Phân Lập Vi Khuẩn Khử Đạm Từ Nước Thải Nhà Máy Sữa Và Các Trại Chăn Nuôi Bò Sữa

Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ mẫu chất thải lỏng và rắn của các nhà máy sữa, trại chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long ĐBSCL.. Kết quả khảo sát kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA VÀ CÁC TRẠI CHĂN NUÔI BÒ SỮA

MSSV:3064464

Cần Thơ, Tháng 5/2010

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

PGs.Ts Cao Ngọc Điệp Ngô Mỹ Ngân

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGs.Ts Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và cho những lời khuyên hết sức quý báu, bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công nghệ sinh học khóa 32 đã luôn quan tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện đề tài

Quý Thầy, Cô giảng dạy chương trình đại học Công nghệ sinh học khóa 32, trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cần thiết trong suốt quá trình tôi theo học tại trường

Anh Bùi Thế Vinh, nghiên cứu sinh tại Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cán bộ phòng thí nghiệm vi sinh vật của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến sự quan tâm và giúp đỡ quý báu này

Sinh viên thực hiện

Ngô Mỹ Ngân

TÓM TẮT

Ô nhiễm đạm là vấn đề đang được quan tâm trong xử lý môi trường hiện nay Hàm lượng ammonia, nitrate trong nước thải cao ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thủy sinh động, thực vật và sức khỏe con người Hiệu quả của quá trình loại bỏ nitrogen bằng vi khuẩn khử đạm đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước Vì vậy, đề tài “ Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa” được thực hiện

Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ mẫu chất thải lỏng và rắn của các nhà máy sữa, trại chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) Khảo sát trên môi trường tối thiểu có bổ sung NH 4 + , NO 2 - , NO 3 - với nồng độ từ 100-700mM, kết quả nhận được cả 47 dòng vi khuẩn đều có khả năng oxy hóa ammonium và khử nitrate Ở nồng độ 100mM, 47/47 dòng phát triển được trên cả hai môi trường bổ sung NH 4 + , NO 3 - , 11/47 dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường

bổ sung NO 2 - Ở nồng độ 700mM, có 5/47 dòng có khả năng oxy hóa ammonium và 15/47 dòng có có khả năng khử nitrate

Từ khóa: ammonium, chu trình nitơ, nitrite, nitrate, nước thải nhà máy sữa, vi khuẩn

khử đạm

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Chu trình nitơ 3

2.2 Vi khuẩn khử đạm 5

2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới và trong nước 6

2.3.1 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới 6

2.3.2 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trong nước 9

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện nghiên cứu 11

3.1.2 Nguyên vật liệu 11

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 11

3.1.3 Hóa chất 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 13

3.2.2 Phương pháp phân lập 13

3.2.3 Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium và khử nitrite, nitirate 15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh, thành ở ĐBSCL, trạm thu mua sữa TP.HCM và mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk 17

4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 17

4.1.2 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập 18

4.1.3 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập 20

4.2 Kết quả khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và nitrate của các dòng vi khuẩn phân lập 24

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Thành phần hoá chất pha chế môi trường Minimal phân lập vi khuẩn 12Bảng 3.2: Thành phần môi trường Minimal bổ sung Nitrate, Nitrite và Ammonium 100mM 16Bảng 4.1: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa, trạm thu mua sữa và nhà máy sữa Vinamilk 17Bảng 4.2: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập 18Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập 20Bảng 4.4: Tỷ lệ phần trăm về hình dạng và khả năng chuyển động của 47 dòng vi khuẩn phân lập 23Bảng 4.5: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của 47 dòng vi khuẩn phân lập 24Bảng 4.6: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung

NH4+, NO2-, NO3- ở 100mM 25Bảng 4.7: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung

NH4+, NO3- ở 200mM 27Bảng 4.8: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung

NH4+, NO3- ở 300mM 29Bảng 4.9: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung

NH4+, NO3- ở 400mM, 500mM và 600mM 31Bảng 4.10: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Chu trình nitơ 3

Hình 3.1: Một số dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 12

Hình 3.2: Mẫu chất thải lỏng và mẫu chất thải rắn 13

Hình 3.3: Mẫu trải phát triển trên môi trường Minimal 14

Hình 3.4: Khuẩn lạc sau khi cấy chuyển 14

Hình 3.5: Khuẩn lạc ròng được trữ trong môi trường Minimal 15

Hình 4.1: Khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường Minimal 22

Hình 4.2a: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung 500mM NH4+ 33

Hình 4.2b: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung 500mM NO3- 34

Hình 4.3a: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung 600mM NH4+ 34

Hình 4.3b: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung 600mM NO3- 34

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Từ lâu, sữa là thực phẩm thiết yếu hàng ngày của người tiêu dùng ở nhiều nước trên thế giới Tại Việt Nam, những năm gần đây do điều kiện kinh tế phát triển, thu nhập người dân tăng lên nên nhu cầu tiêu dùng cũng tăng theo, trong đó có nhu cầu tiêu dùng sữa Tuy nhiên, sản lượng sữa hiện nay không đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước Vì vậy, ngành chăn nuôi bò sữa hiện đang được khuyến khích phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu này Theo số liệu thống kê của Tổng cục Thống kê về số lượng

bò sữa và sản lượng sữa năm 2008, tổng số đàn bò sữa Việt Nam hiện đã lên đến 107.983 con, sản lượng sữa đạt 262.160 tấn nhưng chỉ mới đáp ứng khoảng 25% nhu

cầu sữa trong nước (http://www.dairyvietnam.org.vn/vi/statistics.php?mnu=4&tkid=1 5&dmtk=9)

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng có truyền thống và có điều kiện chăn nuôi bò nhưng lại chậm phát triển Từ năm 2000 tới nay, nhờ chương trình phát triển bò sữa quốc gia (theo quyết định 167/QĐT.Tg của Thủ tướng ngày 26/10/2001),

đã tạo ra sự chuyển biến mạnh mẽ về vị trí con bò nói chung, bò sữa nói riêng trong sản xuất nông nghiệp Một số tỉnh đang dẫn đầu về đàn bò sữa tại ĐBSCL như Long

An, Tiền Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, đã và đang có nhiều dự án khuyến khích phát triển đàn bò sữa trong nông dân giúp họ làm giàu, cải thiện đời sống

có hơn 20.000 người tử vong do điều kiện nước sạch và vệ sinh thấp kém.) Còn theo thống kê của Bộ Y tế, hơn 80% các bệnh truyền nhiễm ở nước ta liên quan đến nguồn

nước Người dân ở cả nông thôn và thành thị đang phải đối mặt với nguy cơ mắc bệnh

do môi trường nước đang ngày một ô nhiễm trầm trọng (http://un.org.vn/index.php

?option=com_content&view=section&layout=blog&id=9&Itemid=187&lang=vi&limitstart= 42).

Vì vậy, việc xử lý chất thải góp phần giảm thiểu tác hại của ô nhiễm nước đang

là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu môi trường Nguyên tắc cơ bản của

xử lý môi trường là loại bỏ các chất độc hại và nguồn chất hữu cơ có trong chất thải Tầm quan trọng của việc loại bỏ các vật chất hữu cơ trong chất thải, đặc biệt là nước thải, liên tục được nhấn mạnh qua nhiều nghiên cứu và điều luật môi trường Một trong hai chỉ tiêu chính trong nước thải được quy định là nitơ tổng số (Toet et al., 2005; Joeng et al., 2006; Zhang et al., 2008) Nitrate (NO3-) hòa tan dễ dàng trong nước Nước có nồng độ nitrate cao sẽ gây nên hiện tượng phú dưỡng làm một số loài tảo, rong rêu phát triển quá mức Các loài rong rêu sẽ chiếm lấy và làm giảm oxy trong nước, phá hủy hệ thủy sinh động vật Hơn nữa khi vào cơ thể con người nitrate có thể biến đổi thành nitrit (NO2-), một hợp chất gây ung thư Trong tự nhiên, quá trình khử đạm được xem là then chốt của chu trình nitơ Quá trình này được ứng dụng trong xử

lý nước thải và được xem là một cách loại trừ ammonium, nitrate hiệu quả nhờ vào hoạt động của một số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria) Biện pháp xử lý bằng vi sinh vật này được chú ý đặc biệt do hiệu quả xử lý cao và ít tốn chi phí Để xử

lý triệt để cần phải có sự phối hợp hoặc hoạt động nối tiếp của nhóm vi khuẩn nitrate hóa (oxy hóa ammonium thành nitrate) và vi khuẩn khử nitrate (khử nitrate thành NO,

NO2 và N2) (Lee et al., 2002)

Với mục tiêu tìm kiếm các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao có thể ứng dụng trong xử lý nước thải từ trại chăn nuôi bò sữa và nhà máy sữa, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các trại chăn nuôi bò sữa”

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được một số dòng vi khuẩn khử đạm từ nước thải trại chăn nuôi bò sữa

và nhà máy sữa Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và khử nitrate của

những dòng vi khuẩn phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Chu trình nitơ

Nitơ giữ một vai trò quan trọng trong đời sống của các sinh vật Nitơ là thành phần thiết yếu của protein; axit nucleic DNA và RNA; trong các enzyme; tham gia cấu tạo các hợp chất dự trữ năng lượng ADP và ATP… Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 2 dạng:

- Dạng tự do: nitơ trong không khí

- Dạng hợp chất: dạng vô cơ (NH4+, NO3-,…), dạng hữu cơ (acid amin, protein,…)

Hình 2.1: Chu trình nitơ

(Nguồn: http://tulieu.violet.vn/document/show/entry_id/122642/cm_id/800569)

Các dạng nitơ trên chuyển hóa nhờ vào hoạt động của sinh vật tạo nên chu trình nitơ trong tự nhiên bao gồm các quá trình cơ bản sau:

- Quá trình cố định nitơ ( Nitrogen fixation):

Khí nitrogen là khí chiếm lượng nhiều nhất trong không khí (79%) Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật không có khả năng sử dụng dạng nitơ này vì cầu nối ba hóa trị giữa hai nguyên tử nitơ làm cho phân tử N2 gần như là một khí trơ Để sử dụng được,

nitơ phải được "cố định" (kết hợp) dưới hình thức ion ammonium (NH4+) hoặc nitrate (NO3-) Các vi khuẩn cố định đạm có khả năng tổng hợp các enzyme cắt đứt liên kết ba giữa hai nguyên tử nitơ của phân tử nitơ trong không khí, chuyển về dạng ammonia cây trồng hấp thu được

- Quá trình nitrate hóa (Nitrification):

Sự nitrate hóa là sự chuyển đổi ammonium (NH4+) thành nitrate (NO3-) bằng hoạt động của các vi sinh vật Quá trình này được thực hiện bằng hai loại vi sinh vật, trong hai giai đoạn: chuyển ammonium thành nitrite và chuyển nitrite thành nitrate Chuyển ammonium thành nitrite: Việc chuyển ammonium thành nitrite được thực hiện bởi các vi khuẩn oxi hóa ammonium, các vi khuẩn này được xếp vào nhóm

phụ beta (Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus, và Nitrosovibrio) và gamma proteobacteria (Nitrosococcus) Nitrosomonas (như loài N europaea) là loài vi khuẩn

tự dưỡng oxi hóa ammonium thành nitrite thông qua hydroxylamine (NH2OH) (Purkhold et al., 2003)

Các phản ứng chuyển hóa ammonium thành nitrite:

proteobacteria và các loài tự dưỡng bắt buộc ngoại trừ Nitrobacter, loài có thể sinh

trưởng dị dưỡng với sự hiện diện của acetate, formate, hoặc pyruvate (Bitton, 2005)

- Quá trình phản nitrate hóa (Denitrification):

Đây là sự hô hấp hiếm khí trong đó NO3- hay NO2- là chất nhận điện tử cuối cùng NO3- hay NO2- được biến đổi thành nitrite oxide (NO), nitrous oxide (N2O) và cuối cùng thành khí nitrogen (N2) Quá trình phản nitrate hóa (hay còn gọi là quá trình khử đạm) làm giảm lượng nitrate, khép kín và hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ

Quá trình khử đạm được coi như là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ (Lee et al., 2002) Theo Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương (2003),

Hydroxylamine oxidoreductase

Ammonia monooxygenase

Schloesing là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng khử nitrate và nitrite thành nitơ phân tử vào năm 1868

Quá trình này được xem như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite kết hợp với sự khử nitric oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997):

Nitrate Nitrite Nitric oxide Nitrous oxide Dinitrogen gas (NO3- ) (NO2- ) (NO) ( N2O) (N2)

Sơ lược về một số vi khuẩn khử đạm:

Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt

cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực Là vi khuẩn

hiếu khí bắt buộc, nhưng P aeruginosa có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu

có NO3- làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC Loài này tăng trưởng

được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn carbon thích

hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose,… P aeruginosa có khả năng thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate, oxidase…Khuẩn lạc của P aeruginosa có ba

dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dại phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn lạc to, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhầy (được phân lập từ bệnh phẩm) (Trần Linh Thước, 2003) Nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi và được tìm thấy chủ yếu trong đất, nước

Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn khử đạm không có sắc tố huỳnh quang của giống Pseudomonas Tế bào vi khuẩn hình que, gam âm, di chuyển bằng chiên mao

đỉnh, có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử, có thể tăng trưởng trong maltose và tinh bột (Bennasar et al., 1998; Sikorski et al., 1999) Cho phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase Nó được phân lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri

và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được đổi tên thành Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen (Van Niel và Allen, 1952) Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có dạng không bình thường và độ sệt thay đổi theo thời gian, có

khuẩn lạc thì khô cứng và gắn kết chặt, có nếp gấp, có khuẩn lạc có màu trắng đục hay màu vàng nhạt (Van Neil và Allen, 1952; Lalucat et al., 2006)

2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới và trong nước

2.3.1 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới

Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate của ba

loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, nhưng tốc độ

tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau Sản phẩm sinh ra của quá

trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, Pseudomonas aeruginosa và Pseudomonas paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là khí NO2 Vi khuẩn P.stutzeri

và P Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO-3, NO2-, NO2 và vi khuẩn này có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện NO2 trong môi trường

Những nghiên cứu tiếp theo của Holmes (1986) và Rosello et al (1991) đã phân

lập được tổng cộng 49 dòng Pseudomonas stutzeri Chúng được phân lập từ các mẫu

bệnh lý, bùn biển và trong hệ thống nước thải

Những nghiên cứu đầu tiên về cơ sở phân tử và sinh học tế bào của sự khử đạm được biết đến là mô tả kích thước gen và bản đồ gen của vi khuẩn khử đạm; những đặc

tính và cấu trúc enzyme khử nitrite, nitric oxide, nitrous oxide; các dòng Pseudomonas

khử đạm; độ đa dạng của vi khuẩn khử đạm Nghiên cứu này do Zumft thực hiện năm

1997

Sự xuất hiện của kỹ thuật PCR (1985) đã hỗ trợ rất nhiều trong việc nhận diện các dòng vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác Vì thế những nghiên cứu sau này tập trung vào các đoạn gen mã hóa cho tính khử đạm Điển hình có Braker et al (1998) đã nghiên cứu phát triển hệ thống các cặp mồi chạy PCR khuếch đại đoạn gen

khử nitrite (nirK và nirS) để phát hiện vi khuẩn khử đạm trong mẫu môi trường thu được (bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải ở Đức) Gen nirK đã được khuếch đại từ Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans và Alcaligenes sp.(DM 30128); gen nirS được khuếch đại từ Alcaligenes eutrophus DSM 530 và từ chủng khử

đạm IFAM 3698 Với mỗi gen, ít nhất một mồi phối hợp đã khuếch đại thành công đối

với tất cả các chủng trong thí nghiệm Cặp mồi nirK1F-nirK5R và nirS1F-nirS6R

được dùng trong PCR cho kết quả như mong đợi với các chủng vi khuẩn khử đạm có

mang gen tương ứng nirK và nirS Sản phẩm khuếch đại không chuyên biệt đã không thu được ở những vi khuẩn không khử đạm hoặc với các chủng có kiểu gen nir khác

Năm 1999, Hallin và Lindgren đã tìm ra gen mã hóa cho sự khử nitrite (2 dạng

của gen nir: nirK và nirS) trong vi khuẩn khử đạm (Pseudomonas stutzeri ATCC

14405, P fluorescens ATCC 33512, P putida CCUG 2479, P aureofaciens ATCC

13985, P denitrificans ATCC 13867, Paracoccus denitrificans ATCC 19367, Alcaligenes eutrophus ATCC 17699,…) bằng kỹ thuật PCR Bước chính của con

đường khử đạm là sự khử nitrite bằng enzyme nitrite reductase (nir) Được biết có 2

loại enzyme nir đó là: một enzyme với heme c và heme d1 (cd1-nir) và một có chứa đồng (Cu-nir) Cả hai loại enzyme này đều tương tự nhau về chức năng và đặc điểm

sinh lý học

Chèneby et al (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của vi khuẩn khử đạm phân lập từ 3 vị trí đất nông nghiệp ở Đông bắc nước Pháp, đất được lấy từ tầng mặt (0-20 cm) Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ 1445 chủng vi khuẩn

kỵ khí là có khả năng khử đạm Phân tích hệ thống phát sinh loài của 16S rDNA của

những dòng khử đạm đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã phát hiện sự đa dạng ở một mức độ cao

Su et al (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu khí, dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 và Pseudomonas stutzeri SU2 Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống xử lý nước thải

từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan

Năm 2002, Sikorski et al sử dụng môi trường SW-LB để phân lập P stutzeri từ

mẫu môi trường (đất) SW-LB gồm có 10 g/l Bacto Trypton; 5 g/l yeast extract và 15 g/l agar cùng với nước biển nhân tạo (SW) chứa 24 g/l NaCl; 10,5 g/l MgSO4.7H2O và 0,11 g/l NaHCO3, có bổ sung 50mg cycloheximide để ngăn chặn sự phát triển của nấm Cặp mồi chuyên biệt và rất nhạy dựa trên vùng gen 16S rDNA được sử dụng

trong bài là fps158 và rps743 đã được mô tả bởi Bennasar et al (1998) để phân tích sự hiện diện của DNA P stutzeri trong mẫu môi trường Phương pháp này đã cải tiến một cách chuyên biệt những qui trình phân lập, nhận diện P stutzeri được Baggi et al mô

tả năm 1987 bằng đoạn mồi thích hợp và đặc biệt hơn nữa là có độ nhạy tối đa để khuếch đại mẫu DNA vi khuẩn đã phân lập từ môi trường Gia tăng tính chuyên biệt

của qui trình phân lập, nhận diện đối với P stutzeri có quan hệ với những vi khuẩn

khác bằng việc rút ngắn 4 nucleotide ở đầu 5’ của mồi ngược rps743, đổi tên thành rps743minus4; mà các nucleotide đó được cho là đã làm tăng hiệu quả mất ổn định của những lỗi sao chép ở đầu 3’ trong lúc mồi gắn với các gen của vùng 16S rDNA của

những vi khuẩn khác hơn là của P stutzeri

Cùng lúc đó Lee et al (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phương pháp dựa trên 16S rDNA Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một số chủng từ CR-I (high-nitrate-removing activated sludge) và CR-II (low-nitrate-removing activated

sludge) Đa số thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn gram (-), có hình que như Pseudomonas putida, P stutzeri, P azotoformans

Nghiên cứu về định lượng gen khử đạm của Henry et al (2006) đã ứng dụng kỹ

thuật PCR để phát hiện, định lượng gen nosZ (mã hóa cho enzyme nitrous oxide

reductase khử nitrous oxide [N2O] thành nitơ phân tử [N2]) trong vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens từ mẫu môi trường đất và đối chiếu với sự phong phú của các gen 16S rRNA, narG (mã hóa cho enzyme khử nitrate ở màng), và nirK (mã hóa

cho enzyme khử nitrite với nhân đồng) Hiện nay, nồng độ nitrous oxide (N2O) (một khí nhà kính quan trọng) trong khí quyển đang gia tăng với một tỉ lệ khoảng 0,3 % mỗi năm N2O là một sản phẩm trung gian của con đường khử đạm, bao gồm sự khử nối tiếp NO3- thành N2 với sự tham gia của các metalloenzyme như nitrate reductase, nitrite reductase, nitric oxide reductase và nitrous oxide reductase

Một nghiên cứu khác nhằm tối ưu hóa điều kiện phân lập và nuôi cấy vi khuẩn khử đạm cũng đã được tiến hành bởi Heylen (2006) Theo đó, môi trường sinh trưởng tối ưu với giá trị pH= 7; hàm lượng đạm là 3 mM; có bổ sung 1ml dung dịch vitamin; nguồn carbon từ ethanol hoặc succinate và tỉ lệ phân tử gam C/N là 2,5 : 20 hoặc 25 là những điều kiện nuôi cấy thành công nhất Nghiên cứu cũng đồng thời quan sát sự đa dạng của vi khuẩn khử đạm từ bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải đô thị Có

199 vi khuẩn khử đạm đã được phân lập, trong đó, đa số thuộc về lớp

Betaproteobacteria (50,4 %) và Alphaproteobacteria (36,8 %), còn tìm thấy một số lớp khác như Gammaproteobacteria (5,6 %), Epsilonproteobacteria (2 %), Firmicutes (4 %) và Bacteroidetes

2.3.2 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trong nước

Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn khử đạm P stutzeri: Phan Trường Khanh (2007), thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý ammonia trong nước ở

điều kiện phòng thí nghiệm” Tác giả đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn

Pseudomonas từ các mẫu đất phù sa, phèn, mặn ở ĐBSCL và nhận diện được một dòng P stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S rDNA Bước đầu khảo sát khả năng khử

đạm trong nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia

Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R và nirF-cd1-nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có chứa gen nosZ, và 8 dòng có chứa gen cd1-nir

cd1-Tô Thị Lài (2008), ở qui mô phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri phân lập từ môi trường nuôi cá tra đều có khả năng xử lý

ammonia hiệu quả

Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Trường ĐHCT cũng đang

thực hiện phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri

từ ao nuôi tôm, ao nuôi cá tra

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Nguyên vật liệu

Mẫu chất thải rắn và chất thải lỏng từ trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh, thành ở ĐBSCL, trạm thu mua sữa tại Tp.HCM và mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Máy ảnh, kính hiển vi Olympus CH-2 (Nhật Bản)

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

-Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức)

- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam, lamen, bọc nylon và chai đựng mẫu rắn và mẫu nước

Hình 3.1: Một số dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

3.1.3 Hóa chất

Các hóa chất dùng để pha môi trường phân lập vi khuẩn được liệt kê trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Thành phần hoá chất pha chế môi trường Minimal phân lập vi khuẩn

Môi trường Minimal (Sikorski et al., 2002)

- Sodium succinate hoặc acid succinic 8,1 g/l

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

- Thời gian: bắt đầu từ tháng 1/2010 đến tháng 05/2010

- Địa điểm thí nghiệm: tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm vi sinh vật của Viện

NC & PT CNSH - Trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 Phương pháp phân lập

a Chuẩn bị mẫu

- Dạng mẫu: mẫu chất thải rắn và chất thải lỏng từ trại chăn nuôi bò sữa, trạm thu mua sữa và mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk

- Số lượng mẫu: 11 mẫu lỏng và 2 mẫu rắn

- Bảo quản mẫu: mẫu chất thải lỏng và chất thải rắn được cho vào các chai nhựa, ghi nhãn đem về phòng thí nghiệm bảo quản trong tủ lạnh (Hình 3.2)

- Đối với mẫu nước: pha loãng đến tỉ lệ 10-2 hoặc 10-3

- Dùng micropipet hút lần lượt 30-40μl mẫu nước và mẫu rắn đã pha loãng rồi nhỏ lên đĩa petri có môi trường Minimal

- Dùng que trải mẫu phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch, mở nắp đĩa để khô trong khoảng 5-10 phút với ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy

- Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 300C trong tủ ủ vi sinh vật từ 24-48 giờ để vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc (Hình 3.3)

Hình 3.3: Mẫu trải phát triển trên môi trường Minimal

- Tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau cấy chuyển sang các đĩa môi trường cho đến khi các khuẩn lạc được kéo rời rạc qua các đường cấy (Hình 3.4)

Hình 3.4: Khuẩn lạc sau khi cấy chuyển

- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quang học Cách chuẩn bị tiêu bản:

+ Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn

+ Nhỏ 30-40μl nước cất vô trùng lên lam kính

+ Dùng que cấy để nguội sau khi đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít khuẩn lạc rời rồi trải đều lên giọt nước trên lam kính

+ Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với lam kính và giọt nước một góc 450, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí

+ Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu; mô tả hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn trên kính hiển vi

Khuẩn lạc rời

- Cuối cùng chuyển một khuẩn lạc rời (xem như một chủng-isolate) vào ống nghiệm chứa môi trường trên để trữ mẫu ròng

Hình 3.5: Khuẩn lạc ròng được trữ trong môi trường Minimal

- Đồng thời các dòng vi khuẩn này được cấy ria trên môi trường Minimal đặc, ủ ở nhiệt độ 30oC sau 24-48 giờ đem đo kích thước và quan sát hình dạng của khuẩn lạc

3.2.3 Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và nitrate

Từ các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành nuôi cấy trên môi trường Minimal (môi trường tối thiểu) có bổ sung ammonium, nitrite và nitrate ở dạng hợp chất (NH4Cl, NaNO2, NaNO3) qua các nồng độ tăng dần nhằm kiểm tra khả năng oxy hóa ammonium và khử đạm của các dòng vi khuẩn trên Nồng độ của các chất bổ sung được tính dựa theo nồng độ hợp chất chứa chúng

Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn nào không phát triển (-), được coi là không có khả năng oxy hóa (hoặc khử) môi trường đó; chủng nào phát triển yếu (+), được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) thấp; chủng nào phát triển trung bình (++), được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) trung bình; chủng nào phát triển khá (+++), được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) khá; chủng phát triển rất tốt (++++) được xem có khả năng oxy hóa (hoặc khử) tốt

PL6b

Bảng 3.2: Thành phần môi trường Minimal bổ sung Nitrate, Nitrite và Ammonium 100mM

Hoá chất MT nitrate MT nitrite MT amonium