bổ sung bromelin thô vào nguyên liệu

Hàm lượng nitơ amin sinh ra tăng nhanh trong khoảng từ ngày 0 đến ngày 9, tăng chậm lại vào những ngày ủ sau Trong số các mẫu, mẫu bổ sung 0,35% bromelin thô cho lượng nitơ amin sinh ra đo được cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

Định dạng
Số trang	97
Dung lượng	1,96 MB