Xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng clostridium difficile mang gen độc tố phân lập được từ bệnh nhân tiêu chảy

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊNĐẶNG THỊ THÙY DƯƠNG XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC T

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC

PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ

PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH TẠI BỐN BỆNH VIỆN Ở HÀ NỘI (2013 - 2015)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH TỈ LỆ NHIỄM VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN

TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ

PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH TẠI BỐN BỆNH VIỆN Ở HÀ NỘI (2013 – 2015)

CHUYÊN NGÀNH

MÃ SỐ

: VI SINH VẬT HỌC : 62420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ

2 TS VŨ THỊ THU HƯỜNG

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới

sự hướng dẫn của tập thể cán bộ hướng dẫn Các số liệu trong luận án là một phần

kết quả của đề tài: “Nghiên cứu vai trò gây bệnh và đặc điểm dịch tễ học phân tử

của các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí gây hội chứng tiêu chảy liên quan đến kháng sinh ở một số bệnh viện ở Hà Nội” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc

gia – NAFOSTED tài trợ, mã số đề tài là 106.03-2012.65, do TS Vũ Thị ThuHường là chủ nhiệm đề tài mà tôi là một thành viên Các kết quả trong luận án làtrung thực và chưa từng được ai khác công bố

Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Thùy Dương

LỜI CẢM ƠN

Luận án này không thể hoàn thành nếu thiếu sự hướng dẫn, hỗ trợ, động viên của nhiều cá nhân và cơ quan:

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa

Sinh học, Trường Đại học khoa học Tự nhiên, đã truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên ngành Vi sinh vật học, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập,

đã tận tình sửa chữa luận án, đặc biệt cô luôn động viên và cho tôi những bài học rất quý giá khi giải quyết những khó khăn và trở ngại trong học tập cũng như trong cuộc

sống; TS Vũ Thị Thu Hường, Trưởng phòng Vi khuẩn Kỵ khí, Khoa Vi khuẩn, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu vai trò gây bệnh và đặc

điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí gây hội chứng tiêu chảy

do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia tài trợ, đã cho phép tôi tham gia

đề tài, được sử dụng một phần số liệu trong đề tài vào luận án, đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo để tôi nắm vững các thao tác kỹ thuật cũng như các kiến thức chuyên sâu về đối tượng nghiên cứu, tận tình giúp tôi sửa chữa hoàn thiện luận án, cô dẫn dắt chỉ bảo tôi trở thành một nhà nghiên cứu khoa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học và Khoa

Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

trong suốt quá trình học tập

Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Hội đồng Trường, Ban Giám hiệu, Labo

XNATVSTP, đặc biệt TTND PGS TS Vũ Đình Chính, TS Đinh Thị Diệu Hằng Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi đi học

và hoàn thành luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tạo

mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tôi làm nghiên cứu đề tài ở Viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Tăng Thị Nga, CN Lê Thị Trang, CN Phạm Thị

Hồng Thủy, BS Phùng Thu Hằng đã giúp đỡ tôi trong việc thu thập mẫu, thực hiện

kỹ thuật trong thời gian tôi làm việc tại phòng Vi khuẩn Kỵ khí.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Vi sinh vật học, Trường ĐH

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và các bạn đồng nghiệp tại trường

ĐH Kỹ thuật Y tế Hải Dương đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ, động viên tôi trong suốt

quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, Chồng, các con, những người thân

yêu đã động viên và hỗ trợ rất nhiều về thời gian, vật chất và tinh thần để tôi vượt qua

mọi khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu.

ĐẶNG THỊ THÙY DƯƠNG

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC HÌNH 7

DANH MỤC BẢNG ……… 8

MỞ ĐẦU 10

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 10

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 11

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 11

3.1 Ý nghĩa khoa học 11

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 12

4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 12

5 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 14

1.1 TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH 14

1.1.1 Định nghĩa 14

1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh 14

1.2 VI KHUẨN Clostridium difficile 16

1.2.1 Đặc điểm sinh học 16

1.2.1.1 Lịch sử 16

1.2.1.2 Hình thể 16

1.2.1.3 Nuôi cấy 16

1.2.1.4 Tính chất sinh hóa 18

1.2.1.5 Sức đề kháng 18

1.2.2 Độc tố của C difficile 18

1.2.2.1 Độc tố TcdA và TcdB 18

1.2.2.2 Độc tố kép CDT 23

1.2.3 Cơ chế gây bệnh 23

1.2.4 Các bệnh do C difficile gây ra 24

1.2.5 Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C difficile 26

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 27

1.3.1 Trên thế giới 27

1.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng do C difficile 27

1.3.1.2 Dịch tễ học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh 29

1.3.2 Trong nước 31

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium difficile 34 1.4.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố 35

1.4.1.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ bệnh phẩm 35

1.4.1.2 Xác định chủng vi khuẩn C difficile sinh độc tố 37

1.4.1.3 Ưu, nhược điểm 37

1.4.2 Phương pháp khuếch đại gen phát hiện gen độc tố trực tiếp từ mẫu phân 38

1.4.2.1 Các gen đích 38

1.4.2.2 Các phương pháp khuếch đại gen 38

1.4.2.3 Ưu nhược điểm của phương pháp khuếch đại gen 40

1.4.3 Các phương pháp khác 40

1.4.3.1 Trung hòa độc tố tế bào (CCCNA – cell culture cytotoxicity neutralization assay) 40

1.4.3.2 Phương pháp miễn dịch hấp phụ enzym (EIAs hoặc ELISA) 41

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI PHÂN TỬ CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ 42

1.5.1 Phương pháp PCR ribotyping 42

1.5.2 Phương pháp giải trình tự gen slpA 43

1.5.3 Các phương pháp khác 44

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 47

2.2 CỠ MẪU, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 47

2.3 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 48

2.4 CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 48

2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 48

2.4.2 Thông tin bệnh nhân 49

2.5 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 50

2.5.1 Chủng vi khuẩn 50

2.5.2 Sinh phẩm 51

2.5.3 Môi trường nuôi cấy 52

2.5.4 Thiết bị, dụng cụ 53

2.6 NỘI DUNG VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 54

2.6.1 Đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trường CCMA 54

2.6.2 Nuôi cấy phân lập C difficile mang gen độc tố 56

2.6.2.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ mẫu phân 56

2.6.2 2 Xác định chủng vi khuẩn C difficile và phân loại độc tố 57

2.6.3 Phương pháp nested PCR 59

2.6.4 Phương pháp PCR ribotyping 60

2.6.5 Phương pháp giải trình tự gen slpA 62

2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 64

2.8 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 66

3.1 TỈ LỆ NHIỄM C difficile MANG GEN ĐỘC TỐ Ở BỆNH NHÂN TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH 66

3.1.1 Kết quả đánh giá hiệu năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trường CCMA 66

3.1.1.1 Tính năng suất 66

3.1.1.2 Tính chọn lọc 66

3.1.1.3 Giới hạn phát hiện của môi trường CCMA 67

3.1.2 So sánh phương pháp nested PCR với phương pháp nuôi cấy C difficile mang gen độc tố 70

3.1.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy

sau dùng kháng sinh 75

3.1.3.1 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố (C difficile MGĐT) 75

3.1.3.2 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo kiểu độc tố 79

3.1.3.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo đặc điểm nhân khẩu học 83

3.1.3.4 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh 89

3.1.3.5 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo 95

3.1.3.6 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện 97

3.2 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG Clostridium difficile MANG GEN ĐỘC TỐ 99

3.2.1 Đặc điểm dịch tễ học phân tử C difficile MGĐT theo phương pháp phân loại PCR ribotyping 99

3.2.1.1 Kết quả phân loại 99

3.2.1.2 Sự phân bố của các ribotype 102

3.2.1.3 Sự phân bố các ribotype C difficile lưu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội so với một số nước trên thế giới 107

3.2.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C difficile MGĐT theo phương pháp giải trình tự gen slpA 109

3.2.2.1 Kết quả phân loại 109

3.2.2.2 Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới 113

KẾT LUẬN 119

KIẾN NGHỊ 120

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC

Base pairBrain heart Infusion (Canh thang não tim)Cyclocerine – Cefoxitin – Manitol – AgarCyclocerine – Cefoxitin – Fructose – AgarCyclocerine – Cefoxitin – Manitol – BrothCenters for Disease Control and Prevention(Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ)Colony form unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)Confidence Interval (khoảng tin cậy)

C difficile mang gen độc tố

Enzym linked – immusorbent assay(Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzym)GAM – Horse Taurocholate

KilobaseKilodaltonMinimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)Multilocus Variable-number tandem-repeat Analysis

(Phân tích trình tự lặp lại ngẫu nhiên)Multilocus sequence typing (Phân tích trình tự đa locus)

Methicillin Resistant Staphylococcus aureus

5

Odd Ratio (tỉ suất chênh)

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Điện di xung trường)

REA Endonuclease Restriction Analysis

(Phân tích đoạn nhờ enzym giới hạn)

SHEA/IDSA Society for Healthcare Epidemiology of America

and the Infectious Diseases Society of America(Hiệp hội nghiên cứu dịch tễ học của Mỹ/ các bệnh truyềnnhiễm của Mỹ)

slpAST slpA Sequence Typing (Phương pháp phân loại giải trình tự

gen slpA)

US United States (Hợp chủng quốc Hoa Kỳ)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng hình thái của C difficile 17

Hình 1.2 Đặc điểm khuẩn lạc C difficile 17

Hình 1.3 Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C difficile 19

Hình 1.4 Cấu trúc của TcdA và TcdB, vị trí và chức năng hoạt động của mỗi domain 20

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của các độc tố TcdA và TcdB 22

Hình 1.6 Các thể nhiễm trùng do C difficile 25

Hình 1.7 Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013 30

Hình 1.8 Hệ thống hộp ủ GasPak 36

Hình 1.9 Cấu trúc gen slpA của C difficile 44

Hình 2.1 Quy trình thu thập mẫu và thông tin……… 49

Hình 2.2 Nội dung và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 54

Hình 2.3 Kết quả PCR đa mồi trên các chủng C difficile sinh độc tố và không sinh độc tố 58

Hình 2.4 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng nested PCR 60

Hình 3.1 Khả năng mọc của C difficile trên môi trường CCMA và GAM –HT……66

Hình 3.2 Khả năng ức chế các vi khuẩn khác của môi trường CCMA 67

Hình 3.3 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nước 77

Hình 3.4 Tỉ lệ dòng vi khuẩn C difficile A-B+ tại bốn bệnh viện ở Hà Nội và một số nước 82

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR ribotyping 100

Hình 3.6 Tỉ lệ các ribotype trong quần thể nghiên cứu 102

Hình 3.7 Sự lưu hành của các ribotype tại 4 bệnh viện Hà Nội 103

Hình 3.8 Sự lưu hành của các ribotype C difficile qua các năm 103

Hình 3.9 Sự phân bố các phân nhóm slpAST ở 4 bệnh viện 111

Hình 3.10 Mối quan hệ di truyền gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu và các chủng trên thế giới 115

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh do 15

Bảng 1.2 Các ribotype phổ biến ở một số nước trên thế giới 31

Bảng 1.3 Các phương pháp phân loại phân tử C difficile 45

Bảng 2.1 Danh sách chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 50

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi trong phản ứng PCR đa mồi 51

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi cho phản ứng nested PCR 51

Bảng 2.4 Cặp mồi dùng cho phương pháp PCR ribotyping 52

Bảng 2.5 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho PCR giải trình tự 52

Bảng 2.6 Thành phần môi trường CCMA 53

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR đa mồi 57

Bảng 2.8 Kết quả phân loại độc tố bằng PCR đa mồi 58

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng nested PCR 60

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng PCR ribotyping 61

Bảng 2.11 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ribotyping 62

Bảng 2.12 Các thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen slpA 63

Bảng 2.13 Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen 64

Bảng 3.1 Tỉ lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 103 bào tử/1g phân 68

Bảng 3.2 Tỉ lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 102 bào tử/ 1g phân 68

Bảng 3.3 Tỉ lệ phát hiện C difficile ở nồng độ 10-50 bào tử/1g phân 69

Bảng 3.4 Kết quả xét nghiệm mẫu phân bằng 2 phương pháp 71

Bảng 3.5 Các trường hợp đồng nhiễm 73

Bảng 3.6 Kết quả xét nghiệm kết hợp song song hai phương pháp 75

Bảng 3.7 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo năm 76

Bảng 3.8 Tỉ lệ nhiễm C difficile theo kiểu độc tố 79

Bảng 3 9 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo các đặc điểm về nhân khẩu học 84

Bảng 3.10 Mối liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu học và nhiễm 84

Bảng 3.11 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo giới tính qua các năm 85

Bảng 3.12 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo giới tính ở mỗi bệnh viện 86

Bảng 3.13 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử sử dụng kháng sinh 91

Bảng 3.14 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo tiền sử bệnh lý kèm theo 96

Bảng 3.15 Tỉ lệ nhiễm C difficile MGĐT theo khoa và bệnh viện 98

Bảng 3.16 Kết quả phân loại 65 chủng theo phương pháp PCR ribotyping 100

Bảng 3.17 Phân bố của hai ribotype trf và 017 theo một số đặc điểm 106

Bảng 3.18 Các ribotype C difficile lưu hành tại 4 bệnh viện ở Hà Nội và một số nước trên thế giới 108

Bảng 3.19 Kết quả phân loại 65 chủng C difficile theo phương pháp slpAST 110

Bảng 3.20 So sánh trình tự gen slpA giữa các chủng trong nghiên cứu với các chủng trên thế giới 113

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Tiêu chảy sau dùng kháng sinh được định nghĩa là tình trạng tiêu chảy xảy ra

có liên quan đến việc sử dụng kháng sinh gây phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩnđường ruột hoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hại sinh độc tố [22] Trong

số các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, Clostridium difficile (C difficile)

là nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất, chiếm từ 10-25% các ca tiêu chảy sau

dùng kháng sinh, 90-100% các ca viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng sinh [23,127]

C diffìcile là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, có khả năng sinh bào tử Vi khuẩn

này đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phổ biến ở các nước châu Âu và châu

Mỹ trong gần hai thập kỉ qua Ở Mỹ, C difficile là nguyên nhân hàng đầu gây ra các

ca tử vong do viêm dạ dày ruột [41, 61, 105] Các nghiên cứu dịch tễ học phân tửtrên thế giới đã chỉ ra rằng có mối liên quan giữa mức độ nặng của bệnh với kiểu

gen của vi khuẩn, điển hình như típ C difficile BI/NAP1/027 được xác định là căn

nguyên gây ra nhiều vụ dịch lớn ở Châu Âu và Bắc Mỹ vào đầu thế kỉ XXI Do vậy,

việc nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ học phân tử của C difficile gây bệnh là cần

thiết cho điều tra vụ dịch tiêu chảy trong bệnh viện và phát hiện một típ chủng vikhuẩn có khả năng gây ra các vụ dịch mới

Trong khi, nhiều nước như Anh, Mỹ, Ai-xơ-len có hệ thống giám sát tiêu

chảy bệnh viện nói chung và tiêu chảy sau dùng kháng sinh do C difficile nói riêng

ngày càng được mở rộng và trở thành bắt buộc, nhận thức về tác nhân gây bệnh này

ở châu Á còn rất hạn chế [37] Một số ít nghiên cứu trong thời gian gần đây đã

bước đầu xác định C difficile là tác nhân truyền nhiễm mới nổi ở các nước Nhật Bản,

Trung quốc, Singapore, Hàn Quốc và Thái Lan [71, 86, 92, 109]

Tại Việt Nam, vai trò gây bệnh của vi khuẩn kỵ khí nói chung và C difficile nói riêng chưa được quan tâm đúng mức Một trong những nguyên nhân của thực

trạng này là do thiếu các bằng chứng, cơ sở khoa học chứng minh vai trò

gây bệnh của các vi khuẩn này Trong khi đó, với thực trạng lạm dụng kháng sinh,môi trường bệnh viện luôn trong tình trạng quá tải và các biện pháp kiểm soátnhiễm khuẩn bệnh viện kém hiệu quả ở nước ta đều là các yếu tố làm tăng nguy cơ

nhiễm trùng do C difficile Từ năm 2012, nhóm nghiên cứu phòng Vi khuẩn Kỵ

khí, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã xây dựng qui trình nuôi cấy và PCR chẩn

đoán nhiễm trùng do C difficile và đã báo cáo các ca bệnh điển hình do C difficile

[2, 4], bước đầu xác định được tỉ lệ nhiễm C difficile nhưng trên lượng mẫu còn

nhỏ [5] Tuy nhiên, một vài kết quả này chưa phản ánh đầy đủ tình hình nhiễm C.

difficile trong một khu vực Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào phân tích đặc điểm

dịch tễ học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh ở nước ta Xuất phát từ thực

tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định tỉ lệ nhiễm và một số đặc điểm dịch

tễ học phân tử của các chủng Clostridium difficile mang gen độc tố phân lập

được từ bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội (2013 – 2015)”.

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1) Xác định được tỉ lệ nhiễm Clostridium difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân

tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện ở Hà Nội

2) Phân tích được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng

Clostridium difficile mang gen độc tố

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Ý nghĩa khoa học

 Đây là một trong số ít các nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định tỉ lệ

nhiễm C difficile ở bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh trên cỡ mẫu lớn Kết quả

này không những góp phần bổ sung thông tin bị thiếu hụt về tiêu chảy sau dùng khángsinh mà còn cung cấp bằng chứng chứng minh vai trò gây bệnh quan trọng của vi khuẩn

C difficile cũng như nhóm vi khuẩn kỵ khí gây bệnh nói chung, vốn ít được quan tâm ở

Việt Nam

 Kết quả về phân loại đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C difficile

mang gen độc tố sẽ là cơ sở khoa học để xác định mối tương quan về kiểu

gen giữa các chủng vi khuẩn gây bệnh trong một bệnh viện, giữa các bệnh viện trong khu vực.

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

 Tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố trên những bệnh nhân tiêu chảy sau

dùng kháng sinh tại bốn bệnh viện lớn ở Hà Nội là 24,9% Đây là bằng chứng thuyết

phục cho thấy sự cần thiết phải tiến hành xét nghiệm phân tìm C difficile gây bệnh trong các ca bệnh tiêu chảy sau dùng kháng sinh Kết quả của các xét nghiệm này sẽ giúp cho

các bác sỹ lâm sàng trong việc xử trí, lựa chọn liệu pháp điều trị thích hợp cho các bệnhnhân bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh, đồng thời giúp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh việntốt hơn và giảm gánh nặng cho ngành y tế

 Kết quả phân loại đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng C difficile mang

gen độc tố đã phát hiện được các típ vi khuẩn gây bệnh phổ biến tại bốn bệnh viện ở HàNội là trf, 017, cc835, og39 và dự đoán típ có thể gây ra các vụ dịch là trf Đây là thôngtin quan trọng giúp cho các nhà dịch tễ học, các nhà quản lý y tế có biện pháp phòngchống hiệu quả khi dịch bệnh xảy ra

Luận án nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi khuẩn kỵkhí, Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương Đối tượng nghiên cứu là bệnh nhân bị tiêuchảy sau khi dùng kháng sinh; có độ tuổi ≥ 15 tuổi; thu thập từ 4 bệnh viện lớn ở HàNội bao gồm bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, bệnhviện Lão Khoa và bệnh viện Đống Đa Một trong những mục đích của nghiên cứu là

xác định tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở người lớn, tuy nhiên bệnh viện

Nhi Trung ương chỉ nhận bệnh nhân dưới 15 tuổi Do vậy, nghiên cứu này đã lựachọn bệnh nhân ≥ 15 tuổi ở 4 bệnh viện trên vào đối tượng nghiên cứu Các số liệunghiên cứu được thu thập trong khuôn khổ hợp tác nghiên cứu giữa Viện vệ sinhDịch tễ Trung ương và các bệnh viện trên Các khía cạnh về đạo đức của nghiêncứu được thông qua và chấp thuận bởi Hội đồng y đức của Viện Vệ sinh Dịch tễTrung ương

12

Luận án này thực hiện 4 nội dung nghiên cứu chính Một là đánh giá hiệu

năng và xác định giới hạn phát hiện của môi trường Cycloserine – Cefoxitine –

Manitol – Agar (CCMA) trong nuôi cấy phân lập C difficile Hai là so sánh

phương pháp nested PCR phát hiện gen sinh độc tố A với phương pháp nuôi cấy

phân lập C difficile mang gen độc tố (C difficile MGĐT) Ba là xác định tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở những bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh bằng hai phương pháp nested PCR và nuôi cấy Bốn là phân tích đặc điểm dịch

tễ học phân tử của các chủng C difficile mang gen độc tố bằng hai phương pháp phân loại phân tử PCR ribotyping và giải trình tự gen slpA (slpAST).

1) Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam chứng minh sự lưu

hành của các chủng C difficile thuộc 8 ribotype và 10 phân nhóm slpAST trên quần thể

bệnh nhân bị tiêu chảy sau dùng kháng sinh, có độ tuổi ≥ 15 tuổi, tại bốn bệnh viện ở HàNội Trong đó, các ribotype phổ biến nhất là trf, 017, cc835 và og39, các phân nhómslpAST phổ biến nhất lần lượt là fr-01, kr-03.1, og39-01 Luận án có vai trò như là bước

đi đầu tiên thúc đẩy hướng nghiên cứu tiếp theo về dịch tễ học phân tử của các chủng C.

difficile gây bệnh trên các quần thể bệnh nhân khác nhau và các vùng miền khác nhau ở

nước ta

2) Kết quả luận án còn cho thấy, ở nước ta xuất hiện hai phân nhóm slpAST

mới so với các phân nhóm đã công bố trên thế giới là fr-23 và fr-24 Trình tự gen slpA

của các chủng này đã được đăng ký trên ngân hàng Genbank với số truy cập tương ứng

là LC176667 và LC189481 Kết quả này có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc điều tranguồn gốc của các chủng gây bệnh lưu hành giữa các vùng miền trong một nước, giữacác nước trong một khu vực và trên toàn thế giới

13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 TIÊU CHẢY SAU DÙNG KHÁNG SINH

1.1.1 Định nghĩa

Tiêu chảy sau dùng kháng sinh được định nghĩa là tình trạng tiêu chảy xảy rasau khi sử dụng kháng sinh gây phá vỡ sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruộthoặc làm phát triển quá mức các vi khuẩn có hại sinh độc tố [21, 23] Tiêu chảy làbiến chứng phổ biến nhất của liệu pháp điều trị kháng sinh Tiêu chảy xảy ra ở 5-10% bệnh nhân được điều trị với ampicillin, 10-25% bệnh nhân được điều trị vớicefixime, amoxicillin và 2-5% bệnh nhân được điều trị với các kháng sinh khácnhư cephalosporins, fluoroquinolones, azithromycin, clarithromycin, erythromycin,

và tetracylin [16] Các biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm đại tràng sau dùng khángsinh bao gồm đau bụng, sốt, tăng bạch cầu, có bạch cầu trong phân, giảm albumine,thành ruột dày được quan sát khi chụp cắt lớp, và những thay đổi đặc trưng kháckhi kiểm tra nội soi hoặc sinh thiết [21] Các thể lâm sàng của tiêu chảy sau dùngkháng sinh dao động từ nhẹ đến nặng, có thể gây viêm đại tràng giả mạc, dẫn đếntắc ruột, hoại tử đại tràng, nhiễm khuẩn huyết và tử vong [21, 23]

1.1.2 Các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh

Trong số các tác nhân gây tiêu chảy sau dùng kháng sinh, C difficile là

nguyên nhân nhiễm trùng quan trọng nhất chiếm từ 10-25% các ca tiêu chảy saudùng kháng sinh, 90-100% viêm đại tràng giả mạc sau dùng kháng sinh [23, 127]

Ngoài ra, các vi khuẩn khác bao gồm Clostridium perfringens típ A,

Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp và Candida albicans có

thể là nguyên nhân, nhưng ít phổ biến hơn; còn lại phần lớn các ca tiêu chảy nhẹ tự

khỏi và không xác định rõ nguyên nhân [21, 23, 146] Tiêu chảy sau dùng kháng

sinh do Klebsiella oxytoca và E coli O157: H7 luôn tạo ra viêm ngay trên bề mặt và dưới hình ảnh nội soi giống như viêm đại tràng thiếu máu cục bộ Tiêu chảy do K.

oxytoca thường

được điều trị với penicillin, không cần điều trị với metronidazole và vancomycin,

viêm do E.coli O157: H7 việc sử dụng kháng sinh làm cho bệnh nặng hơn [54] Đặc điểm lâm sàng chính để phân biệt giữa tiêu chảy sau dùng kháng sinh do C difficile

và tiêu chảy sau dùng kháng sinh do các tác nhân khác được chỉ ra ở Bảng 1.1

Bảng 1 1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt tiêu chảy sau dùng kháng sinh do C.

difficile so với các tác nhân khác [21]

Đặc điểm Tiêu chảy do C difficile Tiêu chảy do các tác

nhân khác

Kháng sinh Clindamycin, cephalosporins, Clindamycin,

acid clavulanicĐặc điểm của tiêu Thường dữ dội, cấp tính, nhiều Thường ở mức độ trungchảy lần/ ngày (5-10 lần), mất nước, bình

rối loạn điện giải, sốt, bạch cầutrung tính tăng cao trong máuBằng chứng khi Thường viêm đại tràng Không viêm

chụp cắt lớp hoặc

nội soi

Biến chứng Giảm albumine, sưng ruột, thủng Thường không có biến

ruột, tái phát khi điều trị với chứng, ngoại trừ trườngmetronidazole hay vancomycin hợp mất nước nặng

1.2 VI KHUẨN Clostridium difficile

1.2.1 Đặc điểm sinh học

1.2.1.1 Lịch sử

Clostridium difficile được phân lập đầu tiên bởi Hall và O’Toole [54, 62], ban

đầu vi khuẩn này có tên là Bacillus difficile Tên “difficile” được sử dụng với hàm ý vi

khuẩn này khó phân lập do đòi hỏi điều kiện nuôi cấy kỵ khí tuyệt đối, môi trường nuôicấy đặc biệt và khó xác định đặc điểm sinh hóa Về sau, vi khuẩn này được xếp vào

giống Clostridium và đến giữa những năm 1930 được mô tả lần đầu tiên với tên

Clostridium difficile [54, 118] Năm 2016, Lawson và cộng sự đã phân loại lại Clostridium difficile thành Clostridioides difficile thuộc họ Peptostreptococcaceae và

tên mới này chính thức được sử dụng làm danh pháp quốc tế [102] Tuy nhiên, tên

thường gọi Clostridium difficile vẫn được phần lớn các nhà nghiên cứu sử dụng cũng như trong luận án này sẽ dùng tên Clostridium difficile.

1.2.1.2 Hình thể

C difficile là trực khuẩn Gram dương, kích thước 1x3µm, kỵ khí bắt buộc,

có khả năng sinh bào tử C difficile có thể tồn tại ở hai dạng, dạng tế bào sinh

dưỡng có hoặc không có nội bào tử và dạng bào tử tự do Trên hình ảnh tiêu bản

nhuộm Gram từ canh thang nuôi cấy, ở dạng tế bào sinh dưỡng C difficile có dạng hình que, bắt màu tím, kích thước ngắn hơn và nhỏ hơn so với loài C perfringens, nội bào tử ở gần đầu cực; ở dạng bào tử tự do C difficile có hình dạng giống như

“đầu cái kim” (Hình 1.1) [54]

1.2.1.3 Nuôi cấy

C difficile là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối Do vậy, điều kiện ủ các môi trường

nuôi cấy phải đảm bảo không có oxi, thay vào đó là khí trường gồm hỗn hợp các khí

N2 (80%), CO2 (10%), H2 (10%) Thời gian tiến hành các thao tác nuôi cấy phải rất

nhanh (thường không quá 20 phút) C difficile là vi khuẩn khó sinh trưởng, đòi hỏi

môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng có bổ sung các chất như: vitamin K, hemin, máu

ngựa hoặc cừu, nhũ tương lòng đỏ trứng Ngoài ra, để phân lập được bào tử C difficile

từ các mẫu phân hay mẫu môi trường thì cần phải bổ sung thêm các chất

kích thích quá trình nảy mầm như cholate, taurocholate, glycocholate hay glycine[27, 147, 159].

3 2

1

Hình 1 1 Các dạng hình thái của C difficile [54]

1: tế bào sinh dưỡng; 2: tế bào sinh dưỡng có nội bào tử; 3: bào tử tự do

Đặc điểm khuẩn lạc C difficile có thể thay đổi tùy thuộc loại môi trường

nuôi cấy, từ dạng nhẵn đến ghồ ghề, từ màu vàng nhạt đến trắng đục, từ lồi đến dẹt,thường có rễ giả hoặc bờ không đều Trên môi trường phân lập chọn lọc CCMA,

khuẩn lạc C difficile có đặc điểm dẹt hoặc hơi lồi, bờ không đều, bề mặt thô ráp,

kích thước dao động từ 2-5mm, màu vàng do chuyển hóa mannitol (Hình 1 2)

Ngoài ra, có thể nhận biết khuẩn lạc C difficile bằng các đặc tính sau [36, 162]: có

mùi rất đặc trưng như mùi phân ngựa hay phân voi (dễ nhận ra mùi này từ đĩa cấychủng thuần); có khả năng phát huỳnh quang màu vàng xanh hoặc lục nhạt khichiếu tia UV với bước sóng 360 nm [4] (Hình 1 2)

Hình 1 2 Đặc điểm khuẩn lạc C difficile [4, 74]

quang màu vàng trên môi trường CCMA, màu lục nhạt trên môi trường AIA C perfringens không

mọc trên CCMA, B fragilis không phát huỳnh quang trên môi trường AIA.

1.2.1.4 Tính chất sinh hóa

C difficile lên men một số loại đường như: fructose, manitol, glucose;

không lên men đường arabinose, lactose, maltose, sucrose; thủy phân được gelatin,

không có lecithinase và lipase, phản ứng indol âm tính, thủy phân được esculin,phản ứng khử nitrate âm tính [154]

1.2.1.5 Sức đề kháng

C difficile có thể tồn tại ở dạng sinh dưỡng hoặc dạng bào tử Dạng sinh

dưỡng thường có mặt trong đường ruột của người và động vật, nhưng nhanh

chóng bị chết khi tiếp xúc với oxi không khí Ở dạng bào tử, C difficile có thể sống

sót rất lâu bên ngoài vật chủ, có sức đề kháng cao với các điều kiện khắc nghiệt,hơn 12 tháng trong môi trường khô hoặc không có khí [136], sống được trong môitrường axit [63]; đề kháng với nhiều chất tẩy trùng như: ethanol 95%, isopropylalcohol 70%, chlorhexidine gluconate, hydrogen peroxide 3%, các dung dịch dạngxịt chứa 65% ethanol và 0.6% hợp chất chứa ammonium, povidone iodine 10%[63]; có sức đề kháng trung bình với benzisothiazolinone và isothiazolin-benzalkonium chloride [101] Các chất tẩy trùng peroxide 10%, potassiumperoxymonosulphate, sodium hypochlorite 1% và sodium dichloroisocyanurate có

tác dụng tốt với bào tử C difficile [101].

1.2.2 Độc tố của C difficile

Các chủng C difficile gây bệnh có thể sản xuất 3 loại độc tố bao gồm độc tố

A (TcdA), B (TcdB) và độc tố kép (binary toxin CDT) Trong đó TcdA và TcdB làhai loại độc tố chính

1.2.2.1 Độc tố TcdA và TcdB

 Phân loại các chủng C difficile theo độc tố

Gần như tất cả các chủng C difficile gây bệnh trong tự nhiên đều sản xuất độc

tố TcdB, và hầu hết các chủng cũng sản xuất độc tố TcdA [153] Dựa vào sự có mặt

của các độc tố này, các chủng C difficile được phân thành các típ: A+B+, A-B+, A+B

-và A-B- Các chủng mang một trong hai độc tố TcdA hoặc TcdB hoặc cả hai

độc tố có khả năng gây bệnh, các chủng không sản xuất độc tố nào (A-B-) không cókhả năng gây bệnh Các độc tố A và B có thể được phát hiện trong phân bệnh nhân

bị nhiễm trùng do C difficile và là hai dấu ấn đầu tiên cho chẩn đoán nhiễm trùng

do C difficile [155] TcdA là độc tố ruột, TcdB có khả năng gây độc tế bào cao hơn

TcdA, gấp 10 lần trên tế bào biểu mô ruột của người và thậm chí 500-1000 lần trênmột số dòng tế bào khác [32].Trong những năm 1990, chủng A-B+ đã được xác

định gây ra các ca nhiễm trùng nghiêm trọng do C difficile, tuy nhiên chiếm tỉ lệ ít

hơn (0,14 -11%) so với chủng A+B+ [155]

 Cấu trúc của độc tố TcdA, TcdB

Các độc tố TcdA và TcdB được mã hóa bởi các gen tương ứng tcdA, tcdB nằm trong locus gây bệnh của C difficile (được gọi là đảo PaLoc) dài 19,6 kb (kilo

base) (Hình 1.3) [138] Ở những chủng không sản xuất độc tố (A-B-) vị trí PaLocđược thay thế bởi một trình tự ngắn gồm 115 bp [138]

Hình 1 3 Tổ chức gen trong locus gây bệnh của C difficile [138]

Đảo PaLoc dài 19,6 kb ở các chủng sinh độc tố (điển hình là chủng thuộc toxinotype 0) Trong đảo

PaLoc, ngoài hai gen tcdA và tcdB còn có các gen khác bao gồm tcdR, tcdC và tcdE Đoạn gen dài

115 bp thay thế đảo PaLoc ở những chủng không sinh độc tố

TcdA và TcdB có bản chất là chuỗi polypeptid, TcdA có 2710 gốc axit amin vớikhối lượng phân tử 308 kDa (kilodalton) và TcdB có 2366 gốc axit amin với khốilượng phân tử 270 kDa [32] Cả hai độc tố A và B đều là các glucosyltransferase, cócấu trúc gồm 4 domain: domain GT (N-terminal glucosyltransferase domain) có chức

năng glycosyl hóa các GTPase, nằm ở đầu amino; domain CPD (autocatalyticcysteine protease domain) thủy phân protein tại vị trí cystein; domain TMD (centraltranslocation domain) chuyển vị trí và domain RBD (receptor binding domain) bámvào thụ thể tế bào chủ, nằm ở đầu carboxyl (Hình 1.4) Cả 4 domain này đều có vaitrò tham gia vào quá trình xâm nhập của độc tố vào trong tế bào và glycosyl hóa cácGTPase trong bào tương của các tế bào ruột.

RBD

RBD

Chức năng: Glycosylate Cắt domain Chèn đầu N vào Bám vào tế bào

Rho GTPase GT khỏi độc tố màng endosome biểu mô

Vị trí hoạt động:Tế bào Tế bào Endosome Ngoại bào

receptor binding domain)

 Cơ chế hoạt động của độc tố TcdA và TcdB

Cơ chế hoạt động của các độc tố A và B được thể hiện ở Hình 1.5 Bước cóvai trò quyết định trong cơ chế này là chuyển vị trí của các domain, xảy ra khidomain RBD ở đầu C của độc tố tương tác với thụ thể là các phân tử carbohydratetrên bề mặt tế bào (ví dụ: αGal(1→3)bGal(1→4)βGlcNac glycan ở chuột) Sau đóGal(1→3)bGal(1→4)βGlcNac glycan ở chuột) Sau đóGlcNac glycan ở chuột) Sau đócác vùng trung tâm và đầu C của độc tố dễ dàng đi vào trong tế bào nhờ quá trình

nhập bào (endocytosis) qua trung gian thụ thể Nhờ pH thấp trong endosome, cácđộc tố bị thay đổi hình dạng làm cho domain TMD bị gấp nếp và chèn vào màngendosome, dẫn đến hình thành các kênh trên màng endosome mở đường chodomain GT đi qua Lúc này, các phân tử InsP6 (inositol hexakisphosphate) bám vàodomain CPD và kích hoạt phản ứng phân cắt nội phân tử giải phóng domain GT vàotrong bào tương Domain GT xúc tác phản ứng chuyển một phân tử glucose từ cơchất cho là UDP – glucose tới gốc threonine (Thr-37) của các protein Rho, Rac vàCdc42 trong các tế bào đích, khiến cho các protein này chuyển từ dạng hoạt độngsang trạng thái không hoạt động, do đó điều chỉnh một số quá trình sinh lý tế bàonhư làm gián đoạn quá trình hình thành khung xương tế bào và mất đi mối liên kếtchặt chẽ trong tế bào, do đó cấu trúc tế bào bị lỏng lẻo, các thành phần trong tế bàokhông liên kết với nhau như một thể thống nhất và cuối cùng làm chết tế bào [54,

136, 142] Tuy nhiên, tùy thuộc vào hiệu lực của CPD hoặc các chất ức chế quátrình tự phân cắt, sự phân cắt và giải phóng GTD bị giảm hoặc bị chặn lại, lúc nàydomain GTD của các độc tố vẫn bám vào màng của endosome Khi ở trạng thái gắnvới màng của endosome, GTD chỉ có thể tương tác và làm thay đổi một lượng nhỏcác Rho GTPases có mặt xung quanh nó Cả hai dạng GTD tự do và liên kết đềulàm bất hoạt Rho GTPases nhưng ở các bộ phận tế bào khác nhau thì mức độ hoạtđộng cũng khác nhau

Bên cạnh cơ chế gây bệnh lý tế bào ở trên, các độc tố TcdA và TcdB của C.

difficile có thể làm tổn thương các tế bào ruột nhờ cơ chế gây độc tế bào Bản thân

các độc tố hoặc các độc tố liên kết với các thành phần trung gian khác làm tổnthương ruột và viêm ruột bằng cách phá vỡ hàng rào bảo vệ biểu mô ruột, cảm ứngcác chất trung gian của quá trình tiền viêm và các cytokine, gây ra chết tế bào theochu trình hay hoại tử biểu mô và các tế bào miễn dịch, từ đó góp phần làm tổnthương mô [32, 136]

Axit hóa

Endosome

Hình 1 5 Cơ chế hoạt động của các độc tố TcdA và TcdB [108]

Các độc tố bám vào thụ thể trên các tế bào đích và được chuyển vào trong tế bào nhờ quá trình nhập bào Nhờ quá trình axit hóa trong endosome khiến domain TMD bị gấp nếp và chèn vào màng endosome, mở đường cho domain GT đi qua a) khi có mặt của InsP6 sẽ kích hoạt domain CPD xúc tác phản ứng phân cắt nội phân tử làm giải phóng domain GT vào trong bào tương Domain GT tự do xúc tác cho phản ứng glycosyl hóa, chuyển một phân tử gluco từ UDP-Gluco sang phân tử Rho, Rac, Cd42, do đó làm bất hoạt các protein này.b) trong trường hợp có mặt chất

ức chế hoặc hiệu lực domain CPD giảm domain GT không được cắt và vẫn bám vào màng của endosome Lúc này nó chỉ có hiệu lực đối với các phân tử Rho, Rac, Cd42 có mặt xung quanh nó.

1.2.2.2 Độc tố kép CDT

Khoảng 10% các chủng C difficile (bao gồm cả các chủng dịch tễ thuộc NAP1/

027) có sản xuất độc tố kép (CDT) song song với việc sản xuất độc tố TcdB và/ hoặcTcdA [136]; 6 – 30% các chủng A+B+ cũng sản xuất độc tố CDT; đặc biệt 2% cácchủng A-B- không gây ra tiêu chảy nhưng cũng sản xuất CDT và thường có

ở người lành mang C difficile [127] Gen mã hóa độc tố CDT được mã hóa trên vùng nhiễm sắc thể CdtLoc chứa hai gen cdtA và cdtB cấu tạo nên độc tố, và một gen điều hòa cdtR [121] Gen cdtA cấu tạo nên enzym ribosyltransferase ADP, gen

cdtB cấu tạo nên thành phần bám của độc tố.

Độc tố kép CDT thuộc về họ các độc tố giống như độc tố iota của vi khuẩn

Clostridia CDT có vai trò kích thích hình thành các cấu trúc nhỏ giống như các vi

ống có kích thước khoảng từ 5-100 µm nằm trên bề mặt tế bào biểu mô ruột, do đólàm tăng độ bám dính của vi khuẩn với tế bào biểu mô ruột [142], tạo điều kiện cho

vi khuẩn nhân lên mạnh mẽ hơn và quá trình nhiễm trùng cũng diễn ra nặng nề hơn

Những bệnh nhân bị nhiễm C difficile sản xuất cả độc tố CDT song song với các độc tố A và B có tỉ lệ tử vong cao hơn 60% so với những bệnh nhân bị nhiễm C.

difficile chỉ sản xuất các độc tố A và hoặc B [18].

1.2.3 Cơ chế gây bệnh

C difficile được truyền vào cơ thể qua đường phân - miệng và gây bệnh khi

có sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột chủ yếu do liệu pháp điều trị kháng sinh Các

dạng tế bào sinh dưỡng và bào tử của C difficile đi vào cơ thể qua đường miệng.

Tuy nhiên hầu hết các tế bào sinh dưỡng bị chết bởi axit trong dạ dày, chỉ 1% mầm

bệnh đi vào ruột non do bào tử của C difficile có khả năng kháng axit Các bào tử

nảy mầm trong ruột non khi tiếp xúc với axit mật Một số yếu tố độc lực, bao gồmđộc tố, lông, roi, SLPs (protein lớp bề mặt), protein thành tế bào Cwp66, Cwp84 và

các enzym thủy phân được sản xuất bởi C difficile đóng vai trò trong quá trình phát

triển bệnh Trong đó, yếu tố độc lực đặc trưng nhất và quan trọng nhất là các độc tốTcdA và TcdB

Nhờ cơ chế gây độc và gây bệnh lý tế bào, các độc tố của C difficile tác

động nhanh chóng đến tế bào biểu mô ruột làm mất đi sự liên kết chặt chẽ giữa các

tế bào, các tế bào tách rời nhau và gây hoại tử tế bào để tạo ra các lỗ thủng trong lớpnhầy bảo vệ Khi hàng rào biểu mô bị thủng, TcdA, TcdB và các protein khác tiếpxúc với các đại thực bào dưới niêm mạc, bạch cầu đơn nhân và kích hoạt phản ứngviêm bằng cách kích thích giải phóng cytokine tiền viêm IL-1, IL-1, IL-6, IL-8

và yếu tố hoại tử khối u  Sự phân hủy tế bào mast sẽ giải phóng histamine qua đólàm tăng tính thấm của mạch máu dẫn đến mất nước vào khoang ruột và gây tiêuchảy phân lỏng Triệu chứng lâm sàng phản ánh các phản ứng viêm nhiễm bao gồm

số lượng bạch cầu tăng cao và sốt, tiêu chảy nặng có thể dẫn đến đau bụng, mấtnước Khi các tế bào biểu mô ruột bị tổn thương nặng sẽ hình thành giả mạc, baogồm các mảnh vỡ tế bào do bị hoại tử, fibrin, dịch nhầy, bạch cầu trung tính và các

tế bào đa nhân khác Trong trường hợp bệnh nặng hơn, phức tạp hơn, bệnh nhân cóthể bị chướng phình bụng, tắc ruột, loét đại tràng ở các lớp mô dưới có thể dẫn đếnthủng ruột, nhiễm trùng huyết và tử vong Quá trình chuyển đổi từ một phản ứngviêm ở bộ phận niêm mạc đến phản ứng toàn thân dẫn đến hội chứng bệnh lý, baogồm tăng creatinine huyết thanh, suy thận, suy hô hấp cấp tính, và rối loạn chứcnăng của nhiều nội tạng [144]

1.2.4 Các bệnh do C difficile gây ra

Vi khuẩn C difficile được miêu tả đầu tiên vào năm 1935 là một loài thuộc

hệ vi khuẩn chí nhưng với số lượng thấp ở trẻ khoẻ mạnh và không được coi là căn

nguyên gây bệnh Đến năm 1978, lần đầu tiên C difficile được biết có khả năng gây

bệnh khi nó được xác định là căn nguyên gây viêm đại tràng giả mạc [73] Các thể

lâm sàng của nhiễm trùng do C difficile dao động từ tiêu chảy nhẹ đến các thể viêm

nặng có thể gây tử vong, đặc điểm của các thể này như sau [118]:

 Tiêu chảy nhẹ đến vừa: là thể lâm sàng phổ biến nhất của nhiễm trùng do

C difficile Bệnh nhân có thể đau bụng, tiêu chảy không có máu, ruột không bị tổn

thương

 Viêm không hình thành giả mạc: bệnh nhân có các triệu chứng như sốt,khó chịu, tiêu chảy nhiều, phân có thể dính máu, đau bụng từ vừa đến dữ dội Bạch cầutăng và đây có thể là tiêu chí để chẩn đoán Không hình thành giả mạc.

 Viêm đại tràng giả mạc: bệnh nhân có các triệu chứng đau bụng, sốt, tiêuchảy nghiêm trọng, phân có thể có máu Bạch cầu tăng cao, có hình thành giả mạc (Hình1.6 a), đây có thể là dấu hiệu để chẩn đoán

 Đau bụng cấp với hội chứng nhiễm trùng huyết: Hiếm khi C difficile gây

ra hội chứng nhiễm trùng huyết với các triệu chứng: sốt, hạ huyết áp, đaubụng cấp, chướng phình bụng, tắc ruột nhưng không tiêu chảy, ruột bịgiãn, có thể tràn dịch màng phổi và màng bụng lớn Chẩn đoán phân biệt

là thủng ruột Bạch cầu có thể lên đến 20x109/l Viêm tối cấp có thể xảy

ra ở 3-8% bệnh nhân nhiễm trùng do C difficile [67] Một trong những

biến chứng của viêm tối cấp là phình đại tràng nhiễm độc (toxicmegacolon) Toxic megacolon được chẩn đoán dựa trên triệu chứngphình ruột (>7cm) kèm theo nhiễm độc toàn thân (Hình 1.6 b)

Hình 1 6 Các thể nhiễm trùng do C difficile

(Nguồn: http://www.umm.edu/patiented/articles/toxic_megacolon_000215.htm ) a) Viêm đại tràng giả mạc qua hình ảnh nội soi b) Toxic megacolon với biểu hiện phình ruột,

chướng bụng

25

1.2.5 Các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng do C difficile

Yếu tố nguy cơ quan trọng hàng đầu trong nhiễm trùng do C difficile là việc

tiếp xúc với các chất kháng khuẩn, điển hình là kháng sinh [36] Việc sử dụng bất

kỳ kháng sinh nào, phổ rộng hay hẹp, thời gian dài hay ngắn, một loại hay kết hợpnhiều loại kháng sinh đều làm rối loạn hệ vi khuẩn chí đường ruột, có thể dẫn đến

sự nhân lên của C difficile nội sinh (có sẵn trong đường ruột) hoặc ngoại sinh (lây nhiễm bào tử C difficile từ môi trường bên ngoài) Các kháng sinh clindamycine,

cephalosporins (đặc biệt là thế hệ 3) và peniciline phổ rộng (đặc biệt là

amoxicillin-clavulanate) là những kháng sinh phổ biến nhất liên quan đến tiêu chảy do C.

difficile [21, 73] Các kháng sinh ít phổ biến hơn là macrolide, quinolone,

tetracyline; các kháng sinh hiếm khi gây tiêu chảy do C difficile là metronidazole, vancomycin [73] Hầu hết các ca tiêu chảy liên quan đến C difficile xảy ra ở ngày

thứ 4-9 sau khi ngừng điều trị kháng sinh, tuy nhiên cũng có thể xảy ra ở tuần thứ 8sau khi ngừng sử dụng thuốc kháng sinh [67]

Bên cạnh yếu tố dùng kháng sinh, tuổi cao đặc biệt trên 65 tuổi cũng được

xếp vào nhóm nguy cơ hàng đầu cho nhiễm trùng do C difficile Tại Mỹ, số ca tử vong do C difficile không chỉ tăng theo các năm (từ 793 trong năm 1999 lên 7251

trong năm 2009), mà cũng tăng theo nhóm tuổi, từ 5% ở nhóm tuổi 61-70 lên 10% ở

nhóm tuổi >80 [82] Trong năm 2010, có 91% số ca tử vong vì nhiễm trùng do C.

difficile xảy ra ở những người trên 65 tuổi, điều này khiến C difficile trở thành

nguyên nhân gây tử vong thứ 18 trong nhóm tuổi này ở Mỹ [82]

Bệnh viện không chỉ là ổ chứa mà còn là một vector truyền bào tử C.

difficile Những bệnh nhân bị nhiễm trùng do C difficile là nguồn lây lan C difficile

chính trong các cơ sở chăm sóc y tế Bào tử C difficile được thải ra ngoài môi

trường qua phân của những bệnh nhân này, sau đó được truyền đến bệnh nhân khácqua bàn tay của nhân viên y tế hay do tiếp xúc với các bề mặt trong bệnh viện nhưdụng cụ y tế, giường, ghế, tay vịn cầu thang, bồn vệ sinh, … Các nghiên cứu cho

thấy 25-30% nhân viên y tế mang bào tử C difficile [118], 30% các bề mặt trong bệnh viện có bào tử C difficile [149].

Nhóm nguy cơ thứ hai bao gồm các yếu tố như: sử dụng thuốc giảm axit dạdày, đặt ống thông mũi, thực quản, hút thuốc lá hoặc các bệnh lý kèm theo Đặt ống

sông thức ăn, ống thông mũi làm tăng nguy cơ nhiễm trùng C difficile gấp 3 lần, sử

dụng chất ức chế axit dạ dày bằng các chất ức chế bơm proton đều làm tăng nguy cơ

cho nhiễm trùng do C difficile [149].

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.3.1 Trên thế giới

1.3.1.1 Tình hình nhiễm trùng do C difficile

C difficile đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng phổ biến ở các nước

phương Tây trong gần hai thập kỉ qua Ở Mỹ, C difficile là nguyên nhân hàng đầu

gây ra các ca tử vong do viêm dạ dày ruột, gần một nửa triệu các ca nhiễm trùng,ước tính 14000 ca tử vong trong năm 2007, 29000 ca trong năm 2011 và tăng lên

44500 ca trong năm 2014 [41, 61, 105] Năm 2008, có đến 93% số ca tử vong do

nhiễm trùng do C difficile ở những bệnh nhân trên 65 tuổi [119] C difficile là

nguyên nhân phổ biến nhất gây ra nhiễm trùng bệnh viện và chi phí chăm sóc sức

khỏe liên quan đến nhiễm trùng do C difficile lên đến 4,8 tỉ đô la Mỹ trong năm

2008; 5,4 tỉ đô la trong năm 2014 [41, 46] Theo CDC (trung tâm kiểm soát vàphòng chống bệnh tật Hoa Kỳ), trong 20 bệnh nhân nằm viện sẽ có 1 bệnh nhânmắc phải nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế và trong khi nhiễm trùng liên

quan đến chăm sóc y tế bởi MRSA (S aureus kháng methicillin) đang giảm thì tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile tiếp tục tăng lên nhanh chóng; cứ 5 bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện do C difficile sẽ có 1 bệnh nhân bị tái nhiễm trùng; cứ 9 bệnh nhân trên 65 tuổi bị nhiễm trùng bệnh viện do C difficile sẽ có 1 bệnh nhân tử vong trong

vòng 30 ngày sau khi chẩn đoán [58]

Ở Canada, trong năm 2012 có tổng số 37.932 ca nhiễm trùng do C difficile,

trong đó 20.002 ca nhiễm trùng ở bệnh viện; 16.326 ca nhiễm trùng ở cộng đồng và

1.604 ca trong các cơ sở chăm sóc dài hạn Trong đó, 73% là các ca nhiễm mới,

27% là các ca tái nhiễm Tỉ lệ nhiễm trùng C difficile cao nhất ở Quebec, tiếp đến là

Ontario, British Columbia và Alberta [107] Ở Quebec, hàng năm ước tính khoảng

3.700 ca nhiễm trùng bệnh viện do C difficile trong giai đoạn từ năm 2010 - 2013

[111]

Ở Đông Âu, tỉ lệ nhiễm trùng bệnh viện do C difficile là 21/1000 (2,1%)

bệnh nhân nhập viện vì tất cả nguyên nhân Tỉ lệ này cao nhất ở nhóm bệnh nhântrên 60 tuổi, chiếm 83,4%; 40-60 tuổi là 11,9% và nhỏ hơn 40 tuổi là 4,7% [99]

Ở Anh và các nước lân cận, nhiễm trùng do C difficile gia tăng liên tục suốt

từ thập niên 90 đến đầu năm 2000 Từ 2007 đến 2010, tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile giảm 61% [158].

Trong khi nhiễm trùng do C difficile nổi lên như bệnh dịch chính ở các nước Bắc Mỹ và Châu Âu trong hơn thập kỷ qua, nhận thức về nhiễm trùng do C difficile

ở Châu Á còn rất hạn chế [37] Trong những năm gần đây, C difficile được báo cáo

là tác nhân truyền nhiễm mới nổi của các nước Nhật Bản, Trung quốc, Singapore, HànQuốc và Thái Lan

Ở Hàn Quốc, số lượng bệnh nhân nhiễm trùng do C difficile tăng từ 700

trong năm 2008 lên 1.177 ca trong năm 2009; 1.714 trong năm 2010 và 2.521 trong

năm 2011 Tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile ở nhóm bệnh nhân trên 65 tuổi là 61,7%

trong năm 2008; 59,5% năm 2009; 66,3% năm 2010 và 67% năm 2011 Số ca tử

vong liên quan đến nhiễm trùng do C difficile tăng 2,5 lần trong 3 năm, từ 69 ca

trong năm 2008 lên 172 ca trong năm 2011 Trong đó, số ca tử vong ở nhóm nữ giớichiếm 62% Gánh nặng kinh tế ước tính 2,4 triệu đô la trong năm 2008 tăng lên 7,6triệu đô la (tăng 3,12 lần) trong năm 2009; 10,5 triệu đô la (tăng 4,28 lần) trong năm2010; và 15,8 triệu đô la (tăng 6,45 lần) trong năm 2011 [35]

Ở Trung Quốc, tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile tại một bệnh viện ở Thượng

Hải là 17,1/ 10.000 dân trong năm 2007 - 2008 Các ribotype phổ biến là 017, 012

và 046 [37]

1.3.1.2 Dịch tễ học phân tử của các chủng C difficile gây bệnh

Nghiên cứu mối liên quan giữa thể lâm sàng và đặc điểm kiểu gen của các

chủng C difficile gây bệnh cho thấy một số chủng vi khuẩn có xu hướng gây bệnh

cảnh nặng nề và là căn nguyên lưu hành trong các vụ dịch, đại dịch, như típ vi

khuẩn C difficile BI/NAP1/027 gây đại dịch ở Mỹ và châu Âu [20, 59, 60] Trong năm 2005, 30 bệnh viện ở Quebec báo cáo tỉ lệ tiêu chảy bệnh viện do C difficile

tăng gấp 5 lần so với các năm trước đó, chi phí ước tính lên đến 13,7 tỉ Euro [97]

Nguyên nhân được xác định là do xuất hiện biến chủng độc lực cao C difficile

ribotype 027 [97] Năm 2006, típ độc lực cao này đã lan rộng ra 7 tỉnh của Canada,

tỉ lệ nhiễm và tử vong cao nhất ở Quebec lần lượt là 13/1000 bệnh nhân nhập viện

và 7,9% [48] Típ độc lực cao này cũng gây ra nhiều vụ dịch ở 11 bang của Mỹ

trong giai đoạn đầu những năm 2000 [97] Ở Anh, tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile tăng từ 4/10.000 bệnh nhân nhập viện trong năm 2004 đến 83/10.000 trong năm

2005, tỉ lệ tử vong trong một vụ dịch năm 2005 là 22% (19/85 bệnh nhân) [97] Ở

Bồ Đào Nha, vụ dịch do C difficile ribotype 027 đầu tiên đã được báo cáo bởi

Oleastro, chiếm 72,7% các chủng phân lập [128] Nhìn chung, các vụ dịch liên quanđến típ độc lực cao ribotype 027 đều có tỉ lệ nhiễm và tử vong cao hơn, tăng mức độnghiêm trọng của bệnh, đáp ứng kém với liệu pháp điều trị trước đó và tỉ lệ tái phátcao [40]

Kết quả khảo sát dịch tễ học phân tử nhiễm trùng do C difficile ở Anh cho

thấy có sự thay đổi đáng kể sự lưu hành của các típ gây bệnh Từ năm 2007 đến

2011 C difficile ribotype 027 là căn nguyên chủ yếu của các vụ dịch, tuy nhiên lại

có xu hướng giảm dần từ năm 2012- 2015 Thậm chí một số vùng đông nam vàđông bắc, típ này gần như không còn xuất hiện [28, 50] Bên cạnh đó, xuất hiện cácribotype mới nổi như 078, 002, 005, 014, 015 [127][115], 176 và 198 [28, 50](Hình 1.7) Ribotype 078 gây ra các vụ dịch ở Bắc Ireland, lưu hành phổ biến ở

Netherland và Scotland Điểm đặc biệt là chủng thuộc típ ribotype 078 cũng đượcphân lập từ một số loài động vật, tuy nhiên chưa có bằng chứng xác định mối liênquan giữa nguồn thực phẩm này với các ca nhiễm trùng ở người [50] Hai ribotype

176 và 198 có nhiều đặc điểm giống với ribotype 027, và cả ba ribotype này đềuđược phân loại trong một cụm theo phương pháp phân loại trình tự đa locus(Multiple Locus Sequence Typing – MLST) [28] Điều này gợi ý rằng có sự đồngtiến hóa trong các ribotype này

Hình 1 7 Tỉ lệ các ribotype ở Anh từ năm 2007 đến 2013 [115]

Mặc dù ribotype 027 và 078 gây ra các vụ dịch lớn ở Bắc Mỹ và châu Âunhưng lại hiếm gặp ở châu Á [37] Trong khi đó, các biến chủng A-B+ thuộcribotype 017 được xác định là nguyên nhân gây ra các vụ dịch ở Trung Quốc [37],Hàn Quốc [94], Thái Lan [135] Hay ribotype smz (mới được xác định là ribotype

018 theo phương pháp phân loại ở châu Âu) là típ gây bệnh phổ biến ở Nhật Bảntrong hơn thập kỷ qua và gần đây đã xuất hiện ở Hàn Quốc, Áo, Tây Ban Nha vàSlovenia [37] Sự phân bố các ribotype ở một số quốc gia theo các năm được tổnghợp trong Bảng 1.2

Bảng 1 2 Các ribotype phổ biến ở một số nước trên thế giới

Anh

2007 - 2011 027, 001, 106

[50] [28]2012-2015 002, 005, 014, 015, 078

Bỉ

[53]2012-2014 014, 020

Như vậy, có thể thấy C difficile là tác nhân gây bệnh phổ biến ở các châu

lục Đặc biệt ở các nước phương Tây, nhiều nước đã hình thành mạng lưới giám

sát quốc gia và liên quốc gia về nhiễm trùng do C difficile như ở Anh và các nước

lân cận, các nước Bắc Mỹ Các ribotype độc lực cao có khả năng lưu hành rộng vàgây ra các vụ dịch lớn ở Châu Âu và Châu Mỹ như 027, 078, 014; ở Châu Á là 017,018

1.3.2 Trong nước

Kết quả tìm hiểu các nghiên cứu công bố trên thế giới cho thấy chỉ có mộtvài nghiên cứu của Vu Nguyen và cộng sự tập trung vào 2 loại vi khuẩn

Bacteroides fragilis và Clostridium perfringens [125, 126] Các nghiên cứu công bố

trong nước về nhóm vi khuẩn kị khí chủ yếu tập trung vào loài C perfringens và

trên đối tượng nghiên cứu chủ yếu là động vật và mẫu môi trường [3, 9]

31

 Nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí thường tốn kém, đòi hỏi môi trường nuôi cấynhiều dinh dưỡng và điều kiện khí đặc biệt không chứa oxy Điều này làm tăng chi phícho các xét nghiệm vi khuẩn kỵ khí.

 Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí thường phức tạp Đặc biệt đối với một số vi

khuẩn kỵ khí tuyệt đối như C difficile, việc phơi nhiễm lâu với môi trường không khí chứa

oxy sẽ gây chết vi khuẩn và nuôi cấy không thành công Do đó, thao tác nuôi cấy phải rấtnhanh chóng Nếu sử dụng hệ thống tủ nuôi cấy

kỵ khí mà không bảo dưỡng và kiểm soát chất lượng khí thường xuyên có thể là một nguyên nhân dẫn đến thất bại khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí

 Thiếu các bằng chứng vi khuẩn học từ bệnh phẩm lâm sàng nên không khẳngđịnh được vai trò gây bệnh quan trọng của nhóm vi khuẩn kỵ khí Điều này làm hạn chế

sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng cũng như toàn xã hội

Với thực trạng lạm dụng kháng sinh, môi trường bệnh viện luôn trong tìnhtrạng quá tải và các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện kém hiệu quả ở

nước ta gợi ý rằng tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile có thể ở mức khá cao tại các

bệnh viện Từ năm 2012, phòng Vi khuẩn Kỵ khí, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

là đơn vị tiên phong nghiên cứu về nhiễm trùng do C difficile ở Việt Nam Những

bằng chứng lâm sàng và xét nghiệm vi sinh đầu tiên về các ca bệnh tiêu chảy sau

dùng kháng sinh và viêm đại tràng giả mạc do C difficile đã được ghi nhận tại một

số bệnh viện ở Hà Nội [2, 4]

Năm 2014, nhóm nghiên cứu Vi khuẩn kỵ khí, viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

đã xây dựng thành công phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile mang gen độc tố (nuôi cấy) gồm 2 bước cho chẩn đoán nhiễm trùng do C difficile với mã phương pháp

là QT-VKKK-05. Bước 1 là quy trình nuôi cấy phân lập C difficile từ mẫu bệnh phẩm phân trên môi trường CCMA và bước 2 là quy trình PCR đa mồi phát hiện vi khuẩn C.

difficile, gen sinh độc tố A, B và cho phép phân loại 3 dòng vi khuẩn C difficile A+B+,

A-B+ và A-B- Môi trường CCMA được đánh giá có khả năng phân lập C difficile cao

gấp 9 lần so với môi trường CCFA [74], phương pháp PCR đa mồi có độ nhạy là 50 vikhuẩn/ 1 phản ứng, độ đặc hiệu 100% Ứng dụng

phương pháp này trên 100 mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy sau dùng kháng sinh

tại bệnh viện Bạch Mai cho thấy tỉ lệ nhiễm trùng do C difficile là 14%.

Năm 2015, phương pháp nested PCR phát hiện gen sinh độc tố A với mãphương pháp là QT-VK-5.5.4.3 được phát triển để xác định C difficile mang gen

độc tố trực tiếp từ phân, và áp dụng trên 115 mẫu phân từ những bệnh nhân tiêuchảy sau dùng kháng sinh tại bệnh viện Bạch Mai Kết quả cho thấy, phương phápnested PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu lý thuyết trên các chủng vi khuẩn là 100%;trên mẫu lâm sàng có độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự đoán dương tính, giá trị dựđoán âm tính lần lượt là 95%, 92,6%, 73,1% và 98,9% (so với phương pháp nuôi

cấy); tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố theo nested PCR là 22,6% [5].

Năm 2016, một luận văn cao học thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung

ương đã báo cáo tỉ lệ C difficile mang và không mang gen độc tố bằng phương

pháp nuôi cấy là 22,7% trên 154 mẫu phân từ các bệnh nhân ≥ 5 tuổi có triệu chứngtiêu chảy sau dùng kháng sinh từ 3 bệnh viện Bạch Mai, Bệnh Nhiệt Đới Trungương, Đống Đa, trong thời gian từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2015 Trong đó, tỉ lệ

chủng C difficile A+B+ là 6,5%, chủng C difficile A-B+ là 10,4%

Như vậy, trong vài năm gần đây, một số ít nghiên cứu trong nước đã đưa ra

được quy trình xét nghiệm 2 bước cho chẩn đoán nhiễm trùng do C difficile, báo cáo các ca bệnh điển hình, tỉ lệ nhiễm C difficile Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy 2 bước cho chẩn đoán C difficile đòi hỏi nhiều thời gian, điều kiện cũng như chi phí tốn kém

trong nuôi cấy phân lập và xác định gen sinh độc tố từ chủng phân lập Do vậy,phương pháp này chưa thích hợp là phương pháp chẩn đoán áp dụng thường quy tạicác phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng trong các bệnh viện Ngoài ra, một trong cácyếu tố quyết định nuôi cấy phân lập thành công là môi trường phân lập Trong khi đó,môi trường phân lập CCMA được sử dụng tại phòng vi khuẩn kỵ khí chưa được đánhgiá hiệu năng và giới hạn phát hiện Phương pháp nested PCR được cho là có độ nhạycao hơn so với nuôi cấy, tuy nhiên cần phải đánh giá trên số lượng mẫu lớn hơn Hơn

nữa, số lượng các nghiên cứu báo cáo về tỉ lệ nhiễm C difficile vẫn còn hạn chế và trên lượng mẫu nhỏ, do đó chưa làm rõ tình hình nhiễm

C difficile ở khu vực đô thị, chưa làm rõ được vai trò gây bệnh của vi khuẩn này.

Đặc biệt, chưa có một công trình nào nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử

của các chủng C difficile gây bệnh ở nước ta Vì vây, trong khuôn khổ chương

trình hợp tác nghiên cứu giữa Viện Vệ sinh Dich tễ Trung ương, Viện Truyềnnhiễm quốc gia Nhật bản, và một số bệnh viện tại Hà Nội, nghiên cứu này đượcthực hiện nhằm 2 mục tiêu chính:

1) Xác định được tỉ lệ nhiễm C difficile mang gen độc tố ở bệnh nhân tiêu

chảy sau dùng kháng sinh

Trong mục tiêu này, nghiên cứu thực hiện các nội dung sau: Một là đánh giá

hiệu năng, giới hạn phát hiện của môi trường CCMA Kết quả này làm tăng

độ tin cậy cho phương pháp nuôi cấy Hai là mỗi mẫu phân được xét nghiệm đồng thời bằng hai phương pháp nuôi cấy C difficile MGĐT và

nested PCR Kết quả của xét nghiệm song song này sẽ xác định được tỉ lệ

nhiễm C difficile mang gen độc tố, đồng thời so sánh phương pháp nested PCR với phương pháp nuôi cấy để cung cấp cơ sở chứng minh phương pháp

nested PCR có thể áp dụng thường quy tại các phòng xét nghiệm vi sinh lâmsàng ở nước ta

2) Phân tích được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng C

difficile mang gen độc tố

Để thực hiện mục tiêu này, mỗi chủng C difficile mang gen độc tố phân lập

từ phân sẽ được phân loại phân tử bằng hai phương pháp PCR ribotyping vàslpAST

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM TRÙNG DO Clostridium

difficile

Theo Hiệp hội dịch tễ học và các bệnh truyền nhiễm của Mỹ (SDEA/ IDSA),

một ca bệnh được chẩn đoán là nhiễm trùng do C difficile dựa trên tổ hợp bằng

chứng về lâm sàng và kết quả xét nghiệm bao gồm: có hiện tượng tiêu chảy 3 lần

hoặc nhiều hơn trong 24 giờ và kết quả xét nghiệm mẫu phân có độc tố hoặc C.

difficile sinh độc tố, hoặc có bằng chứng viêm đại tràng giả mạc qua hình ảnh nội

soi hoặc giải phẫu bệnh [36] Dưới đây là các phương pháp thường được sử dụng

để chẩn đoán nhiễm trùng do C difficile.

1.4.1 Phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố

Phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile sinh độc tố gồm hai bước: nuôi cấy phân lập C difficile từ bệnh phẩm sau đó xác định chủng sinh độc tố.

1.4.1.1 Nuôi cấy phân lập C difficile từ bệnh phẩm

Có nhiều phương pháp nuôi cấy phân lập C difficile từ phân Nguyên lý

chung của các phương pháp này là nuôi cấy mẫu phân hoặc mẫu tăm bông trựctràng trên môi trường rắn hoặc môi trường lỏng có bổ sung các chất ức chế sự sinhtrưởng của các vi khuẩn đường ruột khác đồng thời tăng khả năng nảy mầm của

bào tử C difficile Một số nghiên cứu cho rằng việc xử lý mẫu bằng sốc nhiệt hoặc sốc cồn trước khi cấy có hiệu quả phân lập C difficile tốt hơn [28] Hink và cộng sự

đã chứng minh phương pháp nhạy nhất để phát hiện C difficile từ mẫu phân và tăm

bông trực tràng là sốc nhiệt ở 80oC trước khi cấy vào canh thang cycloserine –cefoxitin manitol broth, sau đó cấy phân lập trên môi trường thạch không chọn lọc[66] Tuy nhiên, hai yếu tố chính quyết định thành công trong nuôi cấy phân lập C

difficile là môi trường nuôi cấy phân lập và kỹ thuật ủ.

− Môi trường nuôi cấy phân lập C difficile

Môi trường nuôi cấy phân lập C difficile đòi hỏi nhiều chất dinh dưỡng, bổ

sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn này như Hemin,Vitamin K, máu ngựa hoặc cừu và các kháng sinh cefoxitin, cycloserine có khả năng ứcchế sự sinh trưởng của vi khuẩn khác trong phân Ngoài ra để tăng cường hoạt tính nảy

mầm của các bào tử C difficile, cần bổ sung các chất kích thích nảy mầm như sodium

taurocholate, cholate, glycocholate, glycine [27, 147, 159] Hiện nay, có nhiều môi

trường khác nhau dùng để nuôi cấy phân lập C difficile như: CCEY

(cycloserin-cefoxitine- egg york agar), CCEYL (cycloserin- (cycloserin-cefoxitine- egg york-lysozym agar),CCFA (Cefoxitin-Cycloserine Fructose Agar), CCMA (Cefoxitin-Cycloserine MannitolAgar) Hai môi trường CCEY và CCEYL không chọn lọc