Phân Lập Và Tuyển Chọn Nấm Men Tự Nhiên Lên Men Rượu Bưởi

TÓM TẮT Với mong muốn tạo ra một sản phẩm rượu bưởi để góp phần đa dạng sản phẩm từ trái bưởi, tăng tính kinh tế cho nhà vườn cho nên nghiên quá trình lên men tạo ra một loại rượu bưởi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MEN TỰ NHIÊN

LÊN MEN RƯỢU BƯỞI

MSSV:3064491

LỚP:CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010

TÓM TẮT

Với mong muốn tạo ra một sản phẩm rượu bưởi để góp phần đa dạng sản phẩm

từ trái bưởi, tăng tính kinh tế cho nhà vườn cho nên nghiên quá trình lên men tạo ra một loại rượu bưởi phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng được đặt ra cho các nhà sản xuất

Muc tiêu đề tài là tiến hành nghiên cứu phân lập một số dòng men có khả năng lên men rượu vang bưởi cho độ rượu cao và chất lượng cảm quan tốt Vì vậy, chúng tôi tiến hành phân lập một số dòng men thuần chủng từ dịch bưởi lên men tự nhiên Từ các dòng men phân lập được kết hợp với dòng men Saccharomyces cerevisiae cùng dòng men từ men rượu và cho lên men, nhằm tìm ra dòng men lên men tốt nhất Sau

đó, từ dòng men này cho lên men rượu và khảo sát ảnh hưởng của nhân tố mật số nấm men và độ Brix trước lên men đến chất lượng rượu Khi tìm ra các điều kiện thích hợp lên men ta tiến hành lên men và điều vị sản phẩm bằng rượu cao độ

Sau khi nghiên cứu và tiến hành thí nghiệm, thu được kết quả như sau: tìm ra ba dòng men ký hiệu là Y1001, Y1002 và Y1003 Trong đó dòng men Y1003 cho độ rượu cao và kết quả cảm quan tốt nhất Độ Brix dịch quả trước lên men được điều chỉnh về 22 độ Brix cho kết quả tốt và mật số nấm men chủng vào thích hợp là 10 5 tế bào/ml Sản phẩm rượu được điều vị về nồng độ rượu 26% thể tích được yêu thích nhất

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây bưởi và rượu vang trái cây 3

2.1.1 Giới thiệu về Cây bưởi 3

2.1.2 Rượu vang trái cây 4

2.2 Nấm men 5

2.3Quá trình lên men 9

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Phương tiện vật liệu 16

3.2 Thời gian và địa điểm 16

3.3 Phương pháp Thí nghiệm 16

3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch bưởi lên men tự nhiên 16

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao nhất 18

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố: mật số nấm men và độ Brix đến quá trình lên men rượu 20

3.3.4 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu điều vị (14; 18; 22; 26; 30%) đến màu sắc, mùi vị của sản phẩm 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 22

4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch bưởi lên men tự nhiên 22

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao nhất 25

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố: mật số nấm men và độ Brix

đến quá trình lên men rượu 31

4.4 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu điều vị (14; 18; 22; 26; 30%) đến màu sắc, mùi vị của sản phẩm 35

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Bảng chỉ tiêu đánh giá

Phụ lục 3: Bảng kết quả thí nghiệm

Phụ lục 4: Kết quả thống kê

1 Kết quả thống kê thí nghiệm 2

2 Kết quả thống kê thí nghiệm 3

3 Kết quả thống kê thí nghiệm 4

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Thành phần hóa học của bưởi 4

Bảng 2: Bảng thành phần hóa học trong rượu vang 5

Bảng 3: Bảng bố trí thí nghiệm 2 18

Bảng 4: Bảng bố trí thí nghiệm 3 20

Bảng 5: Theo dõi sự biến đổi độ Brix theo thời gian trong quá trình lên men 26

Bảng 6: Sự thay đổi pH theo thời gian của dịch lên men 27

Bảng 7: Bảng đo độ rượu sau lên men của các dòng nấm men khác nhau 38

Bảng 8: Bảng kết quả cảm quan thí nghiệm 2 29

Bảng 9: Ảnh hưởng của mật số nấm men và độ Brix ban đầu đến độ Brix và pH sau lên men 31

Bảng 10: Kết quả đo độ rượu sau lên men thí nghiệm 3 32

Bảng 11: Kết quả đánh giá cảm quan thí nghiệm 3 34

Bảng 12: Bảng kết quả cảm quan các mẫu rượu đã điều vị 36 Bảng 13: Bảng chỉ tiêu đánh giá cảm quan rượu PL2 Bảng 14: Bảng kết quả theo dõi chiều cao cột khí chuông Durham thí nghiệm 2 PL3 Bảng 15: Bảng số liệu theo dõi Brix trong quá trình lên men theo thời gian thí

nghiệm 2 PL3 Bảng 16: Bảng số liệu theo dõi pH trong quá trình lên men theo thời gian thí

nghiệm 2 PL3 Bảng 17: Độ rượu đo bằng phương pháp tỷ trọng kế thí nghiệm 2 PL3 Bảng 18: Kết quả đánh giá cảm quan thí nghiệm 2 PL3 Bảng 19: kết quả thí nghiệm 3 PL3 Bảng 20: Kết quả đánh giá cảm quan thí nghiệm 3 PL3 Bảng 21: Kết quả đánh giá cảm quan thí nghiệm 4 PL3

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Hình trái bưởi Năm roi trên cây (a) đã gọt vỏ (b) 4

Hình 2: Saccharomyces cerevisiae (a) và Saccharomyces uvarum (b) 7

Hình 3: Saccharomyces chevalieri (a) và Saccharomyces oviformis (b) 8

Hình 4: Sơ đồ lên men tự nhiên dịch bưởi và phân lập 17

Hình 5: Dòng Y1001 trên đĩa thạch (a) và trên kính hiển vi (b) 23

Hình 6: Dòng men Y1002 trên đĩa thạch (a) và trên kính hiển vi (b) 24

Hình 7: Dòng men Y1003 trên đĩa thạch và qua kính hiển vi .25

Hình 8: Đồ thị biểu điễn sự thay đổi độ Brix theo thời gian lên men của các dòng men khác nhau .26

Hình 9: Đồ thị sự biến đổi pH trong quá trình lên men theo thời gian 27

Hình 10: Biểu đồ đánh giá cảm quan các mẫu rượu lên men với các dòng men khác nhau 30

Hình 11: Hình biểu đồ kết quả ảnh hưởng của độ Brix và mật số nấm men đến độ rượu sau lên men 33

Hình 12: Biểu đồ đánh giá cảm quan thí nghiệm 3 35

Hình 13:Quy trình lên men rượu vang bưởi 39

Hình 14: Men Saccharomyces cerevisiae trên đĩa thạch (a) và hình kính hiển vi

(b) PL1 Hình 15: Nấm men rượu trên đĩa thạch (a) và kính hiển vi (b) PL1 Hình 16: Dòng men Y1003 trong môi trường lỏng (a) hình hệ thống chưng cất

rượu (b) PL1 Hình 17: Sản phẩm rượu vang bưởi (a) và rượu trong tủ ủ (b) PL1 Hình 18: Kính hiển vi OLYMPIC BX 41(a) và OLYMPIC BH-2 (b) PL1 Hình 19: Nồi khử trùng (a) và tử cấy (b) PL1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng trồng cây ăn trái lớn nhất nước, đa dạng về chủng loại và sản lượng Tuy nhiên, thực tế thì đầu ra cho sản phẩm còn bấp bênh do khâu sản xuất, bảo quản, chế biến tiêu thụ sản phẩm còn nhiều yếu kém Để tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào này một số nơi đã sử dụng nguồn cây ăn trái tại địa phương

để sản xuất rượu vang

Rượu vang là một thức uống có từ lâu đời và khá phổ biến,rượu vang trái cây được xem là những thức uống tự nhiên có lợi cho sức khỏe vì thực chất chỉ là nước trái

cây lên men, có thể dùng làm thức uống hoặc pha chế tạo thành các dạng cocktail

Rượu vang được thu không qua chưng cất có độ rượu nhẹ (10-18%), có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, là loại nước giải khát lên men thơm ngon giàu chất dinh dưỡng Rượu vang nếu dùng điều độ tốt cho tim mạch, giúp tiêu hóa, lợi tiểu, … Các loại quả như: nho, táo, dâu, dừa… Thậm chí mận, khóm, cóc đều có thể dùng làm nguyên liệu chế biến rượu vang Trong đó như ta biết thì nho là loại quả được ứng dụng sản xuất rượu vang tốt nhất và hầu như phổ biến trên toàn thế giới Sau nho các loại quả khóm, dâu, bưởi, dừa cũng cho nước quả rất thích hợp lên men rượu vang (Vũ Công Hậu, 2005)

Rượu bưởi cũng là một đặc sản nổi tiếng của nước ta phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng trong và ngoài nước như rượu bưởi Tân Triều ở Đồng Nai Tuy nhiên, chất lượng rượu chưa ổn định nên tính cạnh tranh chưa cao Ngoài là cây ăn quả, bưởi cũng

là một vị thuốc trị một số bệnh phổ biến Rượu bưởi giúp tăng khả năng tiêu hóa, hạ men gan, lợi tiểu, …

Vì tính cạnh tranh mà những trái bưởi nhỏ, chất lượng hình dáng không đạt thường bán với giá rẻ hoặc không bán được phải bỏ đi Góp phần đa dạng sản phẩm từ cây trồng của người dân và đáp ứng nhu cầu sử dụng rượu, tạo đầu ra mới cho nhà

vườn thực hiện đề tài: Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang bưởi là rất cần thiết

1.2 Mục tiêu đề tài

Với đề tài này nhằm mục đích chọn ra các dòng nấm men với các điều kiện thích hợp cho quy trình sản xuất rượu vang bưởi với giá thành rẻ, giải quyết nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền tại địa phương Nghiên cứu tạo ra sản phẩm rượu bưởi có giá trị cao về dinh dưỡng, có tác động tốt đến sức khỏe của người tiêu dùng Có thể sử dụng những trái bưởi có ngoại hình không đạt để sản xuất, tránh lãng phí qua đó tăng thu nhập cho nhà vườn, góp phần đa dạng hóa sản phẩm và đặc sản Việt Nam

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây bưởi và rượu vang trái cây

2.1.1 Giới thiệu về Cây bưởi

a Cây bưởi

Bưởi hay còn gọi là bòng, tên khoa học Citrus maxima hay Citrus grandis thuộc

họ cam chanh, thường có màu xanh lục nhạt cho tới vàng khi chín, có múi dầy, tép xốp, có vị ngọt hoặc chua ngọt tùy loại, là loại cây ăn quả được trồng phổ biến khắp nước Bưởi có nhiều kích thước tùy giống, chẳng hạn bưởi Đoan Hùng chỉ có đường kính độ 15 cm, trong khi bưởi Năm Roi, bưởi Tân Triều Biên Hòa và nhiều loại bưởi khác thường gặp ở Việt Nam, Thái Lan có đường kính khoảng 18-20 cm Ở nước ta, đặc biệt là Đồng Bằng sông Cửu Long (Vĩnh Long, Tiền Giang, .) với nhiều giống bưởi nổi tiếng như bưởi Năm Roi, bưởi Long, bưởi Da Xanh, bưởi Đoan Hùng… (http://vi.wikipedia.org/, ngày 29/12/2009)

 Bưởi Năm Roi

Là một giống bưởi nổi tiếng ở Việt Nam được trồng nhiều ở một số tỉnh miền Tây Nam Bộ (nhất là Vĩnh Long) Mỗi năm, giống bưởi này cho thu hoạch hai lần vào tháng Tám và tháng Chạp âm lịch Giống bưởi Năm Roi do ông Trần Văn Bưởi (1918

- 1990) (người làng Mái Dầm nay thuộc xã Phú Hữu A, huyện Châu Thành, Hậu Giang) tìm thấy Sinh thời, ông Bưởi làm nghề buôn bán trên sông Một tối ông ngủ lại trên ghe bầu ở Tân Châu (vùng Châu Đốc thuộc tỉnh An Giang thời Pháp thuộc) thì vô tình nhặt được một trái cây trên sông Trái cây da có màu xanh, ruột màu đỏ vàng Xé

ra nếm thử thấy vị ngon, mọng nước ông Bưởi rất thích Ông lấy hột mang về quê Phú Hữu (chợ Mái Dầm) để trồng (http://vi.wikipedia.org/, ngày 29/12/2009)

Sau khi giống bưởi này được phổ biển khắp vùng quê ông Trần Văn Bưởi, người các nơi khác cũng đến xin giống cây về trồng Ngày nay, bưởi Năm Roi được trồng nhiều nhất là ở Phú Hữu, Châu Thành, Hậu Giang và Long Hồ, Vĩnh Long Có thể nói

ở trên thế giới chỉ có hai nơi này là trồng bưởi Năm Roi ít bị sâu bệnh, trái ngọt và to

Ở Phú Hữu người tiêu dùng có thể dễ dàng tìm được một trái bưởi 3-4 kg có trái còn nặng tới 5kg, những trái lớn như vậy chỉ có vào một hai mùa đầu, người dân gọi là bưởi tơ Vào các mùa sau thì bưởi cho trái nhiều hơn, thường xuyên hơn Ngày nay

người nông dân có thể cho trái quanh năm, tháng nào cũng có thể được thưởng thức bưởi Năm Roi chín (http://vi.wikipedia.org/, ngày 29/12/2009)

Hình 1: Hình trái bưởi Năm roi trên cây (a) đã gọt vỏ (b)

Vitamin1 (chỉ tính các loại vitamin B chủ yếu là

Trung bình

Nguồn : Vũ Công Hậu, 2005

2.1.2 Rượu vang trái cây

a Giới thiệu về rượu vang trái cây

Rượu vang là loại rượu được sản xuất từ dịch trái cây không qua chưng cất có độ rượu etylic từ 10- 18

Theo quy định thì đa số các nước sản xuất rượu vang chỉ được phép cho thêm đường và một số chất kích thích đã được xác định vào nước quả trước khi lên men

Sau khi lên men, rượu được gạn lọc và ổn định, không được cho thêm bất cứ chất gì (đường, rượu, acid, chất màu, dầu thơm…) vào để đảm bảo tính chất tự nhiên của sản phẩm (Vũ Công Hậu, 2005)

b Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của rượu vang tùy thuộc vào thành phần của nguyên liệu sử dụng, những biến đổi trong quá trình lên men, quá trình chín của rượu, hoạt lực của nấm men Thành phần chính của rượu vang bao gồm: rượu etylic, đường, acid tổng

số, tro và muối khoáng, chất gây mùi thơm, vitamin, polyphenol, …

Bảng 2: Bảng thành phần hóa học trong rượu vang

Nguồn: Vũ Công Hậu, 2005

2.2 Nấm men

Quá trình lên men rượu được thực hiện nhờ loài Saccharomyces, loài này có tính

kỵ khí không bắt buộc, chúng có khả năng hô hấp và lên men Trong sản xuất rượu,

người ta thường dùng những nòi nấm men thuộc giống Saccharomyces cerevisiae Đặc

trình lên men có sử dụng chất sát trùng Theo Nguyễn Đức Lượng (2006) giữa các nòi này có đặc điểm khác nhau, tuy nhiên nhìn chung thì các nòi lên men rượu phải có các đặc tính sau:

 Có sức phát triển mạnh trong dịch đường lên men

 Có khả năng tiết ra hệ enzyme zyma để lên men nhanh chóng và hoàn toàn

 Có thể lên men được ở nhiệt độ tương đối cao ở mùa hè

 Có khả năng chịu được độ rượu cao trong quá trình lên men

 Chịu được môi trường có độ acid cao

Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của nấm men trong khoảng 25 ÷ 30°C, còn

chết, trong môi trường có nồng độ đường cao nấm men ngừng các quá trình sống Đối với các nòi nấm men khác nhau, nồng độ đường thích hợp cũng không giống nhau Các giống men rượu là loại nấm men nổi có khả năng lên men mạnh, có thể lên men được mono và disaccarid, cũng như một phần dextrin (chủ yếu là dextrin cuối)

Các nòi lên men rượu đều thuộc giống nấm men Saccharomyces ( kể cả lên men

bia, rượu vang và bánh mì) Các nòi men này được chia làm 2 loại: men nổi và men chìm

 Men nổi: là các chủng nấm men khi lên men hay phát triển trong dịch

nuôi cấy, chúng tạo thành từng đám với lớp bọt tương đối dày và duy trì trong suốt thời gian lên men Sau khi kết thúc chúng (những tế bào nấm men) mới lắng dần xuống đáy và tạo thành một lớp xác men không chặc chẽ

 Men chìm: khi phát triển trong dịch nuôi cấy và lên men không tạo

thành lớp bọt dày trên bề mặt dịch và các tế bào lắng dần xuống đáy thùng tạo thành lớp cặn men khá chặc chẽ Đặc biệt nổi bật của men chìm là lắng nhanh tạo cho dịch lên men chóng có độ trong sáng và các nòi men có enzyme -galactosidase nên có thể dùng hoàn toàn đường rafinose cho lên men, còn các nòi men nổi chỉ có một số là đồng hóa được 1/3 rafinose thành rượu và CO2, bằng cách nuôi chuyển qua dịch đường hóa hoặc rỉ đường có thêm các nguồn muối khoáng Có thể bảo quản giống dưới lớp dầu paraffin hoặc vaseline vô trùng Phương pháp này có thể hằng năm mới

có thể cấy chuyển lại (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005)

Theo Lương Đức Phẩm (1998) một số nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang trái cây:

2.2.1 Saccharomyces cerevisiae

Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là Saccharomyces

cerevisiae Meyer hay là S ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces vini Nấm men

này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số

Saccharomyces có trong nước quả khi lên men Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc

vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, rượu và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic,

biotin, mezoinozid, thiamin và piridoxin Đa số các tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 – 8) x (5 – 12)m, sinh sản theo lối nẩy chồi và tạo thành bào tử

Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invectarase có khả năng khử đường

sacarose thành fructose và glucose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men này chỉ đạt được 8 – 10% so với thể tích

Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong

dịch rượu

Các chủng này có đặc tính riêng về khả năng chịu cồn, chịu sulfite, tạo thành các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp làm cho rượu vang có màu đặc trưng riêng biệt

Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces cerevisiae

thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành rượu và bị chết rất nhanh

Hình 2: Saccharomyces cerevisiae (a) và Saccharomyces uvarum (b)

11/12/2009)

2.2.2 Saccharomyces uvarum

Loại này được tách ra từ nước quả nho, rượu và nước quả phúc bồn tử lên men tự nhiên, về hình thái nó không khác với các loài khác Khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch – malt Các chủng của loài này có thể lên men đạt 12- 13% rượu trong dịch nước nho

2.2.3 Saccharomyces chevalieri

Nấm men này được tách ra từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được

gây men từ nước dừa Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể

Được tách ra từ nước nho tự lên men, những loài nấm men này ít hơn so với

Saccharomyces vini Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước

quả khác, có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao, lên men kiệt đường và có thể tạo thành tới 18%rượu Các yếu tố sinh trưởng của loài này giống như Saccharomyces

cereviseae Dùng chủng thuần khiết của giống này lên men dịch quả có hàm lượng

đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt

Trong quá trình lên men, giống này tạo thành trên dịch quả Saccharomyces

ovifromis với Saccharomyces vini là không lên men được galactose và men nổi trên bề

mặt dịch lên men tạo thành màng Hình dáng giống như Saccharomyces cereviseae và

có thể tạo thành 18% rượu

Nhìn chung, hai giống men rượu vang Saccharomyces ovifromis và

Saccharomyces vini có nhiều chủng loại được dùng trong sản xuất, nhiều chủng men

rượu có nhiệt độ thích hợp là 18 – 25°C, ở 35°C sự sinh sản của nó bị ức chế, ở 40°C

sự sinh sản của nó bị ngừng hoàn toàn, ở nhiệt độ 16°C sự sinh sản và lên men bị kéo

dài Các điều kiện hóa lý, thành phần chất lượng của dịch quả, cũng như pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sống của nấm men (Nguyễn Công Hà, 2000)

Trong men rượu còn có loài men giả là Endomycopsis fibuliger Giống

Endomycopsis tương tự nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh

glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose Vì vậy, trong nghề làm rượu

người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh

bột

2.3 Quá trình lên men

2.3.1 Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men rượu

Sự lên men rượu là một quá trình sinh hóa phức tạp, có sự tham gia của nấm men, trải qua hàng loạt các phản ứng phức tạp với sự tham gia của nhiều men xúc tác khác nhau

Trong đó

trong điều kiện yếm khí” theo L Pasteur

“ Sự lên men là sự phân giải các chất đường thành rượu và CO2 dưới tác dụng của chất men do nấm men tiết ra” theo Buchner

aldehyde, rượu cao phân tử…Tùy theo điều kiện lên men, pH môi trường thì quá trình lên men rượu sẽ tạo theo chiều hướng tạo sản phẩm chính là rượu và sản phẩm phụ khác nhau

2.3.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Theo Nguyễn Công Hà (2000) để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng tế bào nấm men cho vào là khác nhau, đối với lên men tự nhiên thì nấm men có chủ yếu từ nguyên liệu và môi trường Do diện tích bề mặt tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác cho quá trình lên men được hấp thụ qua bề mặt của tế bào nấm men sau đó được khuyếch tán qua màng vào trong tế bào nấm men Qua một chuỗi phản ứng bên trong tế bào rất

phức tạp rượu và CO2 được tạo thành Quá trình lên men là một quá trình rất phức tạp, đầu tiên đường sau khi vào tế bào nấm men được chuyển hóa qua hàng loạt sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic dưới tác dụng của enzyme Pyruvat-

Phương trình tóm tắt của quá trình lên men

Lên men

C6H12O6 C2H5OH + 2CO2 + 113.4 KJ

2.3.3 Động học của quá trình lên men rượu

Tốc độ lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm

thành cũng như sự thay đổi trị số nồng độ của dịch lên men

Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính

- Thời kỳ đầu: khoảng 60giờ từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men Sự lên men xảy ra rất chậm, lượng đường lên men không đáng kể

- Thời kỳ 2: đây là thời kỳ lên men chính Chiếm khoảng 60- 120 giờ sau thời kỳ đầu Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng lên đáng kể và đạt đến trị số cực đại

- Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ, xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ

ổn định tạo mùi cho sản phẩm Tùy theo phương pháp cho lên men, loại sản phẩm cho lên men mà thời kỳ lên men phụ kéo dài khác nhau

Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch cho lên men Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình cho lên men Trong giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi 1 độ (Brix, balling, %) tùy thuộc vào loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất Sự tồn tại của quá trình lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột (Nguyễn Công Hà, 2000)

2.3.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

a Ảnh hưởng của oxy

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc giống

Saccharomyces sp., chúng là các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc Trong môi trường

đủ oxy, nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng, cấu tạo tế bào và tăng sinh khối

Trường hợp thiếu oxy hoặc không có oxy, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí Khi đó sản phẩm chủ yếu trong quá trình lên men là rượu etylic

b Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất của nấm men Nấm men rất nhạy cảm với nhiệt độ cao, ở 36°C nấm men bắt đầu bị ức chế, ở nhiệt độ khoảng 60 - 65°C chúng sẽ bị chết sau 5 phút Nhiệt độ tối ưu cho nấm men rượu vang

là 25-30°C Ở nhiệt độ thấp hơn 16°C nấm men hoạt động chậm và yếu hơn

Khi nhiệt độ lên men càng thấp, thời gian lên men càng dài, hiệu suất chuyển hóa đường thành rượu cao, chất lượng rượu vang khi đó tốt hơn, hương thơm tạo thành sẽ khuếch tán vào dung dịch Nhiệt độ càng cao lên men càng hạn chế, độ rượu càng thấp, lượng đường còn lại trong rượu càng nhiều

e Ảnh hưởng của đường

Đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, nấm men có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng phù hợp từ 22- 25 độBrix Trong giới hạn này, nếu nồng độ đường cao, rượu càng mạnh do hàm lượng etylic cao, nên thêm đường vào dịch lên men là biện pháp phổ biến nhất để nâng cao

độ rượu Hàm lượng đường tối đa là 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm Nguyên nhân là phần lớn tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh

f Ảnh hưởng nồng độ etylic

Sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men kỵ khí là rượu etylic Rượu etylic sẽ ức chế hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ ức chế khác nhau đối với các dòng nấm men khác nhau Nồng độ rượu khi đạt 7-8 % thể tích sẽ ức chế khả năng sinh sản của nấm men

g Thời gian lên men

Ở cùng nhiệt độ như nhau, pH khác nhau thì thời gian lên men khác nhau Ở nhiệt độ khác nhau, pH như nhau thì thời gian lên men cũng khác nhau Ngoài ra các loại dịch quả khác nhau thì thời gian lên men cũng khác nhau Vậy nhiệt độ, pH, loại dịch quả có ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lên men Ngược lại, thời gian lên men cũng ảnh hưởng đến chất lượng dịch lên men sau này

rượu phát triển, thời gian kéo dài từ 15 -20 ngày

h Nguồn nitơ

Đa số trong nước quả có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men Song cũng

có nhiều trường hợp do hạn hán hoặc tùy từng loại quả không đủ nguồn nitơ cho nấm men sinh trưởng, do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ Trong trường hợp này người ta thường bổ sung amon sulfat (NH4)2SO4 Nếu dịch quả quá chua dùng tactrat amon- kali hay amon hydroxid trung hòa bởi acid (Lương Đức Phẩm, 2000)

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm lên men

 Chất lượng quả

Cần phải nhấn mạnh rằng: không có nguyên liệu tốt thì không có chế phẩm tốt

Có thể nói khoảng 60% chất lượng rượu do nguyên liệu quyết định Rượu vang tuy có giá trị dinh dưỡng cao nhưng lại là một loại rượu đặc biệt, hương vị rượu sẽ khác hẳn

so với nguyên liệu ban đầu mặc dù cũng mang hương vị đặc trưng của loại quả làm ra nhưng không phải là mùi thơm của quả tươi ban đầu mà được thay thế bằng một mùi hương đặc trưng khác (Vũ Công Hậu, 2005)

Quả dùng chế biến phải có lượng nước nhiều, chất lượng nước tốt (chứa nhiều đường, muối khoáng, và không chứa chất độc đối với nấm men) không nhất thiết chọn những trái có hình dáng đẹp, có thể chọn những trái chất lượng ngoại hình không đạt

để hạ giá thành cho rượu vang

 Nấm men

Tùy vào chủng nấm men mà cho ra độ rượu khác nhau: thí dụ trong dung dịch

không thiếu đường, dùng Saccharomyces cerevisiae độ rượu có thể đạt 14-16,

S.oviformis 16-18, Torulopsis stellata 9-10, Kloeckare chỉ khoảng 4,5 % rượu (Vũ

Công Hậu, 2005)

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men sẽ ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình lên men và ảnh hưởng đến chất lượng rượu: sự có mặt của oxy hay không trong quá trình lên men, pH, nhiệt độ trong quá trình lên men, ảnh hưởng của thành phần đường, đạm, chất khoáng trong nước quả ban đầu, chất kích thích và chất ức chế sự phát triển của nấm men

 Sự oxy hóa nước quả

Bưởi có vỏ dày và chất dầu có tính kháng sinh bảo vệ cho phần thịt trái bên trong

có thể bảo quản một thời gian dài sau khi hái trái, nhưng chất lượng trái để trong thời gian dài cũng không được bảo đảm (có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện bảo quản hay tác nhân cơ học) Khi trái đã bị hái khỏi cây, trao đổi chất khác hẳn khi còn trên cây Khi bị tổn thương và bị tách lấy nước thì cân bằng sinh hóa của trái bị phá hủy nghiêm trọng Do tiếp xúc với oxy không khí nên các enzyme hoạt động mạnh một cách khác thường, đặc biệt là enzyme oxy hóa khử như polyphenola oxydase hay tirozinase làm nước bị oxy hóa nhanh chóng Những chất này làm nước trong trái có thể bị phá hủy những chất làm cho trái có mùi thơm, vị mát , oxy hóa chất màu làm cho rượu tối màu kém hấp dẫn

 Ảnh hưởng của thời tiết và điều kiện bảo quản

Ảnh hưởng của thời tiết, tuy không tác động trực tiếp đến quá trình lên men nhưng có ảnh hưởng trực tiếp lên nguyên liệu Chất lượng trái bưởi phụ thuộc nhiều vào thời tiết như mùa nắng hay mùa mưa, nhiệt độ cao hay thấp, cây gần nguồn nước hay không… Thời tiết cũng ảnh hưởng gián tiếp đến quá trình bảo quản vì nó cũng là nhân tố ảnh hưởng đến điều kiện phát triển của nấm men, lão hóa rượu Thời tiết cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của dịch bệnh trên cây gây ảnh hưởng chất lượng trái Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản Rất quan trọng trong quá trình vận chuyển và tồn trữ rượu sau khi đã thành phẩm Nếu điều kiện bảo quản không tốt có thể gây biến đổi chất lượng rượu, có thể làm một số muối sắt hay muối đồng sau một thời gian có

thể hòa tan hay kết tủa do sự hoạt động trở lại của các enzyme bị ức chế nay được hoạt hóa Bên cạnh đó là sự phát triển của một số vi sinh vật tạp nhiễm bị ức chế trở nên hoạt động do điều kiện bảo quản không tốt Rượu có thể bị lên men chua bởi vi khuẩn lactic tạo thành acid lactic làm mất chất lượng rượu, bên cạnh đó cũng sẽ có sự phát triển của những vi sinh vật sản sinh ra độc tố nguy hại đối với sức khỏe của con người

2.3.6 Các yếu tố gây hư hỏng

 Do vi sinh vật tạp nhiễm

Dịch lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà còn cho các vi sinh vật khác Trong nguyên vật liệu, nước, không khí và các thành phần tham gia cho quá trình lên men luôn tồn tại một lượng vi sinh vât có hại cho nấm men rượu Các vi sinh vật này sẽ cạnh tranh sử dụng đường với nấm men và biến đường thành các chất khác do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu

Trong điều kiện lên men rượu thường gặp các vi sinh vật tạp nhiễm sau:

Vi khuẩn lactic: Đây là loại vi khuẩn yếm khí Chúng tồn tại ở hai loại: lactic điển hình và lactic không điển hình Vi khuẩn lactic điển hình sẽ tạo ra sản phẩm duy nhất là acid lactic từ đường Vi khuẩn lactic không điển hình sẽ sử dụng đường và tạo

ra acid lactic, ngoài ra còn tạo một lượng đáng kể các sản phẩm như alcol, acid acetic, cacbonic, diacetyl và acetone Lactic điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 49 – 51°C, lactic không điển hình có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 37 – 38°C

Vi khuẩn acetic: là vi khuẩn háo khí không tạo thành bào tử Nhiệt độ tối ưu trong khoảng 20 - 35°C Chúng phát triển trong canh trường có nồng độ alcol thấp, oxy hóa alcol thành acetic Trong môi trường không có alcol, vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa đường thành acid butyric Vi khuẩn acetic thường phát triển trên bề mặt dịch lên men để lâu ngày, trong điều kiện lên men rượu chúng ít có khả năng phát triển vì là vi khuẩn rất hiếu khí

Vi khuẩn butyric và các vi sinh vật khác Trong dịch lên men cũng có nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh bào tử nếu được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp Chúng gồm vi khuẩn butylic, acetone butylic, subtylic…Nhưng trong điều kiện lên men rượu thì tất cả các vi khuẩn này đều không có khả năng phát triển vì pH tối thích của chúng đều nằm trong khoảng trung tính hoặc kiềm nhẹ Vì vậy

vi khuẩn chủ yếu trong lên men rượu là vi khuẩn lactic (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005)

 Do tự bản thân nguyên liệu ban đầu

Nếu trong quá trình chế biến ta không kiểm soát nguồn nguyên liệu đầu vào chặc chẽ có thể làm ảnh hưởng chất lượng của rượu Nếu trong nguồn nước của dịch bưởi

có các chất kháng sinh hay chất ức chế phát triển của nấm men sẽ làm nấm men không hoạt động được hoặc hoạt động không cao ảnh hưởng đến chất lượng rượu Để phát triển tốt được thì nguồn nguyên liệu phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết Những chất lạ hay chất ức chế đối với quá trình lên men của nấm men có thể làm giảm chất lượng hay hư hỏng rượu sau lên men

 Nguyên nhân do điều kiện chế biến và bảo quản

Quá trình lên men không đòi hỏi những điều kiện quá nghiêm ngặt nhưng cũng phải có những điều kiện thích hợp bảo đảm lên men tốt tránh tạp nhiễm Lên men trong điều kiện kỵ khí vì vậy cần tạo điều kiện yếm khí cho nấm men có thể lên men tốt Các chủng nấm men kỵ khí tùy nghi có thể phát triển trong cả điều kiện có hay

không có oxy, ví dụ chủng Saccharomyces cerevisiae nếu nuôi cấy trong điều kiện có

oxy sẽ phát triển tăng sinh khối mà không sinh ra các chất cho quá trình lên men, chỉ khi trong điều kiện yếm khí chúng mới thực hiện quá trình lên men Nếu không tạo điều kiện cho mấn men lên men mà các vi sinh vật tạp nhiễm khác lên men thì sản phẩm rượu mất chất lượng và có thể hư hỏng nghiêm trọng

Điều kiện bảo quản, rất quan trọng sau quá trình lên men Rượu thành phẩm có thể ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật tạp nhiễm nhờ vào nồng độ rượu, sự có mặt của vi sinh vật hữu ích, … nhưng trong rượu bây giờ hàm lượng các chất dinh dưỡng cũng rất cao, vì vậy nếu bảo quản không tốt thì vi sinh tạp nhiễm sẽ sử dụng các chất dinh dưỡng cần thiết để phát triển và có thể sinh ra độc tố hay các chất làm hư

hỏng rượu

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện vật liệu

3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch bưởi lên men tự nhiên

a Mục đích thí nghiệm: phân lập được những dòng nấm men dạng thuần khiết có

trong dịch quả lên men tự nhiên

khiết Vì thế, phân lập nấm men là tách riêng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu

và đưa chúng về dạng thuần khiết Chủng nấm men được gọi là thuần khiết khi chúng được tạo ra từ một tế bào ban đầu (Nguyễn Đức Lượng, 2003)

(2) Sơ đồ thực hiện lên men rượu vang bưởi và phân lập nấm men trong quá trình lên men tự nhiên rượu bưởi (Mai Thị Tươi, 2007)

Nuôi trong ống nghiệm

Hình 4: Sơ đồ lên men tự nhiên dịch bưởi và phân lập

(3) Thuyết minh sơ đồ

Bưởi đem về gọt vỏ, loại bỏ vỏ và hat, ép lấy nước (sử dụng máy ép trái cây ép lấy dịch quả) Cho thêm đường (khoảng 20% so với thể tích đem lên men, có thể dùng máy đo điều chỉnh về khoảng 22 – 25 độ Brix là thích hợp nhất), cho lên men trong

Bổ sung đường

bình tam giác, đậy bình bằng water clock để theo dõi quá trình lên men Lên men tự nhiên khoảng 2 – 3 ngày Tiến hành phân lập các dòng nấm men trên môi trường khoai tây – glucose – agar (PGA: khoai tây 20%, glucose 2%, agar 2%, (NH4)2SO4 0.2%, nước cất), hút lấy một lượng nhỏ dịch lên men (khoảng 0.05ml) cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị, dùng cây cấy trang trải mẫu lên mặt đĩa, ủ ở 30°C Chọn khuẩn lạc rời rạc để cấy phân lập đến khi ròng thì giữ giống trong ống nghiệm để tiến hành các thí nghiệm sau

Kết thúc thí nghiệm sẽ phân lập được một số dòng thuần nấm men tự nhiên có trong dịch quả bưởi lên men

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát và tuyển chọn dòng nấm men có hoạt tính lên men cao nhất

a Mục đích thí nghiệm: tìm ra dòng nấm men có khả năng lên men cho độ rượu cao

nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

b Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhân tố A là nấm

men, có khoảng 5 dòng (phân lập, men đối chứng và thị trường) với cùng 1 mức độ giống nhau lượng (mật số) nấm men chủng vào dịch lên men; pH bằng 4,2 và độ Brix

là 22 (Mai Thị Tươi, 2007) Như vậy, Thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lai 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 5 x 3 = 15

Bảng 3: Bảng bố trí thí nghiệm 2

Nồng độ đường ( độ Brix)

(1) Nguyên tắc: nuôi cấy nấm men trong môi trường Xác định lượng CO2 tạo thành

năng lực lên men của nấm men càng lớn Hoặc có thể đánh giá năng lực lên men theo

thời gian cần thiết để tạo ra một lượng CO2 xác định (0,5 ml CO2) Thời gian càng ngắn chứng tỏ năng lực lên men càng lớn





 100

Trong đó: a: độ Brix của dịch quả bưởi ban đầu

b: độ Brix cần đạt để làm thí nghiệm

md: khối lượng dịch quả ban đầu

=> Lượng đường cần bổ sung: md*x* 10 (kg)

lệ là 122 mg/l trong 30 phút, sau đó để ổn định và bổ sung nấm men cho lên men Cho môi trường nuôi cấy đã thanh trùng vào bình Einhorn Hút 1ml dịch lên men với các dòng nấm men phân lập được và dòng nấm men thuần làm đối chứng vào bình

trong ống, ghi lại, quan sát cẩn thận thời gian cuối để khi vừa đạt đúng 5ml thì ngừng

với 3 nồng độ đường khác nhau, thí nhiệm được lặp lại 2 lần (Lê Thanh Mai et al., 2007) Có thể dùng chai Durham có cấu tạo gồm chai thủy tinh có nấp đậy và ống thủy tinh úp ngược để khảo sát khả năng lên men

Mỗi nghiệm thức chuẩn bị thêm một bình dùng theo dõi độ Brix mỗi ngày

Tiến hành lên men với thể tích lớn hơn trong bình tam giác, chưng cất xác định

- Xác định độ rượu: bằng cách chưng cất rượu và dùng rượu kế để đo hay sử dụng phương pháp đo nhiệt độ sôi: phương pháp này dựa trên nguyên tắc mỗi dung dịch có hàm lượng rượu khác nhau thì có điểm sôi khác nhau, xác định nhiệt độ sôi của dịch từ đó xác định được hàm lượng rượu trong dung dịch (Lê Thanh Mai et al., 2007)

- Từ dịch rượu trên tiến hành đánh giá cảm quan về màu sắc, mùi vị và độ trong của rượu

cho độ rượu cao

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố: mật số nấm men và độ Brix đến quá trình lên men rượu

a Mục đích thí nghiệm: Tìm ra độ Brix và nồng độ nấm men thích hợp cho lên men rượu bưởi

b Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm hai nhân

tố, nhân tố B là nồng độ nấm men với 3 mức độ (103, 105, 107) và nhân tố C là độ Brix ban đầu của dịch lên men với 3 mức độ (19, 22, 25) Thí nghiệm bao gồm 9 nghiệm thức được lặp lại 3 lần Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 9 x 3 = 27

c Tiến hành thí nghiệm: Tiến hành lên men trong bình tam giác 500ml, mỗi

bình chứa 100ml dịch lên men Chọn dòng nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất từ thí nghiệm 2 và tiến hành cho lên men với nồng độ đường được điều chỉnh (19, 22, 25)

chỉnh về 4.2 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

d Chỉ số theo dõi:

- Độ Brix sau lên men

- Xác định độ rượu sinh ra sau lên men

- Tiến hành đánh giá cảm quan: màu sắc, mùi, vị, độ trong của dịch rượu

3.3.4 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu điều vị (14; 18; 22; 26; 30%) đến màu sắc, mùi vị của sản phẩm

a Mục đích: tìm ra nồng độ rượu điều vị cho sản phẩm tốt

Dịch lên men được điều vị bằng rượu cao độ theo hệ phương trình sau:

x + y = 1

ax + by = d

Trong đó:

x: thể tích rượu vang trong 1 lít rượu thành phẩm (sau điều vị)

y: thể tích rượu nếp dùng điều vị trong 1 lít rượu thành phẩm

a: nồng độ rượu vang ban đầu chưa điều vị

b: nồng độ rượu nếp dùng điều vị

d: nồng độ rượu cần đạt được sau điều vị

c Chỉ số theo dõi: đánh giá về các chỉ tiêu màu sắc, mùi vị và độ ưa thích sản phẩm

Điều vị

vị

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men từ dịch bưởi lên men tự nhiên

Bưởi được cho lên men tự nhiên sau 4 ngày lấy dịch lên men trải lên môi trường glucose-khoai tây-agar Chọn khuẩn lạc rời rạc tiếp tục cấy chuyển và quan sát trên kính hiển vi đến khi mẫu đã thuần (hình dạng tế bào nấm men đồng nhất)

Kết quả sau nhiều lần phân lập đã tìm ra được ba dòng nấm men thuần (ký hiệu: Y1001, Y1002, Y1003) có hình dạng khác biệt khi quan sát dưới kính hiển vi ở cùng một thời gian nuôi cấy (sau 2 ngày nuôi trên môi trường thạch)

4.1.1 Dòng Y1001: Thu được từ quá trình phân lập nấm men ở điều kiện lên men tự

nhiên không bổ sung đường Brix dịch quả tự nhiên là 10, pH tự nhiên là 4,75

Vi sinh vật phát triển trên môi trường trường thạch (khoai tây- glucose- agar) tạo thành những dạng đặc biệt gọi là khuẩn lạc (colony) Khuẩn lạc là tập đoàn vi sinh vật sinh ra từ một tế bào hay bào tử có trước (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) Vì vậy khi quan sát khuẩn lạc các dòng vi sinh vật khác nhau trên môi trường thạch có những đặc điểm khác nhau

- Mô tả khuẩn lạc

Hình dạng khuẩn lạc không đều

Màu sắc trắng đục, màu hơi sậm, không trong Có một viền màu trắng trong, mỏng phía ngoài

Bìa khuẩn lạc không đều, có khía răng cưa

Khuẩn lạc không nhô cao, tạo đường viền cách mép khoảng 1/3 từ tâm khuẩn lạc Viền màu trắng sữa hơi nhô cao hơn, ở giữa trũng xuống Có một tâm màu trắng sữa ở giữa

Kích thước khuẩn lạc khoảng 3- 5 mm

- Mô tả tế bào nấm men

Hình dạng nấm men: tế bào dạng dài, hẹp hai bên, hình dạng gần giống hình trụ dài, một số có hình elip dài, vách tế bào dầy, không bào nhiều phân bố rộng khắp tế

bào, đôi khi tập trung thành một không bào lớn Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi, chồi thường xuất hiện ở một đầu của tế bào nấm men

Các hình nấm men quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần

(a) (b) Hình 5: Dòng Y1001 trên đĩa thạch (a) và trên kính hiển vi (b)

4.1.2 Dòng Y1002: Phân lập từ quá trình lên men dịch bưởi tự nhiên không bổ sung

đường pH dịch quả ban đầu là 4,75 và Brix ban đầu là 10

- Mô tả khuẩn lạc

Hình dạng khuẩn lạc: hình tròn Màu sắc: khuẩn lạc màu trắng đục

Bìa khuẩn lạc láng, đều

Độ nổi của khuẩn lạc: dạng mô, khuẩn lạc nhô lên cong đều, tạo đỉnh nhọn ở giữa khuẩn lạc

Kích thước khuẩn lạc khoảng 1,5- 2 mm

- Mô tả tế bào nấm men: hình dạng nấm men cầu tròn, tế bào có vách mỏng hơn dòng Y1001, có ít không bào, mặt tế bào nhẵn, nảy chồi nhiều, tế bào riêng rẽ không kết chùm

(a) (b)

Hình 6: Dòng men Y1002 trên đĩa thạch (a) và trên kính hiển vi (b)

4.1.3 Dòng Y1003: Được phân lập từ quá trình lên men dịch bưởi tự nhiên, dịch lên

men không bổ sung đường Dịch quả lên men ban đầu có pH là 4,75, Brix là 10