Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm vân chi trametes versicolor

SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật 2 Nguyễn Thị Bích Hằng TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trame

Trang 1

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYM LACCASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI

CẤY NẤM VÂN CHI TRAMETES VERSICOLOR

Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến

MSSV: 107150153 Lớp: 15H2B

Đà Nẵng – Năm 2019

Trang 2

SVTH: Đoàn Thị Luyến GVHD: Đặng Minh Nhật 2

Nguyễn Thị Bích Hằng

TÓM TẮT

Tên đề tài: Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh

trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor

Sinh viên thực hiện: Đoàn Thị Luyến

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Laccase là một enzym oxi hóa khử đa đồng có thể oxy hóa được nhiều loại cơ chất bao gồm phenol, keton, phosphat, ascorbat, amin và lignin Nghiên c ứu được tiến hành nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng (thành phần môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy) đến hoạt độ enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Giống nấm Vân Chi được tiến hành nuôi cấy trên 5 công thức môi trường khác nhau và kết quả cho thấy môi trường tốt nhất là môi trường bao gồm: dịch khoai tây, glucose, KH2PO4, MgSO4, NH4+, Cu2+ và ABTS Thời gian nuôi cấy được khảo sát tử 7 – 11 ngày với môi trường trên đạt hoạt độ cao nhất là 2,858 U/ml sau 8 ngày nuôi cấy Nghiên cứu cũng đươc tiến hành để so sánh hiệu quả của các phương pháp nuôi cấy dịch thể (lắc, sục khí và lên men tĩnh) và kết quả thu được là phương pháp lắc có hiệu quả cao nhất

Nghiên cứu còn nhằm xác định ảnh hưởng của các tác nhân kết tủa đến hiệu quả kết tủa enzym laccase Tỷ lệ dung dịch enzym thô và dung môi hữu cơ (ethanol, acetone) được thay đổi từ 1:1 đến 1:5 (v/v), tương tự nồng độ amonium sulfate bão hòa trong dịch enzym cũng dao động từ 40% đến 100% Thời gian kết tủa thích hợp

từ tác nhân được lựa chọn cũng được khảo sát Kết quả cho thấy ethanol đạt hiệu quả kết tủa enzym laccase cao nhất Tỷ lệ dung dịch enzym thô/ethanol là 1:3 (v/v) và thời gian kết tủa là 45 phút cho hiệu suất tủa đạt 78,12% Khối lượng phân tử của enzym laccase được xác định bằng điện di là xấp xỉ 100 kDa

Trang 3

Họ và tên sinh viên: Đoàn Thị Luyến Số thẻ sinh viên: 107150153

Lớp: 15H2B Khoa: Hóa Ngành: Công nghệ thực phẩm

1 Tên đề tài đồ án: Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ

canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Các số liệu và dữ liệu ban đầu:

4 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

5 Các bảng, hình ảnh

6 Họ tên người hướng dẫn: PGS.TS Đặng Minh Nhật, ThS Nguyễn Thị Bích Hằng

7 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 18/08/2019

Trang 4

i

LỜI NÓI ĐẦU

Sau hơn 3 tháng thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quá trình thu nhận và tinh sạch enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi Trametes versicolor”, dưới sự hướng dẫn của thầy Đặng Minh Nhật và cô Nguyễn Thị Bích Hằng, tôi đã hoàn thành xong đồ án tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng nói chung, bộ môn Công nghệ thực phẩm nói riêng, đã tận tâm truyền đạt những kiến thức nền tảng, nhiệt tình giúp đỡ chỉ bảo trong quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập đúng với tiến độ

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Đặng Minh Nhật và

cô Nguyễn Thị Bích Hằng đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, sát cánh cùng tôi trong suốt quá trình làm đồ án Trong quá trình thực hiện, dù bận nhiều công việc nhưng thầy

cô đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, chỉ bảo tận tình từng bước, từ việc chọn đề tài, thực hiện đề tài và báo cáo đề tài Với những góp ý, sửa chữa của thầy cô, đã giúp tôi nắm bắt chính xác hơn về những nội dung liên quan đến đồ án từ đó hoàn thành đồ án một cách tốt nhất có thể

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và các bạn sinh viên ở các phòng thí nghiệm tại trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, khích lệ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp của mình

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đồ

án tốt nghiệp đã dành thời gian quý báu của mình để đọc và đưa ra ý kiến đóng góp cho

đồ án tốt nghiệp của tôi

Trang 5

ii

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu sử dụng, phân tích trong đồ án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định Các kết quả nghiên cứu trong đồ án do tôi tự thực hiện, phân tích một cách trung thực, khách quan Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác Các số liệu trích dẫn có ghi chú nguồn gốc rõ ràng

Sinh viên thực hiện

Đoàn Thị Luyến

Trang 6

iii

MỤC LỤC

Tóm tắt

Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp

Lời nói đầu i

Cam đoan ii

Mục lục iii

Danh sách các bảng v

Danh sách các hình vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nấm Vân Chi 4

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái nấm Vân Chi 5

1.1.3 Chu trình phát triển của nấm Vân Chi 5

1.1.4 Giá trị dược học của nấm Vân Chi 6

1.1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm 10

1.2 Tổng quan về enzym laccase 11

1.2.1 Giới thiệu chung về laccase 11

1.2.2 Cấu trúc phân tử của laccase 12

1.2.3 Cơ chế xúc tác của laccase 13

1.2.4 Nguồn thu nhận laccase 15

1.2.5 Ứng dụng của laccase 17

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về laccase 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên c ứu 22

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 23

2.2.3 Thiết bị thí nghiệm 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy dịch thể 23

Trang 7

iv

2.3.2 Phương pháp thu dịch nuôi cấy 24

2.3.3 Phương pháp tinh sạch 25

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ laccase 27

2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28

2.3.6 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 32

3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 34

3.3 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 36

3.4 Hiệu quả kết tủa của (NH 4 ) 2 SO 4 đối với dịch enzym laccase thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 39

3.5 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ trong kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 42

3.5.1 Khả năng kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi bằng dung môi ethanol 42

3.5.2 Khả năng kết tủa enzym laccase thu từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi bằng dung môi acetone 43

3.6 So sánh, lựa chọn chất kết tủa enzym laccase tốt nhất 45

3.7 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất kết tủa enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 46

3.8 Xác định khối lượng phân tử của enzym laccase 47

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Trang 8

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

2.2 Thành phần các môi trường khác nhau được sử dụng để

3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzym

laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 32

3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lắc đến hoạt độ enzym

laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 35

3.3 Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy đến hoạt độ

enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 36

3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tĩnh đến hoạt độ

enzym laccase từ canh trường nuôi cấy nấm Vân Chi 38

3.5 Hiệu quả kết tủa enzym laccase với muối (NH4)2SO4 40

3.6 Hiệu quả kết tủa enzym laccase với dung môi ethanol 42

3.7 Hiệu quả kết tủa enzym laccase với dung môi acetone 44

3.8 So sánh hiệu quả kết tủa enzym laccase bằng các tác

3.9 Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hiệu suất tủa của

Trang 9

vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

1.3 Cấu trúc ba chiều của enzym laccase từ Melanocarpus

albomyces

12

1.6 Quá trình oxy hóa các tiểu đơn vị phenol của lignin bằng

laccase

14

1.8 Quá trình oxy hóa phần không phenol của lignin bởi laccase

3.2 Hình ảnh nuôi cấy nấm Vân Chi trên môi trường lỏng sau:

a) 7 ngày; b) 9 ngày; c) 11 ngày

34

3.3 Hoạt độ enzym laccase thu được ở thời gian nuôi cấy khác

nhau trong điều kiện nuôi lắc

3.7 Hiệu suất tủa enzym laccase ở các nồng độ muối (NH4)2SO4

bão hòa khác nhau

41

Trang 11

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired immune seficiency syndrome

HAART Highly-active anti-retroviral therapy

ABTS 2,2'-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

RBBR Remazol brilliant blue R

Trang 12

Nấm Vân Chi (Trametes versicolor) là một loại nấm có giá trị dược liệu tốt, đã và

đang được người tiêu dùng ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, các nước Châu Âu, châu Mỹ ưa chuộng Trong nấm Vân Chi có chứa các hợp chất polysaccharid liên kết với protein, gồm hai loại chính: PSP (Polysaccharide peptide) và PSK (Polysaccharide krestin) PSP và PSK có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào ung thư như các tế bào ung thư biểu mô, các tế bào ung thư máu Các chất này được coi là có khả năng chữa trị ung thư, tăng miễn dịch cơ thể, chống các phản ứng phụ của xạ trị và hoá trị, ức chế sự nhân lên của HIV [2] Tại Việt Nam, gần đây ngành trồng nấm nói chung và nấm Vân Chi nói riêng đã và đang được quan tâm và phát triển, góp phần nâng cao sản lượng nấm hàng năm

Nuôi trồng nấm trên chất nền rắn đã được nghiên cứu rộng rãi vì đó là phương pháp nuôi trồng nấm truyền thống ở khắp các vùng miền Nhưng để rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu thì hiện nay người ta đã áp dụng công nghệ nuôi cấy lỏng (lên men) trong công nghệ nhân giống nấm Nuôi cấy lỏng là phương pháp nuôi cấy cho khả năng sản xuất sinh khối cao với thời gian rút ngắn và tỷ lệ nhiễm thấp hơn so với nuôi cấy môi trường rắn truyền thống

Do đó trong nuôi trồng nấm Vân Chi hiện nay, công nghệ lên men này được áp dụng rất nhiều Sản phẩm sau khi lên men bao gồm sinh khối sợi nấm Vân Chi và dịch nuôi cấy Sinh khối sợi nấm dùng để làm giống cấp 1, giống cấp 2, đồng thời có thể trực tiếp làm giống nuôi trồng (giống cấp 3) Còn dịch lên men thì ít có ứng dụng đem lại hiệu quả kinh tế Tuy nhiên trong thành phần của dịch nuôi cấy có chứa enzym laccase

Enzym laccase là một enzym thuộc nhóm oxidoreductase, xúc tác quá trình oxy hóa một electron của nhiều loại chất hữu cơ và vô cơ, bao gồm các hợp chất thơm có chứa các nhóm hydroxyl như mono-, di-, poly-, và methoxy-phenol và các amin thơm, hydroxyindoles, benzenethiols, carbohydrate và cả các hợp chất vô cơ như iot [2],[3] Một đặc điểm nổi bật của enzym laccase là nó oxy hóa cả các chất độc và không độc

Trang 13

hại Nó được sử dụng để loại bỏ các gốc lignin giúp tẩy trắng bột giấy hoặc để xử lý dịch lỏng độc hại sau quá trình tẩy trắng giấy bằng các hợp chất chlorine và các oxid chlorine để tẩy trắng bột giấy trong ngành công nghiệp giấy Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ các hợp chất phenol không mong muốn trong nấu nướng, chế biến nước trái cây, ổn định rượu vang và nước giải khát Trong công nghiệp dệt may, enzym laccase được sử dụng để cải thiện độ trắng của bông, giúp tiết kiệm hóa chất, năng lượng và nước Ngoài ra, enzym laccase còn được ứng dụng trong xử lý sinh học của nước thải công nghiệp, phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quá trình sản xuất khác nhau như hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ, xử

lý đất bị ô nhiễm Laccase có thể được sử dụng trong quá trình tổng hợp các hợp chất y

tế phức tạp như thuốc gây mê, thuốc chống viêm, thuốc kháng sinh, thuốc an thần, …

và hiện nay còn được ứng dụng trong mỹ phẩm

- Xác định khối lượng phân tử của enzym laccase từ nấm Vân Chi

3 Đối tượng nghiên cứu

Giống nấm Vân Chi được lấy từ phòng công nghệ sinh học Nấm, khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm, đại học Đà Nẵng

Trang 14

- Tổng quan về enzym laccase (giới thiệu chung, cấu trúc và cơ chế xúc tác của enzym laccase, các nguồn thu nhận enzym, ứng dụng và tình hình nghiên cứu về enzym laccase)

❖ Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu

- Hóa chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Phương pháp nghiên cứu (bố trí thí nghiệm, phương pháp nuôi cấy dịch thể, phương pháp thu dịch enzym, phương pháp làm sạch và tinh chế, phương pháp xác định hoạt độ, phương pháp thu thập và xử lý số liệu)

❖ Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Kết quả thí nghiệm

- Nhận xét, giải thích và kết luận

❖ Chương 4: Kết luận và kiến nghị

- Kết luận về kết quả nghiên cứu

- Đề xuất hướng nghiên cứu mới

Trang 15

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nấm Vân Chi

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại

Nấm Vân Chi là loại nấm dược liệu đã và đang được sử dụng ở nhiều nước châu

Á và là loài sinh trưởng khắp nơi trên thế giới đã được y học cổ truyền phương Đông sử dụng từ lâu Vân Chi có nhiều tên gọi khác nhau Vân Chi có tên tiếng Anh là “Turkey tails” (đuôi gà tây) do nó có nhiều màu sắc khác nhau: màu cam, nâu, xanh dương và xanh lá cây giống với chùm lông của gà tây [4],[3] Ở Trung Quốc, người ta gọi là

“Yunzhi” (nấm đám mây) vì nấm có hình dạng như mây Còn ở Nhật Bản thì gọi là

“Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những nơi gần bờ sông

Vân Chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau Trametes versicolor được chính Carl von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên là Boletus versicoler L (1753) Sau đó Christiaan Hendrik Persoon (1805) lại xác định với tên Boletus vulutinus Pers., và Elias Magnus Fries (1821) đưa chúng vào chi Polyporus (với hai loài: Polyporus versicoler Fr và Polyporus Vulutinus Fr) nhưng Lucien Quesslet (1886) lại đưa vào chi Coriolus (Coriolus versicolor) Sau 50 năm, Abert Pilát (1936) đề nghị và được đa số các nhà nấm học thống nhất xếp vào chi Trametes, họ Polyporacea Các hệ thống phân loại về

sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng

danh pháp đã chỉnh lý là Trametes versiclor [5]

Vân Chi là một loài nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm 22000 loài đã biết Nấm Vân Chi thường mọc trên những thân cây khô đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh nhất, có thể phá hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose và lignin)

Vị trí phân loại nấm Vân Chi [6]

Trang 16

Họ nấm nhiều lỗ : Polyporaceae

Chi : Trametes

Loài : Trametes versicolor

1.1.2 Đặc điểm hình thái nấm Vân Chi

Vân Chi là loại nấm hàng năm, mũ nấm

không có cuống, dai, phẳng hay hơi quăn,

hình bán nguyệt, mọc thành cụm Nấm

thường mọc thành tán dạng ngói lợp Mặt trên

tán phủ lông dày, mịn, dễ thay đổi về màu sắc,

đặc trưng bởi những vòng đồng tâm với màu

sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng

nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ có sắc thái xanh đến đen

Đảm quả khi non dạng u lồi tròn, sau phân hóa

thành dạng bán cầu, khi già đảm quả có dạng

thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay

cũng có khi trải sát giá thể hay trải cuộn lại

thành dạng vành với mép tán màu trắng đến

Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2 – 7 cm, dày cỡ 2,5 – 4 mm Thịt nấm mỏng, màu kem đến hơi vàng, dày 0,6 – 2,5 mm, trên lát cắt hiển vi thấy rõ lớp sắc tố đen xanh đặc trưng bên dưới lớp lông Tiếp xuống dưới là lớp bào tầng gồm các ống nấm dày cỡ 0,6 – 1,8 mm, miệng ống tròn, xẻ răng cưa, đôi khi có dạng nhiều gốc, có các gờ nổi gân, có 3 – 7 ống/mm, bề mặt phủ lông tơ rất mịn với đảm và bào tử dày đặc, màu trắng hơi vàng Hệ sợi trimitic, sợi dinh dưỡng trong suốt, vách mỏng có khóa rõ ràng, đường kính cỡ 2,5 – 3,5 µm; sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách rất dày, không thấy có vách ngăn tế bào, đường kính tới 6 – 12 µm, rất hiếm khi thấy phân nhánh, sợi bện cũng có vách dày, phân nhánh rõ rệt, không thấy có vách ngăn ngang, đường kính nhỏ hơn 5,0 – 5,5 µm, không thấy có liệt bào Đảm bào hình chùy, có 4 tiểu bính (nơi đính của 4 bào tử), có khóa ở phần gốc Bào tử đảm hình trụ, hơi cong hình quả dưa gang, trong suốt, nhẵn, kích thước 5,5 x 2,5 µm [9]

1.1.3 Chu trình phát triển của nấm Vân Chi

Đảm bào tử nảy mầm cho hệ sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp khác phối hợp cho hệ sợi thứ cấp Hệ sợi thứ cấp phát triển thành mạng hệ sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng

hệ sợi sẽ kết hạch tạo tiền quả thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm

Hình 1.1 Nấm Vân Chi [8]

Trang 17

trưởng thành, các phiến dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóng thích và chu trình lại tiếp tục

1.1.4 Giá trị dược học của nấm Vân Chi

1.1.4.1 Thành phần dược tính chính trích từ nấm Vân Chi

Theo các kết quả nghiên cứu, hai thành phần chính trích từ nấm Vân Chi có giá trị dược liệu quan trọng là hợp chất PSK (polysaccharide krestin) và PSP (polysaccharide peptide) Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám phá ra PSK Sau đó, hợp chất PSP cũng đã được phân lập lần đầu tiên tại Trung Quốc năm 1983 PSK và PSP có cấu trúc hoá học cũng như các tính chất khá tương đồng Chúng đều là các hợp chất polysaccharid liên kết với protein Dịch trích PSP từ nấm (thuật ngữ gọi là proteoglycan) là những chuỗi polypeptide hay những phân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗi polysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả trong chữa trị các bệnh ung thư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư ngực… Thành phần các yếu tố có trong dịch trích: cacbon: 40,5%; hydrogen: 60,2%; nitrogen: 5,2%; oxygen: 47,5% Cả hai đều có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa và các chuỗi polypeptid trong phân tử của chúng đều chứa một số lượng lớn các acid amin aspartic

và glutamic Tác dụng chung của PSP và PSK là hoạt hóa, tăng cường sự sản sinh và bảo vệ các tế bào của hệ miễn dịch

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Vân Chi [9]

1 Tầng đảm; 2 Đảm; 3 Kết hợp nhân ở đảm; 4 Hình thành bào tử

đảm, 5 Bào tử đảm nảy mầm; 6 Sự kết hợp sợi sơ cấp; 7 Sợi nấm

song nhân; 8 Quả thể

Trang 18

a) Hiệu quả của PSP chiết tách từ nấm Vân Chi

Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe và năng lượng PSP là loại chất cảm ứng, kích thích làm tăng các yếu tố hoại tử u và có tác dụng điều hòa hoạt động của các cytokine, là thành phần rất quan trọng để ngăn ngừa sự hình thành và phát triển các khối u Đồng thời, PSP còn ức chế

sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật, thúc đẩy sự sản xuất các tế bào miễn dịch chính (các đại thực bào và tế bào Lymphocyte) có tác dụng chống lại các tác nhân gây độc xâm nhập từ ngoài vào [10]

PSP không gây hại đối với các tế bào bình thường, có khả năng phân biệt giữa

tế bào thường và tế bào ung thư và tiêu diệt chúng mà không gây bất cứ sự thay đổi hay tạo độc tố trên tế bào Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả của PSP trong các giai đoạn 2 và 3 cho thấy tỉ lệ sống còn gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng: 90 – 97% đối với ung thư dạ dày, 82 – 87% đối với ung thư thực quản, 70 – 86% đối với ung thư phổi PSP là chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong điều trị ung thư

Ngoài ra PSP còn có một số công dụng khác:

- PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường

- PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật

- PSP còn được ứng dụng trong chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan

b) Hiệu quả của PSK chiết tách từ nấm Vân Chi

Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất trong số các dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u PSK bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách trung hoà các thuốc hoá trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư

- Có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u

- PSK có khả năng ngăn chặn bệnh AIDS PSK đã góp phần ngăn chặn sự nhân lên của virus HIV trong tế bào, hạn chế phần nào sự phá hỏng hệ thống miễn dịch do virus HIV gây ra, gây ức chế enzym phiên mã ngược Do đó PSK đã góp phần ngăn

Trang 19

1.1.4.2 Công dụng chính của nấm Vân Chi

Nấm Vân Chi là một loại nấm dược liệu đã được y học cổ truyền phương Đông

sử dụng từ lâu Sở dĩ như vậy vì nấm này có rất nhiều đặc tính dược lý và trong vài thập kỷ gần đây đã có hàng ngàn công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của nấm Vân Chi Theo kinh nghiệm cổ truyền ở Trung Quốc thì nấm Vân Chi có tính hàn, vị ngọt, giúp thanh nhiệt, tiêu viêm, nâng cao miễn dịch của cơ thể, có tác dụng tốt trong điều trị ung thư, viêm gan, HIV,… [9]

Nổi bật nhất là tác dụng phòng chống và điều trị ung thư Ở Nhật Bản, vào những năm 1980, nấm Vân Chi đã được công nhận là một chất chống ung thư Dịch trích từ nấm được sử dụng với hóa trị liệu làm tăng thời gian sống và giảm các tác dụng phụ đối với các bệnh nhân ung thư trong các nghiên cứu ngẫu nhiên với các dạng ung thư sau: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư thực quản, ung thư phổi và ung thư vú [4] Một nghiên cứu khác với các bệnh nhân ung thư dạ dày, thực quản, phổi, ung thư buồng trứng và cổ tử cung thì PSP cũng có tác dụng cải thiện chất lượng cuộc sống, làm giảm đau và tăng cường khả năng miễn dịch

ở 70 – 97% bệnh nhân [12] Tại Trung Quốc có rất nhiều nghiên cứu chứng minh dịch chiết xuất nấm Vân Chi có tác dụng ức chế 40 – 95% đối với sự tăng trưởng của

tế bào ung thư, trong khi đó lại không thấy có tác dụng phụ nào đáng kể Tại Anh, kết quả nghiên cứu do nhóm của tiến sĩ Kenyon ở trung tâm nghiên cứu điều trị lâm sàng Dove (Winchester, London) trên 30 bệnh nhân ung thư thuộc nhiều dạng khác nhau chỉ ra rằng điều trị bằng bột nghiền từ sinh khối nấm Vân Chi làm giảm mạnh

mẽ hoạt độ của enzym telomerase (một enzym thiết yếu giúp các tế bào ung thư chống lại quá trình “tự chết”), đồng thời tăng cường đáng kể các phản ứng miễn dịch chống lại các khối u Vì vậy, nghiên cứu cho thấy điều trị bằng nấm Vân Chi vẫn có tác dụng với các trường hợp ung thư giai đoạn 3 và 4, khi mà các liệu pháp hoá học và phóng xạ đã không còn tác dụng Các hợp chất trích từ Vân Chi rất an toàn khi sử dụng, không có phản ứng phụ, không độc [13]

Một tác dụng dược lý quan trọng nữa của nấm Vân Chi là khả năng kiềm chế virus HIV Năm 1997, R.A Collins thuộc Đại học Hồng Kông công bố kết quả nghiên cứu về tác dụng chống lại virus HIV typ 1 của các polysaccharid từ nấm Vân Chi

Trang 20

Ngay sau đó, nhiều nhà nghiên cứu khác đã tiến hành các thử nghiệm sử dụng nấm Vân Chi trong điều trị bệnh nhân AIDS Tiêu biểu phải kể đến là nghiên cứu của Marijke Pfeiffer trên một nhóm bệnh nhân HIV dương tính ( M.Pfeiffer, 2001) Các bệnh nhân này được điều trị bằng Coriolus MRL, một dược phẩm chế xuất từ nấm Vân Chi, kết hợp với liệu pháp châm cứu và dùng thảo dược; một số có dùng thêm HAART, một loại thuốc chống AIDS Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 3 – 4 tháng điều trị, sức khỏe của các bệnh nhân đều được cải thiện, biểu hiện như tăng cân, cảm thấy khỏe khoắn hơn, giải tỏa ức chế tâm lý Đặc biệt số lượng virus trong cơ thể họ đều giảm một cách đáng kinh ngạc (từ vài chục nghìn xuống vài nghìn) và số lượng các tế bào kháng thể CD – 4 đều tăng Sau thời gian điều trị các bệnh nhân đều khỏi hoặc thuyên giảm hẳn các triệu chứng hệ quả của AIDS như ỉa chảy, viêm phế quản, đau tim, viêm dây thần kinh, nhiễm khuẩn,… Một nghiên cứu đáng lưu ý khác do nhóm của G Rotolo (1999) thực hiện cũng chứng minh tác dụng điều trị các biểu hiện thứ cấp trong sự phát triển bệnh ở các bệnh nhân AIDS Các bệnh nhân đều trên

35 tuổi, HIV dương tính, được điều trị bổ sung bằng chế phẩm từ nấm Vân Chi Kết quả cho thấy sau 15 ngày điều trị với hàm lượng chế phẩm sử dụng là 3g/ngày, số lượng các tế bào bạch cầu trong cơ thể các bệnh nhân đều tăng lên khoảng 27 so với các trường hợp không được điều trị, và con số này giảm xuống còn 14,1 nếu lượng chế phẩm sử dụng cho điều trị được giảm đi một nửa Sau 45 ngày điều trị kết hợp cả hai chế độ, số lượng bạch cầu trong cơ thể các bệnh nhân tăng 45,2 Từ các kết quả này tác giả khuyến cáo việc sử dụng chế phẩm từ nấm Vân Chi như một liệu pháp chống bệnh AIDS và đề nghị nghiên cứu sâu hơn về bản chất tác dụng của nấm đối với sự tăng số lượng bạch cầu Nấm Vân Chi còn được phát hiện là có khả năng điều trị bệnh viêm gan B mãn tính và làm tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể

Bên cạnh những công dụng tuyệt vời của nấm Vân Chi trong y học, hiện nay nấm Vân Chi ngày càng được sử dụng nhiều trong ngành mỹ phẩm giúp cải thiện làn

da cho người sử dụng Một ví dụ về sản phẩm mỹ phẩm từ nấm Vân Chi là gel rửa mặt nấm Vân Chi và kem nám nấm Vân Chi của công ty mỹ phẩm Lan Hảo [14] Sản phẩm có tác dụng phục hồi và làm trẻ hóa da, giảm quá trình lão hóa da và ngăn ngừa các tác hại của ánh nắng mặt trời, làm mờ dần các mảng da bị nám và tàn nhang Ngoài ra nấm Vân Chi còn sản xuất ra các enzym phân hủy lignin bao gồm laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LiP) Trong đó, laccase là enzym có ưu điểm vượt trội là có tính oxy hóa mạnh và chỉ sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử trong khi LiP và MnP xúc tác phản ứng dưới sự có mặt của H2O2

Trang 21

1.1.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm

Nuôi trồng nấm trên chất rắn đã được nghiên cứu rộng rãi vì đó là phương pháp nuôi trồng nấm truyền thống ở khắp các vùng miền Nhưng để rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu thì hiện nay người ta đã áp dụng công nghệ lên men trong công nghệ nhân giống nấm Công nghệ này cho phép thu được lượng sinh khối sợi nấm lớn hơn phương pháp truyền thống

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và sản xuất giống nấm dịch thể Liu và cộng sự (2010) đã có kết luận rằng nuôi cấy nấm trong môi trường dịch thể có thể sản xuất ra giống nấm cao hơn trong thời gian ngắn hơn và với mức độ nhiễm bệnh ít hơn so với phương pháp nuôi cấy nấm truyền thống trên nền cơ chất rắn truyền thống Theo Sukamar và cộng sự (2008), ở Ấn Độ đã có nghiên cứu về ảnh hưởng điều kiện pH và nhiệt độ tới sự phát triển của Vân Chi trong môi trường dịch thể Kết quả là sinh khối sợi nấm Vân Chi thu được khi môi trường pH 5 và pH 6 là 2,99 g/l

và 4,28 g/l Trong khi đó nếu pH 8 thì sinh khối sợi giảm chỉ còn 1,97g/l Còn với điều kiện nhiệt độ thì tại nhiệt độ 300C, sinh khối sợi đạt được 4,32 g/l, tại 400C sinh khối sợi ghi nhận là thấp nhất đạt 1,72 g/l Tuy việc nghiên cứu và nuôi trồng giống nấm Vân Chi dịch thể trên thế giới đã có rất nhiều nhưng hầu như chỉ với mục đích thu sinh khối sợi và tách chiết các hoạt chất sinh học của nó còn việc nuôi trồng để thu quả thể ở loài nấm này rất ít được nghiên cứu

Ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản đã có nhiều sản phẩm nổi tiếng từ nấm Vân Chi Sản phẩm Vân Chi Can Thái của xí nghiệp dược phẩm Trường Xuân có tác dụng rõ rệt trong việc điều trị bệnh viêm gan mãn tính do virus HBV; thuốc Vân Tinh của Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên kết hợp với

xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh dùng để điều trị viêm gan do virus HBV và ung thư gan đã đạt được hiệu quả tốt; viên nang Vân Chi đa đường của xí nghiệp Dược phẩm Lão Sơn (Nam Kinh) cũng dùng để điều trị viêm gan B mãn tính và ung thư gan; Vân Chi khuẩn do xưởng Đông dược Thượng Hải nghiên cứu và nuôi trồng nấm

từ bã mía và chiết xuất ra polysaccharide để điều trị bệnh viêm gan B mãn tính,… [15]

Còn ở Việt Nam, việc nghiên cứu và nuôi trồng nấm Vân Chi cũng đang ngày càng được quan tâm hơn nhờ các giá trị dược lý của nó Lê Thị Hoàng Yến và cộng

sự (2003) đã phân lập quả thể Vân Chi từ Trung Quốc, sau đó thử nghiệm trên môi trường lỏng cho kết quả thu được nấm Vân Chi sinh trưởng tốt nhất trên môi trường 20g bột đậu tương; 20g đường kính; 2,5g (NH4)2SO4; 2g CaCO3; 1g MgSO4; sinh

Trang 22

1.2 Tổng quan về enzym laccase

1.2.1 Giới thiệu chung về laccase

Laccase (EC 1.10.3.2) là một enzym thuộc nhóm enzym oxy hóa khử, chứa các nguyên tử đồng (Cu) xúc tác quá trình oxy hóa nhiều hợp chất hữu cơ và vô cơ khác nhau Laccase được mô tả lần đầu tiên bởi Yoshida vào năm 1883 khi ông chiết xuất

từ các dịch tiết của cây sơn mài Nhật Bản Rhus vernicifera Năm 1896 laccase được tìm thấy trong nấm bởi Bertrand và Laborde [16]

Enzym laccase xúc tác quá trình oxy hóa một electron của nhiều loại chất hữu

cơ và vô cơ, bao gồm diphenol, polyphenol, phenol thay thế methoxy, amin thơm, ascorbate và cả các hợp chất vô cơ như iot Laccase có tính đặc hiệu cơ chất rộng đối với các hợp chất thơm có chứa các nhóm hydroxyl như mono-, di-, poly-, và methoxy-phenol và các amin thơm và béo, hydroxyindoles, benzenethiols, carbohydrat và kim loại vô cơ [2],[3] Do đó laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước

Laccase là một enzym thân thiện với môi trường do trong phản ứng chỉ lấy oxy

từ không khí và sản phẩm phụ tạo thành chỉ có nước Hơn nữa, laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng Do vậy nên nó được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, dược phẩm, công nghiệp mỹ phẩm và xử lý phụ phẩm và nước thải công nghiệp

Laccase có thể thu nhận từ vi khuẩn, thực vật và côn trùng nhưng với hoạt độ hạn chế Các laccase trong nấm được quan tâm nhiều hơn do khả năng xúc tác của chúng [1] Các loại laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau về mức

độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học

Trang 23

1.2.2 Cấu trúc phân tử của laccase

Vị trí hoạt động của laccase có chứa 4 nguyên tử đồng trong 3 nhóm là T1 (đồng đơn nhân), T2 (đồng thường) và T3 (đồng nhị nhân) Chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Đồng loại 1 (T1) có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh

ở khoảng 600nm tạo màu xanh điển hình của các phản ứng oxy hóa đồng, đồng loại

2 (T2) bình thường chỉ có sự hấp thụ yếu trong vùng ánh sáng khả kiến, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [2]

Hầu hết các laccase từ nấm có bản chất là glucoprotein chứa khoảng 10 – 25% carbohydrate Khối lượng phân tử laccase dao động trong khoảng 50 – 100 kDa do thành phần glycoprotein nấm có thể thay đổi theo thành phần môi trường tăng trưởng [3]

Cấu trúc không gian ba chiều của phân tử laccase

Hình 1.3 Cấu trúc 3 chiều của laccase từ Melanocarpus albomyces

Các tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B: màu vàng và vùng C: màu xanh lá

cây)

Phân tử laccase thông thường bao gồm ba tiểu phần (vùng) chính: A, B và C có khối lượng tương đối bằng nhau và cả 3 đều đóng vai trò trong quá trình xúc tác của laccase Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên

tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng còn lại nằm ở bề mặt chung của vùng A và C (Hình 1.3) Trung tâm đồng một chỉ chứa một đồng loại 1 (T1) được liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein Sự liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein (S-Cys) là liên kết cộng hóa trị bền

Trang 24

và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, do đó tạo màu xanh đặc trưng cho enzym laccase Trong khi đó, cụm trung tâm ba nguyên tử đồng chứa một nguyên tử đồng loại 2 (T2) và một cặp đồng loại 3 (T3) Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1.4)

1.2.3 Cơ chế xúc tác của laccase

Cơ chế của phản ứng oxy hóa nhờ enzym laccase tương đối đơn giản Có thể coi enzym laccase hoạt động như một cục pin, nó lưu trữ các electron từ các phản ứng oxy hóa riêng lẻ để khử oxy phân tử Do vậy để khử hoàn toàn phân tử oxy thành nước thì cần phải oxy hóa 4 phân tử cơ chất Do đó để khử hoàn toàn oxy phân tử thành nước thì quá trình oxy hóa bốn phân tử cơ chất khử là cần thiết [3]

Hình 1.4 Trung tâm hoạt động của laccase [17]

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa

cơ chất Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời các điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 1.5)

Trang 25

Hình 1.5 Cơ chế xúc tác của laccase

Cơ chế xúc tác của laccase vẫn có thể xảy ra theo cơ chế đơn giản nhất là cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên sản phẩm ban đầu thường không ổn định và có thể bị oxy hóa bởi một enzym khác hoặc xảy ra phản ứng phi enzym như là phản ứng trùng hợp, phản ứng hydrat hóa Ví dụ các liên kết của lignin được phân tách bởi laccase bao gồm quá trình oxy hóa cacbon Cα, phân tách Cα-Cβ và phân tách aryl-alkyl (Hình 1.6)

Hình 1.6 Quá trình oxy hóa các tiểu đơn vị phenol của lignin bằng laccase [3]

Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóa học trung gian Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do Sau đó hợp chất hóa học trung gian ở dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác Ngược lại, laccase sau khi cho hợp chất hóa học trung gian một điện tử thì trở thành dạng khử

Trang 26

và sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 1.7)

Hình 1.7 Các kiểu xúc tác của laccase [3]

(a) Chu kì xúc tác không có sự tham gia của hợp chất hóa học trung gian, (b) và (c) Chu kì xúc tác có sự tham gia của hợp chất hóa học trung gian

Các hợp chất hóa học trung gian thường phù hợp cho laccase là hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (VLA) Sự tham gia của hợp chất hóa học trung gian đã làm tăng phổ

3-cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu 3-cơ chất của laccase

Hình 1.8 Quá trình oxy hóa phần không phenol của lignin

bởi laccase và các hợp chất trung gian [3]

1.2.4 Nguồn thu nhận laccase

Laccase là enzym phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và chúng được tìm thấy

Trang 27

trong cả thực vật bậc cao, nấm, vi khuẩn và côn trùng

1.2.4.1 Laccase từ thực vật

Năm 1883, Yoshida lần đầu tiên mô tả về laccase thực vật từ dịch tiết của cây

gỗ Rhus vernicifera Sau đó các đặc trưng của laccase thực vật được nghiên cứu ở các thực vật bậc cao khác như Zea mays, Populus euramericana, Nicotiana tobacco, Lolium perenne, và Arabidopsis thaliana

Sau đó, laccase được thu nhận từ bắp cải, củ cải, củ cải đường, táo, măng tây, khoai tây, quả lê và các loại rau quả khác Sự xuất hiện của laccase ở thực vật bậc cao

có nhiều hạn chế so với nấm mốc Vì các laccase nấm có khả năng oxy hóa cao hơn laccase của vi khuẩn hoặc thực vật (lên tới 800 mV) [3]

1.2.4.2 Laccase từ vi khuẩn

Ở vi khuẩn, hoạt độ laccase cũng đã được tìm thấy trong một số ít trường hợp

như ở Azospirillum lipoferum, Bacillus subtilis, Streptomyces lavendulae, S cyaneus

và Marinomonas mediterranea [3] Tuy nhiên, tất cả các laccase hay protein tương

tự laccase được tìm thấy ở vi khuẩn có mặt trong nội bào hoặc chu chất, khác với các laccase ở nấm mốc và thực vật bậc cao đều được tiết ra môi trường bên ngoài [18]

1.2.4.3 Laccase từ nấm

Laccase từ nấm đã được nghiên cứu và khảo sát từ nấm Đảm Basidomyces Ngoài ra, còn có các loài nấm khác thuộc chi Ascomyces, Deuteromyces, Basidomyces và các loài nấm có khả năng phân hủy ligincellulose như Agaricus bisporus, Botrytis cinerea, Chaetomium themophilum, Coprius cinereus, Neurospora crassa, Phlebia radiate, Pleurotus ostrotus, Pycnoporus cinnabarius, Trametes versicolor cũng được nghiên cứu [18]

Hoạt độ của laccase thể hiện ở khả năng phân hủy lignin và chúng được tìm thấy nhiều trong các chủng nấm Đã có hơn 100 loại laccase được tinh chế từ nấm mốc và xác định được các đặc tính xúc tác và sinh hóa riêng của chúng Một số nấm

điển hình có khả năng tổng hợp laccase như nấm Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Botrytis cinerea, Coprinus cinereus hay là nấm lớn như Pycnoporus cinnabarinus

Laccase chủ yếu được biết đến là một enzym ngoại bào nhưng cũng có những tài liệu chứng minh về sự xuất hiện của laccase nội bào của nấm mục trắng Trong đó laccase nội bào có chức năng như một tiền thân cho laccase ngoại bào và không có

sự khác biệt giữa hai loại này Nấm mục trắng phân hủy lignocellulose đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các mảnh gỗ vụn Trong cơ chế chịu trách nhiệm cho

sự phân hủy lignin do nấm mục trắng, laccase được sản xuất trong quá trình trao đổi

Trang 28

chất thứ cấp Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy việc sản xuất các laccase phụ thuộc vào sự lựa chọn sinh vật sản xuất mới có hiệu quả phân hủy lignin cao hơn [3] Laccase nấm có khả năng oxy hóa khử cao hơn so với laccase vi khuẩn hoặc thực vật và có khả năng ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học

1.2.5 Ứng dụng của laccase

Hiện nay, nhu cầu về enzym nói chung và enzym laccase nói riêng ngày càng tăng do các ứng dụng tiềm năng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau mà đặc biệt

là trong công nghệ sinh học Một đặc điểm nổi bật của enzym laccase là nó oxy hóa

cả các chất độc và không độc hại Nó được sử dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp chế biến gỗ, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất

1.2.5.1 Ứng dụng trong công nghiệp giấy

Phương pháp oxy hóa sinh học nhờ enzym được xem là phương pháp khả quan

có thể thay thế các phương pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với môi trường và đặc biệt là do phản ứng bởi enzym thường rất đặc hiệu và có hiệu suất cao Các gốc lignin là nguyên nhân làm cho bột giấy có màu nâu Người ta thường dùng các hợp chất chlorine và các oxid chlorine để tẩy trắng bột giấy Quá trình tẩy trắng giấy tạo dịch lỏng có màu nâu đen chứa các sản phẩm bị chlorin hoá độc, có khả năng gây đột biến và nguy hiểm đối với môi trường và con người Quá trình tẩy trắng giấy bằng laccase ít tốn kém hơn cách dùng các chất tẩy trắng khác như chlorine

và các oxid chlorine Peroxidase và laccase có tác dụng tích cực trong việc xử lý dịch lỏng sau quá trình tẩy nói trên Do đó laccase đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình loại bỏ các hợp chất lignin và tẩy trắng bột giấy

1.2.5.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ các hợp chất phenol không mong muốn trong nấu nướng, chế biến nước trái cây, ổn định rượu vang và nước giải khát [19][20] Laccase còn cải thiện về các đặc tính cảm quan trong ngành công nghiệp bia, laccase không chỉ cung cấp sự ổn định mà còn làm tăng tuổi thọ của bia do enzym laccase thêm vào giúp loại bỏ được lượng polyphenol dư thừa Ngoài ra, trong sản xuất bánh nướng, enzym laccase cũng đã được thêm vào bột

mì để cải thiện kết cấu, khối lượng, hương vị và độ tươi của bánh mì Khi thêm laccase vào bột, độ bền cấu trúc gluten trong bột và các sản phẩm nướng được cải thiện: tăng khối lượng sản phẩm, cải thiện cấu trúc ruột bánh mì và sự mềm của các sản phẩm nướng Do sự bổ sung laccase, độ dính giảm, độ bền và sự ổn định tăng lên Laccase cũng được sử dụng trong sản xuất dầu thực vật để cải thiện mùi hương

Trang 29

Trong sản xuất rượu vang, sử dụng laccase nhằm ổn định tính chất của rượu vang [20] Do rượu vang là hỗn hợp các hợp chất hóa học khác nhau như ethanol, axit hữu cơ (mùi thơm), muối và các hợp chất phenolic (màu sắc và mùi vị) Laccase được sử dụng để loại bỏ các polyphenol không mong muốn trong rượu vang

1.2.5.3 Ứng dụng trong dệt may công nghiệp

Trong dệt may, enzym laccase được sử dụng để cải thiện độ trắng của bông, sử dụng để làm chuyển đổi tiền chất nhuộm để nhuộm vải tốt hơn và hiệu quả hơn, làm sạch và loại bỏ mùi hôi trên vải như rèm cửa, bề mặt ghế sofa Lợi ích của việc sử dụng laccase giúp tiết kiệm hóa chất, năng lượng và nước

1.2.5.4 Ứng dụng trong xử lí sinh học

Laccase có thể được áp dụng để làm giảm các chất khác nhau như các chất gây

ô nhiễm không mong muốn, các sản phẩm phụ hoặc các vật liệu bị loại bỏ Trong quá trình xử lý sinh học, các chất gây ô nhiễm được chuyển đổi sinh học thành trạng thái ban đầu của chúng mà không ảnh hưởng xấu đến môi trường

Đối với xử lý sinh học của nước thải công nghiệp, laccase đã được sử dụng để khử màu nước thải nhà máy nhuộm mà hầu như không bị mất màu bởi các nhà máy

xử lý nước thải thông thường Ngoài ra, laccase cũng có thể khử màu nước thải từ các nhà máy dầu ô liu và nhà máy bột giấy bằng cách loại bỏ các hợp chất phenolic màu Laccase cũng có thể được sử dụng để loại bỏ mùi hôi phát ra từ những nơi như nơi xử lý rác, trang trại chăn nuôi Laccase bất động đã được dùng để loại bỏ các chất

ô nhiễm phenolic và clo hóa, trong đó laccase chuyển đổi 2,4,6-trichlorophenol thành 2,6-dichloro-1,4-hydroquinol và 2,6-dichloro-1,4-benzoquinone Laccase từ nấm thối trắng cũng đã được sử dụng để oxy hóa anken, carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene

và dibenzothiophene với sự có mặt của HBT và ABTS làm chất trung gian [3] Một ứng dụng tiềm năng khác của laccase là xử lý sinh học đất bị ô nhiễm vì laccase có thể oxy hóa các chất ô nhiễm hữu cơ độc hại, chẳng hạn như xenobamel, PAHs, chlorophenols và các chất gây ô nhiễm khác Laccase cũng có thể được sử dụng để làm giảm nồng độ của hợp chất dị vòng tổng hợp như thuốc trừ sâu hữu cơ halogen trong đất

Laccase có thể tham gia phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quá trình sản xuất khác nhau như hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ Laccase được

cố định trên các chất mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator này hiệu quả trong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất chlorine phenol khác như các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân PAH, PCB từ ngành công

Trang 30

Một lĩnh vực ứng dụng mới lạ cho laccase là trong mỹ phẩm Ví dụ, thuốc nhuộm tóc dựa trên laccase có thể ít gây kích ứng và dễ xử lý hơn so với thuốc nhuộm tóc hiện tại Gần đây, các chế phẩm mỹ phẩm và da liễu có chứa protein để làm sáng

da cũng đã được phát triển Laccase có thể được sử dụng làm chất khử mùi cho các sản phẩm vệ sinh cá nhân, bao gồm kem đánh răng, nước súc miệng, chất tẩy rửa, xà phòng và tã lót [20]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về laccase

So với một số enzym như protease, amylase, pectinase,… thì enzym laccase chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều ở Việt Nam mà chủ yếu là các công trình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2008, Kurniawati S và cộng sự đã nghiên cứu về các đặc tính của enzym laccase từ nấm Vân Chi Kết quả nghiên cứu cho thấy enzym laccase có độ ổn định cao ở pH từ 5 đến 8 ở 250C và điều kiện ổn định tối ưu nhất ở pH 6, 250C [21] Năm 2013, Tugba Aydınoglu và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất enzym laccase

từ Trametes Versicolor (nấm Vân Chi) bằng cách lên men ở trạng thái rắn sử dụng lá

ô liu làm chất nền phenolic Để đạt được mức độ hoạt động laccase cao thì các tác động của độ ẩm ban đầu, kích thước lá, bổ sung nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ đã được đánh giá Hoạt độ laccase cao nhất (276,62 ± 25,67 U/g chất nền khô) với độ ẩm ban đầu của cơ chất là 80% và kích thước hạt 1,4 – 11,6 mm mà không cần thêm bất kì một chất cảm ứng nào [22]

Năm 2015, Daniela Chmelova và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau đến hoạt động của laccase từ nấm Vân Chi và khả năng khử màu thuốc nhuộm triphenylmethane của enzym này Kết quả nghiên cứu cho thấy các ion hóa trị I (Li+, Na+, K+, Ag+) làm ức chế hoạt động laccase Nhưng các ion kim loại hóa trị II (Cu2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+) lại làm tăng hoạt động của laccase Khi có mặt ion

Na+ và Mg2+ làm tăng khả năng khử màu thuốc nhuộm của laccase [23]

Trang 31

Năm 2012, Tô Kim Anh và cộng sự đã tinh sạch và xác định đặc tính laccase từ Aspergillus Niger đạt hoạt độ cao nhất 4250 U/l sau 7 ngày nuôi ở tốc độ lắc 200 vòng/phút, pH 6 Laccase tái tổ hợp đã được tinh chế nhờ kết tủa phân đoạn với ammonium sulfate 40% – 80% bão hòa ở 40C và sắc kí trên cột Hitrap Q Fast Flow với gradien NaCl 0 – 1 M, đạt hiệu suất thu hồi enzym 26%, hoạt độ riêng 34,7 U/mg protein, tăng 41,19 lần so với enzym thô Laccase tinh sạch có khối lượng phân tử 70 kDa, phản ứng tối ưu ở nhiệt độ 450C và pH 4 Enzym bền trong khoảng nhiệt độ từ

30 – 350C và pH 4 – 6 [16]

Năm 2013, Dương Minh Lam và cộng sự đã nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm Đảm Trametes maxima CPB30 sinh laccase Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng T.maxima CPB30 sinh mạnh laccase ở 84 – 90 ngày nuôi trong môi trường có bổ sung RBBR ở nhiệt độ 300C Kết quả cũng cho thấy rằng trong các môi trường có nguồn cacbon khác nhau, khả năng sinh trưởng của nấm khá tốt nhưng chỉ

có môi trường PDA (gồm khoai tây và glucose) phù hợp với sự sinh tổng hợp laccase

và chỉ trong môi trường PDA, hoạt độ laccase được duy trì ổn định và cao hơn nhiều lần so với các nguồn đường khác [25]

Năm 2014, Ngụy Thị Mai Thảo và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của một

số ion kim loại lên khả năng sinh tổng hợp laccase ở nấm Pleurotus sp (nấm Sò) Trong số các kim loại khảo sát, bổ sung Cu2+ với nồng độ 0,5 mM cho khả năng tăng hoạt độ laccase lên 105%, còn khi được bổ sung Cu2+ ở những ngày nuôi cấy khác nhau có sự khác biệt về thời gian cho hoạt độ laccase tối đa Hoạt độ cao nhất đạt được là 1,333 U/ml và 1,407 U/ml sau 7 ngày nuôi cấy khi Cu2+ được bổ sung lần lượt ở ngày thứ 3 và 4 và hoạt độ đạt 1,332 U/ml sau 14 ngày nuôi cấy nếu Cu2+ được

bổ sung sau 5 ngày nuôi Nếu bổ sung Cu2+ vào những ngày nuôi cấy muộn hơn, ngày thứ 6 và 7 thì hoạt độ enzym laccase giảm dần Các ion kim loại nặng hóa trị II khác

Trang 32

như Co2+, Cd2+, Hg2+, Mn2+ lại là tác nhân ức chế sinh trưởng của nấm, vì vậy, hoạt

độ laccase giảm so với mẫu đối chứng [26]

Năm 2016, Trần Thị Thu Hiền và cộng sự đã nghiên cứu môi trường thích hợp sinh tổng hợp laccase của chủng nấm Đảm Polyporus sp FBD154 thu thập từ vườn quốc gia Bidoup, Núi Bà và thử nghiệm khả năng loại màu thuốc nhuộm của chúng Kết quả nghiên cứu cho thấy, laccase được sinh nhiều nhất khi môi trường có pH 4,

về nghiên cứu bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy thì bổ sung CuSO4, tyrosine và vaniline cho hoạt lực enzym cao trong khi ion Fe2+, Ni2+, acid galic không

có tác dụng cảm ứng khả năng sinh laccase Nguồn cacbon thích hợp nhất là mannose, nguồn nitrogen vô cơ thích hợp nhất là NH4Cl và (NH4)2SO4 [27]

Nhiều ứng dụng của enzym laccase cũng đã và đang được nghiên cứu nhiều hơn Năm 2017, Muhammad Asgher cùng cộng sự đã nghiên cứu về hiệu quả xúc tác của enzym laccase từ nấm Vân Chi khi được cố định trên các hạt chitosan, sử dụng GLU (glutaraldehyd) làm tác nhân liên kết ngang Kết quả cho thấy các hạt chitosan

cố định laccase (ký hiệu là CTS-Lac) thể hiện phạm vi pH và nhiệt độ hoạt động rộng hơn enzym laccase tự do CTS-Lac kết hợp ABTS đem lại hiệu quả cao trong việc khử màu của các thuốc nhuộm dệt khác nhau và có thể khử màu hiệu quả trong mười

lô liên tiếp Do đó, nó có thể mang lại lợi ích kinh tế khi được sử dụng trong các ứng dụng quy mô lớn [28]

Năm 2019, Myleidi Vera và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng của laccase từ Agaricus bisporus (nấm Mỡ) và Trametes versicolor (nấm Vân Chi) trong loại bỏ diazinon, một hợp chất thuốc bảo vệ thực vật gốc lân hữu cơ thường sử dụng để diệt trừ côn trùng nhóm đục thân trên lúa và một số cây trồng khác như cam quýt, nho, chuối, khoai tây, cà phê, ca cao,… hoặc sử dụng để diệt giáp xác trong các ao nuôi trồng thủy sản Với sự có mặt của chất trung gian (ABTS), diazinon đã bị phân hủy 100% sau 48 giờ phản ứng với 0,2 U/ml enzym [29]

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	1,58 MB