Phân Lập Vi Khuẩn Pseudomonas Từ Đất Vùng Rễ Cây Sài Đất [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]

Kiểm tra khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đã phân lập .... Khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập .... Bảng tổng

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN Pseudomonas TỪ ĐẤT VÙNG

RỄ CÂY SÀI ĐẤT [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]

MSSV: 3064473

LỚP: CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGs Ts Cao Ngọc Điệp Ngô Yến Phương DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học này, ngoài sự cố gắng của bản thân,

tôi còn nhận được sự hướng dẫn, ủng hộ, giúp đỡ của rất nhiều người

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học-trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32, đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học và thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm vi sinh vật của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài

Xin cảm ơn ba mẹ đã động viên, khuyến khích, hỗ trợ cho tôi học tập và hoàn thành tốt đề tài

Cảm ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32 đã luôn cổ vũ và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin kính chúc quý thầy cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khoẻ và công tác tốt

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

Ngô Yến Phương

TÓM TẮT

Cây sài đất (Wedelia chinensis (Osb.) Merr.) là cây thuộc họ Cúc rất phổ biến trong tự nhiên Đây là dạng cây thân thảo, có khả năng sinh trưởng rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại đất, thường được trồng để tạo cảnh quan Ngoài ra sài đất còn được sử dụng như một loại thuốc Đông y để trị cảm mạo, sốt, viêm họng, viêm phế quản phổi, mụn nhọt… Hai mươi tám dòng (chủng) vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ của cây sài đất thu từ 4 tỉnh: An Giang, Bạc Liêu, Đồng tháp, Vĩnh Long, trên môi trường Pseudomonas isolation agar Tất cả 28 chủng đều không có khả năng cố định đạm Tuy nhiên, tất cả chúng đều có khả năng hòa tan lân khó tan Trong đó, 2 chủng BL2a và AG2a là tốt nhất với lượng lân hòa tan được lần lượt là 378,73 mg/lít

và 355,09 mg/lít, có tiềm năng cao trong việc ứng dụng để sản xuất phân lân sinh học

Từ khóa: cây sài đất, hòa tan lân, phân lập, Pseudomonas, vi khuẩn vùng rễ

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 1 Cây sài đất 2 2 Vi khuẩn Pseudomonas 3 2 Vi khuẩn Pseudomonas 3 3 Vi khuẩn cố định đạm 4 3.1 Vai trò của Nitơ 4

3.2 Quá trình cố định Nitơ (Nitrogen fixation) 5

3.3 Vi khuẩn cố định đạm 5

4 Vi khuẩn hòa tan lân 7 4.1 Vai trò của lân (P) 7

4.2 Chu trình P 7

4.3 Vi khuẩn hòa tan P 8

5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas cố định đạm và hòa tan lân trên thế giới và ở Việt Nam 9 5.1 Trên thế giới 9

5.2 Tại Việt Nam 10

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 1.Phương tiện nghiên cứu 12 1.1 Dụng cụ thiết bị 12

1.2 Vật liệu 14

1.3 Hóa chất 14

2 Phương pháp 14 2.1.Thời gian và địa điểm 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Thu mẫu 15

2.2.2 Phân lập vi khuẩn 15

2.2.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 16

2.2.4 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 16

2.2.5 Kiểm tra khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đã phân lập 16

2.2.6 Chọn lọc các dòng vi khuẩn hòa tan lân tốt nhất 17

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 19 1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập 19 1.1 Phân lập vi khuẩn 19

1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn 20

1.2.1 Đặc điểm của tế bào vi khuẩn 21

1.2.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 21

2 Khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

2.1 Kiểm tra khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn trên môi trường đặc 24

2.2 Kết quả đo khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập 25 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

1 Kết luận 28 2 Đề nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Môi trường Pseudomonas isolation agar 14

Bảng 2: Môi trường lỏng King B 14

Bảng 3: Môi trường Burk không đạm 14

Bảng 4: Môi trường NBRIP 14

Bảng 5 Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 19

Bảng 6 Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đã phân lập 20

Bảng 7 Tỷ lệ (%) các đặc điểm của các vi khuẩn đã phân lập 21

Bảng 8 Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập 22

Bảng 9 Bảng tổng hợp kết quả kiểm tra khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24 Bảng 10 Kết quả đo khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn đã phân lập26

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Cây sài đất Wedelia chinensis (Osb.) Merr .2

Hình 2: Các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm 13

Hình 3 Sơ đồ các bước xác định khả năng hòa tan lân khó tan 18

Hình 4 Vi khuẩn phát triển làm biến đổi màu môi trường phân lập 20

Hình 5 Đặc điểm của một số dạng khuẩn lạc đã phân lập 23

Hình 6 Phản ứng màu của lượng lân hòa tan với thuốc thử Oniani 25

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Cúc là loài thực vật hạt kín, hai lá mầm, có khoảng 350 loài, được trồng phổ biến ở nước ta Các loài cây thuộc họ cúc có rất nhiều công dụng khác nhau như trồng làm kiểng, làm thuốc, làm rau ăn… Ngoài ra, một số cây trong họ cúc còn có khả năng

cải tạo đất, cụ thể là cây Sài Đất (tên khoa học Wedelia chinensis (Osb.) Merr.) Đây là

dạng cây thân thảo, có khả năng sinh trưởng rất mạnh ở hầu hết tất cả các loại đất, thường được trồng lấn cỏ ở những diện tích khá rộng nhằm tạo cảnh quan đẹp mắt Tuy nhiên, tiềm năng lớn mạnh của cây sài đất chính là khả năng cố định đạm và hòa tan lân của một số dòng vi khuẩn ở vùng rễ Trong số các dòng vi khuẩn cố định đạm này thìPseudomonas là loài có triển vọng to lớn về số lượng dòng và khả năng cố định

đạm

Lượng Nitơ tự do tồn tại trong không khí là rất lớn (khoảng 80%) nhưng cây xanh hầu như không tận dụng được Chính nhờ vào các dòng vi khuẩn cố định đạm ở vùng rễ mà lượng Nitơ khổng lồ này sẽ được chuyển hóa thành dạng đạm dễ tiêu cho cây xanh và làm giàu đạm cho đất Việc sử dụng các dòng vi khuẩn cố định đạm để bổ sung lượng đạm cho đất có nhiều ưu thế hơn bón phân hóa học do hạn chế được sự tạo thành của hai loại khí thải CO2 và NO2 trong quá trình sản xuất và sử dụng

Bên cạnh Nitơ, lân (P) cũng đóng vai trò quan trọng đối với dinh dưỡng cây trồng P là thành phần cấu tạo của tế bào, liên quan đến sự tổng hợp và giải phóng năng lượng trong quá trình thành lập tế bào (Alexander, 1977) Từ xưa, nguồn bổ sung

P chủ yếu cho đất thường là các loại phân lân sản xuất bằng con đường hóa học Việc sản xuất này gây ô nhiễm môi trường và giá thành cao Do đó quá trình vô cơ hóa P nhờ vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng đối với cây trồng Thêm vào đó,

Pseudomonas luôn được biết đến như một nhân tố tích cực trong quá trình chuyển hóa

P khó tan thành P vô cơ dễ tiêu cho cây trồng

Chính vì những yếu tố nêu trên mà yêu cầu cấp thiết đặt ra là nghiên cứu, phân

lập được các chủng vi khuẩn Pseudomonas vừa có khả năng cố định đạm, vừa có khả

năng hòa tan lân Đây cũng là mục tiêu chính của đề tài: “Phân lập vi khuẩn

Pseudomonas từ vùng rễ cây sài đất [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]”

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 Cây sài đất

Họ Cúc (Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng dương, họ Cúc tây,

là một họ lớn có mức tiến hóa cao nhất trong các loài thực vật hạt kín hai lá mầm Họ Cúc bao gồm chủ yếu các cây thân cỏ, cây bụi và một số rất ít cây thân gỗ Theo dữ liệu của Vườn thực vật hoàng gia Kew mà APG II trích dẫn, họ này chứa 1,620 chi và 23,600 loài Lá của họ hoa này có thể mọc đối, so le hoặc ít phổ biến hơn là kiểu mọc vòng Lá có thể là lá đơn có hình lông chim hoặc lá kép hình chân vịt và không có lá kèm Hoa cúc được chia ra làm hai kiểu cơ bản: loại có hình ống, đối xứng, tỏa tia và loại có hình dây (strap-shaped) đối xứng hai bên Hoa cúc có thể đơn tính hoặc lưỡng tính tùy loại Bộ nhị thường có 4 – 5 nhị hoa được bọc trong bao phấn

Sài đất còn gọi là Ngổ núi, Cúc nháp, Húng

trám; có tên khoa học Wedelia chinensis (Osb.)

Merr., thuộc họ Cúc

Cây mọc hoang và được trồng nhiều nơi trong nước ta Cây thân thảo sống dại, đứng thẳng hay mọc bò, cao tới 40 cm Thân màu xanh, có lông trắng Lá mọc đối, hình bầu dục, có răng cưa to

và nông, có lông thô ở cả hai mặt Lá có một gân chính và hai gân phụ xuất phát gần như từ một điểm ở phía cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá Hoa màu vàng tươi, xếp thành đầu ở nách

lá hoặc ở ngọn cành

Dịch ép của cây chứa dầu hoà tan 11,2%, hợp chất béo 29,7%, phytosterol 3,75%, caroten 1,14%, chlorophylle 3,75%, nhựa 44,95%, còn có đường, tanin, saponin, các chất có solice, pectin, mucin, lignin và các chất có cellulose Ngoài ra còn

có tinh dầu và muối vô cơ Theo Đông y, sài đất có vị ngọt, hơi chua, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, cầm ho, mát máu nên thường được dùng để trị cảm mạo, sốt, viêm họng, viêm phế quản phổi, mụn nhọt…

(http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/saidat.htm)

Hình 1: Cây sài đất Wedelia

chinensis (Osb.) Merr

2 Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas là vi khuẩn tự do tồn tại trong đất, nước, môi trường biển và

trong các môi trường tự nhiên khác Chúng cũng được tìm thấy ở động vật và thực vật

như hệ sinh vật bình thường hay như các tác nhân gây bệnh Pseudomonas là trực khuẩn, hiếu khí bắt buộc, Gram âm, có hình que hơi cong Một số dòng Pseudomonas

di động nhờ vào tiêm mao Chúng sử dụng glucose và các carbohydrate khác bằng cách oxi hóa

Ngày nay họ Pseudomonaceae được phân loại theo 5 nhóm dựa vào sự tương

đồng giữa rARN và AND Từ trước hầu hết vi khuẩn của họ này đều được xếp vào

loài Pseudomonas nhưng ngày nay chỉ có nhóm rRNA I mới thuộc loài Pseudomonas

Pseudomonas aeruginosa là một chi của loài Pseudomonas và cũng là một trong các vi

khuẩn Gram âm phổ biến nhất Một số chi quan trọng trong loài này là Pseudomonas

fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes…

Pseudomonas aeruginosa có thể tìm thấy trong đất, nước, cây trồng, môi trường

tự nhiên và đặc biệt trong môi trường bệnh viện các yếu tố hình thành nên tính độc của vi khuẩn là khả năng sản xuất exotoxin A, một chất giết tế bào chủ bằng cách tổng hợp protein ức chế và việc tạo ra một vài enzyme phân giải protein và làm tan huyết tố

sẽ phá hủy các mô và tế bào chủ

Pseudomonas fluorescens và Pseudomonas putida hiện diện trong nước, đất và

có thể cả ở trong nguồn nước của bệnh viện chúng có khả năng sinh trưởng ở 4oC và thủy phân gelatin Những đặc tính này giúp giải thích sự hiện diện của chúng trong

thực phẩm đông lạnh, đặc biệt là trong thịt gà và các thực phẩm chế biến

Pseudomonas mendocina có liên quan đến Pseudomonas stutzeri và hiếm khi

được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm Khuẩn lạc bằng phẳng, trơn láng

Psedomonas stutzeri tồn tại khắp nơi trong đất, nước và có thể được thu hồi từ

phân, rơm, nước thải, nước ứ đọng, thiết bị bệnh viện… Pseudomonas stutzeri hiếm

khi gây độc và độc tính của nó chưa được chứng minh rõ ràng Chúng ta có thể nhận biết dòng thuần này bằng hình dạng khuẩn lạc có nếp nhăn và nhầy nhớt

Pseudomonas mendocina có liên quan đến Pseudomonas stutzeri và hiếm khi

được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm Khuẩn lạc của chúng bằng phẳng và trơn láng

Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas pseudoalcaligenes và nhóm Pseudomonas species CDC được đặc trưng bởi không thể chuyển hóa đường hoặc chỉ

rất yếu khi nuôi trên môi trường OF glucose Mặc dù các vi khuẩn thuộc nhóm này được thu hồi từ các mẫu bệnh phẩm nhưng khả năng gây bệnh của chúng cũng rất hiếm

Một số chi Pseudomonas cũng được biết đến bởi khả năng chuyển hóa các hợp

chất hóa học khác nhau như: các hydrocarbon thơm, acid béo, thuốc trừ sâu và các chất gây ô nhiễm môi trường khác Khả năng này làm chúng trở nên có ích khi được ứng dụng như các tác nhân xử lí môi trường Một vài chi được ứng dụng cho mục đích

này bao gồm: Pseudomonas alcaligenes có khả năng phân giải các chất hydrocarbon

đa vòng; Pseudomonas mendocina có khả năng phân giải toluene; Pseudomonas

pseudoalcaligenes có khả năng sử dụng cyanide như nguồn cung cấp nitơ; Pseudomonas resinovorans có thể phân hủy carbazole và Pseudomonas veronii được

dùng để phân giải các hợp chất thơm khác nhau

Một số lượng đáng kể vi khuẩn Pseudomonas có thể sản xuất ra các

exopolysaccharide , một dạng chất nhầy, góp phần vào sự tạo thành bề mặt màng sinh học Các hợp chất phức tạp sẽ liên kết chặt chẽ với bề mặt này, và là nơi trú ngụ của vi khuẩn và các vi sinh vật khác Màng sinh học này sẽ bảo vệ các vi khuẩn và cho phép chúng chuyển hóa một số chất dinh dưỡng khác thường (Agner Martinez, 2007,

Microorganism of the Month: Pseudomonas species, EMLab P&K Analyst)

3 Vi khuẩn cố định đạm

3.1 Vai trò của Nitơ

Đạm là cơ cấu của protein, nhất là protein nhân, chiếm khoảng 40-50% chất khô của nguyên sinh chất, đạm còn là cơ cấu của diệp lục tố, pyrimidine và purin… Cho nên đạm là một chất có vai trò quan trọng trong đời sống của thực vật

Nitơ tham gia vào thành phần của tất cả các enzyme quang hợp vì nó ở trong thành phần protein của enzyme, nhóm hoạt động của enzyme và thành phần của ATP nên Nitơ có vai trò quan trọng trong biến đổi chất và năng lượng trong quang hợp Vì vậy, khi bón phân đạm, diệp lục nhanh chóng được hình thành làm cho lá xanh đậm, diện tích lá tăng lên rất nhanh và hoạt động quang hợp cũng tăng lên Ngược lại, khi thiếu Nitơ thì lá vàng vì diệp lục thiếu, lá sẽ khô và rụng, giảm sút quang hợp Do đó,

việc sử dụng phân đạm để tăng năng suất chủ yếu là tăng diện tích lá và khả năng quang hợp của chúng

(http://www.dthu.edu.vn/bgdt/BG/Nguyen%20Kim%20Bup/Baigiangdientusltv/Chuon g5/C5m4.htm)

Trong tự nhiên đạm ở 2 dạng: thể khí tự do trong khí quyển chiếm khoảng 78% Dạng đạm này cây không thể hấp thụ được Cây có thể sử dụng được những dạng đạm hữu cơ và vô cơ trong đất Các dạng đạm này có nguồn gốc khác nhau như từ xác bã động vật và thực vật chết, từ nước mưa, từ các vi sinh vật đất Nguồn đạm chủ yếu cung cấp cho cây vẫn là đạm vô cơ Đạm vô cơ thường ở 2 dạng: ammonium (NH4+)

và nitrat (NO3-) Hai dạng đạm này có thể biến đổi lẫn nhau do tác động của các quá

trình lý hóa và vi sinh vật học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

3.2 Quá trình cố định Nitơ (Nitrogen fixation)

Một nguồn cung cấp Nitơ phong phú là bầu khí quyển của trái đất - gần 79% tồn tại dưới hình thức khí N2 Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật không có khả năng sử dụng dạng Nitơ này vì cầu nối ba hóa trị giữa hai nguyên tử Nitơ làm cho phân tử N2 gần như là một khí trơ Để sử dụng được, Nitơ phải được "cố định" (kết hợp) thực hiện dưới hình thức ion ammonium (NH4+) hoặc nitrate (NO3-) Các vi khuẩn cố định đạm

có khả năng tổng hợp các enzyme cắt đứt liên kết ba giữa hai nguyên tử Nitơ của phân

tử Nitơ trong không khí, chuyển về dạng amonia cây trồng hấp thu được Để thực hiện phản ứng này cần cung cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết của phân tử Nitơ

3.3 Vi khuẩn cố định đạm

3.3.1 Vi khuẩn nốt sần

Vi khuẩn nốt sần: thuộc loại hiếu khí không tạo bào tử có thể đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, pH thích hợp: 6,5-9,5, nhiệt độ phát triển thích hợp: 24-

26oC Phân loại vi khuẩn nốt sần có nhiều ý kiến chưa thống nhất:

+ Theo Todorovic chia vi khuẩn nốt sần ra 2 loài: Rhizibiomonas leguminosarum

và Rhizobacterum leguminosrum

+ Theo Bergli thì giống Rhizobium bao gồm 6 loài vi khuẩn nốt sần: Rh

leguminosarum, Rh phaseoli, Rh trifolii, Rh lupini, Rh sapnicum, Rh meliloti

3.3.2 Vi khuẩn hiếu khí sống tự do thuộc giống Azotobacter và Beijerinckia

- Azotobacter: chủ yếu có 4 loài

+ Azotobacter chroocuccum: kích thước 3,1x2,0µm khi còn non có khả năng di

động, khi già có sắc tố màu nâu đến màu đỏ, không khuyếch tán vào môi trường

+ Azotobacter beijerincki: kích thước 3,1x2,0µm không di động, khi già có sắc tố

màu vàng đến màu nâu sáng, không khuyếch tán vào môi trường

+ Azotobacter vinelandi: kích thước 3,4x1,5µm có khả năng di động, sắc tố màu

vàng lục đến huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

+ Azotobacter agilis: kích thước 3,3x2,8µm có khả năng di động, sắc tố màu lục,

huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

Azotobacter làm tăng cường nguồn thức ăn cung cấp cho cây trồng, kích thích

khả năng tăng trưởng, nâng cao tỷ lệ nảy mầm và độ phát triển của mầm (vì nó tiết ra môi trường thiamin, a.nicotinic, a.pantotenic, piridoxin, biotin, ) và có khả năng tiết ra một số chất chống nấm

Chế phẩm Azotobacterin là dịch Azotobacter cho hấp thụ trong than bùn (hoặc

các loại đất giàu hữu cơ đã trung hòa và bổ sung photpho, kali)

Beijerinckia: là loài hiếu khí, cố định Nitơ giống Azotobacter nhưng có khả năng

chịu chua cao hơn Gồm có 3 nhóm:

+ B indica: kích thước tế bào 0,5-1,5 x 1,7-3,0µm có khả năng di động hoặc

không di động, khi già có sắc tố màu đỏ đến màu nâu, có tốc độ cố định Nitơ nhanh

+ B fluminensis: kích thước tế bào 1,1-1,5 x 3,0-3,5µm có khả năng di động, sắc

tố màu nâu tối, tốc độ cố định Nitơ chậm

+ B derxii: kích thước tế bào 1,5-2,0 x 3,5-4,5µm không di động, sắc tố màu lục

huỳnh quang

3.3.3 Vi khuẩn kỵ khí sống tự do thuộc Clostridium

Loài được nghiên cứu nhiều nhất là Clostridium pasteriaum, ngoài ra còn có các loài Clostridium khác như Cl butylicum, Cl bacterinkin, Cl aceticum,

Kích thước tế bào 2,5-7,5 x 0,7-1,3µm có thể riêng rẽ hoặc xếp đôi hoặc thành chuỗi ngắn Có khả năng di động khi còn non, có khả năng tạo bào tử, bào tử có kích

thước lớn hơn tế bào và có thể nằm ở đầu hoặc ở giữa tế bào

(http://www.dost-bentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1247&Itemid=138)

4 Vi khuẩn hòa tan lân

4.1 Vai trò của lân (P)

Trong đất P tồn tại dưới 2 dạng là P vô cơ và hữu cơ P hữu cơ tồn tại trong xác

bã thực vật và vi sinh vật

Trong xác bã thực vật, P hữu cơ như phytin, phospholipids, acid nucleic, các nucleo protein, các dạng đường có chứa P và các hợp chất khác Trong tế bào vi sinh vật, phần lớn P là thành phần cấu tạo của acid nucleic, trong các hợp chất trong nguyên sinh chất và các enzyme có P

P vô cơ thường là những dạng phosphat như phosphat canxi, phosphat nhôm, phosphat sắt Trong đất trung hòa và kiềm, phosphat canxi chiếm ưu thế; trong đất chua, phosphat nhôm và phosphat sắt chiếm ưu thế Tất cả các dạng đó cây xanh không hấp thu được, chỉ khi chúng được chuyển sang dạng P2O5 vô cơ dễ tan cây mới hấp thụ được Quá trình này vi sinh vật đóng vai trò quan trọng

4.2 Chu trình P

Đối với chất hữu cơ, trong quá trình sống nhiều vi sinh vật tiết ra các chất hòa tan lân Các vi sinh vật này phân hủy các chất hữu cơ thành các đường đơn để lấy cacbon cho chúng, quá trình này các chất đó phóng thích P dạng phosphat

Đối với các dạng P bị cố định trong đất như phosphat sắt, phosphat nhôm cũng được chuyển hóa sang dạng dễ tiêu dưới tác dụng của vi sinh vật trong đất Một số vi khuẩn có khả năng sinh ra H2S tác dụng lên phosphat sắt hay phosphat nhôm để cho ra sulfite sắt hoặc nhôm và phóng thích phosphat dưới dạng dễ tiêu Hiện tượng này xảy

ra trong điều kiện thiếu oxi

Các vi sinh vật hòa tan phosphate làm cho phosphate khó tan trở thành dạng

có thể hòa tan bằng quá trình acid hóa và làm giảm pH do các acid hữu cơ được vi khuẩn tiết ra tạo ra nhiều ion H+ Các acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn và nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid

Theo nghiên cứu của Moghimi và Tate (1978) thì ngoài cơ chế acid hóa, các vi khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion Trong đó phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức

Ngoài ra, một số vi sinh vật còn tiết ra các phosphatase, enzyme mà chúng xúc tác sự thủy phân hai chất ester và alhydride của H3PO4 Các enzyme được chia làm 5 nhóm: phosphoric monoester hydrolase; phosphoric diester hydrelase; triphosphoric monoester; enzyme hoạt động lên những liên kết P-N, như là phosphoamidase

4.3 Vi khuẩn hòa tan P

Trong đất thường tồn tại một nhóm vi sinh vật có khả năng hoà tan lân Nhóm

vi sinh vật này được các nhà khoa học đặt tên là PSM (phosphate solubilizing microorganisms).

Cho đến ngày nay người ta đã biết nhiều chủng vi sinh vật có khả năng hòa tan

lân bao gồm: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn (actinomycetes) Có khoảng 857 loài vi khuẩn

có khả năng hòa tan lân đã được phát hiện Có nhiều vi sinh vật được phân lập từ các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long có khả năng hòa tan lân như là các nhóm vi khuẩn và nấm Trong đó nhóm vi khuẩn nhiều hơn nấm nhưng nấm có độ hữu hiệu cao hơn

Một số vi khuẩn cộng sinh cố định đạm cũng có khả năng hòa tan lân

Những vi khuẩn hòa tan lân là nhờ tiết ra các enzyme và acid hữu cơ có khả năng hòa tan các hợp chất lân khó tan

Trong đất, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện với số lượng khác nhau Một lượng lớn vi khuẩn hòa tan lân sống trong vùng rễ của cây và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây Vi khuẩn hòa tan lân phân lập ở các vùng rễ của nhiều loài thực vật khả năng hoạt động cao hơn ở vùng khác Nhóm vi khuẩn này gọi là “vi khuẩn vùng rễ kích thích cây trồng”, chúng có thể phân lập để làm phân bón cho cây trồng Đất mát mẻ,

ẩm thấp, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện nhiều hơn là vùng đất khô cạn

Chính vì vậy, vi khuẩn hòa tan lân có vai trò quan trọng trong trường hợp đất thiếu lân, người ta sử dụng phân vô cơ hay phân vi sinh có chứa các chủng vi sinh vật

có khả năng hòa tan lân để bón cho cây trồng Để có nguồn phân lân vi sinh , chúng ta phải chọn dòng vi khuẩn có hiệu quả cao và chủng chúng vào đất để hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây trồng

5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas cố định đạm và hòa tan lân trên

thế giới và ở Việt Nam

5.1 Trên thế giới

Từ những năm 1978, Gaur et al đã nhận thấy các vi khuẩn Pseudomonas

striata, Bacillus polymyxa, B megaterium, B pulvifaciens, và nấm Aspergillus awamori, A niger , Penicillium có khả năng hòa tan các loại đá phosphate Mussorie và

Udaipur tốt hơn tricalcium phosphate Khả năng hòa tan lân của A awamori, A niger

và P striata là tốt nhất Hoạt động của các vi sinh vật này sẽ làm giảm kích thước của

các hạt tricalcium phosphate từ 140 - 250 còn 30 - 90 nm sau 3 tuần ủ

(http://www.springerlink.com/content/w4424837341x571l/)

Tại Áo, khả năng hòa tan lân vô cơ của 2 chi Penicillium aurantiogriseum và

Pseudomonas sp (PI 18/89) đã được kiểm định bằng hiệu suất hòa tan calcium

phosphates trong điều kiện vô trùng Những thí nghiệm trong phòng lab, lượng lân dễ tan chỉ tăng khi các vi sinh vật hòa tan lân được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu Những nghiên cứu về lĩnh vực này chỉ ra rằng các vi sinh vật hòa tan lân cũng dễ bị tổn thương và không bền vững để sử dụng trong nông nghiệp Có quá nhiều yếu tố hữu sinh và vô sinh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm theo hướng rất khó đoán (Illmer và Schinner, 1995)

Vào năm 2003, Beauchamp et al đã phân lập 2 dòng vi khuẩn có khả năng cố

định đạm từ phân bón bã bùn giấy (DPS) và xác định là thuộc dòng Pseudomonas Ở

20oC, khả năng cố định đạm của 2 dòng này cao hơn hẳn so với các dòng

Pseudomonas trước đây Hai dòng vi khuẩn này hoạt động tốt ở nhiệt độ từ 18-25oC,

tương tự với dòng Azotobacter ATCC 7486

Cho đến thời gian gần đây, một số vi khuẩn hòa tan lân được phân lập từ 4 vùng

ở Ethiopia nhằm nghiên cứu khả năng hòa tan lân khó tan của chúng Các dòng vi

khuẩn này được xác định là Pseudomonas sp Anb-105, Meh-008, Meh-101, Meh-303

và Meh-305 Hiệu suất hòa tan lân của 5 dòng này tương đương với dòng Jim-41 từ trung tâm nghiên cứu đất quốc gia (the National Soil Research Centre) khi nghiên cứu trên các nguồn P khác nhau như Tricalcium Phosphate (TCP), Egyptian Rock Phosphate (ERP), Bikilal Rock Phosphate (BRP) và Old Bone meal (OB) Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với nguồn P là TCP, khả năng hòa tan lân của dòng Meh-305

là cao nhất (39mg trên 50ml), tiếp sau đó là dòng Meh-101 hòa tan lân trên ERP với hiệu suất là 31 mg per 50ml tại pH lần lượt là 3.83 và 3.0 (Keneni et al., 2009)

5.2 Tại Việt Nam

Từ năm 2004, một thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện nhằm đánh giá

hiệu quả vi khuẩn Pseudomonas spp trên năng suất và lượng đường trong cây mía đường (Saccharum officinarum L.) (giống VĐNL-7) trồng trên đất phèn huyện Bến

Lức, tỉnh Long An trong 2 vụ (2004-2005) liên tiếp Kết quả cho thấy vi khuẩn

Pseudomonas spp với chất mang là than bùn (phân sinh học) tăng trữ đường trong mía

cây ở vụ 1 và tăng năng suất mía cây và lượng đường trong cả 2 vụ Bón phân sinh học cho cây mía đường giảm được 184 kg N (400 kg urê), 192 kg P2O5 (1200 kg phân supe lân) nhưng vẫn đảm bảo năng suất và lượng đường thu được cao hơn bón phân hóa học, nông dân thu lời được từ 37,968 triệu đến 56,596 triệu đồng/ha (Cao Ngọc Điệp

và Bùi Thị Kiều Oanh, 2005)

Vào năm 2007, tại khoa nông nghiệp tài nguyên thiên nhiên, Đại học An Giang,

Võ Thị Xuân Tuyền cũng đang nghiên cứu thực hiện đề tài “Hiệu quả của việc chủng

vi khuẩn cố định nitơ (Sinorhizobium fredii), vi khuẩn hòa tan lân (Pseudomonas spp.) lên năng suất và phẩm chất đậu nành (Glycine max (L) Merrill) tại Chợ Mới-AG vụ Đông Xuân 06 -07” (http://agri.agu.edu.vn/?q=dtncct.nckh)

Cũng vào năm 2007, Viện nghiên cứu cây ăn quả miền Nam vừa phối hợp với các cán bộ khoa học Viện nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ nghiên cứu thành công quy trình sản xuất phân bón vi sinh theo tiêu chuẩn nông nghiệp bằng vi khuẩn đa năng

Pseudomonas strata và vi nấm Piriformospora indiaca Các vi sinh vật này có khả

năng chuyển hóa phosphate ở dạng thô trong đất thành phosphate ở dạng hòa tan dễ tiêu, cải

thiện đất bị nhiễm kim loại nặng (nếu cấy các chủng Pseudomonas strata và vi nấm

Piriformospora indiaca vào đất có nhiễm cadmium nồng độ 50 ppm thì chỉ sau 4 tháng đã giảm

xuống còn 15 ppm) Ngoài ra, đất được cấy vi khuẩn Pseudomonas strata hoặc vi nấm

Piriformospora indiaca đều làm tăng sinh khối và protein hữu cơ trong đất, giúp đất trồng giàu

dinh dưỡng hơn

(http://www.skhcndaklak.gov.vn/Trangchủ/ThôngtinKHCN/Bảntinphụcvụnôngthôn/Số 022007/tabid/126/ctl/Details/mid/493/ItemID/166/Default.aspx)

Thêm vào đó, chủng vi khuẩn nốt rễ Sinorhizobium fredii [VN064] và vi khuẩn hòa tan lân, Pseudomonas spp [P14] được đưa vào sản xuất phân sinh học đa chủng

bón cho đậu nành trồng trong tỉnh Đồng Tháp trong chất mang gồm 50% than bùn và 50% mùn mía + 1% CMC được ép thành viên có độ sống sót cao (mật số >log10=8,4 - 8,7/g chất mang) Sau 6 tháng tồn trữ đạt tiêu chuẩn TCVN-6166-1996 và 6166-1996

ban hành năm 2001 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông Thôn Việt Nam (Cao

Ngọc Điệp, 2008)

Vào đầu năm 2009, Hội đồng Khoa học công nghệ Cục Trồng trọt - Bộ NNPTNT nghiệm thu công nhận một sản phẩm phân bón vi sinh “Dasvila” chuyên dùng cho lúa dựa trên kết quả nghiên cứu khoa học tại trường Đại học Cần Thơ Tại đây, các nhà khoa học đã phân lập thành công dòng vi khuẩn cố định đạm

Azospirillum sp từ cây lúa mùa trên vùng ĐBSCL và dòng vi khuẩn phân giải lân Pseudomonas sp từ cây so đũa Loại phân vi sinh này có khả năng giúp người trồng

giảm 50% lượng phân đạm và 100% lượng phân lân hóa học mà vẫn giữ vững năng suất

(http://www.agro.gov.vn/news/newsDetail.asp?targetID=12617&CAT_ID=71)