Nuôi Cấy Túi Phấn Của Cây Lai F1 Giữa Giống Lúa Thơm Jasmine 85 Và Các Giống Lúa Cao Sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NUÔI CẤY TÚI PHẤN CỦA CÂY LAI F1 GIỮA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NUÔI CẤY TÚI PHẤN CỦA CÂY LAI F1 GIỮA GIỐNG LÚA THƠM JASMINE 85

VÀ CÁC GIỐNG LÚA CAO SẢN

MSSV: 3064465 LỚP: CNSH K32

Cần Thơ, Tháng 5/2010

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa có vị trí đặc biệt quan trọng trong đời sống người dân Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng Nền văn minh lúa nước xuất hiện cách đây khoảng 10.000 năm tại vùng Đông Nam Á cho thấy giá trị của cây lúa là không thể thay thế

Ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) lúa được xem là cây lương thực mang tính chiến lược và chủ lực Theo số liệu thống kê năm 2008 diện tích trồng lúa của ĐBSCL

là 3858,9 nghìn ha (cả nước là 7414,3 nghìn ha) đóng góp hơn 50% sản lượng lúa cả nước (20681,6 nghìn tấn trong 388725,1 nghìn tấn của cả nước) Lượng gạo xuất khẩu của vùng chiếm 80% tổng lượng gạo xuất khẩu của cả nước (Nguồn niên giám thống

kê Việt Nam, 2008)

Công tác chọn tạo giống lúa cho Đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây đã có những thành tựu nghiên cứu góp phần đáng kể vào ngân hàng giống Ngày càng nhiều giống lúa mới đạt về cả chất lượng hạt, có khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, kháng phèn, kháng mặn đồng thời có năng suất cao Sự thành công của công tác chọn giống đã góp phần gia tăng sản lượng lúa gạo cũng như chất lượng gạo xuất khẩu của cả nước Thương hiệu gạo Việt Nam ngày càng được thế giới biết đến và ưa chuộng Bên cạnh các phương pháp chọn tạo giống cổ điển cũng như các phương pháp chọn giống hiện đại, thì kỹ thuật nuôi cấy mô mà phổ biến là nuôi cấy túi phấn đã được ứng dụng để hỗ trợ cho công tác chọn giống lúa Nuôi cấy túi phấn được coi là công cụ đắc lực để rút ngắn thời gian trong chọn lọc các dòng đồng hợp, giúp tạo giống có độ thuần cao trong thời gian ngắn Đề tài “Nuôi cấy túi phấn của cây lai F1 giữa giống Jasmine 85 và các giống lúa cao sản” được thực hiện nhằm góp phần vào công tác chọn giống và nhân nhanh các giống lúa mới có phẩm chất tốt và năng suất cao

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát môi trường thích hợp để tạo mô sẹo (callus) cũng như tái sinh thành cây con hoàn chỉnh

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu sơ lược về các giống lúa

Theo tài liệu khoa học cho biết thì trên thế giới có khoảng từ 13.000 đến 15.000 giống lúa, nhưng trong thực tế thì chỉ có khoảng 20 loài lúa dại và hai loài lúa canh

tác Ngày nay, hai cây lúa được canh tác rộng rãi trên thế giới là loài Oryza sativa L ở châu Á có năng suất cao và loài lúa Oryza glaberrima Steud, năng suất thấp được canh

tác ít hơn ở Tây châu Phi

Loài Oryza sativa thuộc chi Oryza, họ Poaceae, bộ Poales, lớp Liliopsida, ngành

Streptophyta

Về phương diện sinh thái và địa lý, lúa Oryza sativa được phân ra làm ba nhóm:

- Lúa Indica: trồng ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới, gạo có nhiều tinh bột Năng suất kém hơn lúa Japonica

- Lúa Japonica: trồng vùng ôn đới hoặc nơi có độ cao trên 1000m Gạo dẻo, cho năng suất cao

- Lúa Javanica (bulu) được trồng ở Indonesia, có đặc tính ở giữa hai loại lúa Indica và Japonica (Trần Văn Đạt, 2002)

Dưới đây là những giống lúa đã được sử dụng làm giống cha mẹ cho các giống lúa lai thực hiện trong đề tài:

2.1.1 Jasmine 85

Giống lúa Jasmine 85 là giống lúa thơm có nguồn gốc từ giống IR841 của Viện Lúa Quốc tế do Bộ Nông nghiệp Mỹ chọn lọc lại với dòng Jasmine 85 Giống này được du nhập vào Việt Nam trong những năm đầu của thập niên 1990, trồng nhiều các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Long An, và một số vùng khác Diện tích trồng rộng ở tỉnh

Tuy nhiên Jasmine 85 nhiễm rất nặng với các loại sâu hại chính ở ĐBSCL như rầy nâu, bệnh bạc lá, bệnh đạo ôn, một số các bệnh siêu vi trùng lúa cỏ, lùn xoắn lá (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008)

2.1.2 OM 5199

Giống lúa OM 5199-1 là dòng lai thuần chọn từ tổ hợp lai Khang Dân/OM 2512 thực hiện trong vụ Hè Thu 2003, được chọn lọc theo phương pháp phả hệ từ quần thể F2 (vụ Hè Thu 2004) đến quần thể F6 (vụ Hè Thu 2006) Được công nhận giống chính thức năm 2009 theo Quyết định số 198 QĐ/BNN-KHCN ngày 18/06/2009 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT (www.giongnongnghiep.com)

Giống có thời gian sinh truởng 105-115 ngày, chiều cao cây 95cm, dạng hình đẹp, thân lá thẳng, rất cứng cây, lá cờ thẳng đứng và xanh khi bông lúa chín Bông thuộc loại bông chùm, nhiều nhánh, đóng hạt khít, ít lép, hạt nhỏ và ngắn, trọng lượng

1000 hạt 20,8g Giống có hàm lượng amylose cao (31,73%) và hàm lượng sắt trong gạo trắng cao gấp đôi các giống lúa đang được gieo trồng tại ĐBSCL, tỉ lệ gạo nguyên cao Nhược điểm của giống là hạt gạo nhỏ, bạc bụng, cơm khô và hơi cứng khi để nguội

Giống cho năng suất cao trong cả hai vụ Đông xuân và Hè thu Giống có tính kháng ngang đối với rầy nâu, bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá, chịu được điều kiện đất phèn mặn tốt (Long An, Bến Tre, Kiên Giang, Sóc Trăng ) và chống chịu với điều kiện bất lợi tốt Trái lại, giống dễ nhiễm bệnh cháy lá (www.omonrice.org)

2.1.3 OM 4900

Giống lúa OM 4900 do Viện Lúa ĐBSCL chọn từ tổ hợp lai C53/Jasmine

85//Jasmine 85 (marker RG28) Được công nhận giống chính thức năm 2009 theo

Quyết định số 198 QĐ/BNN-KHCN ngày 18/06/2009 của Bộ Nông Nghiệp & PTNT Giống được chấp nhận cao ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Kiên Giang, và nhiều địa phương khác ở ĐBSCL Giống phát huy tốt ở các vùng đất phù sa ngọt sản xuất giống lúa chất lượng cao cho xuất khẩu (www.giongnongnghiep.com)

Thời gian sinh trưởng của giống OM 4900 là 100 ngày Chiều cao cây 105 cm, thân rạ cứng, khả năng đẻ nhánh khỏe, số hạt chắc trên bông 250 hạt, tỉ lệ hạt lép 13,2% Trọng lượng 1000 hạt 28,5g, độ bạc bụng cấp 1, hàm lượng amylose 16%,

chiều dài hạt gạo 7,5 mm, tỉ lệ dài/rộng 3,1 (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008) Gạo đẹp, cơm dẻo, thơm…(www.giongnongnghiep.com)

Khả năng kháng rầy nâu khá từ cấp 1-3, khả năng kháng đạo ôn cấp 1-3, kháng vàng lùn, lùn xoắn lá Chỉ số sau thu hoạch (HI) 0.59 %, năng suất 6-7 tấn/ha (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008)

2.1.4 OM 1490

Giống lúa OM 1490 được Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long lai tạo từ cặp lai OM06/IR44592-62-1-1-3 Giống OM 606 có nguồn gốc từ IR42/Trân châu lùn, có dạng hạt rất đẹp Giống OM 1490 được công nhận giống quốc gia từ tháng 7/1999 Giống lúa OM 1490 có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm Ao 85-90 ngày (nếu canh tác lúa sạ) và 90-95 ngày (nếu canh tác lúa cấy) Chiều cao cây thấp hơn 90 cm, tán lá trung bình, đẻ nhánh khá, chiều dài bông 24,3cm Số hạt chắc trên bông 78,3 hạt, tỉ lệ hạt lép 14,2% trong vụ Đông xuân và 17-18% trong vụ Hè thu Trọng lượng

1000 hạt 27,2g Chiều dài hạt của giống OM 1490 là 7,10 mm, Dài/rộng 3,40 Hạt gạo trong suốt, ít bạc bụng Độ trở hồ biến động từ cấp 3 đến 5 Độ bền gel 58.50 mm thuộc nhóm trung bình Hàm lượng amylose 22.51% thuộc nhóm cơm mềm Hàm lượng protein 8.2% Năng suất trung bình khảo nghiệm qua 15 điểm tại ba tỉnh An Giang, Cần Thơ và Đồng Tháp trong vụ Đông Xuân 98-99 là 6,69 tấn/ha, có nơi đạt năng suất 8.62 tấn/ha tại Long Mỹ (Cần Thơ)

Giống OM 1490 chịu được điều kiện khắc nghiệt do phèn tương đối khá OM

1490 có khả năng chống chịu khô hạn đầu vụ hè thu, chống chịu tương đối với mặn (EC = 2-4dS/m)

Phản ứng sâu bệnh cho thấy giống lúa OM 1490 có khả năng kháng được bệnh đạo ôn (cấp 1) và chống chịu trung bình đối với rầy nâu (cấp 5) Khuyết điểm của giống này là trổ bông không đồng loạt, dễ bị ngộ nhận lẫn giống (Nguyễn Thị Lang và

1999 Giống được Hội đồng Khoa học Bộ NN và PTNT cho phép khu vực hóa năm

2000 và giống quốc gia năm 2002

Thời gian sinh trưởng 93 ngày (Đông xuân 93 ngày, Hè thu 99 ngày) Nó thuộc dạng hình thâm canh trung bình Chiều cao cây 108cm, thân rạ cứng trung bình, đẻ nhánh khá (www.giongnongnghiep.com) Chiều dài bông 24cm, số hạt chắc/bông 70-

90 hạt Màu sắc vỏ trấu: vàng Tỉ lệ hạt lép 15-19% Trọng lượng 1000 hạt: 25-26g Tỉ

lệ dài/rộng 3,3 Độ bạc bụng cấp 1 Chất lượng gạo tốt: tỉ lệ gạo nguyên 52,4%, tỉ lệ amylose 25,6%, cơm mềm và đậm Năng suất cao nhất đạt 8 tấn/ha, trung bình 5,4 tấn/ha, thấp nhất 3,6 tấn/ha Thị hiếu tiêu dùng được đánh giá khá cao trong thị trường nội địa Đây là 1 trong 5 giống chủ lực của chương trình 1 triệu ha lúa xuất khẩu ở ĐBSCL

Khả năng chống chịu rầy nâu cấp 5 và đạo ôn cấp 7 Thích nghi rộng, đặc biệt trên vùng đất phèn Diện tích gieo trồng luôn luôn đứng 20 trong nhóm 10 giống được xếp hàng đầu ở Nam Bộ (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2008)

Hình 1: Hột lúa và gạo của giống Jasmine 85

(Nguồn: http://www.giongnongnghiep.com/giong-lua/111-ging-lua-jasmine-85.html)

Hình 2: Hột lúa và gạo của giống OM 4900

(Nguồn: http://www.giongnongnghiep.com/images/stories/hinh_giong_lua/hinh%20om%204900.jpg)

Hình 3: Hột lúa và gạo của giống OM 5199

2.2 Tái sinh cây bằng phương pháp nuôi cấy túi phấn

Nuôi cấy túi phấn là sự nuôi cấy các túi phấn có chứa những tiểu bào tử phấn hoa còn non Mục tiêu của phương pháp này thường là để thu được những cây đơn bội bởi

sự hình thành các phôi soma một cách trực tiếp từ phấn hoa, hoặc đôi khi do sự phát sinh cơ quan qua mô sẹo

Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ, thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi Đối với một số loài cây khác nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, lúa mì) trên môi trường nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng Một số trường hợp phải dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.2.1 Môi trường nuôi cấy túi phấn

Môi trường nuôi cấy túi phấn gồm các khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, carbohydrate, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng,…

Hiện nay trong nuôi cấy túi phấn không có công thức nuôi cấy nào là vạn năng Hầu như mỗi tác giả đều sử dụng một thành phần hỗn hợp khoáng và vitamin riêng của mình (Ong Tài Thuận, 2001)

2.2.1.1 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôi cấy mô thường là nước cất một lần Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng

Nước khử khoáng là nước cất một hoặc hai lần đi qua các cột khử khoáng hoặc các cột trao đổi ion (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.2.1.2 Khoáng và các vitamin

Các môi trường thường sử dụng trong nuôi cấy túi phấn là Murashige và Skoog (MS-1962), White (W-1963), Guha và Maheshwari (GM-1966), Blaydes (B-1966), Linsmaier và Skoog (LS-1965), Chu Chih Ching (N6-1976) Các môi trường nuôi cấy

cơ bản có chứa nguyên tố đa vi lượng, đường, vitamin và các acid amin, với pH từ 5,4 đến 6 Bên cạnh các môi trường tổng hợp có thành phần xác định trên, các môi trường

cơ bản có bổ sung thêm dịch trích từ khoai tây, nước dừa Ở lúa hiệu suất tạo mô sẹo

từ túi phấn phụ thuộc nhiều vào các hợp chất chứa nitrogen Theo Chu Chih Ching

(1975) thi nồng độ NH4+ cao sẽ kìm hãm quá trình hình thành mô sẹo từ túi phấn lúa, trong khi đó nồng độ NO3- cao thuận lợi cho quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây

Các nguyên tố khoáng đa lượng

 Chloride (Cl)

Chloride có vai trò trong quang hợp chủ yếu ở hệ thống quang II trong quá trình quang phân ly nước Ngoài ra ion Cl còn điều hòa sự đóng và mở của khí khẩu Mô cấy hấp thu chloride ở dạng Cl-

Các nguyên tố khoáng vi lượng

 Iodine (I)

Iodine không được công nhận như một số nguyên tố dinh dưỡng cho thực vật bậc cao, mặc dù nó có thể cần thiết cho một số tảo và một lượng rất nhỏ của thực vật bậc cao

 Aluminium, Nickel (Al, Ni)

Aluminium và Nickel là các nguyên tố vi lượng được cho vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, vai trò sinh lý của các nguyên tố này thì chưa thật sự hiểu rõ Người ta thấy Nickel là thành phần của enzyme urease biến đổi urea sang ammonium

2.2.1.3 Các chất sinh trưởng

Ngoài môi trường cơ bản thì các chất sinh trưởng cũng cần thiết trong nuôi cấy

mô Trong đó có các acid amin: glutamin, serin, asparagin, glycin ; các vitamin: thiamin, pyridocin, nicotinic acid, inositol, panthothenate Trong các loại vitamin trên người ta chứng minh được vai trò của thiamin và nicotinic acid có liên quan chặt chẽ với túi phấn (Ngô Hữu Tình et al., 1997)

Các hạt phấn và túi phấn ở lúa và lúa mì tạo mô sẹo sau đó mới tái sinh cây đơn

bội, hoặc 2n Chúng thuộc những loài có hạt phấn và phát sinh hình thái gián tiếp in

vitro, nồng độ và tỉ lệ chất sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong hình thành mô

nước dừa thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với cây ngũ cốc (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.2.1.4 Đường

Đường là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy túi phấn, có vai trò như một nguồn cung cấp năng lượng (Nguyễn Đức Thành, 2000) Khi sử dụng đường sucrose trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc một phần thành monosaccharide: glucose và fructose (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Đường sucrose được dùng thông dụng với nồng độ 2-3% Ở cây thuốc lá sử dụng với nồng độ 2-4%, khoai tây là 6% thậm chí đến 12% (Nguyễn Đức Thành, 2000) Ở cây họ hòa bản, dùng đường sucrose cao hơn, lúa 5-6%, bắp 15-20% Ở lúa nồng độ sucrose thích hợp cho tạo mô sẹo là 5%, cho tạo cây là 3% Sự cân đối giữa đường và chất sinh trưởng là yếu

tố quan trọng nhất trong nuôi cấy túi phấn (Chaleff và Stolarz, 1982)

2.2.1.5 Than hoạt tính

Vai trò của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy túi phấn là hấp thụ một số hợp chất không có lợi cho sự phát triển của bào tử, những hợp chất này được sinh ra trong quá trình khử trùng, trao đổi chất của túi phấn, hàm lượng được sử dụng trong môi trường khoảng 5% (Ngô Hữu Tình et al., 1997) Than hoạt tính có tác dụng hấp phụ các chất sinh trưởng nội tiết từ vỏ bao phấn cũng như từ vỏ tế bào già, làm gia tăng hiệu suất sinh phôi, tạo chồi xanh và tạo cây lúa (Bajai et al., 1977)

2.2.1.6 Chất tạo gel

Agar: sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo

Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến: thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước (hyperhydricity), sự hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.2.1.7 Ánh sáng

Đối với nuôi cấy túi phấn lúa cần đến 3200 Lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300-500 Lux Nhiệt độ trung bình thường từ 25-28ºC là thích hợp đối với nuôi cấy túi phấn và hạt phấn của hầu hết các giống cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.2.2 Điều kiện nuôi trồng cây cho túi phấn

Hiệu suất tạo cây đơn bội từ nuôi cấy in vitro phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh

trưởng của cây cho túi phấn Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, dinh dưỡng và nước là điều kiện để cây mẹ có tình trạng sinh lý tốt, cho phép một kết quả sinh dục tốt Các nghiên cứu khác cho thấy rằng sự đáp ứng tốt nhất đối với những cây trồng trong nhà lưới so với cây trồng ngoài đồng Cây khỏe là điều kiện đầu tiên cho túi phấn nuôi cấy phản ứng tốt, cây sinh trưởng mạnh thì phản ứng của túi phấn sẽ rộng hơn cây sinh trưởng yếu và chỉ có kiểu gen đó mới cho phản ứng tốt (Ong Tài Thuận, 2001) Cây cho túi phấn khỏe là điều kiện tiên quyết đối với sự thành công trong nuôi cấy túi phấn, không những đúng với cây ngô mà còn đúng với nhiều loại cây ngũ cốc khác như cao lương (Prieard et al., 1987), lúa (Beanmont và Controis, 1990) Điều kiện sinh trưởng là tác nhân quan trọng làm tăng khả năng sinh sản đơn tính đực Điều này thúc đẩy sự nghiên cứu chọn lọc và nâng cao tần suất phản ứng của kiểu gen Mức độ phản ứng của túi phấn sinh trưởng trong mùa xuân tốt hơn mùa đông, trên đồng tốt hơn trong nhà kính (Genovesi, 1983; Barloy và Becker, 1993; Ngô Hữu Tình et al., 1997) Khả năng cho mô sẹo cao nhất ở túi phấn lấy trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần sau (Ong Tài Thuận, 2001)

2.2.3 Tuổi phát triển của hạt phấn

Nuôi cấy túi phấn hoặc hạt phấn ta nhận được những cây đơn bội Tỉ lệ cây đơn bội nhận được phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì ở giai đoạn mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 2000) Nitsh (1969) nhận thấy cây đơn bội chỉ

có thể thu được khi cấy túi phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ bộ tứ cho đến ngay sau mitose 1 Tuy nhiên, không phải các loài đều cho hiệu suất tối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau mitose 1 Về mặt này, các loài hòa thảo có nhiều điểm khác nhau:

ở lúa mì-giai đoạn đơn nhân muộn là thích hợp (Ouyang et al., 1973; Pan và Kao, 1978), ở lúa là giai đoạn đơn nguyên sớm (De Beauville, 1982) và đơn nhân muộn (Sun, 1978; Chu Chih Ching, 1982) Đối với tuổi mô sẹo càng sớm được chuyển sang môi trường tái sinh cây và thời gian tái sinh càng ngắn thì tỉ lệ cây đơn bội càng cao (Nguyễn Đức Thành, 2000)

2.2.4 Các kiểu mô sẹo (callus)

Một số mô sẹo có cấu trúc cứng trong khi các mô sẹo khác có thể bể vỡ thành các mảnh nhỏ gọi là mô sẹo rời rạc Mô sẹo có thể có sự xuất hiện màu sắc khác nhau: vàng, xanh, trắng, đỏ

Hình 6: Các kiểu mô sẹo

(Nguồn: Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Phương pháp chọn tạo giống thông thường đòi hỏi một thời gian rất dài mới tạo

ra một dòng thuần, được bắt đầu từ việc lai giữa các cá thể có những đặc tính quí cần cải thiện Thế hệ đầu tiên là dị hợp tử và đồng nhất về mặt di truyền Phân ly bắt đầu

từ thế hệ thứ hai (F2) và quá trình chọn lọc được bắt đầu Lúa là cây tự thụ phấn nên đến thế hệ F5 có đến 97% cá thể ở dạng đồng hợp tử và đến khi đó việc so sánh các dòng thuần mới có thể bắt đầu Như vậy để cho ra một giống lúa mới bằng phương pháp cổ điển phải mất nhiều năm sau khi công việc lai được thực hiện (Bùi Bá Bổng et al., 1999)

Phương pháp nuôi cấy túi phấn để tạo cây đơn bội kép đã giúp cho các nhà chọn tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian trong quá trình chọn lọc Phương pháp này ngày càng được sử dụng nhiều trên thế giới để thay thế những chiến lược cổ điển trong sản xuất những dòng cố định bằng sự tự thụ (Picard, 1995) Nuôi cấy túi phấn cho phép tạo ra các dòng đơn bội kép trong vài tháng sau khi nuôi cấy túi phấn so với vài

năm theo cách thông thường (Choo et al., 1985; Morrison và Evans, 1988; Snape, 1989)

Các dòng đơn bội kép này đồng hợp tử và thuần giúp cho quá trình chọn lọc giống rút ngắn thời gian một cách đáng kể Mặt khác, ngoài việc tái tổ hợp giữa các tính trạng của cây cha mẹ, nuôi cấy túi phấn có thể giúp gia tăng biến dị thông qua nuôi cấy (gameto clonal variation) Các tính trạng lặn cũng sớm xuất hiện và đặc biệt làm gia tăng được hiệu quả chọn lọc khi tái sinh được một quần thể đơn bội kép đủ lớn (Bùi Bá Bổng et al., 1999)

Những công trình nghiên cứu nuôi cấy bao phấn đầu tiên được Guha và

Maheshwari (1966, 1967) thực hiện ở cà độc dược (Datura) và ở ngô (Armon, 1975)

Đặc biệt kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ngô được hoàn thiện bởi Miao et al (1981), Chu (1981), Ku et al (1981), Kuo et al (1986) được áp dụng trong tạo giống lai (Genovesi, 1990; Ngô Hữu Tình et al., 1997)

Công trình của Bourgin và Nitsch (1967) trên cây thuốc lá Niizeki và Oono (1968) trên cây lúa Các tác giả đã nhận được nhiều cây thuốc lá đơn bội trên môi trường nuôi cấy đơn giản (Nguyễn Đức Thành, 2000), những điển hình về sản xuất giống bằng phương pháp này đối với ngũ cốc xuất hiện ngày càng nhiều trên thế giới như ở Colombia (Pulver và Jenning, 1986), Argentina, Chilê, Nhật, Philippine (Zapata

et al., 1983; Alejar et al., 1991), Ấn Độ, Hàn Quốc (Chung, 1987), Indonesia, Coote d’ Ivoire, Pháp (Guiderdoni et al., 1991), Đài Loan (Chen et al., 1991) Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật này trong cải thiện giống lúa đã bị ngăn trở do khó khăn của cảm ứng hình thái , đồng thời do trực tiếp từ túi phấn được cấy hoặc gián tiếp từ mô sẹo tạo

ra từ túi phấn Một khó khăn khác là khi được nuôi cấy in vitro, tất cả các giống lúa

không tạo thành mô sẹo và tái sinh như nhau Điều này có lẽ do đặc tính di truyền hoặc

do môi trường của các giống lúa khác nhau (Niizeki và Oono, 1968; Guha – Mukherjee, 1973) Dù gặp những khó khăn trên, các khoa học gia Trung Quốc đã thành công trong việc tái sinh những giống lúa mới từ túi phấn của những cây F1 lai giữa japonica và indica (Hu, 1978) Trong vài trường hợp, các cây lai được phối hợp những đặc tính của mỗi cha mẹ nên nó đã cho kết quả tốt hơn, như khả năng nảy chồi cao, số gié và đặc tính hạt mong muốn (Chen và Li, 1978; Hu và Hao, 1980)

Viện Nghiên Cứu Lúa Quốc Tế (IRRI) từ tháng 9 năm 1979, đã bắt đầu nghiên cứu đánh giá các khía cạnh ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy túi phấn lúa trong việc cải thiện giống (Zapata et al., 1983)

Ở Việt Nam, theo Đoàn Thị Ái Thuyền (1983), từ năm 1976-1980, tác giả đã tạo thành công một số dòng đơn bội kép từ nuôi cấy túi phấn của các giống lúa như IR36, Trắng Lùn, Nàng Co Đỏ, IR 2307

Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy túi phấn để sản xuất các dòng đơn bội kép có triển vọng với cặp lai japonica và indica; các dòng

ưu tú từ nuôi cấy túi phấn đã được trồng thử nghiệm ở nhiều điểm khảo nghiệm (Bùi

Bá Bổng et al., 1998)

Sự hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy túi phấn có tầm quan trọng rất lớn ngoài việc tạo

ra các dòng đơn bội kép một cách nhanh chóng thay cho phương pháp lai nội phối Kỹ thuật này còn được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm phân tích đột biến, định vị các đặc điểm đơn gen, nhờ vậy kỹ thuật này rất thích hợp cho các thí nghiệm nghiên cứu về di truyền, tế bào cũng như lập bản đồ gen Nhìn chung sự thành công của kỹ thuật nuôi cấy túi phấn, hạt phấn tách rời cũng như noãn chưa thụ tinh phụ thuộc vào khả năng sinh sản đơn tính của các nguồn nguyên liệu nghiên cứu (Nguyễn Hữu Tình

et al., 1997)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Nồi khử trùng nhiệt ướt

- Tủ cấy và các dụng cụ trong tủ cấy: đèn cồn, ống đựng cồn, kéo, kẹp cấy mẫu…

- Máy khuấy từ

- Máy đo pH

- Cân điện tử

- Giấy A4 để cấy mẫu

- Các dụng cụ thủy tinh: đĩa petri, chai 500ml,…

3.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất

- Túi phấn từ cây lúa F1 của các tổ hợp: Jasmine 85/OM 5199 (L1), Jasmine 85/OM 4900 (L2), Jasmine 85/OMCS 2000 (L3) và Jasmine 85/OM 1490 (L5)

- Javel

- Ethanol 70% và ethanol 96%

- Các hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy (bảng 1 và 2)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ tháng 12/2009 đến tháng 05/2010

Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật và nhà lưới của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy túi phấn

 Thu thập và vô trùng vật liệu nuôi cấy:

Đòng lúa được thu vào buổi sáng sớm hoặc buổi chiều, khi khoảng cách từ gốc lá đòng đến gốc lá kề phía dưới từ 5-9 cm tùy theo giống sao cho đầu hột lúa non có màu xanh nhạt Đòng lúa sau khi rửa với nước cất thì được khử trùng bằng ethanol 70% và

xử lý lạnh ở 8ºC trong 8 ngày (Chaleff và Stolarz, 1981, Yamaguchi et al., 1990) Hạt phấn lúc này ở giai đoạn cuối đơn nhân và thích hợp cho nuôi cấy (Croughan, 1995) Đòng lúa sau khi xử lý lạnh được rửa dưới vòi nước chảy 10-15 phút rồi tách lấy bông lúa Chọn những hột lúa ở phần giữa của bông sao cho các túi phấn chưa đến điểm giữa của chiều dài hột lúa (Trần Đình Giỏi, 2003) Khử trùng những hột lúa đã chọn bằng Javel được pha loãng (với tỉ lệ 1 Javel: 6 nước cất) trong 20 phút và rửa sạch 3 lần bằng nước cất vô trùng (vật liệu đã sẵn sàng cho nuôi cấy túi phấn)

Hình 7: Đòng lúa sau khi thu và rửa với nước cất

 Tạo mô sẹo:

Cắt đầu hột lúa vừa sát các túi phấn rồi dùng kẹp vô trùng kẹp ngang hột lúa, gõ nhẹ lên thành đĩa Petri để túi phấn rơi xuống trải đều trên môi trường dinh dưỡng thiết

kế như trong thí nghiệm 1 Sau khi cấy, các đĩa Petri được bao lại bằng màng parafin

và ủ trong buồng tối ở nhiệt độ 26±1ºC (Croughan, 1995) Mô sẹo được hình thành sau 3-4 tuần Khi các mô sẹo có đường kính khoảng 2-4 mm thì được cấy truyền sang môi trường tái sinh (Yoshida, 1995) được thiết kế trong thí nghiệm 2 và được giữ ở cường

độ ánh sáng 1000 Lux với thời gian chiếu sáng là 16/24 giờ, nhiệt độ 24±1ºC (Croughan, 1995)

Hình 8: Hột lúa non

3.2.3 Bố trí thí nghiệm

 Thí nghiệm 1: Tìm môi trường thích hợp tạo mô sẹo cho các tổ hợp lai Sử

dụng môi trường nền N6 (Chu Chih Ching el al., 1975) và thay đổi nồng độ đường sucrose:

 Kết quả ghi nhận:

- Ngày mô sẹo bắt đầu xuất hiện

- Số túi phấn tạo mô sẹo trên 1 đĩa nuôi cấy

- Tỉ lệ tạo mô sẹo tính trên tổng số túi phấn cấy

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường và thành phần chất điều

hòa sinh trưởng đến việc tái tạo cây

 Môi trường:

N6 của Chu Chih Ching el al (1975)

 Chất điều hòa sinh trưởng:

- Hiệu quả nuôi cấy (tỷ lệ mô sẹo cho cây xanh trên số túi phấn cấy)

Bảng 1: Thành phần các môi trường tạo mô sẹo

Muối khoáng

1 Amonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 463,0 463,0 463,0

5 Ferrous sulfate.7H2O (FeSO4.7H2O) 27,8 27,8 27,8

6 Magesium sulfate (MgSO 4 7H 2 O) 185,3 185,3 185,3

7 Manganese sulfate.4H 2 O (MnSO 4 4H 2 O) 4,4 4,4 4,4

9 Potasium nitrate (KNO 3 ) 2830,0 2830,0 2830,0

10 Monobase potasium phosphate (KH 2 PO 4 ) 400,0 400,0 400,0

Chất hữu cơ và vitamin

Bảng 2: Thành phần các môi trường tái sinh

(mg/l)

TN6_2 (mg/l)

TN6_3 (mg/l)

TN6_4 (mg/l) Muối khoáng

1 Amonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 463,0 463,0 463,0 463,0

3 Calcium chloride (CaCl 2 ) 125,3 125,3 125,3 125,3

5 Ferrous sulfate.7H 2 O (FeSO 4 7H 2 O) 27,8 27,8 27,8 27,8

6 Magesium sulfate (MgSO4.7H2O) 185,3 185,3 185,3 185,3

7 Manganese sulfate.4H2O (MnSO4.4H2O) 4,4 4,4 4,4 4,4

9 Potasium nitrate (KNO 3 ) 2830,0 2830,0 2830,0 2830,0

10 Monobase potasium phosphate (KH 2 PO 4 ) 400,0 400,0 400,0 400,0

11 Zinc sulfate.7H2O (ZnSO4) 1,5 1,5 1,5 1,5

Chất hữu cơ và vitamin

Chất điều hòa sinh trưởng

17 α-Naphthalene acetic acid (NAA) 1,0 0,5 1,0 0,5

3.2.4 Quy trình nuôi cấy túi phấn lúa

Hình 10: Sơ đồ nuôi cấy túi phấn

Xác định môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo

Tạo chồi bằng nghiệm thức

đã xác định tái sinh

Khử trùng và cấy trên môi trường dinh dưỡng

Khoảng 3-4 tuần

Mô sẹo bắt đầu hình thành

Đường kính mô sẹo khoảng

2-4 mm