Phân Lập Và Ly Trích Enzyme Amylase Từ Vi Khuẩn Bacillus Subtilis

Nghiên cứu ứng dụng enzyme từ vi sinh vật đã được công bố rất nhiều: enzyme và ứng dụng Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007, ứng dụng sản xuất enzyme từ vi sinh vật vào sản xuất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ HOÀNG ANH

PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE

TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: TRỒNG TRỌT

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME AMYLASE

TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Phạm Phước Nhẫn Lê Hoàng Anh MSSV: 3060555 Lớp: Trồng Trọt K32

Cần Thơ, 2010

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành trồng trọt với đề tài: “PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH

ENZYME AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS”

Do sinh viên LÊ HOÀNG ANH thực hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2009 Cán bộ hướng dẫn

Ts Phạm Phước Nhẫn

iii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài:“PHÂN LẬP VÀ LY TRÍCH ENZYME

AMYLASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS”, do sinh viên HUỲNH THỊ

NHANH thực hiện và bảo vệ trước Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua

Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:………

Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:………

………

………

………

………

Duyệt Khoa Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2009 Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD Chủ tịch Hội đồng

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Lê Hoàng Anh

v

TIỂU SỬ CÁ NHÂN

I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Họ và tên: LÊ HOÀNG ANH

Năm sinh:1988

Nơi sinh: Hội An Đông, Lấp Vò, Đồng Tháp

Họ và tên cha: Lê Hoàng Tâm Nghề nghiệp: Làm ruộng

Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Anh Đào Nghề nghiệp: Làm ruộng

Chỗ ở hiện nay: ấp An Phú, xã Hội An Đông, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

1994 - 1999: học tiểu học tại Trường tiểu học Hội An Đông, xã Hội An Đông, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp

1999 - 2003: học trung học tại Trường trung học cơ sơ Hội An Đông, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp

2003 - 2006: học phổ thông tại Trường trung học phổ thông Lấp Vò 1, thị trấn Lấp Vò, huyện Lấp Vò, tỉnh Đồng Tháp

2006 - 2010:học đại học tại Trường Đại học Cần Thơ, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ

vi

LỜI CẢM ƠN

Chân thành biết ơn:

Cha mẹ và gia đình là chỗ dựa vững chắc, là nguồn động lực mạnh mẽ của đời con

Thầy Phạm Phước Nhẫn về tất cả những gì thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Chị Đỗ Thị Hồng, anh Huỳnh Văn Trung, anh Nguyễn Trọng Cần đã tận tình giúp đỡ và giải đáp khi khó khăn Đồng gởi lời cảm ơn đến tất cả những thầy cô và các anh, các chị trong Phòng thí nghiệm Sinh hóa, bộ môn Sinh Lý – Sinh Hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Các bạn sinh viên lớp Công nghệ Hóa Khóa 30 đặc biệt là nhóm các bạn làm luận văn chung luôn gắn bó, động viên, chia sẻ những khó khăn cũng như vui, buồn trong suốt quá trình học tập và làm luận văn Và gửi lời biết ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Khoa học cây trồng và tất cả thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo những kiến thức bổ ích phục vụ cho luận văn và công việc tương lai

Mặc dù rất cố gắng nhưng cũng không tránh khỏi nhiều sai sót, mong quý thầy

cô chỉ dẫn thêm

xii

LÊ HOÀNG ANH, 2010 Phân lập và đánh giá khả năng tạo amylase từ vi khuẩn

Bacillus subtilis Luận văn tốt nghiệp ngành Trồng Trọt Khoa Nông Nghiệp,

Trường Đại Học Cần Thơ, 44 trang

cứu sản xuất amylase từ vi khuẩn, Bacillus subtilis là đối tượng có nhiều triển vọng

vì B subtilis có khả năng sản xuất amylase với hoạt tính cao và amylase từ vi khuẩn

B subtilis có nhiệt độ thích hợp cao hơn các loại amylase từ các nguồn vi khuẩn khác Vì vậy, đề tài “Phân lập và ly trích enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis” là cần thiết nhằm phân lập và thử nghiệm khả năng sản xuất amylase từ vi khuẩn B subtilis được từ tự nhiên Nhằm phân lập và đánh giá khả năng tạo amylase của B subtilis, đề tài này đã thực hiện phân lập B subtilis từ mẫu đất và rễ cây cà chua khỏe có nhiễm bệnh héo xanh (do Ralstonia solanacearum) Sau đó

nuôi thử nghiệm trên hai môi trường lỏng nhằm xác định môi trường tối ưu Dùng (NH4)2SO4 60% để kết tủa protein, thẩm tích với dung dịch phosphate pH 7, sau đó đông khô để thu lượng protein thô có chứa enzyme amylase, hoạt tính của amylase được đánh giá qua khả năng phản ứng thủy phân hồ tinh bột Kết quả đã phân lập và

tách ròng được vi khuẩn B subtilis từ mẫu đất và rễ cà chua Ly trích được enzyme amylase từ vi khuẩn B subtilis Xác định được hàm lượng protein hòa tan cao nhất

là 37,2% trong hỗn hợp protein – amylase đã ly trích được Xác định được hoạt tính enzyme amylase từ hỗn hợp protein trích được với nồng độ tinh bột bị thủy phân đạt

tối đa là 82,91% Kết quả thí nghiệm cho thấy B subtilis là vi khuẩn tiềm năng để ly

trích amylase

xiii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC

DANH SÁCH BẢNG v

DACH SÁCH HÌNH vi

DANH MỤC PHỤ LỤC vii

MỞ ĐẦU xiii

CHƯƠNG I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE 2

1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase trong nước và ngoài nước 2

1.1.2 Giới thiệu tổng quan về enzyme và enzyme amylase 4

1.1.3 Phân loại enzyme amylase 6

1.1.4 Nguồn amylase từ sinh vật 11

1.1.5 Ứng dụng enzyme amylase 12

1.1.6 Giới thiệu chế phẩm thương mại của enzyme amylase 15

1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS 16

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Thời gian và địa điểm 18

2.1.2 Vật liệu và dụng cụ 18

2.1.3 Các môi trường nuôi cấy vi khuần Bacillus subtilis 18

xiv

2.1.4 Hóa chất 19

2.1.5 Xử lý số liệu 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP 20

2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và nhân nguồn vi khuẩn vùng rễ Bacillus subtilis

20

2.2.2 Thí nghiệm 2: Ly trích và thử hoạt lực của enzyme amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 PHÂN LẬP BACILLUS SUBTILIS 26

3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 26

3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 26

3.1.3 Mật số Bacillus subtilis 27

3.1.4 Trữ nguồn 30

3.2 LY TRÍCH VÀ THỬ HOẠT LỰC CỦA ENZYME AMYLADE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 30

3.2.1 Xác định hàm lượng protein hòa tan có trong mẫu protein ly trích được từ vi khuẩn Bacillus subtilis ở hai môi trường 33

3.2.2 Thử hoạt lực enzyme amylase bằng phản ứng thủy phân hồ tinh bột 35

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

MỞ ĐẦU

Amylase là nhóm enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ sản xuất rượu bia, công nghệ thực phẩm…đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất bia Trong lĩnh vực sản xuất bia amylase được sử dụng để đường hóa tinh bột thành maltose, glucose dùng làm cơ chất cho quá trình lên men bia

Người ta có thể thu nhận amylase từ nhiều nguồn khác nhau: động vật, thực vật,

vi sinh vật Trong đó nguồn thu nhận amylase từ vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có nhiều ưu điểm như vi khuẩn có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh hơn nấm mốc và

nấm men Trong hướng nghiên cứu sản xuất amylase từ vi khuẩn, B subtilis là đối tượng có nhiều triển vọng vì B subtilis có khả năng sản xuất amylase với hoạt tính cao

và amylase từ vi khuẩn B subtilis có nhiệt độ thích hợp cao hơn các loại amylase từ

các nguồn vi khuẩn khác

Vì vậy, đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng tạo amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis” là cần thiết nhằm mục đích phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis cũng như đánh giá khả năng tổng hợp α-amylase từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã phân lập được

2

CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE

1.1.1 Tình hình nghiên cứu enzyme amylase trong nước và ngoài nước

Enzyme – chất xúc tác sinh học có vai trò quan trọng trong hầu hết các phản ứng sinh hoá học của cơ thể sống Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực hoá học, sinh học và các lĩnh vực có liên quan đều quan tâm đến việc nghiên cứu các vấn

đề về enzyme Các nghiên cứu xoay quanh các vấn đề chiết tách, tinh sạch enzyme, các yếu tố tác động làm thay đổi hoạt tính enzyme, khả năng ứng dụng sản phẩm enzyme

vào thực tế… Chính vì thế mà công nghệ enzyme ngày càng phát triển

Amylase, một loại enzyme khá phổ biến, có cả ở thực vật lẫn động vật Amylase được tinh sạch từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz (trích bởi: Nguyễn Đức Lượng, 2004) Một số đặc tính của amylase cũng đã được tìm ra như trọng lượng phân tử của α-amylase malt được xác định bởi Knin (1956) và Fisher cùng Stein (1960); vùng đẳng điện của amylase được xác định năm 1955 với nghiên cứu của Bernfeld; ảnh hưởng của Ca2+ trong sự hình thành và ổn định cấu trúc của enzyme theo nghiên cứu của Modolova năm 1965 (Nguyễn Tiến Thắng, 2008)

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã nghiên cứu sử dụng mầm lúa để ly trích amylase sử dụng với vai trò thuỷ phân tinh bột Năm 1996, Wang và cộng sự cũng có nghiên cứu liên quan đến enzyme amylase từ lúa Một số nghiên cứu về cấu trúc của amylase phân lập từ vi sinh vật, ly trích, tinh sạch và ảnh hưởng chất ức chế α-amylase

từ lúa mì (trích bởi: Vũ Thị Yến, 2008)

Trên thế giới những công trình nghiên cứu về enzyme đặc biệt là enzyme từ vi sinh vật đã phát triển rất sớm như: năm 1862, Danilevxki đã tách được amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc Năm 1940, REYED M REYED đã sinh

tổng hợp amylase ngoại bào bởi những thể vỏ của Bifidobatrium trong một đợt nuôi

cấy trên môi trường lỏng chứa tinh bột hòa tan đã được làm giàu cao nhất ở 48 giờ Khi

3

nghiên cứu enzyme amylase ngoại bào này đã thấy rằng ở nhiệt độ tối thích là 75oC enzyme ổn định trong 2 giờ, trong khi ở 60oC, 70oC và 90oC, 4%, 13%, 38% hoạt độ ban đầu bị mất đi pH=7,5 sau khi dung dịch thô trong 24 giờ ở pH=7,5 đã giảm khoảng 5% hoạt độ enzyme Enzyme bị ức chế mạnh nhất bởi Cu2+, Mg2+ nhưng kém hơn ảnh hưởng bởi Mn2+ Và đã xác định được ở NaCl 1M, 5M thì enzyme được giữ lại 70% và 47% hoạt độ sau 24 giờ ủ ở 4oC

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu về amylase càng phát triển, việc ứng

dụng của enzyme amylase trong các quốc gia là rất nhiều Manas và ctv (2006) đã sản xuất được -amylase ngoại bào từ vi khuẩn B subtilis được phân lập từ những vi sinh

vật có lợi trong phân của con bò Họ đã xác định được những điều kiện tối ưu để nuôi

vi khuẩn đã được phân lập như nhiệt độ, pH, thời gian nuôi thích hợp lần lượt là 50 –

70oC, 5,0 – 9,0 và 36 giờ Ngoài ra, NH4Cl, (NH4)2SO4 và Urea được xác định là những chất kìm hãm sự hoạt động của enzyme -amylase Việc thêm ion Ca2+ đã cho kết quả cao trong việc cải thiện sản xuất enzyme Nhưng khi thêm một số chất hoạt động bề mặt (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80) và Sodium lauryl sulphate ở 0,02% đã cho kết quả là tăng 2 – 15% trong việc sản xuất enzyme

Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ly trích enzyme α-amylase, nhưng enzyme trích từ thực vật thường ít bền với nhiệt hơn enzyme trích từ vi sinh vật Nghiên cứu ứng dụng enzyme từ vi sinh vật đã được công bố rất nhiều: enzyme và ứng dụng (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007), ứng dụng sản xuất enzyme từ

vi sinh vật vào sản xuất công nghệ vi sinh vật (Lương Đức Phẩm, 2004), nghiên cứu

sản xuất amylase từ Aspergillus oryzae (Hoàng Kim Anh và cộng tác viên), trong các nghiên cứu ở nước ta thì nguồn enzyme từ Bacillus subtilis ít được khai thác Nguồn enzyme α-amylase từ vi sinh vật nói chung và α-amylase từ Bacillus subtilis nói riêng

có khả năng tham gia vào quá trình công nghệ cao như: sản xuất dược phẩm, chế phẩm

vi sinh sử dụng trong ngành thủy sản,… mà vẫn giữ được hoạt tính

4

1.1.2 Giới thiệu tổng quan về enzyme và enzyme amylase

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20000 đến 1000000 Dalton (Da), được cấu tạo từ các L – α– acid amin kết hợp với nhau qua liên kết peptide

Amylase thuộc nhóm một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại có vai trò xúc tác cho phản ứng thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose

Hình 1.1: Hoạt động phân cắt liên kết α-1,4 glucoside của amylase

Amylase phân bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột Amylase được thu nhận từ hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH  RH + R’OH

- Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:

Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như

khoai lang, khoai tây, khoai mì,… trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức

H OH

H OH

H OH

CH2OH

H O

5

tổng quát là (C6H12O6)n Các phân tử tinh bột được cấu tạo bởi các liên kết 1,4 và 1,6-glucoside Vì tồn tại hai loại liên kết khác nhau nên tạo thành các phân tử tinh bột khác nhau Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Reyed, 1940) Các loại tinh bột đều có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng

α-Amylose có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ

200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh

Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng (60 – 85oC) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là

hồ tinh bột

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin

và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose

Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột

Glycogen: là một loại cabohydrate dự trữ Ở động vật được dự trữ trong cơ thể

động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật, glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột

6

Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu - 3 triệu Da Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan (khoảng 10%) và ở cơ (2%)

1.1.3 Phân loại enzyme amylase

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

1.1.3.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase

a Đặc tính của enzyme α-amylase

α-amylase tên hệ thống là 1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase, mã số EC 3.2.1.1,

có trong nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, tụy tạng, trong nấm mốc, vi khuẩn amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là endoenzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn α-amylase trong tụy của heo, chuột có độ đồng nhất cao trong mạch amino acid

α-α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme

- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

7

- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knin, 1956; Fisher, Stein, 1960)

- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

- Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4,2 - 5,7 (Bernfeld, 1955)

- α-amylase là một metaloenzyme Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol tham gia vào

sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+,

Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-amylase từ

vi sinh vật

Độ bền của α-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH Ở 0oC và pH = 3,6, amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính α-amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58-60oC (Trần Xuân Ngạch, 2007)

α-b Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase

α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm

8

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy

phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị

thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose)

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân tách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose

và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose (Trần Xuân Ngạch, 2007) Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

9

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase

* Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột → dextrin phân tử lượng thấp

* Giai đoạn đường hóa:

Dextrin → tetra và trimaltose → disaccharide và monosaccharide

Amylase → oligosaccharide → poliglucose

Maltose → maltotriose → maltotetrose

1.1.3.2 Đặc tính và cơ chế tác dụng của β-amylase

* Đặc tính của β-amylase:

β-amylase còn gọi là 1,4-β-glucan maltohydrolase, mã số EC 3.2.1.2 có nhiều ở hạt nảy mầm Nó xúc tác sự thủy phân các liên kết β-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch

- β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm – SH, nhóm –COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là exoenzyme

- β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodine, ozon…

- β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn β-amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC Nhiệt độ hoạt động tối thích của β-amylase là 55oC, pH 5,1-5,5 (Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên, 2004)

- Dạng β bị ức chế bởi Ag+, Hg2+, Cu2+, pH tối thích 4-5, pI = 4,7- 4,8 (Sách tra cứu hóa sinh (1987), trích bởi Đoàn Thị Kim Hoàng (2008))

* Cơ chế tác dụng của β-amylase

β-amylase là một exoenzyme Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside nhưng khi gặp liên kết β-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết β-1,6 glucoside thì nó sẽ

10

ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết β-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin

* Tác dụng của β-amylase lên tinh bột như sau:

Tinh bột  maltose (54-58%) + β-dextrin (42-46%)

Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α và β-amylase thì lượng tinh bột bị thủy phân đến 95%

Sự khác nhau giữa α và β-amylase khi xúc tác thủy phân tinh bột:

- β-amylase hầu như không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn nhưng nó phân hủy hồ tinh bột rất mạnh

- β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose

- β-amylase phân giải 54-58% amylopectin thành maltose

1.1.3.3 Đặc tính và cơ chế tác dụng của  -amylase

γ-amylase còn gọi là glucoamylase hay α-1,4-glucan glucohydrolase Với mã số enzyme EC 3.2.1.3

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucoside Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Enzyme này

11

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 50oC

Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton

1.1.4 Nguồn amylase từ sinh vật

Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme amylase Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác nhau và thậm chí các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khác nhau Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn Do sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose Khi dùng nồng độ α-amylase từ nấm sợi tương đối lớn

có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men Còn các α-amylase thì mức

độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%

Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn các enzyme amylase: Bacillus Polymyxa, Phytomonas destructans, Bacteria cacsavanum, Clostridium acetobutylicum, Pseodomonas saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt (ưa ấm) có khả

năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác Những vi

khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều enzyme amylase đáng chú ý là Bacillus diastaticus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans Đặc biệt circulans được phân lập từ đất sinh

trưởng tốt ở 65 – 70oC và tạo amylase mạnh nhất ở 50oC Trong số vi khuẩn ưa ẩm tạo

amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 37oC

Trong môi trường nuôi vi khuẩn, sản phẩm thường không tạo thành một phức hệ enzyme amylase như ở nấm sợi mà chỉ có một -amylase Nhiều -amylase đã biết hiện nay đều thu được ở dạng tinh khiết cao hoặc là ở dạng tinh thể

12

1.1.5 Ứng dụng enzyme amylase

1.1.5.1 Trong công nghệ thực phẩm

a Trong sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng enzyme amylase có trong mầm đại mạch Sử dụng enzyme amylase trong quá trình dịch hoá thuỷ phân sơ

bộ tinh bột trong khối bột ở nhiệt độ cao Enzyme cũng có tác dụng làm giảm độ nhớt nguyên liệu, làm tăng quá trình đường hoá và lên men sau này Amylase cũng được sử dụng trong quá trình đường hoá, trong đó lượng đường được tạo thành sẽ quyết định khả năng lên men và chất lượng bia sau này Các enzyme cho vào trong giai đoạn này yêu cầu phải là những enzyme chịu nhiệt

Việc bổ sung enzyme amylase cho vào quá trình sản xuất bia làm tăng hiệu suất thu hồi cho từng giai đoạn Khi sử dụng enzyme chúng ta có khả năng sản xuất bia không có các dextrin dư thừa và do đó chứa ít năng lượng hơn các loại bia thông thường Các enzyme sau khi tham gia vào quá trình đường hoá sẽ còn sót lại và lẫn vào dịch lên men Hoạt tính còn sót lại này không ảnh hưởng gì đến chất lượng bia, mà ngược lại chất lượng bia sau này thường tốt hơn Do đó việc sử dụng enzyme amylase trong sản xuất bia có hiệu suất cao sẽ: giảm tổn thất tinh bột, tiết kiệm lượng malt cần thiết trong sản xuất bia Mặt khác, chất lượng dịch đường hoá được tăng lên, các chất thải bỏ theo bã sẽ ít đi…

b Trong sản xuất rượu

Cồn được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men Amylase được thêm vào làm tác nhân đường hoá để chuyển hoá tinh bột thành đường có khả năng lên men Quá trình đường hoá đóng vai trò quyết định đến khả năng lên men và hiệu suất cồn thu được Vai trò cơ bản của α-amylase trong sản xuất rượu là làm dịch hoá nhanh ở giai đoạn nấu và cả ở giai đoạn đầu của sự đường hoá, dextrin hoá và tích tụ đường

13

c Trong công nghệ sản xuất bánh mì

Bánh mì là một loại lương thực phẩm quen thuộc Trong bánh mì, enzyme được xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để tăng chất lượng bánh mì Enzyme được đưa vào nhằm giải quyết các vấn đề: tăng nhanh thể tích bánh, màu sắc của bánh đẹp hơn và làm tăng mùi thơm cho bánh

Trong sản xuất bánh mì người ta sử dụng cả α-amylase và β-amylase Các enzyme này tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đó, nấm men

Saccharomyces cerevisase sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể tích bánh, tạo màu sắc và hương vị tốt cho bánh Việc sử dụng amylase cho phép sử dụng bột mì kém phẩm chất để làm bánh hoặc có thể giảm bớt tới 50% đường cho thêm vào bánh trong thực đơn sản xuất bánh mì ngọt

d Trong sản xuất bánh kẹo

Mục đích của việc sử dụng enzyme vào sản xuất bánh kẹo là làm tăng mùi và vị Nếu chỉ tận dụng lượng enzyme có sẵn trong bột thì các phản ứng chuyển hóa tinh bột

sẽ xảy ra không mạnh, nhất là khi ta sử dụng loại bột xấu để sản xuất bánh Do đó người ta phải cho thêm enzyme amylase và protease vào chế biến bột trong quá trình sản xuất bánh quy Các enzyme này hoạt động làm tăng lượng đường khử và acid amin Đường khử và acid amin có trong khối bột đó sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng Maillard và kết quả là tạo cho bánh có mùi, vị và màu sắc hấp dẫn

e Trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường

Hiện nay, các nước Châu Âu và Châu Mỹ sản xuất siro đường fructose từ bột bắp bằng enzyme phát triển rất mạnh Theo phương pháp này phôi bắp được xử lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm ra và enzyme sẽ được sử dụng sau khi bột đã được hòa tan vào nước Ở giai đoạn gia nhiệt người ta cũng cho một lượng nhỏ α-amylase vào để dịch tinh bột có độ nhớt thấp tránh hiện tượng cháy khét Sau đó cho lượng còn lại vào giai đoạn đường hóa rất dễ dàng Tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm

14

Enzyme sử dụng trong công nghệ sản xuất siro fructose phải là những enzyme chịu

nhiệt

1.1.5.2 Trong công nghiệp

a Công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa

Mục đích của tẩy rửa (hoặc giặt quần áo) là loại bỏ đất và các loại chất vô cơ, hữu cơ bám vào quần áo Trong đó nhiều chất rất khó làm sạch như protein, tanin, carbohydrate và những chất màu

Enzyme amylase cũng được ứng dụng trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa

và ở đây sử dụng chủ yếu là enzyme amylase của vi khuẩn vì những enzyme này với các thành phần khác của các chất tẩy rửa sẽ làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbohydrate trong quần áo, tăng khả năng tẩy rửa

b Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, amylase hay các chế phẩm của nó dùng để rũ hồ (khử tinh bột) vải sợi bông, sợi hỗn hợp trước khi tẩy trắng hay nhuộm Xử lý vải sợi bằng amylase hay chế phẩm là tốt hơn cả vì giữ được độ bền, độ dai Việc sử dụng amylase không những làm tăng năng suất mà còn cải thiện phẩm chất vải do độ mao dẫn và tính hấp phụ của vải tăng lên, vải dễ tẩy trắng hơn Quá trình hòa tan và khử tinh bột trong dung dịch amylase loãng xảy ra rất nhanh trong 10 phút, do vậy mà khả năng rũ hồ xảy

ra liên tục

1.1.5.3 Trong chăn nuôi

Người ta sử dụng amylase trong chăn nuôi gia súc bằng hai cách: hoặc trộn thẳng vào thức ăn trước khi cho gia súc ăn hoặc xử lý sơ bộ thức ăn trước bằng enzyme amylase Có lẽ xử lý thức ăn bằng enzyme trước tốt hơn vì trong trường hợp này dễ chọn điều kiện tối thích cho tác dụng enzyme lên thức ăn Do vậy mà giá trị dinh dưỡng, độ hấp phụ của thức ăn cũng tiêu tốn ít enzyme amylase hơn

Amylase còn được dùng để điều trị các chứng bệnh về tim, hệ thần kinh, amylase còn dùng điều chế các môi trường dinh dưỡng chuẩn đoán và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau giúp cho công tác nghiên cứu vi sinh vật học trong các viện và phòng thí nghiệm (Nguyễn Đức Lượng và cộng tác viên, 2004)

1.1.6 Giới thiệu chế phẩm thương mại của enzyme amylase

Một số chế phẩm của enzyme amylase được bán trên thị trường: các loại thuốc tiêu hóa như amylase concentrate-HP 90 caps, enzymedica glutenease 60 capsules, enzymedica digest 180 capsules, Phyto Opti – Zymes và neopeptine là loại thuốc tiêu hóa sử dụng tốt cho người; thuốc xử lý nền đáy trong nuôi tôm Bitech-Yucca

Hình 1.2: Chế phẩm enzyme amylase thương mại

16

1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS

Giới (Kingdom): Bacteria

Ngành (Phylum): Firmicutes

Lớp (Class): Bacilli

Bộ (Order): Bacillales

Họ (Family): Bacillaceae

Chi (Genus): Bacillus

Loài (Species): Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 (Schallemey và ctv., 2004) Bacillus subtilis được

gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô

Chúng phân hủy pectin và polysaccharide ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định

mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu

Bacillus subtilis (Schallemey và ctv., 2004)

Theo Priest và Grigorova (1991) Bacillus subtilis là những vi khuẩn hình que,

ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 µm Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay

ít, bám chặt vào môi trường thạch

17

Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36oC – 50oC, tối đa khoảng 60oC Là loại

ưa nhiệt cao Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6µm – 0,9µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm (Nguyễn Thành Đạt, 1990)

Theo Coleman G., W H Elliott (1965), vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là

vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin Ngoài ra nhờ khả năng bám

dính proton lên bề mặt mà B subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) (Schallemey et al., 2004) Đặc biệt, B subtilis được sử

dụng trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức

khỏe (Trần Đình Mẫn và ctv., 2004)

- Nguồn vi khuẩn Bacillus subtilis thu ngoài tự nhiên từ đất và rễ ruộng lúa bị

đốm vằn hoặc cà chua bị héo xanh

- Nước cất, cồn hóa chất, môi trường

- Máy ly tâm, máy đông khô

- Tủ cấy, tủ úm, nồi khử trùng áp suất, micro wave, cân điện tử, máy đo pH, ống nghiệm

- Kính hiển vi, lame đếm hiệu Thoma (do Nhật bản sản xuất), thước đo, lame, micropipette,…

- Bình tam giác 500 ml, 1000 ml, cốc thủy tinh

- Đĩa petri đường kính đáy 9cm

2.1.3 Các môi trường nuôi cấy vi khuần Bacillus subtilis

2.1.3.1 Môi trường cấy vi khuẩn Bacillus subtilis

Môi trường King’ B

19

2.1.3.2 Môi trường lỏng nuôi Bacillus subtilis

Môi trường 1 Môi trường 2 Peptone 8,0 g

Yeast extract 4,0 g NaCl 3,0 g Nước cất 1,0 L

pH = 6

Peptone 5,0 g Yeast extract 5,0 g Glucose 1,0 g MgSO4.7H2O 0,2 g CaCO3………… 20,0g Nước cất…………1L

20

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và nhân nguồn vi khuẩn vùng rễ Bacillus subtilis

Mục đích: Thu thập và phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu đất

và rễ lúa (hoặc cà chua)

- Đất và rễ (2g) được thu tại vị trí các cây lúa khỏe trên ruộng có nhiễm đốm

vằn (do nấm Rhizoctonia solani) hoặc cây cà chua khỏe có nhiễm bệnh héo xanh (do Ralstonia solanacearum)

- Cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml nước cất thanh trùng, sau đó lắc trong

20 phút

- Phân lập bằng cách pha loãng và chà huyền phù bào tử vi khuẩn lên đĩa petri chứa môi trường King B có Agar Sau đó ủ ở 30oC từ 24 – 48 giờ thì tiến hành tách ròng và cấy truyền

- Dựa vào màu sắc, hình dạng khuẩn lạc và dùng phương pháp nhuộm Gram để kiểm tra mức độ tinh sạch của dòng vi khuẩn

- Sau khi phân lập được Bacillus subtilis thuần, tiến hành nuôi vi khuẩn trên hai

môi trường dinh dưỡng lỏng Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm hồng cầu

(lame đếm) Đánh giá sự phát triển của Bacillus subtilis ở mỗi loại môi trường

- Trữ nguồn ở điều kiện 4oC trong ống eppendorf chứa glycerol : nước cất (tỷ lệ

1 : 1) được thanh trùng

2.2.2 Thí nghiệm 2: Ly trích và thử hoạt lực của enzyme amylase từ vi khuẩn

Bacillus subtilis

2.2.2.1 Ly trích enzyme amylase

Mục đích: từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã được phân lập và nuôi cấy trong điều

kiện phòng thí nghiệm, tiến hành ly trích enzyme α-amylase Đo hàm lượng protein của enzyme này bằng phương pháp Folin – Lowry

Khi đã phân lập và nuôi cấy được nguồn Bacillus subtilis thuần, ta tiến hành

nuôi trong 2 môi trường lỏng sau 5, 7, 9, 11 ngày sau đó đem ly trích enzyme amylase bằng phương pháp kết thủa phân đoạn bằng dung dịch (NH4)2SO4 60%

α-21

Ly tâm: để tách lấy phần dung dịch chứa enzyme ở 4oC với tốc độ 7000 vòng/phút trong 30 phút để tách lấy phần dung dịch chứa enzyme ở bên trên và loại bỏ phần xác rắn

Kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4: phần dung dịch thu được sau ly tâm tiến hành kết tủa bằng dung dịch (NH4)2SO4 60% tỉ lệ 1:1 (theo thể tích) Ở nồng độ muối này, đa số enzyme sẽ bị kết tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính Sau đó, phần kết tủa sẽ được tách khỏi dung dịch bằng cách ly tâm lạnh trong điều kiện 4oC ở 9500 vòng/phút Sau 30 phút ly tâm, thu được phần protein kết tủa

Thẩm tích: phần kết tủa được đem đi thẩm tích để loại bỏ muối (NH4)2SO4 và các chất phi protein có kích thước nhỏ hơn bằng túi thẩm tích Seamless Cellulose Tubing 36/32 (Viskase Companies, Inc) Kết tủa chứa enzyme và một ít dung dịch đệm được cho vào túi thẩm tích Túi này được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên và được đặt trong beaker có dung dịch đệm phosphate không được chứa chất hòa tan cần loại bỏ theo tỉ lệ 1 dịch trích enzyme: 4 dung dịch đệm Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ Ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hòa tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thay nước cất mới sau mỗi lần để loại hết muối ra khỏi dung dịch (15 phút x 4 lần, 30 phút x 2 lần, 60 phút x 1 lần và để qua đêm) Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ, cả hệ thống được đặt trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 - 8oC để đảm bảo hoạt tính enzyme

Đông khô: phần dung dịch sau khi thẩm tích được cho vào tủ đông để mẫu

đóng rắn lại sau đó sẽ được đông khô trong 3 ngày để loại bỏ nước thu được enzyme amylase bán thô dạng bột

Sau quá trình này, dạng enzyme amylase dạng bán thô được ly trích từ kết tủa phân đoạn (NH4)2SO4 60% được đem đo hàm lượng protein bằng phương pháp Folin – Lowry

* Thí nghiệm xác định hàm lượng protein theo phương pháp Folin - Lowry