Phân Lập Vi Khuẩn Lactic Tự Nhiên Để Sản Xuất Mắm Chua Xương Mềm Cá Sặc (Trichogaster Trichopterus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỰ NHIÊN ĐỂ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỰ NHIÊN

ĐỂ SẢN XUẤT MẮM CHUA XƯƠNG MỀM CÁ SẶC

(Trichogaster trichopterus)

MSSV: 3064450 LỚP: CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ đã có công sinh thành

và nuôi dạy con đến ngày hôm nay!

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc Thầy Nguyễn Văn Thành đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và truyền đạt những kinh nhiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Xuân Mai - cố vấn học tập Lớp Công nghệ Sinh học K32 đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn chị Đỗ Thị Tuyết Nhung, chị Lương Uyên Uyên và cán

bộ phòng thí nghiệm phòng Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, chỉ bảo tôi những kinh nghiệm bản thân, các thao tác thí nghiệm trong quá trình làm thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Trường Đại Học Cần Thơ trong những năm qua đã truyền đạt những kiến thức rất quý báu để tôi có thể bước vào đời một cách tự tin, để có thể làm việc và phấn đấu tốt sau này

Xin cảm ơn tất cả các bạn Lớp Công nghệ Sinh học K32 đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua!

Một lần nữa, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

Cần Thơ, ngày 03 tháng 05 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Hậu

Thông qua đề tài chúng tôi phân lập nguồn vi sinh có trong sản phẩm mắm cá sặc, từ đó khảo sát ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lactic đến sự thay đổi pH, acid tổng, đạm amoniac và đạm amin trong sản phẩm ở từng thời điểm lên men

Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập được 2 dòng vi khuẩn, 1 dòng nấm men Và chọn được nghiệm thức có lượng đạm amin cao, acid tổng vừa phải và

có giá trị cảm quan cao là: nồng độ đường 10%, muối 5%, vi khuẩn 10 5 Lên men ở nhiệt độ thường khoảng 20 ngày, như vậy giảm thời gian lên men khoảng 10 – 15 ngày

so với lên men tự nhiên Ở nghiệm thức này thì pH là 4,33, hàm lượng acid tổng 3,67%, hàm lượng đạm amoniac 4,06g/kg, đạm amin là 16g/kg

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Mắm chua 2

2.2 Nguyên liệu cá 2

2.2.1 Cá sặc bướm (Trichogaster trichopterus) 2

2.2.2 Thành phần hóa học của cá 3

2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic 5

2.4 Phân loại 6

2.4.1 Vi khuẩn lactic dị hình 6

2.4.2 Vi khuẩn lactic đồng hình 7

2.5 Nấm men 7

2.6 Các giai đoạn trong quá trình lên men cá 7

2.7 Các nhân tố ảnh hưởng lên quá trình chế biến mắm 8

2.7.1 Nồng độ muối 8

2.7.2 Hàm lượng đường 9

2.7.3 Độ acid và điều kiện không khí 9

2.7.4 Nhiệt độ 9

2.7.5 pH của môi trường 10

2.8 Một số sản phẩm cá lên men ngoài nước 10

2.8.1 Som Fug 10

2.8.2 Pla chao 11

2.8.3 Pla Ra 11

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Phương tiện 12

3.1.1 Thời gian và địa điểm 12

3.1.2 Thiết bị dụng cụ 12

3.1.3 Hóa chất sử dụng 12

3.2 Phương pháp thí nghiệm 14

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 21

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát chất lượng sản phẩm từ quy trình truyền thống chế biến mắm chua xương mềm cá sặc 21

4.2 Thí nghiệm 2: Phân lập vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải sản phẩm mắm chua xương mềm cá sặc từ quy trình truyền thống 22

4.3 Thí nghiệm 3: Đặc tính sinh hóa của hai dòng vi khuẩn phân lập được 25

4.3.1 Kiểm tra khả năng sinh enzyme catalase 25

4.3.2 Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease 25

4.3.3 Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase 26

4.3.4 Nhuộm Gram 27

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lactic đến sự thay đổi pH, đạm amoniac, đạm amin và acid tổng trong quá trình lên men 28

4.4.1 Sự thay đổi pH sau các ngày lên men 28

4.4.2 Sự thay đổi acid tổng số sau các ngày lên men (%) 29

4.4.3 Sự thay đổi đạm amoniac sau các ngày lên men (g/kg) 31

4.4.4 Sự thay đổi đạm amin sau các ngày lên men (g/kg) 32

4.5 Thí nghiệm 5: Kết quả đánh giá cảm quan 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 37

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần hóa học của cá 3

Bảng 2 Tỉ lệ thành phần của môi trường phân lập MRS 13

Bảng 3 Môi trường PCA 13

Bảng 4 Môi trường gelatin – pepton 14

Bảng 5 Mô tả đánh giá cảm quan 19

Bảng 6 Phiếu đánh giá cảm quan 20

Bảng 7 Kết quả phân tích chỉ tiêu hóa học trong mắm cá sặc 21

Bảng 8 Kết quả pH trung bình sau các ngày lên men 28

Bảng 9 Kết quả acid tổng trung bình sau các ngày lên men 29

Bảng 10 Kết quả đạm amoniac trung bình sau các ngày lên men 31

Bảng 11 Kết quả đạm amin trung bình sau các ngày lên men 32

Bảng 12 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm của 12 người 34

Bảng 13 So sánh các chỉ tiêu hóa học giữa mẫu thí nghiệm và mẫu truyền thống 35

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cá sặc bướm 2

Hình 2 Quy trình làm mắm truyền thống 15

Hình 3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 17

Hình 4 Mẫu mắm thu từ quy trình truyền thống 21

Hình 5 Khuẩn lạc dòng vi khuẩn thứ nhất sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường MRS 22

Hình 6 Dòng vi khuẩn thứ nhất dưới kính hiển vi X100 23

Hình 7 Khuẩn lạc dòng vi khuẩn thứ 2 sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường MRS 23

Hình 8 Dòng vi khuẩn thứ 2 dưới kính hiển vi X100 24

Hình 9 Khuẩn lạc dòng nấm men 2 ngày nuôi cấy trong môi trường PCA 24

Hình 10 Dòng nấm men dưới kính hiển vi X40 25

Hình 11 Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease 25

Hình 12 Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase 26

Hình 13 Nhuộm Gram dòng thứ nhất (X100) 27

Hình 14 Nhuộm Gram dòng thứ hai (X100) 27

Hình 15 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi pH sau các ngày lên men 28

Hình 16 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi acid tổng sau các ngày lên men 30

Hình 17 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi đạm amin sau các ngày lên men 31

Hình 18 Biểu diễn % sở thích các mẫu của các cảm quan viên 32

Hình 19 Biểu diễn % sở thích các mẫu của các cảm quan viên 34

Hình 20 Thành phẩm mắm cá sặc 37

Hình 21 Quy trình mắm cá lên men chua đề nghị 38

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

- -1.1 Đặt vấn đề

- Cá là nguồn thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của chúng ta,

là nguồn cung cấp protein động vật giàu dinh dưỡng cho cơ thể Protein của cá có tất

cả những acid amin cần thiết cho con người, ngoài ra còn có chất khoáng, lipid, vitamin Tuy nhiên sau thu hoạch cá không thể giữ được tươi lâu, dễ hư hỏng trong điều kiện bình thường Vì vậy chế biến cá thành những món ăn dinh dưỡng và bảo quản với thời gian dài hơn luôn là vấn đề đã, đang và sẽ được quan tâm

- Mắm cá là sản phẩm truyền thống được ưa chuộng, được bảo quản trong thời gian dài, đặc trưng ở từng địa phương Cá lên men chua là một phương pháp bảo quản

cá thông qua việc chế biến thành dạng sản phẩm khác Quá trình lên men là sự ứng dụng hệ vi khuẩn lactic để chuyển hóa đường trong nguyên liệu thành acid lactic, đồng thời còn tạo cho sản phẩm có hương vị, màu sắc và cấu trúc đặc trưng

- Ở Việt Nam, cá sặc là một loài cá phổ biến, đặc biệt là ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long Cá tuy có kích thước nhỏ nhưng khả năng sinh sản lớn dễ nuôi, là loài cá có giá trị kinh tế thường được sử dụng làm mắm Và điều quan trọng khác ở nước ta là cá lên men được sản xuất theo quy mô thủ công tại gia đình, quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên nên chất lượng sản phẩm không ổn định, dễ bị ngộ độc

do nhiễm các vi sinh vật lạ, quy mô sản xuất công nghiệp chưa được quan tâm Vì những lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn lactic tự nhiên để sản xuất mắm chua xương mềm cá sặc”

1.2 Mục tiêu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:

- Khảo sát quy trình truyền thống ở địa phương

- Phân lập vi sinh vật trong sản phẩm mắm chua xương mềm cá sặc

- Khảo sát mật độ vi khuẩn lactic đến sự thay đổi pH, đạm amoniac, đạm amin

và acid tổng trong quá trình lên men

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

- -

2.1 Mắm chua

- Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong các loại sản phẩm lên men phổ biến của dân tộc trên thế giới Đó là một loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang bản sắc riêng của từng dân tộc và đòi hỏi nhiều kinh nghiệm Cũng như các nước trên thế giới, nước ta cũng có nhiều sản phẩm thực phẩm truyền thống lên men chua như rau cải muối chua, tôm lên men chua Chúng đã gắn liền và trở thành nguồn thực phẩm đặc trưng của người dân địa phương đặc biệt là vùng đồng bằng sông Cửu Long

- Ở nước ta mắm cá cũng là một sản phẩm nổi tiếng ở các địa danh du lịch như: Châu Đốc, Vũng Tàu Trong kho tàng ẩm thực Việt Nam, lĩnh vực chế biến mắm là

vô cùng đồ sộ, phong phú, vùng miền nào cũng làm mắm Người Việt Nam thích ăn mắm Các loại mắm cá thường dùng để nấu lấy hương vị như kho, chưng ít khi được

ăn sống vì xương cứng, thịt ít Nhưng hiện nay có loại mắm cá rất độc đáo là “mắm chua xương mềm cá sặc”, chưa xuất hiện nhiều trên thị trường vì sản xuất chủ yếu trong gia đình Mắm chua cá sặc có mùi vị và hương thơm hài hòa, đặc biệt là xương

cá rất mềm rất thích hợp cho việc ăn sống Hy vọng mắm chua cá sặc có thể được xếp vào danh sách thực phẩm truyền thống của người dân Việt Nam

2.2 Nguyên liệu cá

2.2.1 Cá sặc bướm (Trichogaster trichopterus)

- Cá có màu xanh đen ở mặt lưng nhạt

dần xuống hai bên hông và bụng Trên cơ thể có

hai chấm đen tròn, một ở giữa thân một ở gốc vi

đuôi Ở một số cá còn có nhiều vạch đen mờ

nằm vắt xéo ngang thân

- Thân ngắn, rất dẹp bên Vảy lược nhỏ,

phủ khắp thân và đầu

Hình 1: Cá sặc bướm

- Đầu nhỏ, dẹp bên Mõm ngắn, nhọn Miệng trên nhỏ, rạch miệng ngắn còn cách bờ trước của mắt rất xa Răng nhỏ mịn mọc hai bên hàm

- Phân bố: là loài cá nước ngọt nhưng có thể sống ở nước lợ, nước phèn Thức

ăn là các loài sinh vật nổi, sinh vật bám và mùn bã hữu cơ

- Giá trị kinh tế: tuy có kích thước nhỏ nhưng khả năng sinh sản rất lớn nhờ tuổi thành thục sớm, tái phát dục nhanh nên sản lượng rất lớn, thịt cá được ăn tươi, làm mắm, làm khô Đây là loài có giá trị kinh tế

2.2.2 Thành phần hóa học của cá

- Cá chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển Thành phần hóa học và tính chất của cá ảnh hưởng đến những biến đổi xảy ra trong quá trình chế biến

- Thành phần hóa học của cá gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin…các thành phần này thay đổi phụ thuộc vào dòng, loài, giới tính, điều kiện sinh sống

- Miosin: là protein thuộc loại globulin chiếm khoảng 40 – 50% albumin của

kết tủa ở môi trường acid pH = 5 – 6

- Miogen fibrin: dễ tan, động vật máu nóng không có loại protiein này

- Mioproteit: là loại protein không có tính đông đặc

* Chất cơ bản của cơ

Là thành phần chủ yếu của thịt cá, thuộc loại protein chủ yếu gồm nguyên keo

và loại protein có tính đàn hồi Hàm lượng protein này chiếm nhiều hay ít có ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị dinh dưỡng của thịt cá Chất cơ bản của thịt cá chiếm khoảng 15%

* Thành phần chất ngấm ra của thịt cá

Hàm lượng chất ngấm ra trong thịt cá có sự khác nhau theo từng loại Các loài

cá xương cứng lượng chất ngấm ra ít hơn các loài cá xương mềm Chất ngấm ra có 3 loại:

- Loại chất hữu cơ đạm

- Loại chất hữu cơ không có đạm

- Chất vô cơ: chủ yếu gồm lân, kali, natri, canxi

linolenic (3 nối đôi) và acid arachidonic (4 nối đôi)

c) Chất khoáng

Chất khoáng của cá phân bố chủ yếu trong mô xương, đặc biệt trong xương sống Canxi và phospho là 2 nguyên tố chiếm nhiều nhất trong xương cá Thịt cá là nguồn giàu sắt, đồng, lưu huỳnh và iốt Ngoài ra còn có niken, coban, chì, asen, kẽm

d) Vitamin

Trong cá có những vitamin chính của 3 nhóm: Nhóm vitamin A, nhóm vitamin

B (B1, B2) và nhóm vitamin D (D1, D2, D3) Lượng vitamin này không phân bố đều trong các cơ quan của cá Một lượng lớn vitamin nhóm A và D có trong mỡ và nội tạng của cá; vitamin nhóm D có trong gan và mắt cá, một ít trong nội tạng, trứng của

cá Ngoài ra, trong gan cá còn có nhiều provitamin D Lượng vitamin trong cá thay đổi theo quá trình sinh trưởng và khu vực sống

2.3 Sơ lược về vi khuẩn lactic

- Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857, Pasteur đã chứng minh được sự lên men chua sữa là do nhóm vi khuẩn lactic Đến năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi

khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococcus lactis, về sau các

nhà khoa học liên tiếp phân lập được nhiều loài vi khuẩn khác nhau Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loại khác nhau về hình dạng, sinh lý và khả năng lên men Môi trường sinh trưởng của chúng ngoài gluxid, khoáng, muối amoni, còn cần vitamin

nhóm B, vitamin H, acid folic, acid nicotinic và các acid amin khác

- Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có rất nhiều trong thiên nhiên, vì thế chúng tham gia vào tất cả hoạt động sống của con người trong đó đặc biệt là chế biến thực phẩm Vi khuẩn lactic được tìm thấy trong những thực phẩm như : yaourt, rau quả muối chua, cơm mẻ…Chúng được quan tâm đặc biệt do khả năng lên men cũng như những lợi ích về dinh dưỡng và sức khỏe cho người và vật nuôi

- Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không có enzime oxydase, catalase,

có dạng hình que hoặc hình cầu và không hình thành bào tử (tuy nhiên hiện nay người

ta tìm thấy một số dòng trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử) Chúng sản xuất ra lactat từ quá trình lên men carbohydrate (glucose và lactose) Những dòng vi

khuẩn lactic quan trọng là Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Bifidobacterium

- Tất cả các vi khuẩn lactic sử dụng nguồn carbohydrate để làm nguồn năng lượng cho chúng Vi khuẩn lactic đòi hỏi cao về mặt dinh dưỡng, khả năng tổng hợp acid amin và vitamin của chúng thì giới hạn Không khi nào vi khuẩn lactic có thể tăng trưởng trong môi trường hoàn toàn là muối khoáng nguyên chất Hầu hết các vi khuẩn lactic yêu cầu một số vitamin (riboflavin, thiamin, acid folic, biotin và những vitamin khác), amino acid, purin, pyrimidin

- Vi khuẩn lactic có những hệ thống vận chuyển lớn để tích lũy chất dinh dưỡng

từ môi trường Những hệ thống vận chuyển được đặt trên màng tế chất Những bơm ATP bơm proton theo đường thủy phân ATP, để duy trì pH bên trong tế bào Quá trình sinh acid sẽ không chỉ dẫn đến kết quả là pH thấp ở bên ngoài tế bào, ở bên trong tế bào chất cũng vậy

- Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thường thiếu hai loại enzyme quan trọng: enzyme aldolase, enzyme triosophophatizomerase Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thường được tiến hành theo con đường pentose – photphat

- Vi khuẩn lên men lactic dị hình rất cần cho các sản phẩm lên men chua vì chúng sinh ra acid dễ bay hơi và các hợp chất khác (ester, diacetyl, acetaldehyde ) tạo mùi vị ưa thích cho sản phẩm

- Một số dòng vi khuẩn lactic dị hình được nghiên cứu kỹ như: Lactobacillus pasteurianus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopessici, Streptococcus cumoris, Streptococcus falcalis, Streptolacticus lactic

2.4.2 Vi khuẩn lactic đồng hình

- Vi khuẩn lactic đồng hình là những vi khuẩn trong tế bào của chúng có chứa enzyme aldolase và enzyme triosophotphatizomerase Khi tiến hành lên men các loại đường chúng tạo ra chủ yếu là acid lactic

- Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucose sẽ được chuyển hóa theo

tiếp tục bị khử thành acid lactic:

C6H12O6 2CH3COCOOH + 4H+

- Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị

- Một số dòng vi khuẩn lactic điển hình được nghiên cứu kỹ như sau:

Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus bifdus, Lactobacillus casei, Lactobacillus thermophillus, Lactobacillus plantanrum

quan trọng trong lên men rượu và lên men lactic

2.6 Các giai đoạn trong quá trình lên men cá

Lên men cá có nhiều quá trình: quá trình thẩm thấu, quá trình tăng sinh khối của vi sinh vật, quá trình thủy phân, quá trình tạo acid lactic, quá trình tạo hương Tuy nhiên quá trình lên men cá chia làm 3 giai đoạn chính:

 Giai đoạn đầu

Do muối gây áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khác có trong nguyên liệu khuếch tán vào dung dịch nước muối và bắt đầu có sự hoạt động của

vi khuẩn lactic và một số vi sinh vật khác: nấm men Saccharomyces cerevisiae chuyển

muối thấy xuất hiện những bọt khí Những bọt khí này cũng được tạo ra bởi một số vi

sinh vật có khả năng sinh khí và vi khuẩn lactic (chủng chủ yếu trong thời kỳ này là

Leuconostoc, Mesenteroides), chủng này chuyển đường thành acid lactic, acid

acetic Trong thời kì này men phân giải protein cho pepton, polypeptide và các acid amin, chất đạm tăng lên rõ rệt và tương đối nhanh

 Giai đoạn lên men chính

Vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ và acid lactic tích tụ được nhiều , phần lớn

vi khuẩn gây thối bị ức chế vì pH của môi trường giảm Chủng vi khuẩn phát triển chủ

yếu trong thời kỳ này là Lactobacillus cucumers, Bacterium brassieae fermentati Thời

kỳ này rất quan trọng trong quá trình lên men lactic vì sản phẩm tích tụ được lượng acid cao và có hương vị đặc trưng cho sản phẩm

 Giai đoạn sau quá trình lên men

Khi acid lactic tích tụ với một lượng khá cao thì các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế Nếu trên bề mặt xuất hiện những lớp váng trắng nghĩa là các nấm mốc nấm men phát triển, làm cho độ acid trong sản phẩm giảm tạo điều kiện cho các vi khuẩn hoại sinh phát triển gây hư hỏng sản phẩm Ngoài các nấm mốc hoạt động còn có các vi

khuẩn kỵ khí khác như Clostridium bityrisum biến đường và acid lactic thành acid butyric làm cho sản phẩm có mùi ôi khó chịu và các vi khuẩn gây thối như proteus

Như vậy nhóm vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong quá trình lên men vì thế cần tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn lactic hoạt động tạo hàm lượng acid lactic vừa đủ để ức chế hoạt động của hệ vi sinh vật có hại

2.7 Các nhân tố ảnh hưởng lên quá trình chế biến mắm

lắm (Trần Minh Tâm, 1998)

2.7.2 Hàm lượng đường

Các loại lên men đều lợi dụng đường trong môi trường để lên men Nó là nguồn quan trọng để tích tụ nhiều acid lactic Trường hợp lượng đường trong nguyên liệu không đầy đủ thì lượng acid cần thiết cho sản phẩm muối chua sẽ không đảm bảo và chất lượng kém Đối với một số nguyên liệu có hàm lượng đường thấp thì phải phối

hợp với các nguyên liệu có hàm lượng đường cao hơn hoặc cho thêm đường (Trần Minh Tâm, 1998

2.7.3 Độ acid và điều kiện không khí

- Mỗi loại vi sinh vật lên men đều thích ứng với một độ acid khác nhau Acid lactic được tạo thành trong quá trình lên men khi ở nồng độ 0,5% đã có thể ức chế hoạt động của một số vi sinh vật lạ khác có ảnh hưởng đến quá trình lên men Khi acid lactic tích tụ nhiều làm cho pH giảm xuống 3 – 4 Nồng độ của acid lactic phụ thuộc vào lượng đường ban đầu, nồng độ muối của dung dịch và điều kiện tiến hành quá trình lên men Acid lactic không kìm hãm được quá trình phát triển của một số men,

nhất là mốc (Trần Minh Tâm, 1998)

- Ngoài ra sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện không có oxy, các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy nghi, tức là chúng cần một ít oxy nhưng chúng lên men và phát triển tốt trong điều kiện không có oxy, đôi khi có oxy làm cho một số loài thuộc vi khuẩn lactic bị giảm hoạt động Trong khi đó một số loài

vi sinh vật khác như vi khuẩn acetic, nấm men và mốc có khả năng làm giảm chất lượng sản phẩm lại hoạt động trong điều kiện hiếm khí và khi không có không khí thì

không thể hoạt động được (Ngô Thị Hồng Thẩm, 2005)

2.7.4 Nhiệt độ

- Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, tốc độ hình thành và giải phóng sản phẩm cuối cùng.Mỗi loại vi sinh vật có một yêu cầu nhiệt độ

thích hợp cho sự phát triển của mình (Trần Minh Tâm, 1998) Nhiệt độ ảnh hưởng trực

tiếp đến quá trình lên men lactic và chất lượng sản phẩm

như Butyric (ở 300C) Trong phạm vi thích hợp thì sự thì nhiệt độ càng tăng sự lên

Ở nhiệt độ 20 - 220C: lên men lactic từ 8 – 10 ngày

Ở nhiệt độ 18 - 200C: lên men lactic từ 9 – 12 ngày

Ở nhiệt độ 14 – 160C: lên men lactic từ 14 – 16 ngày

(Trần Minh Tâm, 1998)

2.7.5 pH của môi trường

- Cũng như nhiệt độ, pH cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên men của chúng Các vi sinh vật có

pH tối hảo khác nhau.Đối với vi sinh vật, bao giờ cũng có một khoảng pH thích hợp với sinh lí của chúng cũng như có một khoảng pH tối ưu để vận tốc lên men đạt cực đại, hoặc theo đúng hướng tạo sản phẩm theo yêu cầu Ở các giá trị pH khác nhau của môi trường lên men , ta có thể thu nhận các sản phẩm khác nhau

nấm men hoạt động là 4,5 – 5 Đối với vi khuẩn lactic khi pH < 4 thì vi khuẩn ngừng

hoạt động trong khi nấm men vẫn có thể phát triển (Trần Minh Tâm, 1998)

2.8 Một số sản phẩm cá lên men ngoài nước

2.8.1 Som Fug

- Tên chung: cá lên men của Thái

- Tên địa phương: Som Fug, Som dog, Pla fug, Pla mug, Fug som

- Nguyên liệu: các loại cá nước ngọt khác nhau 69%, muối 10,20%, cơm 13,8%, tỏi 6,9%

- Công nghệ sản xuất: chặt lấy thịt cá cho vào túi vải, vắt bỏ nước Trộn thịt cá với muối cơm tỏi Cho sang khay và đậy bằng chiếc khay khác Lên men ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày

- Đặc tính vật lý: dạng rắn, màu trắng (nếu chỉ sử dụng một loại cá), vị mặn và chua với mùi đặc trưng

- Giá trị dinh dưỡng: Protein 14 – 19%, chất béo 2,4 -2,9% trong 100g

- Vi sinh vật: Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus brevis, Staphylococcus sp, Bacillus sp

- Thời gian bảo quản và sử dụng 2 tuần

2.8.2 Pla chao

- Tên chung: cá lên men vị ngọt

- Tên địa phương của Thái Lan: Pla chao, Pla khaomak

- Nguyên liệu: cá nước ngọt tươi 37,5%, muối 12,5%, khaomak 50%

- Công nghệ sản xuất: chặt cá ra những miếng nhỏ có diện tích 1 inch, phối trộn

- Đặc tính vật lý: dạng rắn, màu nâu đến màu hồng,vị muối và mùi dễ chịu

- Đặc tính hóa học: pH = 4,1 – 5,3, acid lactic 1,08 – 3,8%, muối 4,35 – 9,48%

- Giá trị dinh dưỡng có đầy đủ Protein, chất béo, vitamin A, B trong 100g

-Vi sinh vật: Pediococcus cerevisiae, Staphylococcus sp, Micrococcus sp, Bacillus sp

- Thời gian bảo quản và sử dụng: 1- 2 năm

2.8.3 Pla Ra

- Tên chung: cá lên men

- Tên địa phương của Thái Lan: PlaRa, Pla ha, Ra

- Nguyên liệu: các loại cá nước ngọt khác nhau, hoặc cá biển 38,5%, muối 11,5%, bột gạo rang 50%

- Công nghệ sản xuất: cá được phối trộn với muối (10:3), cho vào khạp sành đậy thật kín Giữ trong 6 tháng, hàng ngày phơi nắng Cho thêm bột gạo rang tỉ lệ theo sản phẩm (1:1)

- Đặc tính vật lý: dạng rắn, màu hồng thẩm hay màu nâu, vị mặn

- Đặc tính hóa học: pH = 4,7- 6,2, acid lactic 0,37 – 3,15%, muối 7,77 – 17,89%

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP

Một số môi trường nuôi cấy và phân lập vi sinh vật: môi trường thạch MRS, MRS Broth, môi trường PCA, gelatin – pepton

Bảng 2: Tỉ lệ thành phần của môi trường phân lập MRS (DeMan, Rogosa and Sharpe)

Pepton from casein

8,0 20,0

2,0 1,0ml

2,0 5,0 0,2

0,04 14,0

Nguồn: Microbiology manual, MERCK, 2005 (Cat.No.1.10660) Pha chế: Hòa tan các thành phần trong 1000ml nước cất, đun nhẹ và khuấy

đều liên tục để hòa tan thạch Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

Bảng 3: Môi trường PCA (Plate Count Agar)

Nguồn: Microbiology manual, MERCK, 2005 (Cat.No.1.105463)

Pha chế: hòa tan các thành phần trong 1000ml nước cất , đun nhẹ và khuấy đều

liên tục để hòa tan thạch Hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút

Peptone from casein

D(+) glucose

Yeast extract

Agar

5,0 1,0

2,5 2,5

Bảng 4: Môi trường gelatin – pepton

Môi trường tăng sinh vi khuẩn lactic MRS Broth: có thành phần giống như

môi trường thạch MRS nhưng không bổ sung agar

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Khảo sát chất lượng sản phẩm từ quy trình truyền thống chế biến mắm chua xương mềm cá sặc

 Mục đích

- Tìm hiểu quy trình làm mắm truyền thống ở địa phương

- Phân tích các chỉ tiêu hóa học (và sau đó phân lập vi sinh ở thí nghiệm tiếp theo)

 Thực hiện

- Tiến hành thu mẫu ở huyện: Giá Rai, Tỉnh Bạc Liêu

- Tiến hành xác định các chỉ tiêu hóa học:

+ Xác định hàm lượng acid tổng số

+ Xác định hàm lượng đạm formol

+ Xác định đạm amoniac

+ Xác định hàm lượng đạm amin : Đạm amin = Đạm formol – Đạm amoniac

3.2.2 Quy trình truyền thống (nguồn huyện Giá Rai, tỉnh Bạc Liêu)

* Thuyết minh quy trình

- Nguyên liệu: cá sặc, cá phải tươi, kích cỡ đồng đều

- Xử lý: làm sạch cá, bỏ vây vẩy, nội tạng, đầu

- Rửa: dùng nước sạch, rửa sạch máu, nhớt bẩn

- Để ráo: thời gian 1 – 2 giờ (khi cảm quan thấy cá mềm là được)

- Ngâm rượu: cho rượu ngập mặt cá + 1 muỗng canh muối + 1 muỗng cafe bột

ngọt Thời gian ngâm khoảng 12 giờ (qua đêm)

- Để ráo: sau khi ngâm rượu xong vớt cá ra để ráo (khoảng 1 giờ)

+ Nấu nước mắm đường (to = 70oC) cho đường tan hết

chặt xuống dùng que tre gài lại

- Ủ: thời gian 30 - 45 ngày Thời gian đầu đem phơi nắng (3 ngày) sau đó để ở nhiệt độ phòng

3.2.3 Phân lập vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải sản phẩm mắm chua xương mềm cá sặc từ quy trình truyền thống

 Mục đích

- Phân lập vi sinh vật trong sản phẩm truyền thống

- Sử dụng nguồn vi sinh này với liều lượng thích hợp để tối ưu hóa quy trình sản xuất

 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi sinh vật trong thực phẩm

Lấy mẫu nước sản phẩm mắm chua đã thu mẫu trãi vào các đĩa petri chứa môi

trường MRS và môi trường PCA Ủ ở nhiệt độ 37o trong thời gian 24 – 48h Khi khuẩn lạc đã lên thì tiến hành cấy chuyển sang đĩa khác đến khi nhìn dưới kính hiển vi chỉ còn thuần một dòng chụp hình rồi chuyển vào ống nghiệm và trữ ở 4oC

3.2.4 Định danh sơ bộ vi sinh vật đã phân lập

 Mục đích

Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được là thuộc nhóm vi khuẩn nào

 Thực hiện

* Hình dạng: quan sát dưới kính hiển vi hình dạng, kích thước, màu sắc, dạng

bìa, độ nổi của vi sinh vật

Rượu 1 ly Thính: 50g Tỏi ớt

Nước mắm ngon 1/ 2chén (chén ăn cơm)

Đường 100g

- Phối trộn cho 1 kg cá làm

sạch