Phân Lập Vi Khuẩn Khử Lân Từ Chất Thải Nhà Máy Sữa Và Các Trại Chăn Nuôi Bò Sữa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ LÂN TỪ CHẤT THẢI NHÀ MÁY SỮA VÀ CÁC TRẠI CHĂN NUÔI

BÒ SỮA

MSSV:3064445 LỚP:CNSH K32

Cần Thơ, tháng 5/2010

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô giảng dạy chương trình đại học Công nghệ Sinh học khóa 32, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức về lĩnh vực Công nghệ Sinh học trong suốt quá trình tôi theo học tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn PGs.Ts Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn gợi ý

và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai - cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học khóa 32 đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn anh Bùi Thế Vinh - nghiên cứu sinh tại Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Xin cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm

Xin cảm ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 32 đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cần Thơ, ngày 04 tháng 05 năm 2010

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT

TÓM TẮT

Lân chiếm hàm lượng lớn trong nước thải sinh hoạt cũng như trong nước thải ngành công, nông nghiệp, trong đó có ngành nông nghiệp chăn nuôi bò sữa và ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm từ sữa và chính lân là tác nhân chính gây ra hiện tượng nở hoa trong nước Hàm lượng lân sẽ ảnh hưởng đến môi trường xung quanh nếu không có biện pháp xử lý Ngày nay, phương pháp xử lý sinh học được xem là phương pháp hữu hiệu nhằm giải quyết nạn ô nhiễm môi trường Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn khử lân từ chất thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa” được thực hiện góp phần xử lý môi trường giàu lân

Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu chất thải lỏng và rắn từ các trại chăn nuôi bò sữa, nhà máy sản xuất cũng như các trạm thu sữa ở đồng bằng sông Cửu Long và thành phố Hồ Chí Minh Bằng cách kiểm tra khả năng phát triển của vi khuẩn trên 2 môi trường có lân khác nhau đã xác định được 15 dòng vi khuẩn để tiến hành định lượng polyphosphate Kết quả có 4 dòng vi khuẩn tạo thành polyphosphate cao trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân

Từ khóa: Chu trình lân, khử lân, nước thải nhà máy sữa, phân lập, polyphosphate

http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về lân 3

2.1.1 Sơ lược về lân 3

2.1.2 Chu trình và sự biến đổi lân trong tự nhiên 4

2.1.3 Các dạng tồn tại của lân trong nước thải 5

2.2 Quá trình khử lân trong nước thải và vi khuẩn khử lân 6

2.2.1 Quá trình khử lân trong nước thải của vi khuẩn 6

2.2.2 Sơ lược về vi khuẩn khử lân 7

2.2.3 Sự tích lũy polyphosphates ở vi khuẩn 8

2.3 Những nghiên cứu về vi khuẩn lân và quá trình khử lân trong nước thải 8

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Phương tiện nghiên cứu 10

3.1.1 Dụng cụ thiết bị 10

a Dụng cụ thí nghiệm 10

b Thiết bị thí nghiệm 10

3.1.2 Vật liệu 12

3.1.3 Hóa chất 12

http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

a Các hóa chất pha môi trường phân lập vi khuẩn 12

b Các hóa chất pha môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân 12

c Các hóa chất pha môi trường lân khó tan 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3 2.1 Thu mẫu 13

3.2.2 Phân lập vi khuẩn 14

a Pha loãng và trãi mẫu 14

b Làm ròng, kiểm tra độ ròng, quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 15

c Trữ mẫu và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn 16

3.2.3 Kiểm tra khả năng khử lân của vi khuẩn 17

a Xác định khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường có lân 17

b Xác định khả năng chuyển thành polyphosphate 17

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu rắn và lỏng đã thu 19

4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 19

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập 20

4.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập 24

4.2.1 Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân có bổ sung 2% agar 24

4.2.2 Kết quả kiểm tra khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường lân khó tan 28

4.3 Xác định các dòng vi khuẩn có khả năng khử lân và kết quả đo polyphosphate của các dòng vi khuẩn đã nuôi 31

4.3.1 Xác định các dòng có khả năng khử lân 31

4.3.2 Kết quả đo polyphosphate 34

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 36

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Bảng thành phần hóa chất trong vi lượng của môi trường tối thiểu (Sikorski et al., 2002)

Phụ lục 2 Thành phần hóa chất trong nước muối nhân tạo (artificial seawater- SW) của môi trường tối thiểu (Sikorski et al., 2002)

Phụ lục 3 Bảng thành phần hóa chất trong vết kim loại của môi trường nuôi cấy

vi khuẩn khử lân (Wang et al., 2008)

Phụ lục 4 Tổng hợp kết quả đo polyphosphate của các dòng vi khuẩn và địa điểm, nguồn gốc của chúng

Phụ lục 5 Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn đo được hàm lượng polyP cao nhất và thấp nhất

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Hóa chất pha chế môi trường phân lập vi khuẩn 12

Bảng 3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân 12

Bảng 3.3 Thành phần môi trường lân khó tan 13

Bảng 4.1 Tổng hợp kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 19

Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập 20

Bảng 4.3 Các đặc điểm về vi khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập 22

Bảng 4.4 Các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập 23

Bảng 4.5 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân (Wang et al., 2008) có bổ sung 2% agar 25

Bảng 4.6 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn theo thời gian 27

Bảng 4.7 Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường lân khó Tan (Nautiyal, 1999) 29

Bảng 4.8 Tổng hợp kết quả khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân và môi trường lân khó tan 32

Bảng 4.9 Kết quả đo polyphosphate 34

Bảng 4.10 Tổng hợp kết quả kiểm tra của các dòng vi khuẩn đo được hàm lượng polyP cao nhất và thấp nhất 35

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Chuỗi cấu trúc của polyphosphate 3

Hình 2.2 Chu trình lân trong tự nhiên 5

Hình 2.3 Chu trình biến đổi lân trong tự nhiên 6

Hình 2.4 Tiến trình cải thiện gen của K aerogenes cho quá trình biến đổi Pi, mà nó được sinh ra từ quá trình oxi hóa Pt và bẽ gãy Pn để hình thành polyP 9

Hình 3.1 Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 11

Hình 3.2 Mẫu chất thải rắn và lỏng tại trại chăn nuôi bò sữa 13

Hình 3.3 Các tỷ lệ pha loãng vi sinh vật 14

Hình 3.4 Mẫu trãi phát triển trên môi trường Minimal 15

Hình 3.5 Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trãi 15

Hình 3.6 Khuẩn lạc ròng được trữ trong ống nghiệm 17

Hình 3.7 Vi khuẩn được nuôi trong ống Falcon và được lắc trên máy lắc 18

Hình 4.1 Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân lập 24

Hình 4.2 Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân 28

Hình 4.3 Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường lân khó tan 31

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong suốt thế kỷ qua, những vấn đề về môi trường được quan tâm như là những vấn đề của địa phương bởi vì sự tác động của nó đến từ một sản phẩm nào đó Tuy nhiên, ngày nay nó trở nên càng bức thiết hơn vì các vấn đề về môi trường phức tạp hơn và liên quan đến tất cả các công đoạn trong chu trình của sản phẩm, từ việc trích nguyên vật liệu đến chất thải hoặc cặn bã của sản phẩm đã sử dụng

Trong chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam đề ra mục tiêu tăng đàn bò sữa từ 104 ngàn con (2005) lên

200 ngàn con vào (2010) Sản lượng sữa từ 200 ngàn tấn tăng lên 377 ngàn tấn Vì vậy

số lượng bò sữa, chuồng trại chăn nuôi bò sữa sẽ tăng trong vài năm tới Tuy nhiên, với diện tích chuồng trại hẹp, trong khi không có hoặc không hoàn chỉnh hệ thống xử

lý chất thải thì lượng chất thải mà bò sữa cũng như các nhà sản xuất thải ra là một vấn

đề lớn (http://www.dairyvietnam.org.vn)

Lân (phospho=P) là thành phần quan trọng của tất cả các sinh vật sống Thành phần lân trong nước thải chiếm một tỷ lệ lớn và góp phần to lớn gây ô nhiễm môi trường Tổng lân từ 18-29 mg/lít, trong đó phosphate chiếm 6-24 mg/lít nước thải sinh hoạt điển hình (http://www.ces.ncsu.edu)

Hiện tại, có một số phương pháp hóa học và sinh học có thể được dùng để khử lân trong nước thải Trong phương pháp hóa học, lân được khử bằng cách kết tủa với vôi (Ca(OH)2), thành dạng calcium hydroxyapatide (Ca5OH(PO4)3) dưới điều kiện kiềm (Fytianos et al., 1998) Tuy nhiên, việc khử lân bằng phương pháp hóa học có nhược điểm là giá thành hóa chất cao và có thể gây tái ô nhiễm môi trường Do đó, phương pháp hữu hiệu thường được sử dụng ngày nay là phương pháp sinh học Chủ yếu dựa vào sự tích lũy lân trong nội bào hay trong môi trường sống của vi khuẩn Chính vì những lý do đó, việc tiến hành “Phân lập vi khuẩn khử lân từ chất thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa” được đặt ra, từ đó có thể sử dụng nguồn vi sinh vật này vào quy trình xử lý nhằm góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường do quá trình chăn nuôi bò sữa và quá trình chế biến sữa gây ra

Mục tiêu chính của đề tài là phân lập một số dòng vi khuẩn khử lân từ các nguồn thải (mẫu lỏng và mẫu rắn) từ các trại chăn nuôi ở Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền

Giang,… các trạm thu mua sữa ở thành phố Hồ Chí Minh và mẫu nước thải nhà máy sữa tại Cần Thơ,…

Nội dung nghiên cứu gồm:

- Phân lập một số dòng vi khuẩn khử lân trong nước thải ở trạm thu mua sữa, nước thải nhà máy sữa và nguồn thải ở các trại chăn nuôi bò sữa

- Xác định khả năng khử lân của các dòng vi khuẩn đã phân lập

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2 1 Sơ lược về lân

2.1.1 Sơ lược về lân

Lân là thành phần chủ yếu và cần thiết cho tất cả các tế bào sống, cấu tạo nên ATP (adenosine triphosphate), nucleic acid (ADN và ARN), phospholipid, teichoic acid, teichuronic acid và là thành phần của răng và xương

Vai trò của các thành phần chứa lân:

+ ATP là phân tử giàu năng lượng, được dùng để vận chuyển năng lượng trong

tế bào

+ Phospholipid là thành phần quan trọng trong cấu trúc màng tế bào

+ Teichoic acid là thành phần quan trọng trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương

Lân còn được dự trữ trong tế bào như là hạt nhỏ volutin hay polyphosphate (polyP) Lân có thể chiếm từ 1-3% trọng lượng khô của vi khuẩn Lân có thể tồn tại dạng vô cơ hay hữu cơ Dạng vô cơ của lân gồm orthophosphate và polyP (Gerardi, 2006)

+ Orthophosphate có giá trị đối với sự chuyển hóa sinh học mà không cần có thêm sự hòa tan nào Orthophosphate được coi như là chất dinh dưỡng lân có giá trị cho vi khuẩn sử dụng trong các hệ thống xử lý nước thải và cho thực vật thủy sinh trong nước tự nhiên Orthophosphate bao gồm PO43-, HPO42-, H2PO4- và H3PO4 Dạng orthophosphate phổ biến nhất trong các hệ thống xử lý nước thải là HPO42- Số lượng của mỗi loại tùy thuộc vào pH của môi trường Trong hầu hết các hệ thống xử lý chất thải HPO42-, H2PO4- là dạng nổi trội ở giá trị pH lớn hơn 7

Hình 2.1 Chuỗi cấu trúc của polyphosphate

(Nguồn: www.dairyscience.info/industrial sms.html, ngày 23/04/2010)

+ PolyP là phân tử phức hợp của hai hay nhiều phân tử phospho với nguyên tử oxy và có thể có nguyên tử hydro PolyP được thể hiện bằng công thức hóa học của ion pyrophosphate (P2O73-) Pyrophosphate là thành phần đầu tiên trong chuỗi polyP không phân nhánh (P3O105-) PolyP trải qua sự thủy phân rất chậm và giải phóng orthophosphate, sự thủy phân có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học hay sinh học nhờ vi khuẩn và tảo Sự thủy phân của polyP chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm thời gian và pH trong bình hiếu khí, dạng chính khi orthophosphate được thủy phân là tùy thuộc vào pH của môi trường Nhờ vào tính ổn định của nước, polyP còn dễ dàng tách khoáng như là aluminum, calcium, và iron

Phosphate (Pi) có thể gắn với các hợp chất hữu cơ gọi là lân hữu cơ Những hợp chất lân hữu cơ thì ít quan trọng trong nước thải chăn nuôi, nhưng nó trở nên đáng lo ngại trong nước thải công nghiệp và bùn Những dạng chất hữu cơ phổ biến của lân gồm inositol phosphates, nucleic acids, phospholipids, phytin Phytin là acid hữu cơ tìm thấy ở bắp và đậu nành rất khó bị phân hủy (Gerardi, 2006)

2.1.2 Chu trình và sự biến đổi lân trong tự nhiên

Pi được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ăn thực vật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào trong đất Hầu hết

Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liên kết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lại đất thì những

Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô cơ hoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành một thành phần hữu

cơ của đất Sự phóng thích của những Pi vô cơ từ những Pi hữu cơ được gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được vi sinh vật bẽ gãy những liên kết hữu cơ Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm của đất (Busman et al., 2009)

Hình 2.2 Chu trình lân trong tự nhiên

(Nguồn:http:// www.arnica.csustan.edu/ /phosphorus_cycle.htm, ngày 05/11/2009; (TV) Thực vật; (Pi) Phosphate )

Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình lân diễn ra trong tự nhiên Chu trình oxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron một cách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự nhiên Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử (redox) của lân nhưng những cơ chế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểu một cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996)

2.1.3 Các dạng tồn tại của lân trong nước thải

Hợp chất lân là một trong những thành phần chất gây ô nhiễm trong công nghiệp

và thải ra bên ngoài Hợp chất chiếm số lượng lớn gây ô nhiễm môi trường chủ yếu là

Pi và các gốc phosphonate (Pn) Tuy nhiên, việc loại thải phosphite (Pt)-bao gồm nước thải công nghiệp trở nên một vấn đề khó khăn đối với một nền công nghiệp công nghệ

Tảo, TV phù du

Nuôi sống sinh vật dị dưỡng

Sự hô hấp tế bào thải ra Phoshate (Pi)

Pi dư thừa từ phân bón

cao Pi được phát hiện giống như một thành phần dinh dưỡng góp phần vào sự điều hòa của những ao, hồ, vịnh và những nguồn nước tự nhiên khác Quy trình sử dụng bùn hoạt tính đã được sử dụng phổ biến để xử lý nước thải Nó rất hiệu quả trong quá trình xử lý các hợp chất hữu cơ nhưng khi sử dụng để xử lý Pi thì rất hạn chế Pn là những hợp chất mà có liên kết C-P, chúng được sử dụng khắp nơi dưới dạng phân bón, thành phần chất tẩy, những chất kháng sinh…Liên kết C-P tương đối bền trước sự thủy phân hóa học và sự thủy phân bằng nhiệt khi so sánh với liên kết ester C-O-P của Pi

Pn tương đối hiếm trong vật liệu sống và thường hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối rửa

Hình 2.3 Chu trình biến đổi lân trong tự nhiên (Ohtake et al., 1996)

Trước đây không lâu, một lượng lớn hypophosphite (H2PO2-) đã được sử dụng để làm giảm lượng ion kim loại trong quá trình mạ kim loại Sau mạ kim loại, nước thải tích lũy một lượng lớn phosphite (HPO32-) giống như một acid hữu cơ nó như pH đệm

và ion kim loại làm ổn định môi trường Bởi vì, Pi hoạt động rất hạn chế, nó phụ thuộc vào sự oxi hóa chuyển Pt thành Pi Tuy nhiên, hiện nay, sự oxi hóa Pi thật sự không hiệu quả khi môi trường tập trung các acid hữu cơ ở mức độ cao (Ohtake et al., 1996)

2.2 Quá trình khử lân trong nước thải và vi khuẩn khử lân

2.2.1 Quá trình khử lân trong nước thải của vi khuẩn

Trong tự nhiên, lân có thể được tìm thấy ở những nơi mà vi sinh vật hoạt động và phát triển Đối với trường hợp lân bị giới hạn, vi sinh vật sẽ tiết ra một phức hợp làm nhiệm vụ là một hệ thống điều tiết để đồng hóa lân một cách hiệu quả Ví dụ, một số

Sự oxi hóa

Sự khử

Sự bẽ gãy

loài vi khuẩn có thể cắt đứt liên kết C-P và dùng Pn như là một nguồn duy nhất trong điều kiện môi trường hạn chế Pi Vi khuẩn cũng có liên quan đến quá trình chuyển hóa

Pt sang Pi Hơn nữa, nhiều vi khuẩn tham gia kích thích vào quá trình tích lũy Pi để hình thành polyP Mặc dù những chức năng của những vi sinh vật này là những tiềm năng thích hợp để áp dụng vào công nghệ ngăn chặn sự ô nhiễm, tuy nhiên chúng chưa được khai thác một cách đầy đủ cho những mục đích này (Ohtake et al., 1996)

2.2.2 Sơ lược về vi khuẩn polyphosphate

Vi khuẩn polyP được biết như là những sinh vật tích lũy lân (PAOs), vi khuẩn polyP tích trữ lân chủ yếu dưới dạng polyP nội bào Vi khuẩn được sử dụng trong quá trình “Làm tăng thêm sự loại bỏ lân sinh học” (EBPR) hay “Lấy đi lân dư thừa” Quá trình này xảy ra khi lân được lấy đi bởi vi khuẩn như là nhu cầu dư thừa của tế bào Hàm lượng lân trong bùn hoạt tính là xấp xỉ 1-3% Khi EBPR được sử dụng, lượng lân trong bùn hoạt tính có thể là 6-7% (Gerardi, 2006)

Quá trình đồng hóa của EBPR sử dụng 2 nhóm vi khuẩn, vi khuẩn lên men và vi khuẩn polyP, do đó có ít nhất hai bình xử lý được sử dụng trong EBPR, bình kỵ khí và bình hiếu khí Vi khuẩn lên men kỵ khí bắt buộc hoặc không bắt buộc, trong khi vi khuẩn polyP là hiếu khí nghiêm ngặt Chìa khóa của EBPR là vi khuẩn polyP với sự xen kẽ điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trong bình kỵ khí, nhu cầu oxi hóa sinh cacbon (carbonaceous biochemical oxygen demand-cBOD) được lên men trong sự vắng mặt của oxy tự do và nitrate, quá trình lên men tạo ra rất nhiều acid béo bay hơi, vi khuẩn polyP nhanh chóng hấp thụ acid béo này và trùng hợp (trữ) acid béo này như là hạt tinh bột không tan (poly-β-hydroxybutyrate (PHB)) PHB trong vi khuẩn polyP có hai nhiệm vụ chính, thứ nhất giúp vi khuẩn sinh trưởng và tạo nên polyP bằng cách lấy đi

Pi hòa tan, thứ hai PHB cùng với polyP giúp cho vi khuẩn polyP hiếu khí sống sót trong điều kiện kỵ khí

Sự trùng hợp của acid béo đòi hỏi sự tiêu dùng năng lượng tế bào của vi khuẩn polyP, sự tiêu dùng này hoặc năng lượng này thì được bẽ gãy hay do sự phóng thích của orthophosphate từ vi khuẩn polyP Kết quả sự phóng thích orthophosphate từ vi khuẩn polyP là trong bình kỵ khí có chứa hai nhóm lân là lân trong nước thải và lân được phóng thích bởi vi khuẩn polyP

Trong bình hiếu khí, vi khuẩn polyP sử dụng oxy tự do để làm thoái giảm PHB được tích trữ như là nguồn năng lượng và carbon Vi khuẩn polyP hấp thu

orthophosphate để tích trữ năng lượng được phóng thích từ sự thoái giảm PHB Lân sau khi hấp thụ được đồng hóa thành đại phân tử và được tích trữ như là hạt nhỏ polyP hay volutin Sự loại bỏ lân đạt được khi vi khuẩn trong bùn được thải ra từ bình thứ cấp, bùn này không được đưa trở lại bình kỵ khí khi quy trình EBPR được lặp lại Bằng các hoạt động của vi khuẩn polyP trong điều kiện kỵ khí và hiếu khí, vi khuẩn polyP lấy đi lân dư thừa như là nhu cầu bình thường của tế bào (Gerardi, 2006)

2.2.3 Sự tích lũy polyphosphate ở vi khuẩn

PolyP được tổng hợp bằng con đường sinh học là một chất tổng hợp gồm một dãy Pi vô cơ và phần còn lại được liên kết với một liên kết cao năng phosphoanhydride Nhiều vi khuẩn có khả năng tích lũy Pi để tạo thành polyP Một enzyme đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tổng hợp để tạo thành

polyP ở Escherichia coli là polyP kinase (PPK)-sử dụng γ-Pi của ATP để kéo dài

chuỗi polymer (Kuroda và Ohtake,2000)

2.3 Những nghiên cứu về vi khuẩn khử lân và quá trình khử lân trong nước thải

Những lý thuyết truyền thống cho rằng sự loại bỏ lân sinh học (BPR) trong quy trình bùn hoạt tính được thực hiện với pha kỵ khí và pha hiếu khí Nhóm vi khuẩn này

gồm Acinetobacter, Pseudomonas (Kim và Pagilla, 2000; Lin et al., 2003)

Lotter và Murphy (1985) cho rằng Pseudomonas ssp., Moraxella ssp., Aeromonas ssp…cũng có khả năng tích lũy polyP ở điều kiện hiếu khí trong bùn hoạt

tính

Những hiểu biết về cơ chế sinh hóa và gen của vi khuẩn chuyển, biến dưỡng lân thì rất cần thiết nhằm tăng khả năng loại thải lân khỏi nước thải Trước đây, Ohtake et

al đã nhân đoạn gen Klebsiella aerogenes ppk mã hóa polyP kinase (PPK) lên, nó là

một enzyme chủ chốt trong quá trình tổng hợp polyP Năm 1996, Ohtake et al có bài

báo cáo về sự nhân lên của gen K aerogenes phn-phụ thuộc vào sự phân hủy Pn và quá trình oxi hóa Pt, Pseudomonas putida pst mã hóa một đoạn gen và tham gia một

cách hiệu quả quá trình biến đổi Pi Với việc sử dụng những gen này Ohtake et al đã

nghiên cứu tính khả thi của gen cải thiện sự tổng hợp Pi ở P putida PRS2000

Escherichia coli MV1184 và K aerogenes ATCC9621 nuôi trên môi trường agar

L có bổ sung kháng sinh thích hợp P putida PRS2000 được nuôi trên agar L ở 30oC

và sử dụng plasmid pKP04 (Ohtake et al., 1996)

Hình 2.4 Tiến trình cải thiện gen của Klebsiella aerogenes cho quá trình

biến đổi Pi, mà nó được sinh ra từ quá trình oxi hóa Pt và bẽ gãy Pn để hình thành polyP (Ohtake et al., 1996)

Ngoài PPK ở E.coli chứa một enzyme exopolyphosphate (PPX), enzyme này có

hoạt tính cao trong quá trình xúc tác sự thủy phân phần cuối của chuỗi dài polyP để tạo thành Pi Ở vi khuẩn, nó được giải thích bằng sự tích lũy polyP xảy ra trong điều kiện

môi trường mất cân bằng dinh dưỡng Sự tích lũy và biến mất của polyP ở E.coli dao

động từ 100 đến 1000 lần Khía cạnh nổi bật của sự trao đổi polyP là tính dễ biến đổi của hàm lượng polyP, do vậy nó sẽ ảnh hưởng đến nhiều chức năng của tế bào PPK được trữ với một lượng lớn ở nhiều loài vi khuẩn

Theo Kuroda và Ohtake (2000), tích lũy polyP là sự phản ứng lại sự thiếu hụt acid amin Nồng độ polyP được thay đổi từ 1 đến 15 nmol/mg protein trong phạm vi

15 phút cho phản ứng thiếu acid amin Sự tích lũy này được thể hiện ở nhiều vi sinh

vật bao gồm Klebsiella aerogenes và Pseudomonas aeruginosa Sự thiếu hụt acid

amin có thể là một dấu hiệu cho sự tích lũy polyP Tuy nhiên, sự thay đổi là không có

ý nghĩa giữa hoạt động của PPK hoặc là PPX, mà những enzyme này được chiết suất

từ những tế bào tự nhiên trong suốt quá trình thiếu acid amin (Kuroda và Ohtake, 2000)

Sự trùng hợp

Sự phân tách C-P

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh vật thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, trường Đại Học Cần Thơ

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị

a Dụng cụ thí nghiệm

- Keo nhựa đựng mẫu chất thải lỏng và rắn

- Đĩa petri; Que cấy trang thủy tinh, que cấy; Đền cồn; Cồn 96O, cồn 70O

- Bình tam giác 250 ml và 500 ml; Ống nghiệm; Giá ống nghiệm

- Lam, lamen, giấy

- Tủ cấy vi sinh vật Flow Cabinet 125B-81804 (Pháp) và ESCO (Singapore)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức)

- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)

- Micropipette Gibson P50, P200, P1000

- Máy chụp hình

- Máy vi tính trữ số liệu

Hình 3.1 Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

3.1.2 Vật liệu

Mẫu chất thải rắn và lỏng từ các trại chăn nuôi bò sữa ở thành phố Cần Thơ, ở tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Đồng Tháp, tỉnh Sóc Trăng, tỉnh Tiền Giang; từ nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ và trạm thu mua sữa ở thành phố Hồ Chí Minh

3.1.3 Hóa chất

a Các hóa chất pha môi trường phân lập vi khuẩn

Bảng 3.1 Hóa chất pha chế môi trường phân lập vi khuẩn

b Các hóa chất pha môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân

Bảng 3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân

c Các hóa chất pha môi trường lân khó tan

Môi trường tối thiểu-Minimal (Sikorski et al., 2002)

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn khử lân (Wang et al., 2008)

Bảng 3.3 Thành phần môi trường lân khó tan

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Khối lượng và thể tích mẫu không nhất định, vừa đủ để tiến hành pha loãng và trữ lại không khuấy, đảo, trộn chất thải trước khi lấy mẫu

Hình 3.2 Mẫu chất thải rắn và lỏng tại trại chăn nuôi bò sữa

Môi trường lân khó tan (Nautiyal, 1999)

Địa điểm thumẫu: Mẫu chất thải được lấy tại các địa điểm dưới đây

- Nhà máy sữa Vinamilk tại Cần Thơ

- Trạm thu mua sữa thành phố Hồ Chí Minh

- Chuồng bò tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Ô Môn, TP Cần Thơ

- Chuồng bò hộ gia đình ở huyện Phong Điền, TP Cần Thơ

- Chuồng bò hộ gia đình ở huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long

- Chuồng bò hộ gia đình ở huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp

- Chuồng bò hộ gia đình ở huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng

- Chuồng bò hộ gia đình ở huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang

3.2.2 Phân lập vi khuẩn

a Pha loãng và trãi mẫu

- Cân 1g mẫu rắn cho vào 99 ml nước cất vô trùng (đã chuẩn bị trước) trong bình tam giác 250 ml, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu Để các bình pha loãng trên máy lắc khoảng 30-60 phút Mẫu lỏng không cần pha loãng

- Mẫu được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau (thường theo tỷ lệ 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000) nhằm tránh hiện tượng không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít nhau trên mặt thạch như thế không thể phân lập được (Nguyễn Đức Lượng et al., 2003)

Hình 3.3 Các tỷ lệ pha loãng vi sinh vật

(Nguồn: http://www.apsnet.org/ /PhotosA-D/dilutionplating.htm, ngày 21/12/2009 )

- Dùng Micropipette P100 hút lần lượt 50 µl mẫu dung dịch, sau đó nhỏ lên đĩa petri có môi trường tối thiểu (Minimal medium) Sử dụng que gạt trãi mẫu đều khắp trên mặt thạch Đĩa trãi mẫu được ủ trong tủ ủ vi sinh vật ở 30oC trong 24-48 giờ để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc

Hình 3.4 Mẫu trãi phát triển trên môi trường Minimal

b Làm ròng, kiểm tra độ ròng, quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

- Chọn tất cả khuẩn lạc có hình dạng khác nhau từ đĩa môi trường trãi mẫu cấy

chuyển lên môi trường phân lập Cấy chuyển nhiều lần sang môi trường phân lập đến khi các khuẩn lạc đồng đều và rời nhau

A Mẫu còn bị nhiễm với các dạng (x, y) khuẩn lạc khác nhau B Mẫu với khuẩn lạc rời

Hình 3.5 Khuẩn lạc cấy chuyển từ mẫu trãi

Sau đó cấy chuyển giống vi sinh vật, các bước thực hiện như sau:

+ Hơ đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn