Phân Lập Và Tuyển Chọn Giống Vi Sinh Vật Lên Men Rượu Nếp

TÓM TẮT Với mục đích tuyển chọn dòng nấm mốc cho hoạt tính đường hóa cao trong thời gian ngắn và dòng nấm men cho hoạt tính lên men nhanh và mạnh để sản xuất bột mốc và bột men lên men r

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT

LÊN MEN RƯỢU NẾP

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ts NGUYỄN VĂN THÀNH NGUYỄN HUỲNH BÍCH LIỄU Viện NC&PT CNSH MSSV: 3064394

Lớp CNSH K32

Cần Thơ, tháng 5/2010

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ts Nguyễn Văn Thành Nguyễn Huỳnh Bích Liễu

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Đầu tiên, con xin chân thành cám ơn cha mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng, dạy dỗ con cho đến ngày hôm nay

Xin cám ơn tất cả quý thầy cô đã tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Cần Thơ, cám ơn các thầy cô của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình theo học tại trường

Xin cám ơn cô cố vấn học tập Ths Trần Thị Xuân Mai là người đã giúp đỡ, động viên tôi khi tôi gặp khó khăn trong vấn đề học tập

Xin chân thành cám ơn thầy Ts Nguyễn Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Cám ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Huỳnh Xuân Phong các anh, chị cao học K14, K15 và bạn bè lớp CNSH TT K32 đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Xin cám ơn tất cả các bạn Lớp Công nghệ Sinh học K32 đã luôn cổ vũ, động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Xin kính chúc cha mẹ, quý thầy cô, các anh chị và bạn bè luôn dồi dào sức khỏe Chúc tất cả các bạn Lớp Công nghệ Sinh học K32 vui vẻ và thành công trên bước đường tương lai

Tp Cần Thơ, ngày 03 tháng 05 năm 2010

Nguyễn Huỳnh Bích Liễu

TÓM TẮT

Với mục đích tuyển chọn dòng nấm mốc cho hoạt tính đường hóa cao trong thời gian ngắn và dòng nấm men cho hoạt tính lên men nhanh và mạnh để sản xuất bột mốc và bột men lên men rượu nếp, chúng tôi tiến hành phân lập nấm mốc và nấm men từ các loại men rượu cho năng suất cao ở thị trường chợ Cái Răng, Quận Cái Răng, Tp Cần Thơ Sau đó khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men đã phân lập để chọn dòng cho hoạt tính tốt nhất và khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc và lên men của nấm men Tiếp theo

là khảo sát lượng nước bổ sung phù hợp để nuôi nấm mốc nhằm đạt bào tử nhiều nhất Khi

có đầy đủ các yếu tố cần thiết của con giống, chúng tôi tiến hành nuôi sinh khối sản xuất bột mốc và bột men, đồng thời khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp cho quá trình lên men rượu

Kết quả chúng tôi phân lập được 4 dòng nấm mốc và 4 dòng nấm men Trong đó dòng nấm mốc M0903 và dòng nấm men Y0904 cho hoạt tính cao nhất Thời gian đường hóa tốt nhất của dòng M0903 là 4 ngày và thời gian lên men tốt nhất của dòng Y0904 là 3 ngày Lượng nước bổ sung để nuôi nấm mốc M0103 là 10% Tỉ lệ phối trộn giữa 2% bột mốc và 0,8% bột men là phù hợp cho quá trình lên men rượu nếp.

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 2 - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 9

I Nguyên liệu sản xuất rượu nếp 9

1 Gạo nếp 9

2 Men rượu 10

2.1 Các thành phần chủ yếu của men rượu cổ truyền 10

2.2 Hệ vi sinh vật trong men rượu cổ truyền 11

3 Nguồn nước 17

4 Quá trình lên men rượu 19

4.1 Khái quát 19

4.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu 19

4.3 Động học của quá trình lên men 20

4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 21

4.5 Các công đoạn chính trong quá trình sản xuất rượu 23

CHƯƠNG 3 - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

I Phương tiện 25

1 Thời gian và địa điểm 25

2 Nguyên vật liệu 25

3 Thiết bị - dụng cụ 25

II Phương pháp nghiên cứu 26

1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm mốc và nấm men trong các loại men 26

1.1 Phân lập nấm mốc 26

1.2 Phân lập nấm men 27

2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men đã phân lập 27

2.1 Xác định hoạt tính các dòng nấm mốc 27

2.2 Xác định hoạt tính các dòng nấm men 27

3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc và lên men của nấm men 28

3.1 Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc 28

3.2 Khảo sát thời gian lên men của nấm men 28

4 Thí nghiệm 4: Sản xuất sinh khối nấm mốc và nấm men 29

4.1 Sản xuất sinh khối nấm mốc 29

4.2 Sản xuất sinh khối nấm men 30

5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa bột mốc và bột men 31

Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa bột mốc và bột men 25

CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

I Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng nấm mốc và nấm men 32

1 Định danh sơ bộ nấm mốc 32

1.1 Dòng nấm mốc M0901 32

1.2 Dòng nấm mốc M0902 33

1.3 Dòng nấm mốc M0903 35

1.4 Dòng nấm mốc M0904 36

2 Định danh sơ bộ nấm men 37

2.1 Dòng nấm men Y0901 37

2.2 Dòng nấm men Y0902 38

2.3 Dòng nấm men Y0903 38

2.4 Dòng nấm men Y0904 39

II Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men phân lập 40

1 Khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc phân lập 40

2 Khảo sát hoạt tính các dòng nấm men phân lập 41

III Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian đường hóa và lên men thích hợp .42

1 Khảo sát thời gian đường hóa 42

2 Khảo sát thời gian lên men 44

IV Thí nghiệm 4: Sản xuất sinh khối nấm mốc và nấm men 44

1 Sản xuất sinh khối nấm mốc 45

1.1 Nuôi nấm mốc 45

1.2 Khảo sát hoạt tính bột mốc 45

2 Sản xuất sinh khối nấm men 46

2.1 Nuôi nấm men 46

2.2 Khảo sát hoạt tính bột men 46

V Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối trộn bột mốc và bột men 47

CHƯƠNG 5 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

I Kết luận 50

II Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 53 PHỤ LỤC 1 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

2.1 Phương pháp xác định ẩm độ

2.2 Phương pháp đếm trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc và tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu

2.3 Phương pháp xác định hàm lượng rượu etylic

PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

3.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men phân lập

Bảng 20 Kết quả khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc phân lập

Bảng 21 Kết quả khảo sát hoạt tính các dòng nấm men phân lập

3.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian đường hóa và lên men thích hợp

Bảng 22 Kết quả khảo sát thời gian đường hóa Bảng 23 Kết quả khảo sát thời gian lên men

3.3 Khảo sát tỉ lệ phối trộn bột mốc và bột men

Bảng 24 Kết quả khảo sát tỉ lệ phối trộn bột mốc và bột men

PHỤ LỤC 4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

4.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men phân lập

4.1.1 Khảo sát hoạt tính các dòng nấm mốc phân lập

Bảng 25 Kết quả thống kê sự thay đổi pH sau ủ mốc

Bảng 26 Kết quả thống kê khả năng đường hóa sau ủ mốc

Bảng 27 Kết quả thống kê thể tích dịch rỉ sau ủ mốc

4.1.2 Khảo sát hoạt tính các dòng nấm men

Bảng 28 Kết quả thống kê sự thay đổi pH sau khi lên men

Bảng 29 Kết quả thống kê sự thay đổi độ Brix sau khi lên men

Bảng 30 Kết quả thống kê hàm lượng etanol sinh ra sau khi lên men

4.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc và lên men của nấm men 4.2.1 Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc

Bảng 31 Kết quả thống kê sự thay đổi pH qua các thời gian ủ mốc

Bảng 32 Kết quả thống kê sự thay đổi độ Brix qua các thời gian ủ mốc

Bảng 33 Kết quả thống kê thể tích dịch rỉ qua các thời gian ủ mốc

4.2.2 Khảo sát thời gian lên men của nấm men

Bảng 34 Kết quả thống kê sự thay đổi pH qua các thời gian lên men

Bảng 35 Kết quả thống kê sự thay đổi độ Brix qua các thời gian lên men

Bảng 36 Kết quả thống kê hàm lượng etanol sinh ra qua các thời gian lên men 4.3 Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa bột mốc và bột men

Bảng 37 Kết quả thống kê sự thay đổi pH sau ủ mốc qua các tỉ lệ phối trộn Bảng 38 Kết quả thống kê sự thay đổi độ Brix sau ủ mốc qua các tỉ lệ phối trộn Bảng 39 Kết quả thống kê sự thay đổi pH sau len men qua các tỉ lệ phối trộn Bảng 40 Kết quả thống kê sự thay đổi độ Brix sau lên men qua các tỉ lệ phối trộn Bảng 41 Kết quả thống kê hàm lượng etanol sinh ra qua các tỉ lệ phối trộn

DANH SÁCH BẢNG

Tên bảng

Bảng 1 Thành phần hóa học của nếp 2

Bảng 2 Thành phần hóa học của nấm men 7

Bảng 3 Giới hạn hàm lượng các ion trong nước .10

Bảng 4 Tên các loại men rượu .18

Bảng 5 Nghiệm thức thời gian đường hóa của nấm mốc .21

Bảng 6 Nghiệm thức thời gian lên men của nấm men .22

Bảng 7 Tỉ lệ phối trộn giữa bột mốc và bột men 24

Bảng 8 Kết quả sự phát triển khuẩn ty và sự xuất hiện dịch rỉ của các dòng nấm mốc.34 Bảng 9 Kết quả khả năng đường hóa của các dòng nấm mốc .34

Bảng 10 Kết quả sự sinh bọt khí CO2 của các dòng nấm men .35

Bảng 11 Kết quả khả năng lên men của các dòng nấm men .36

Bảng 12 Kết quả sự phát triển của khuẩn ty và sự xuất hiện dịch rỉ qua các thời gian đường hóa khác nhau 37

Bảng 13 Kết quả khả năng đường hóa của dòng nấm mốc M0903 qua các thời gian đường hóa khác nhau .38

Bảng 14 Kết quả khả năng lên men của dòng nấm men Y0904 qua các thời gian lên men khác nhau .38

Bảng 15 Kết quả mật số bào tử qua việc bổ sung các lượng nước khác nhau 39

Bảng 16 Kết quả khả năng đường hóa của bột mốc M0903 40

Bảng 17 Kết quả mật số tế bào và độ ẩm bột men .41

Bảng 18 Kết quả khả năng lên men rượu của bột men Y0904 .41

Bảng 19 Kết quả phối trộn tỉ lệ bột mốc và bột men 42

DANH SÁCH HÌNH

Tên Hình

Hình 1 Một số chi nấm có trong men rượu 11

Hình 2 Dòng nấm mốc M0901 27

Hình 3 Dòng nấm mốc M0902 28

Hình 4 Dòng nấm mốc M0903 30

Hình 5 Dòng nấm mốc M0904 31

Hình 6 Dòng nấm men Y0901 32

Hình 7 Dòng nấm men Y0902 32

Hình 8 Dòng nấm men Y0903 33

Hình 9 Dòng nấm men Y0904 33

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU

Rượu là một loại đồ uống có lịch sử hàng ngàn năm có mặt trong hầu hết các

lễ nghi và phong tục của hầu hết các quốc gia trên thế giới Mỗi quốc gia, mỗi vùng lại có một loại rượu đặc trưng và là niềm tự hào của vùng Ở Việt Nam rượu đế truyền thống được mang tên “quốc tửu” với một bề dày lịch sử có nguồn gốc lâu đời cùng với mùi vị đặc trưng của từng địa phương Thành phần chính của rượu là: rượu etylic (etanol:

C2H5OH), nước, và các cấu tử khác tuỳ thuộc vào cách sản xuất, loại nguyên liệu, cách pha chế, tồn trữ Chính các cấu tử khác này tạo nên nét đặc trưng của mỗi loại rượu Khắp cả nước đều có rượu ngon và nổi tiếng gắn với địa danh hay tên của nghệ nhân cho loại rượu đó Một số tên rượu nổi tiếng ở Việt Nam như: Kim Sơn, Làng Vân, Mẫu Sơn, Bàu Đá ở phía Bắc Rượu Gò Đen, Xuân Thạnh ở miền Tây Đặc biệt rượu đế làm từ hạt nếp sáp Long An cho hương thơm dịu, vị ngọt là đặc sản của vùng Nam Bộ

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng đất trù phú về lúa gạo vào loại bậc nhất của cả nước, chính vì thế từ xa xưa người ta đã biết làm rượu từ nguyên liệu là gạo, nếp dựa vào sự lên men tự nhiên của vi sinh vật Trong quá trình lên men rượu vai trò của vi sinh vật tham gia là hết sức cần thiết và đó là yếu tố quyết định chất lượng rượu tạo thành

Chính vì vậy đề tài “ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT

LÊN MEN RƯỢU NẾP ” được thực hiện với mục đích tuyển chọn dòng nấm mốc và

nấm men cho hoạt tính cao đáp ứng yêu cầu làm nguồn giống cho quá trình lên men rượu

CHƯƠNG 2 - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I Nguyên liệu sản xuất rượu nếp

1 Gạo nếp

Ngũ cốc là nguyên liệu chứa hàm lượng tinh bột rất cao phù hợp với ngành công nghiệp sản xuất rượu Trong đó, nếp với hàm lượng tinh bột trên 70% chúng được sử dụng trong sản xuất rượu

Trong tinh bột bao gồm hai thành phần amylose và amylopectin Hai thành phần này khác hẳn về tính chất hóa học và tính chất vật lý Ví dụ: amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho màu tím đỏ, amylose và amylopectin cũng khác nhau về tính hòa tan, amylose dễ hòa tan trong nước ấm tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao còn amylopectin chỉ hòa tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao Trong tinh bột

tỉ lệ amylose và amylopectin thay đổi tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu Trong hạt gạo chủ yếu là amylose còn trong hạt nếp chủ yếu là amylopectin

Amylopectin là polysaccharide mạch thẳng phân nhánh, cấu tạo gồm các gốc - D- glucopyranose, amylopectin tạo thành từ 600-6000 gốc đường glucose liên kết nhau bằng

- 1,4glucoside trên mạch chính, tại các điểm phân nhánh, các gốc glucose liên kết với nhau bằng liên kết - 1,6glucoside Mỗi nhánh trong phân tử amylopectin chứa khoảng 15-30 gốc glucose Phân tử lượng của amylopectin từ 107- 108 đơn vị

Amylose là polysaccharide mạch thẳng cấu tạo gồm các gốc - D- glucopyranose, amylose được tạo thành từ 200-1000 gốc đường glucose chúng liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4glucoside Trọng lượng phân tử của amylose khoảng 105-106 đơn vị

(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2008)

chất lượng rượu tốt nhất (Trần Thị Thanh, 2000)

2.1 Các thành phần chủ yếu của men rượu cổ truyền

 Bột gạo: Phải chọn nguyên liệu tốt, đặc biệt không được nhiễm vi sinh vật hoặc côn

trùng vì sẽ ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của bánh men Có thể sử dụng bột gạo hay bột nếp với độ ẩm khoảng 11.3%

 Men giống: Sử dụng ở dạng đông khô, gồm 2 chủng chủ yếu là chủng: Saccharomyces

và Endomycopsis Men giống được hoạt hóa bằng nước trước khi cho vào hòa trộn với

bột

 Thuốc bắc: Thành phần hóa học của các vị thuốc bắc có thể chia thành hai nhóm:

Nhóm các chất độn và nhóm hoạt chất Nhóm các chất độn bao gồm: nước, muối vô cơ, đường tinh bột, chất béo…Nhóm hoạt chất gồm: acid hữu cơ, acid vô cơ, tinh dầu, chất béo…Nhóm này tác động đến hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ hô hấp, hệ vận động Ngoài

ra một số chất như: dầu, phenol, ancaloit và một số chất kháng sinh như: cinnamic

aldehyte, eugenol, menthol, thymol, vanillin…(Adam, 1995)

Một số vị thuốc bắc thường dùng trong các bài thuốc làm men rượu có chứa hàm lượng chất kháng sinh thực vật khá cao như Quế tinh dầu chứa 95% cinnamic, aldehyte, Đinh hương tinh dầu chứa 85% eugenol, Bạc hà tinh dầu chứa 50% menthol, Tiểu hồi tinh dầu chứa 70% anethol Một số vị khác chứa hàm lượng chất dinh dưỡng đáng kể như: Nhục đậu khấu chứa 40% chất béo, Cam thảo chứa 8% glucose, 6% saccharose, 30% tinh bột…

Nhìn chung vai trò của các vị thuốc bắc trong viên men được quan tâm chủ yếu ở hai tác dụng: kháng khuẩn và tạo hương cho rượu Tuy nhiên, vấn đề này hiện nay chưa được nghiên cứu nhiều

Một số công trình nghiên cứu cho thấy, các vị thuốc bắc có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển sinh khối của nấm men và nấm mốc trong giai đoạn đầu của quá trình lên men Hiện nay, có khoảng 20 vị thuốc bắc được sử dụng phổ biến trong sản xuất rượu đế: Bạc

hà, Đinh hương, Nhục đậu khấu, Đại hồi, Quế chi, Tế tân, Bạch truật, Liên kiều, Thảo quả, Tiểu hồi, Cam thảo, Sa nhân….Sự phối hợp các vị thuốc có tác động mạnh mẽ hơn

từng vị thuốc đơn lẻ (Nguyễn Văn Hiệu, 1991)

2.2 Hệ vi sinh vật trong men rượu cổ truyền

2.2.1 Nấm mốc

Nấm mốc có cấu tạo hình sợi, có sinh bào tử, không có diệp lục tố, không có khả năng tổng hợp chất hữu cơ mà sử dụng chất hữu cơ có sẵn để sinh sống Nấm mốc mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì vậy chúng thường phát triển trên bề mặt cơ chất dưới dạng các nhóm hình sợi lún phún, lớp mạng nhện hay khối bông

 Các loài nấm mốc thường gặp trong bánh men thuốc bắc

Trong bánh men thuốc bắc, nấm mốc chủ yếu là các chi : Mucor, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus Trong đó, đặc biệt là loài Mucor rouxii có nhiều đặc tính quý như:

có khả năng chịu nhiệt độ cao 32-350C, vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa Năm 1998, Lee et al đã khảo sát hệ vi sinh vật trong viên men rượu được sản xuất tại

Việt Nam, kết quả phân lập được các dòng nấm mốc như: Rhizopus oryzae, Mucor indicus, Mucor circinilloides, Amylomyces rouxii

 Sinh trưởng của nấm mốc

Các giống nấm mốc vừa nêu thuộc loại nấm sợi, từ một bào tử hay một đoạn sợi nấm khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển tạo thành một hệ sợi nấm hay khuẩn ty, thời gian để bào tử nảy mầm và tốc độ phát triển của khuẩn ty thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, cơ chất và loài nấm mốc Trong cùng một điều kiện môi trường số lượng bào

tử nấm mốc nảy mầm được tự điều chỉnh sao cho không quá nhiều bào tử nảy mầm trong cùng thời gian (Nout et al., 1999)

Trong điều kiện hiếu khí nấm mốc phát triển mạnh về sinh khối và tăng nhiệt

Trong điều kiện yếm khí, một số loài nấm mốc (Rhizopus oligosporus, Penicillium roqueforti ) cũng có khả năng biến dưỡng tạo năng lượng qua quá trình lên men, quá

trình này cho năng lượng thấp hơn và một số sản phẩm lên men như: etanol, acid lactic, và nhiều CO2 (Nout et al., 1999)

Khi điều kiện môi trường không thuận lợi (đặc biệt nguồn nitơ bị hạn chế) sẽ hình thành bào tử, từ một hệ khuẩn ty có thể hình thành khoảng vài chục triệu bào tử (Bùi Xuân Đồng, 1999) Bào tử là dạng tiềm sinh giúp nấm mốc có thể sống sót trong những điều

kiện môi trường bất lợi của thiên nhiên như : độ ẩm môi trường thấp, nhiệt độ cao, tia tử ngoại

 Vai trò của nấm mốc trong lên men rượu

Nấm mốc có khả năng sinh ra enzyme amylase, đặc biệt là -amylase và amyloglucosidase để thủy phân tinh bột thành đường, chủ yếu là glucose Nguồn tinh bột ban đầu được hấp thu sau đó hóa lỏng bằng -amylase, đường hóa bằng amyloglucosidase

- -amylase cắt ngẫu nhiên các liên kết - 1,4 glucoside trong mạch amylose và amylopectin thành hỗn hợp các oligomer bao gồm các đoạn phân nhánh và không phân nhánh

- Amyloglucosidase cắt các liên kết - 1,4glucoside từ đầu không khử của amylose phóng thích ra các monomer đơn D-glucose, đồng thời các nối - 1,6glucoside cũng được thủy giải nhưng chậm hơn Enzyme này có khả năng thủy phân hầu như hoàn toàn tinh bột thành glucose (đến 98%)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc sản sinh enzyme đường hóa của nấm mốc

- Các chất dinh dưỡng : Glucose là nguồn cacbon tối hảo cho tất cả các sợi nấm Tuy nhiên, muốn sợi nấm sinh ra nhiều enzyme đường hóa thì tinh bột là nguồn cacbon thích hợp Khi nuôi sợi nấm để sinh enzyme thì nguồn nitrogen được sử dụng dưới dạng sulfat amon Tỷ lệ cacbon và nitơ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến tổng hợp sợi nấm và khả năng tạo ra enzyme Khi nguồn cacbon và nitơ đầy đủ thì sợi nấm mới tích lũy enzyme tối đa

- Hàm lượng nước trong môi trường : Hàm lượng nước thích hợp sẽ tạo điều kiện tốt cho sự phát triển của nấm Nếu môi trường thừa nước thì sẽ làm giảm trạng thái xốp của môi trường, giảm lượng oxy khuyếch tán, vi khuẩn sẽ dễ dàng phát triển Nếu thiếu nước thì bề mặt môi trường bị khô là nguyên nhân kìm hãm sự phát triển của sợi nấm và gây hiện tượng sinh bào tử sớm

- Nhiệt độ: Trong quá trình phát triển của nấm sợi, sinh ra lượng nhiệt khá lớn làm tăng nhiệt độ của môi trường Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 32-330C, thông thường chỉ cần điều chỉnh nhiệt độ vào giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy nhằm kích thích bào tử nấm mọc ra sợi nấm tốt

- Thời gian: phụ thuộc vào từng loại nấm, thông thường sau thời gian nuôi cấy từ 30-32 giờ thì nấm sợi sẽ phát triển mạnh nhất và sự tạo thành enzyme đường hóa nhiều nhất khi kết thúc sợi nấm bắt đầu sinh bào tử

2.2.2 Nấm men

Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường sinh sản bằng hình thức nảy chồi hoặc phân cắt, một số có thể sinh sản hữu tính bằng bào tử túi Nhiều loài có khả năng lên men đường, thích nghi được trong môi trường có nồng độ đường cao, acid cao

Tế bào nấm men có hình thái và kích thướt khác nhau Tùy loài, tùy giống chúng có thể có hình bầu dục, hình cầu, hình trứng, hình quả chanh Các loại nấm men thường dùng

trong sản xuất rượu bia là Saccharomyces serevisiae có dạng hình elip, hình trứng, kích

thướt thay đổi trong khoảng 2.5-10m x 4.5-21m Thời gian cho một thế hệ khoảng 120

phút

Bình thường nấm men Saccharomyces serevisiae sinh sản vô tính bằng cách nảy

chồi, nhưng trong điều kiện môi trường không thuận lợi, chúng cũng có khả năng sinh sản hữu tính Trong sinh sản hữu tính, tế bào lưỡng bội (2n) sau quá trình giảm phân sẽ thành lập bào tử túi, trong túi bào tử có chứa 4 bào tử đơn bội (n) bao gồm 2 loại bào tử khác giới, các bào tử khác giới này sẽ tiếp hợp để trở thành bào tử tiếp hợp lưỡng bội trước khi

nảy mầm Ở giống Shizosaccharomyces đặc tính tương tự cũng được phát hiện, túi bào tử

có 8 bào tử, các bào tử đơn bội khác giới có thể nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng đơn bội hoặc tiếp hợp để trở thành tế bào sinh dưỡng lưỡng bội (Nout et al., 1999) Tính chất này có thể giúp tăng cường khả năng sống sót của nấm men trong điều kiện không thuận lợi của môi trường

Nấm men hấp thu tốt các loại đường như D-glucose, fructose, sucrose, maltose, maltotriose Sự biến dưỡng các chất đường được thực hiện bởi quá trình đường phân (lộ trình Embden- Meyerhof), tiếp theo bởi chu trình Krebs trong điều kiện hiếu khí Trong điều kiện khác, sự biến dưỡng có thể được thực hiện qua lộ trình Pentose-phosphate và lộ trình Entner- Doudoroff, tiếp theo bởi sự hô hấp hiếu khí hoặc sự lên men yếm khí (Nout

et al., 1999) Trong điều kiện hiếu khí nấm men tạo nhiều năng lượng, phát triển sinh khối Trong điều kiện yếm khí nấm men tạo ra etanol và CO2, gọi là quá trình lên men

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thu chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khuyếch tán vào bên trong Màng là lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào trong trường hợp này đóng vai trò là màng bán thấm, ngăn cách điều khiển các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải ra môi trường xung quanh những sản phẩm của hoạt động sống

Những chất dinh dưỡng cần thiết cho nấm men : oxy, hydro, cacbon, nitơ, các chất khoáng Nấm men có nhiều trong tự nhiên và có thể sử dụng trong sản xuất rượu, bia, bánh mì Tế bào nấm men giàu protein, vitamin (đặc biệt là vitamin nhóm B và tiền vitamin nhóm D2)

Bảng 2 Thành phần hóa học của nấm men

 Các loại nấm men thường gặp trong men rượu

Mỗi gam bánh men chứa vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nếm men

Chúng gồm 2 giống: Endomycopsis (chủ yếu là Endo fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là S.cerevisiae)

- Endo fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoamylase nên

chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa

- Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose,

saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose Đồng thời, chúng có thể lên men ở nhiệt

độ cao (36-400C) và có khả năng chịu được độ acid Đặc điểm này rất thuận lợi trong trường hợp lên men có sử dụng thuốc sát trùng Điều quan trọng hơn là có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn với đường trong dung dịch 12-14%, có

khi 16-18% Nồng độ rượu cao nhất trong dịch lên men mà nấm men có thể chịu được là 10-12% Nhiệt độ lên men thích hợp nhất là 28-320C

Ngoài 2 chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn nhiều loài men dại khác Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột vừa có khả năng chuyển đường thành rượu tuy nhiên sự chuyển hóa này thấp Đặc biệt các loài men dại này chịu được nhiệt độ rất cao (60-650C)

 Vai trò của nấm men trong quá trình chuyển hóa đường thành rượu

Nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu cổ truyền Trong suốt thời gian lên men ngoài etanol, CO2 còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ như: Glycerol, dầu fusel, ester, acid hữu cơ, diacetyl và aldehyde Sự hiện diện của các hợp chất này tùy thuộc vào dòng nấm men và điều kiện lên men, chúng góp phần quan trọng tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm

Để thu được năng suất rượu cao, nấm men thường được lựa chọn dựa vào 2 đặc tính: Lên men với tốc độ mạnh và khả năng chịu được nồng độ rượu cao trong môi trường lên men Etanol là sản phẩm chính của quá trình rượu hóa nhưng ở một nồng độ nào đó etanol có thể làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào nấm men, ảnh hưởng đến

sự phát triển và các hoạt động biến dưỡng của nấm men, ức chế quá trình lên men (Casey,1986)

So sánh cường độ lên men của các dòng nấm men, phương pháp thường được dùng trong các phòng thí nghiệm là phương pháp chai Durham Phương pháp này so sánh cường độ lên men dựa vào lượng khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men Trong cùng một thời điểm, lượng CO2 sinh ra nhiều hơn chứng tỏ cường độ lên men nhanh hơn So sánh khả năng chịu độ cồn cao của các dòng nấm men bằng cách cho lên men trong dung dịch đường có nồng độ (15-30%) hoặc có thể dùng phương pháp lên men liên tục rồi bổ sung glucose vào từ từ đến khi kết thúc quá trình lên men Đo độ rượu của các dòng nấm men khác nhau, dòng nấm men nào cho nồng độ cồn cao hơn chứng tỏ dòng nấm men đó có khả năng chịu đựng độ cồn cao hơn Khả năng chịu đựng độ cồn của đa số các dòng nấm men trong sản xuất bia vào khoảng 5-10 độ cồn, tuy nhiên ở một số dòng nấm men dùng

để sản xuất rượu Sake khả năng này được ghi nhận ở mức 20-25 độ cồn.(Casey,1986)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men

- Nhiệt độ : Nấm men có thể chịu đựng được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ

0-50C.Nếu lên men ở nhiệt độ lớn hơn 500C, nấm men sẽ chết

- Ảnh hưởng của pH : Nấm men có thể phát triển được trong môi trường pH= 2-8 nhưng thích hợp nhất là pH= 4.5-5

- Ảnh hưởng của oxy: Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, nấm men cần oxy

để tăng sinh khối nhưng ở các giai đoạn sau thì không cần

- Ảnh hưởng của độ rượu: Hàm lượng ethanol sinh ra, nếu vượt quá giới hạn chịu đựng sẽ ức chế sự phát triển của nấm men

c Vi khuẩn

Trong bánh men thuốc bắc có rất nhiều vi khuẩn phát triển, nhưng chủ yếu là vi

khuẩn lactic như Lactobacillus, Streptococcus và vi khuẩn acetic như A aceti, A suboxydans, vi khuẩn gây thối

Vi khuẩn sinh sản bằng cách tự nhân đôi, thời gian cho một thế hệ vi khuẩn thường ngắn Một khảo sát khả năng sinh sản của một số dòng vi khuẩn sinh acid lactic trên môi trường tinh bột ngô ở 300C cho thấy thời gian pha log khoảng 4-8 giờ, thời gian cho một thế hệ khoảng 1.2-2 giờ, độ phát triển tối đa có thể đến 109 CFU/ml Sự hiện diện của vi khuẩn trong viên men rượu được xem là gây hại cho quá trình sản xuất rượu (Holzapel,

1997)

Thời gian đầu của quá trình lên men, các vi khuẩn này phát triển tạo ra pH môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men Tuy nhiên nếu pH quá thấp sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Mặt khác, nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic làm giảm lượng rượu hình thành

+ Không có hoặc có rất ít muối ion kim loại nặng như: Hg2+, Ba2+

+ Khả năng oxy hóa 1 lít nước không vượt quá 2ml dung dịch KMnO40.01N

+ Chất cặn không vượt quá 1000mg/l

+ Muối CaSO4, MgCl2, NaCl với hàm lượng từ 300-400 mg/l thích hợp cho hoạt

động của enzyme amylase, lượng đường khử tăng lên

+ Muối CaCO3, MgCO3, Fe2+, Fe3+ với hàm lượng 400mg/l, muối natri nitrit

400mg/l sẽ ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men

(Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2008)

 Giới thiệu quy trình sản xuất rượu nếp

Nguyên liệu (gạo nếp)

Xử lý(vo, để ráo nước)

Nấu chín

Trãi cơm ra để nguội

Phối trộn

Ủ 48-72h ở nhiệt độ 28-320C

Cho nước sạch ngập cơm rượu

Cho lên men tiếp ở nhiệt độ 28-320C khoảng 48 giờ

Chưng cất

Rượu đế

+ Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường với sự có mặt của oxy như các quá trình lên men acid acetic, acid citric

+ Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic

Trong quá trình lên men rượu, nấm men chuyển hóa đường thành rượu etylic và

CO2 được gọi là quá trình rượu hóa hay cồn hóa Trong qua trình này nấm men phát triển theo 2 giai đoạn:

+ Quá trình phát triển sinh khối: với sự có mặt của oxy tế bào gia tăng kích thướt và

số lượng

+ Quá trình lên men: nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng enzyme có sẵn để thực hiện quá trình xúc tát sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, đồng thời tạo thành rượu và CO2

4.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng lớn tế bào nấm men nhất định Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào phải đạt >100 triệu tế bào trong 1ml dịch lên men Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men, trước tiên được hấp thụ trên bề mặt nấm men sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng

tế bào nấm men Rượu hòa tan trong nước nên khuyếch tán rất nhanh vào môi trường CO2cũng hòa tan vào môi trường nhưng sự hoà tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa Khi bão hòa CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành bọt khí Tế bào nấm men dính liền với nhau, bọt khí sinh ra càng nhiều và càng lớn dần lên thành những túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và nấm men thì tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi sức căng bề mặt chúng bị vỡ ra làm CO2 phóng thích ra bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường Do đó, quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men

4.3 Động học của quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể được quan sát bằng cách theo dõi sự thay đổi hàm lượng đường sinh ra và hàm lượng rượu tạo thành

Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính:

+ Thời kỳ đầu: Khoảng 60 giờ kể từ khi có nấm men tiếp xúc với dịch lên men, sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

+ Thời kỳ giữa: Đây là thời kỳ lên men chính Chiếm khoảng 60-120 giờ sau thời

kỳ đầu Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng lên nhanh chóng và đạt đến trị số cực đại

+ Thời kỳ cuối: Đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ

ổn định tạo mùi cho sản phẩm Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được Thời kỳ lên men chính là thời

kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men

Đặc trưng của quá trình lên men dịch đường hóa từ nguyên liệu chứa tinh bột giai đoạn lên men phụ Trong giai đoạn này sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn với tinh bột không hòa tan Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự phân hủy hàm lượng dextrin không lên men còn lại Tuy nhiên chính những loại

đường không lên men này sẽ tạo vị ngọt cho sản phẩm Như vậy, chu kỳ lên men dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hóa của phức hệ enzyme amylase Thời gian lên men càng kéo dài thì hiệu suất của quá trình lên men càng cao (Nguyễn Đình Thưởng, 2005)

4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Mỗi hoạt động của vi sinh vật nói chung và của nấm men nói riêng liên hệ mật thiết với ngoại cảnh Có 3 mức độ ảnh hưởng khác nhau đến hoạt động sống của nấm men

+ Điểm cực tiểu là điều kiện tối thiểu để nấm men tồn tại, ở điều kiện này bắt đầu xuất hiện các hoạt động sống

+ Điểm tối thích là điều kiện tốt nhất cho hoạt động sống Nấm men có cường độ hoạt động mạnh nhất

+ Điểm cực đại là điều kiện tối đa và là giới hạn trên tồn tại của hoạt động sống Quá giới hạn này nấm men sẽ chết

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể là nấm

men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu Nấm men chủng

XII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-330C, nhiệt độ tối đa 380C, tối thiểu 50C Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu 17-220C có năng lực lên men rất lớn Đối với quá trình lên men thì nấm men chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1-450C Nếu nhiệt độ quá 500C nấm men sẽ chết

 Ảnh hưởng của pH

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH =2-8 nhưng thích hợp nhất là 4-4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH =4,2 và cao hơn, khi pH< 4,2 chỉ có

nấm men phát triển Vì vậy trong lên men rượu, để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn nên

thực hiện trong khoảng pH =3,8- 4,0 Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần với độ acid thấp nên ngoài việc điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH =8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH =3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát

triển Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có

thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào sao cho anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men.(Nguyễn Công Hà, 2006)

 Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Quá trình nuôi cấy nấm men tạo điều kiện cho nấm men phát triển sinh khối đạt số lượng theo yêu cầu Thường trong dịch nấm men có khoảng 4-6% rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men Nồng độ rượu phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào nấm men và nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng tế bào nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4-6% đã có ảnh hưởng xấu

 Ảnh hưởng của việc thông thoáng khí và đảo trộn

Oxy là thành phần không thể thiếu trong quá trình phát triển sinh khối nhưng nó cũng là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu, bia trong các giai đoạn chế biến Với sự có mặt của oxy, nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối

Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ số lượng tế bào lên men, ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu Tuy nhiên, lại có một số chủng nấm men phát triển nhanh và tạo ra lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường có đầy đủ oxy

Thông khí là cung cấp đầy đủ oxy cho quá trình hô hấp của nấm men Việc thông khí kết hợp với đảo trộn có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Thiếu không khí (yếm khí), nấm men sẽ thực hiện quá trình lên men rượu, nồng

độ rượu trong môi trường tăng nhanh chóng, khi đó sự phát triển của nấm men dần dần sẽ

bị kìm hãm

Việc thông khí và đảo trộn còn có tác dụng làm cho môi trường luôn ở trạng thái động, tăng cường sự tiếp xúc giữa tế bào nấm men với môi trường dinh dưỡng, do đó rút ngắn được thời gian nuôi cấy

Ngoài các yếu tố trên các chất sát trùng dùng trong sản xuất như: formol, Na2SiF6, NaF, CaOCl2 các muối kim loại nặng, các tia cực tím đều ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của nấm men Tuy nhiên, mỗi yếu tố có ảnh hưởng khác nhau trong từng điều kiện nuôi cấy và từng chủng nấm men khác nhau (Nguyễn Công Hà, 2006)

4.5 Các công đoạn chính trong quá trình sản xuất rượu

Quá trình sản xuất rượu gồm 2 giai đoạn chính diễn ra như sau:

a Chuẩn bị dịch lên men

 Nguyên liệu

Đối với sản xuất rượu thì thành phần quan trọng nhất là glucid lên men được mà chủ yếu là tinh bột và một số đường Do đó trong nấu rượu nguyên liệu thường được sử dụng là các loại nông sản chứa nhiều tinh bột như gạo, nếp, ngô, khoai, sắn và nguyên liệu chứa đường mà chủ yếu là mật rỉ

Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, cồn, ete và benzen, nhưng hòa tan trong nước nóng dễ dàng và tạo thành dung dịch có độ nhớt cao Mức độ trương nở của tinh bột trong nước phụ thuộc vào nhiệt độ Khi tăng nhiệt độ, dịch tinh bột sẽ biến thành dạng keo

và gọi là hồ tinh bột Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hóa tinh bột Trong thực tế luôn luôn tồn tại một khoảng nhiệt độ hồ hóa hồ tinh bột, vì tinh bột của bất kì một loại nguyên liệu nào cũng gồm một hỗn hợp các hạt có kích thướt khác nhau và tỉ lệ amylose, amylopectin trong các nguyên liệu khác nhau thường không giống nhau

Dưới tác dụng của acid hoặc enzyme thì tinh bột thủy phân thành các phân tử nhỏ hơn như: maltose, saccarose, glucose Đây là những chất chủ yếu tham gia vào quá trình lên men

 Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu trước hết ta phải được xử lý sơ bộ để loại bỏ tạp chất, sau đó ngâm trong nước khoảng 12 giờ để nguyên liệu được ngậm nước tốt và dễ nấu trong giai đoạn tiếp theo Sau đó nấu hoặc hấp chín cho đến khi thấy nguyên liệu được hồ hóa tốt (giai đoạn này dân gian gọi là xôi cơm), kế đó cho ra ngoài xới bông và để nguội

Trong các dạng nguyên liệu như: gạo, nếp, ngô, khoai, hạt tinh bột luôn nằm trong các màng tế bào Màng tế bào sẽ ngăn cản sự tiếp xúc của enzyme amylase với tinh bột

Mặt khác, ở trạng thái không hòa tan, amylase tác dụng lên tinh bột rất chậm và kém hiệu quả Vì vậy mục đích chủ yếu của việc nấu nguyên liệu là nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột, tạo điều kiện biến chúng thành trạng thái hòa tan trong dung dịch Trong quá trình nấu nguyên liệu thể tích của các hạt tinh bột tăng lên rất nhiều lần cho đến khi hạt tinh bột trở thành các túi vô định hình thì ngừng tăng thể tích Theo một số nghiên cứu thì

sự hồ hóa tinh bột sẽ dẫn đến phá vỡ các liên kết hydro nội phân tử và tạo thành liên kết hydro với nước đến khi độ nhớt đạt cực đại Có thể nói nấu nguyên liệu là quá trình ban đầu nhưng rất quan trọng trong sản xuất rượu Các quá trình kỹ thuật tiếp theo tốt hay xấu phụ thuộc rất nhiều kết quả nấu nguyên liệu

 Đường hóa

Sau khi nguyên liệu được làm nguội, trộn đều với bột men và cho vào kháp Kháp được đậy hở để nấm mốc thực hiện quá trình đường hóa vì đây là quá trình hiếu khí

 Lên men

Đường hóa xong, nước được chan thêm vào và dưới tác dụng của nấm men, đường

sẽ biến thành rượu, khí cacbonic và cùng với các sản phẩm trung gian khác Lên men xong, ta thu được hỗn hợp rượu- nước- bã gọi là giấm chín hay cơm hèm

 Xử lý dịch lên men

Sau quá trình lên men ta thu được hỗn hợp rượu, nước và các tạp chất khác Do đó,

để thu được rượu ta cần phải tiến hành chưng cất Trong chưng cất, người ta thường phân thành chưng cất gián đoạn, bán liên tục và liên tục trên các cơ sở thiết bị khác nhau, từ đơn giản đến phức tạp, tùy theo điều kiện vốn đầu tư và yêu cầu chất lượng đề ra của cơ sở sản xuất Đối với các doanh nghiệp sản xuất rượu và cồn thì thường sử dụng hệ thống tháp chưng cất rượu với quy mô lớn và liên tục, còn các cơ sở sản xuất rượu cổ truyền thì thường sản xuất với quy mô nhỏ lẻ, thiết bị chưng cất đơn giản

(Nguyễn Đình Thưởng, 2005)

CHƯƠNG 3 - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Phương tiện

1 Thời gian và địa điểm

Thời gian từ 01/11/2009 đến ngày 30/4/2010

Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

2 Nguyên vật liệu

- Men rượu bán trên thị trường

Bảng 4 Tên các loại men rượu

Hải Anh Quang Hóc Môn - TP.HCM

Việt Thảo Châu Thành - Trà Vinh

Linh Chi Tân Thành- TP.Buôn Mê Thuột

Men rượu Lệ Công, Chợ Cái Răng - Quận Cái Răng TPCT

- Nếp than, nếp sáp Long An mua tại chợ Cần Thơ

- Máy nghiền mẫu

- Brix kế, cồn kế, bếp điện, và một số thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm

- Nồi hấp tiệt trùng (Sam en kipp bv, 22793 Breukelen, Hà Lan)

- Kính hiển vi quang học (Olympus Optical BH-2, Nhật)

- NH2SO4, KH2PO4, CaSO4, MgSO4, D-Glucose

II Phương pháp nghiên cứu

1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm mốc và nấm men trong các loại men

Mục đích của thí nghiệm là phân lập và định danh sơ bộ các dòng nấm mốc và nấm men trong men rượu trên thị trường cho hiệu suất lên men rượu cao

1.1 Phân lập nấm mốc

Lấy 1 ít men đã nghiền sẵn cho vào bình tam giác chứa môi trường PG (Potato Glucose) Quan sát mỗi ngày đến khi trên bề mặt xuất hiện nhiều khuẩn ty trắng Dùng que cấy lấy 1 ít sợi nấm mốc cấy vào đĩa môi trường PGA (Potato Glucose Agar) có bổ sung các khoáng cần thiết, ủ ở 300C Sau vài ngày từ các đĩa thạch có nấm mốc phát triển tốt, riêng rẽ chọn các khuẩn lạc có các đặc điểm khác nhau như: màu sắc, đường kính, độ dày của hệ khuẩn ty Cấy chuyển nhiều lần và kiểm tra độ ròng bằng cách quan sát màu sắc, cách phát triển nhanh/chậm, kích thướt của khuẩn lạc, độ dày/mỏng của hệ khuẩn ty Quan sát dạng bào tử (trần hay kín), dạng tế bào (có vách ngăn hay không có vách ngăn),

dạng cuống bào tử (phân nhánh hay không phân nhánh) trên kính hiển vi quang học Trữ các dòng thuần trên môi trường thạch nghiêng PGA có bổ sung các khoáng cần thiết và bảo quản ở 40C

và trữ giống trong ống nghiệm trên môi trường thạch nghiêng PGA bảo quản trong tủ lạnh

ở 4oC

Định danh sơ bộ các dòng nấm men

2 Thí nghiệm 2: Xác định hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men đã phân lập

Thí nghiệm được tiến hành với mục đích xác định hoạt tính các dòng nấm mốc và nấm men đã phân lập nhằm tuyển chọn dòng nấm mốc và nấm men cho hoạt tính cao nhất

2.1 Xác định hoạt tính các dòng nấm mốc

 Chuẩn bị giống chủng

Nấm mốc lấy từ các ống giống được nuôi cấy trên môi trường PGA có bổ sung các khoáng cần thiết ủ ở 300 trong 2-3 ngày cho sinh bào tử Dùng que cấy cạo sinh khối nấm mốc cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 0.85% đã khử trùng sao cho đạt mật số

106 bào tử/ ml

 Xác định hoạt tính nấm mốc

Cho 50g nếp than vào bình tam giác 250ml, thêm 60ml nước cất, ngâm trong 4 giờ Nếp sau khi ngâm được đem đo pH, hấp ở 1000C trong 1 giờ Để nguội nếp đến 30-400C, chủng 5 ml dịch huyền phù nấm mốc vào mỗi bình, trộn đều, ủ ở 300C trong 3 ngày

Quan sát các chỉ tiêu sau: Sự phát triển khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH sau ủ mốc, độ Brix sau ủ mốc, thể tích dịch rỉ (ml)

2.2 Xác định hoạt tính các dòng nấm men

 Chuẩn bị giống chủng

Nấm men lấy từ các ống men giống được nuôi cấy trên môi trường PGA dùng que

cấy lấy khuẩn lạc nấm men cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý 0.85% đã khử

trùng sao cho đạt mật số 106 tế bào /ml

 Xác định hoạt tính nấm men

Chuẩn bị dịch đường hóa: Dịch đường hóa lấy từ quy trình thử hoạt tính nấm mốc ở

trên Cho 100ml dịch đường hóa được điều chỉnh đến 200Brix vào mỗi bình tam giác loại

250ml, đậy bằng nút gòn và nắp giấy khử trùng ở 1150C/10phút và được làm nguội đến

30-400C

Chủng 1ml dịch huyền phù nấm men vào mỗi bình, thay nắp giấy bằng waterlock

và ủ ở 300C trong 4 ngày

Quan sát các chỉ tiêu sau: pH sau khi lên men, bọt khí sinh ra trong 2 phút, độ Brix

sau khi lên men, độ rượu ở 200C

3 Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc và lên men của nấm

men

Mục đích của thí nghiệm nhằm khảo sát thời gian ủ mốc và lên men thích hợp của

nấm mốc và nấm men được tuyển chọn

3.1 Khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc

Cho 50g nếp than vào bình tam giác 250ml, thêm 60ml nước cất, ngâm trong 4 giờ

Nếp sau khi ngâm được đem đo pH, hấp ở 1000C trong 1 giờ Để nguội nếp đến 30-400C,

chủng 5 ml dịch huyền phù nấm mốc với mật số 106 tb/ml vào mỗi bình, trộn đều, ủ ở

300C với các nghiệm thức (Bảng 5)

Bảng 5 Nghiệm thức thời gian đường hóa nấm mốc

Nghiệm thức

Dịch đường hóa lấy từ thí nghiệm khảo sát thời gian đường hóa của nấm mốc ở trên Cho 100ml dịch đường hóa được điều chỉnh đến 200Brix vào mỗi bình tam giác loại 250ml, đậy bằng nút gòn và nắp giấy khử trùng ở 1150C/10phút và được làm nguội đến 30-400C

Chủng 1ml dịch huyền phù nấm men vào mỗi bình và thay nắp giấy bằng waterlock

và ủ ở 300C với các nghiệm thức (Bảng 6)

Bảng 6 Nghiệm thức thời gian lên men của nấm men

Nghiệm thức

4 Thí nghiệm 4: Sản xuất sinh khối nấm mốc và nấm men

Thí nghiệm được thực hiện nhằm mục đích sản xuất sinh khối nấm mốc và nấm men

được tuyển chọn cho hoạt tính cao

4.1 Sản xuất sinh khối nấm mốc

Nuôi nấm mốc trên đĩa môi trường PGA trong 5 ngày ở 300C

Chuẩn bị môi trường nuôi mốc:

Mốc được nuôi trong bình tam giác 500ml với khối lượng cơ chất là 20g (100% bắp mảnh) và 20% trấu nhằm tạo độ xốp cho môi trường

Bổ sung thêm các chất khoáng cần thiết dựa trên tổng khối lượng cơ chất và trấu: (NH4)2SO4 0.2%, KH2PO4 0.1%, MgSO4 0.05%, CaSO4 0.02% (Dung et al.,2007)

4.1.1 Khảo sát lượng nước bổ sung nuôi nấm mốc

Lượng nước bổ sung để điều chỉnh ẩm độ là 10%, 30% và 50% Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ trước khi khử trùng Môi trường được khử trùng 1210C, 1 giờ trước khi chủng nấm mốc

Chủng nấm mốc: Dùng kim cấy cạo lớp khuẩn ty trên bề mặt đĩa petri vào ống nghiệm chứa dung dịch nước muối sinh lý 0.85% sao cho đạt mật số bào tử là 106 bào

tử/ml Chủng 5ml dịch huyền phù nấm mốc vào các bình tam giác và đậy bằng nút gòn Đem ủ ở 300C trong 4 ngày

Thu hoạch mốc, sấy khô khối mốc ở 450C trong khoảng 10-12giờ và xay nhỏ thành bột và trữ trong túi PP ép miệng ở nhiệt độ môi trường (Dung et al.,2007)

Xác định độ ẩm môi trường, độ ẩm bột mốc và mật số bào tử ở các nghiệm thức 10%, 30%, 50%

4.1.2 Khảo sát hoạt tính của bột mốc

Cho 50g nếp than vào bình tam giác 250ml, thêm 60ml nước cất, ngâm trong 4 giờ Nếp sau khi ngâm được đem đo pH, hấp ở 1000C trong 1 giờ Để nguội nếp đến 30-400C, lấy một ít bột mốc cho vào nước muối sinh lý 0.85% pha loãng để đạt mật số 106tb/ml

Chủng 5 ml dịch huyền phù nấm mốc với mật số 106 tb/ml vào mỗi bình, trộn đều,

ủ ở 300C trong thời gian đường hóa của thí nghiệm 3

Quan sát các chỉ tiêu sau: Sự xuất hiện khuẩn ty, sự xuất hiện dịch rỉ, pH sau ủ mốc, độ Brix sau ủ mốc, thể tích dịch rỉ (ml)

4.2 Sản xuất sinh khối nấm men

4.2.1 Nuôi nấm men

Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng khoai tây-glucose (PG) Cho vào bình tam giác

100 ml môi trường khoai tây Tiệt trùng 121oC, 15 phút, để nguội đến 30-400C Dùng que cấy chủng nấm men từ ống men giống cho vào bình môi trường được đậy bằng nút gòn và nắp giấy Bình sau khi chủng giống được lắc qua đêm trên máy lắc trong 24 giờ, 150v/phút ở nhiệt độ phòng, 150v/phút

Thu hoạch sinh khối bằng cách ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút ở 80C Sinh khối nấm men thu được ở dạng khối nhão (paste) được trộn với bột mì được sấy tiệt trùng

ở 1050C, 17giờ theo tỉ lệ nấm men : bột mì= 1: 1.5 và sấy khô ở 450C.(Dung et al., 2007)

4.2.2 Khảo sát hoạt tính của bột men

Dịch đường hóa được lấy từ thí nghiệm khảo sát hoạt tính của bột mốc Cho 100ml dịch đường hóa được điều chỉnh đến 200Brix vào mỗi bình tam giác loại 250ml, đậy bằng nút gòn và nắp giấy khử trùng ở 1150C/10phút và được làm nguội đến 30-400C Lấy một ít bột men cho vào nước muối sinh lý 0.85% pha loãng thích hợp để đạt mật số 106tb/ml

Chủng 1ml dịch huyền phù nấm men vào mỗi bình và thay nắp giấy bằng waterlock

và ủ ở 300C trong thời gian lên men của thí nghiệm 3

Quan sát các chỉ tiêu sau: pH sau khi lên men, độ Brix sau khi lên men, độ rượu ở

200C

5 Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa bột mốc và bột men

Cho 50g nếp sáp Long An vào bình tam giác 250ml, thêm 60ml nước cất, ngâm trong 4 giờ Nếp sau khi ngâm hấp ở 1000C trong 1 giờ Để nguội khối nếp đến 30-400C, chủng tỉ lệ % bột mốc và bột men trong các nghiệm thức (Bảng 7)

Bảng 7 Tỉ lệ phối trộn giữa bột mốc và bột men

Nghiệm thức

Tỉ lệ sử dụng bột mốc

Tỉ lệ sử dụng bột men

Thí nghiệm được ủ ở thời gian đường hóa nấm mốc và thời gian lên men tối ưu của thí nghiệm 3

Quan sát các chỉ tiêu: pH sau ủ mốc, độ Brix sau ủ mốc, pH sau lên men, độ Brix

sau lên men, độ rượu ở 200C

CHƯƠNG 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

I Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng nấm mốc và nấm men

Qua quá trình phân lập nấm mốc và nấm men từ 4 loại men rượu tại chợ Cái Răng, chúng tôi đã phân lập được 4 dòng nấm mốc và 4 dòng nấm men tiêu biểu, ký hiệu của các dòng mốc là Mi và các dòng men là Yj trong đó i, j là thứ tự phân lập

1 Định danh sơ bộ nấm mốc

Các dòng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên môi trường trữ giống ủ ở 300C Quan sát mỗi ngày để theo dõi đặc điểm và sự phát triển của chúng bằng mắt thường Kết quả quan sát như sau:

1.1 Dòng nấm mốc M0901

Khuẩn ty phát triển sau 24 giờ Sau 48 giờ khuẩn ty mọc kín mặt đĩa và bắt đầu xuất hiện bào tử, khuẩn ty có độ dày trung bình Khuẩn ty màu trắng, sợi nấm không có vách ngăn Sau 72 giờ bào tử xuất hiện nhiều, có màu nâu – xám Nang trụ phân nhánh, không có rễ giả Không có cuống bào tử Túi bào tử có hình tròn, to bên trong chứa nhiều bào tử

Định danh sơ bộ dòng nấm mốc M0901 thuộc chi Mucor

Khuẩn lạc M0901 sau 24 giờ Khuẩn lạc M0901 sau 72 giờ

Nang trụ phân nhánh (X40) Túi bào tử (X40)

Cọng mang túi bào tử (X40) Cọng mang túi bào tử (X100)

Hình 2 Dòng nấm mốc M0901 1.2 Dòng nấm mốc M0902

Khuẩn ty phát triển rất ít sau 24 giờ Khuẩn ty mọc dày và thấp, khẩn ty có màu trắng Khuẩn lạc không lan rộng khắp mặt đĩa Sợi nấm không có vách ngăn, sau 72 giờ bắt đầu xuất hiện bào tử, bào tử có màu đen Nang trụ không phân nhánh, có rễ giả

Định danh sơ bộ dòng M0902 thuộc chi Rhizopus