Nghiên Cứu Sản Xuất Mật Số Cao Bào Tử Nấm Sợi Actinomucor Elegans

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẬT SỐ CAO B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT MẬT SỐ CAO

BÀO TỬ NẤM SỢI Actinomucor elegans

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ts.NGUYỄN VĂN THÀNH NGUYỄN TẤN THÀNH

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học MSSV: 3064414

Lớp: CNSH K32

CẦN THƠ, Tháng 5/2010

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

Nguyễn Văn Thành Nguyễn Tấn Thành

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Xin chân thành cảm tạ!

Ts.Nguyễn Văn Thành đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn các thầy cô Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học

đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian qua

Các cán bộ Viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài này

Em xin cám ơn gia đình và toàn thể các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K32 đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Cần Thơ, ngày 07 tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực hiện

Trong sản xuất starter, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sản lượng bào tử, với mục đích là tìm điều kiện sản xuất tối ưu để thu được sản lượng bào tử cao nhất và điều kiện xử lý (sấy khô và xay) bào tử để ta thu được số lượng bào tử sống cao nhất Nên chúng tôi đã thí nghiệm nhằm tìm nguồn cơ chất, mật số bào tử chủng và thời gian thu hoạch để thu được sản lượng bào tử cao nhất đạt 10 10 bào tử/cơ chất khô Trong thí nghiệm này thì ta tiến hành gồm có 3 thí nghiệm thăm dò Thí nghiệm thăm

dò lần 1 ta sử dụng nguồn cơ chất là tấm+cám và tấm, mật số bào tử chủng/g cơ chất khô: 10 3 , 10 4 , 10 5 bào tử và thời gian thu hoạch là 4, 5, 6 ngày Thí nghiệm thăm dò lần 2 ta sử dụng nguồn cơ chất là tấm+cám(1:1) và tấm+cám(2:1), mật số bào tử chủng/g cơ chất khô: 10 3 , 10 4 , 10 5 bào tử và thời gian thu hoạch là 5, 6, 7 ngày Thí nghiệm thăm dò lần 3 ta sử dụng nguồn cơ chất là tấm+cám(1:1) và tấm+cám(2:1), mật số bào tử chủng/g cơ chất khô: 10 4 , 10 5 bào tử và thời gian thu hoạch là 5, 6 ngày Trong thí nghiệm này ta có bổ sung lượng đạm là 0,0594g và 40% nước Sau khi ta bổ sung bào tử thì ta ủ mốc ở 30 0 C trong tủ ủ

Sau đó ta đem bào tử sau khi thu hoạch sấy khô ở nhiệt độ 42 0 C và 45 0 C trong thời gian là 24 giờ, 48 giờ Sau khi ta tìm ra được nhiệt độ sấy và thời gian sấy thích hợp thì ta bắt đầu đem mẫu đã được sấy khô xay trong thời gian 1 phút, 2 phút và 3 phút

Kết quả nghiên cứu là chúng tôi đã tìm ra được điều kiện sản xuất tối ưu để thu được sản lượng bào tử đạt 10 10 bào tử/cơ chất khô với nghiệm thức: cơ chất tấm+cám gạo (2:1), mật số bào tử chủng vào là 10 5 bào tử/cơ chất khô và thời gian thu hoạch là

6 ngày Sau đó ta đem bào tử đi sấy ở nhiệt độ 45 0 C trong 24 giờ và đem xay trong 1 phút

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2.Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1.Giới thiệu tổng quát về chao 3

2.2.Giới thiệu tổng quát về nấm 3

2.2.1.Khái niệm về nấm 3

2.2.2.Hình dạng, kích thước và cấu tạo 4

2.2.3.Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm mốc 5

2.2.4.Sinh sản 7

2.2.4.1.Sinh sản vô tính 7

2.2.4.2.Sinh sản hữu tính 8

2.2.5.Bào tử nấm mốc 9

2.2.6.Khuẩn lạc nấm mốc 9

2.3.Giới thiệu tổng quát về nấm Actinomucor elegans 10

2.3.1.Khái niệm 10

2.3.2.Sinh sản vô tính 10

2.3.3.Sinh sản hữu tính 11

2.4.Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt 11

2.4.1.Ưu và nhược điểm của phương pháp này 11

2.4.2.1.Nuôi cấy bề mặt trong môi trường lỏng 12

2.4.2.2.Nuôi cấy bề mặt trong môi trường đặc 12

2.5.Quy trình sản xuất nấm mốc giống 13

2.5.1.Nguyên liệu sản xuất mốc giống 13

2.5.2.Chuẩn bị nuôi mốc giống 13

2.5.2.1.Nuôi mốc trong ống thạch nghiêng 13

2.5.2.2.Nuôi mốc trong bình tam giác 13

2.5.2.3.Nuôi mốc trên khay 14

2.6.Quá trình phát triển của nấm mốc khi nuôi bằng phương pháp bề mặt 15

2.7.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt 16

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1.Phương tiện nghiên cứu 18

3.1.1.Dụng cụ, thiết bị 18

3.1.2.Nguyên vật liệu 18

3.1.3.Hóa chất 19

3.2.Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1.Nuôi mốc 19

3.2.2.Xác định độ ẩm nguyên liệu ban đầu 19

3.2.3.Quy trình chung sản xuất bào tử nấm Actinomucor elegans 21

3.2.4.Bố trí thí nghiệm 22

3.2.4.1.Thí nghiệm 1: Nghiên cứu sản xuất mật số cao bào tử Actinomucor elegans 22

3.2.4.1.1.Thí nghiệm thăm dò lần 1 22

3.2.4.1.2.Thí nghiệm thăm dò lần 2 23

3.2.4.1.3.Thí nghiệm thăm dò lần 3 24

3.2.4.2.Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy và nhiệt độ sấy đến số lượng bào tử Actinomucor elegans sống, chết, miên trạng 25

đến khả năng sống của bào tử Actinomucor elegans 26

3.3.Các chỉ tiêu thu thập và phương pháp phân tích 27

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu sản xuất mật số cao bào tử A.elegans 29

4.1.1.Thí nghiệm thăm dò lần 1 29

4.1.2.Thí nghiệm thăm dò lần 2 30

4.1.3.Thí nghiệm thăm dò lần 3 32

4.2.Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy và nhiệt độ sấy đến số lượng bào tử Actinomucor elegans sống, chết, miên trạng 34

4.3.Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện xử lý xay mẫu đến khả năng sống của bào tử Actinomucor elegans 36

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1.Kết luận 40

5.2.Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHẦN PHỤ LỤC

Bảng 4: Ảnh hưởng của thời gian sấy và nhiệt độ sấy đến số lượng bào tử sống, chết,

miên trạng đếm bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang và đếm sống trên môi trường

RBC 35

Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian xay đến số lượng bào tử: tổng số, sống, chết, miên

trạng đếm bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang và đếm sống 37

Trang

Hình 1: sợi nấm và cấu tạo vách tế bào của sợi nấm 4

Hình 2: Một số dạng khuẩn lạc nấm 4

Hình 3: Quy trình chung sản xuất bào tử nấm Actinomucor elegans 21

Hình 4: Quy trình đề nghị sản xuất bào tử nấm Actinomucor elegans 41

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1.Đặt vấn đề

Từ xa xưa ông bà ta đã biết sử dụng các biện pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm, trải qua nhiều thế kỷ sản phẩm lên men ngày càng phổ biến và đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người

Việc áp dụng các biện pháp lên men không chỉ giúp bảo quản thực phẩm tốt hơn

mà còn tạo ra các sản phẩm mới với hương vị mới và đặc biệt là rất dễ tiêu, giàu dinh dưỡng Có rất nhiều sản phẩm được sản xuất bằng phương pháp lên men được biết đến như: pho-mat, nước tương, bia, rượu… và một trong những sản phẩm lên men cũng khá phổ biến và quen thuộc đó là chao Chao là một sản phẩm được lên men từ đậu

nành nhờ nguồn mốc Actinomucor elegans Chao còn được gọi là phomat Châu Á Có

thể nói thực phẩm lên men được sản xuất từ vật liệu đậu nành chiếm vị trí quan trọng trong khẩu phần ăn của người Châu Á Nó bổ sung thêm phần protein và các acid amin quan trọng trong thức ăn chủ yếu của người Châu Á là gạo và nếp rất nghèo protein Ngoài ra thực phẩm này còn là cung cấp nguồn năng lượng, khoáng, vitamin rất đáng

kể

Trước đây các sản phẩm lên men thường được sản xuất thủ công với nguồn nấm mốc có sẵn trng tự nhiên Việc này dẫn đến nhiều bất lợi như: sản phẩm lên men có chất lượng không đồng nhất do nguồn giống không thuần, thời gian lên men kéo dài, sản phẩm không bảo quản được lâu, đôi khi nhiễm các nấm lạ sinh độc tố như aflatoxin ảnh hưởng tới sức khỏe con người

Hiện nay với sự phát triển của khoa học, đặc biệt là công nghệ sinh học người ta

đã phân lập được chủng giống Actinomucor elegans dung trong quá trình lên men sản

xuất chao, nhờ đó giúp cho sản phẩm có chất lượng cao, ổn định, đảm bảo an toàn, vệ sinh thực phẩm Tuy nhiên chỉ phân lập được chủng giống thôi chưa đủ, mà vấn đề cần quan tâm là “Nghiên cứu sản xuất mật số cao bào tử nấm sợi Actinomucor elegans”

1.2.Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu tìm ra qui trình sản xuất mốc giống Actinomucor elegans có mật số

bào tử cao, điều kiện xử lý tối ưu để thu được số lượng bào tử sống cao Cụ thể:

- Nghiên cứu cơ chất, mật số bào tử chủng, thời gian thu hoạch bào tử thích hợp

để ta thu được sản lượng bào tử cao nhất

- Tìm điều kiện xử lý (sấy khô, xay) tối ưu để thu được số lượng bào tử sống cao, từ đó ta có thể bảo quản mẫu tốt hơn và vẫn duy trì được mật số bào tử sống cao

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu tổng quát về chao

Chao (sufu) cũng được viết như fu-ru, là do hao sữa đậu nành lên men mốc có mùi khá nặng Chao được sản xuất chủ yếu ở Trung Quốc cho tiêu thụ nội địa và xuất khẩu, sản lượng hàng năm ước tính ít nhất 300 triệu tấn Chao được tiêu thụ như một chất gia vị

Chao được làm từ khối đậu hũ (thu được từ kết tủa sữa đậu nành) Đậu hũ được dùng làm chao cứng hơn bởi ép hoặc được xử lý hơi nóng nhanh, và tuần tự được chủng giống trên bề mặt và ủ ở ẩm độ cao tại nhiệt độ 20-350C, tùy thuộc vào địa điểm

và mùa (trong năm) Các loại nấm mốc tham gia chủ yếu là Actinomucor và Mucor

spp Sau vài ngày khối đậu hũ được bao phủ với một lớp dầy của sợi nấm như bong gòn Sản phẩm trung gian được gọi là pehtze- đậu hũ lên mốc Pehtze đã trở thành một nguồn enzim thủy phân đạm và đạm đậu nành phần lớn đã được phân cắt

Bước kế tiếp là muối và ngâm nước muối với mục đích bảo quản sản phẩm trong khi đó cho phép sự trưởng thành về mặt enzim mà cuối cùng sẽ cho ra cấu trúc mềm, mùi và vị nặng theo yêu cầu Xử lý đầu tiên với muối (hạt, bọt), với mục đích là làm tăng lên nhanh chóng hàm lượng muối khoảng 15%

Tiếp theo các pehtze muối được đặt và các keo/lọ và bơm đầy với nước muối hoặc hỗn hợp nước chan để chao chín Thành phần của nước muối để chao chín ảnh hưởng mạnh mẽ đến tính chất của sản phẩm cuối cùng Nó luôn chứa từ 10- 12% NaCl, và rượu gạo 10% hàm lượng ethanol

2.2 Giới thiệu tổng quát về nấm

nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acid hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đã được đưa vào sản xuất công nghiệp và

có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu và di truyền học

2.2.2 Hình dạng, kích thước và cấu tạo

Một số nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast = nấm men), đa số có hình sợi (filamentous fungi = nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào) Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thướt lớn nhỏ khác nhau tuỳ loài Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể đến vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm

Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin, có hoặc không có cellulose Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina Những vi sợi chitin được hình thành nhờ enzim chitin syntaz

Hình 1: sợi nấm và cấu tạo

vách tế bào của sợi nấm

Hình 2: Một số dạng khuẩn

lạc nấm

Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nội mạc (endoplasmic reticulum), không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribo thể (ribosomes) và những thể khác chưa rõ chức năng

Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm

Cercosporina kikuchi

Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dày 0,02µm, bên trong màng nhân chứa ARN và DNA

2.2.3.Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm mốc

 Nhu cầu dinh dưỡng

Nấm mốc sống dị dưỡng và hấp thụ hay hoại sinh Do đó nấm mốc phải bám trên

cơ chất thích hợp để sinh trưởng và phát triển Theo Alexopuos và Minns (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K,

Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca … Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucoz, muối ammonium sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzim thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào

Nguồn carbon: nấm mốc có thể sử dụng nguồn thức ăn carbon rất khác nhau, thường là các loại hydrat carbon và các dẫn xuất của hydrat carbon như các loại rượu, các loại acid hữu cơ… Nhiều loài nấm mốc có khả năng đồng hóa cả những hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc với nhiều sinh vật khác Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm mốc thường có những nhu cầu không giống nhau về nguồn thức

ăn carbon Vì vậy sự thích hợp của nguồn thức ăn carbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau: mức độ sinh trưởng tối đa, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hóa

Nguồn thức ăn Nitơ: Nấm mốc có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn nguồn nitơ vô cơ Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat

Các nguyên tố khoáng: về các nguyên tố đa lượng có thể kể đến S, P, K, Ca, Mg

và Fe chúng thường chiếm vài phần nghìn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô của sợi nấm Các nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với lượng rất nhỏ thường chỉ tính bằng µl được gọi là nguyên tố vi lượng có thể kể đến Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B,…Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết đối với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm mốc Một số nguyên tố vi lượng có thể hoạt hóa nhiều enzim và một enzim cũng có thể được hoạt hóa bởi nhiều nguyên tố vi lượng khác nhau

Các chất sinh trưởng: Cũng giống như các loài sinh vật khác nấm mốc có những quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các hợp chất sinh trưởng khác nhau như nhóm mốc dị dưỡng cần phải được cung cấp một vài hoặc nhiều chất sinh trưởng cần thiết cho hoạt động sống của nó

 Hàm lượng nước – Độ ẩm

Ngoài chất dinh dưỡng nấm mốc cũng có nhu cầu về nước cho các hoạt động về sinh lý sinh hóa của tế bào liên quan đến lượng nước này và độ ẩm bao gồm: hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm tương đối trong không khí

Hàm lượng nước trong môi trường phải phù hợp với nhóm vi sinh vật Đối với nấm mốc yêu cầu hàm lượng nước thường thấp hơn so với nấm men và vi khuẩn Nếu hàm lượng nước môi trường thấp hơn 30% nước thì nấm mốc khó sinh trưởng và phát triển được Nếu cao hơn 70% nước thì sẽ làm giảm trạng thái xốp của môi trường, làm giảm lượng oxi khuấch tán trong môi trường, do đó làm giảm khả năng sinh trưởng và phát triển của sợi nấm và dễ bị nhiễm vi khuẩn

Theo báo cáo của Narahara (1992) độ ẩm thích hợp của Aspergillus oryzae khi nuôi cấy trên môi trường gạo là 40% nước ( Đái Thị Xuân Trang, 1996)

Theo báo cáo của Annunziato (1986) khi nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường đậu nành và cám mì độ ẩm cần là 30-40% nước (Đái Thị Xuân Trang, 1996) Tuy nhiên duy trì hàm lượng nước môi trường sẽ rất khó khăn nếu độ ẩm không khí thấp, nhiệt độ cao, việc chứa môi trường trong túi polypropylene nhằm mục đích giữ ẩm được tốt

Mặc khác độ ẩm không khí thường không ổn định trong suốt quá trình phát triển của nấm mốc

Theo báo cáo của Reid (1989) cho rằng lượng nước được sinh ra từ quá trình biến dưỡng sẽ không đủ để bù đắp lượng nước mất đi từ quá trình dị hóa, do đó lượng nước môi trường thường có khuynh hướng giảm dần trong suốt quá trình tăng trưởng và phát triển của nấm mốc (Đái Thị Xuân Trang, 1996)

 Nhiệt độ

Khả năng hấp thu hay thoát hơi nước của sản phẩm đều có liên quan đến nhiệt độ môi trường Mỗi loài nấm mốc có nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định, nhưng phần lớn có khoảng nhiệt độ này là 15-300C

Trong điều kiện thuận lợi nấm mốc phát triển mạnh và tạo thành hệ sợi nấm Tùy thành phần của môi trường dạng hệ sợi nấm này thường có những đặc điểm sinh trưởng, hình thái và cấu tạo đặc trưng của mỗi loài Khuẩn lạc của một loài còn đặc trưng bởi màu sắc của sợi, bào tử và bộ phận mang bào tử đó (Bùi Xuân Đồng, 2004) Nấm mốc trong thực phẩm cũng thuộc hai lớp chính là nấm mốc có vách ngăn (Phycomycetes) và nấm mốc không có vách ngăn (Hyphomycetes) (Lương Đức Phẩm, 2002)

2.2.4.Sinh sản

Nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái

2.2.4.1.Sinh sản vô tính

Nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử

Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau:

- Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): các bào tử động (zoospores) có ở nấm Saprolegnia và bào tử túi (sporangiopores) ở nấm Mucor, Rhizopus chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và túi bào tử (sporangium) được mang bỡi cuống túi bào

tử (sporangiophores)

- Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Penicillium, Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm

- Bào tử tản (Thallospores): trong nhiều loài nấm men và nấm mốc có hình thức sinh sản đặc biệt gọi là bào tử tản Bào tử tản có thể có những loại sau:

+ Chồi hình thành từ tế bào nấm men: Cryptococcus và Candida là những loại bào tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi (blastospores)

+ Giống Ustilago có những sợi nấm có xuất hiện tế bào có vách dầy gọi là bào

tử vách dầy còn gọi là bào tử áo (chlamydospores) Vị trí của bào tử vách dầy ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài

+ Giống Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chử nhật và

tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores)

2.2.4.2.Sinh sản hữu tính

Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes)

có trãi qua hai giai đoạn giảm phân Quá trình sinh sản hữu tính trãi qua 3 giai đoạn:

- Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hoà hợp 2 tế bào trần (protoplast) của

Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nấm Myxomycetes

Bào tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang (ascus) và túi này chứa những bào tử gọi là bào tử nang (ascospores) Nang và bào tử nang là đặc trưng của nhóm Ascomycetes

Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng của cấu trúc thể quả gọi là đãm (basidium) và bào tử được gọi là bào tử đãm (basidiospores)

Nhóm Nấm bất toàn (Deuteromycetes=Deuteromycotina) gồm những nấm cho đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng

2.2.5 Bào tử nấm mốc

Một trong những phương thức sinh sản đặc trưng của nấm mốc là sinh sản bằng bào tử Bào tử có nhiều dạng khác nhau (bầu dục, thoi,…) màu sắc (cam, vàng, nâu,…), số lượng (vài ngàn bào tử) và sự sắp xếp của bào tử khác nhau trong một cấu trúc gọi là cuống bào tử (sporophore)

Bào tử phát tán nhờ gió và khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm bằng cách tạo khuẩn ty, đầu sợi tăng trưởng, phân nhánh nối kết tạo ra khuẩn ty thể Mỗi sợi nấm phân chia vách ngăn ngang giữa các tế bào tạo thành tế bào đồng nhất hay đa bào, cũng có nhiều loại nấm trong lớp phycomycetes không phân chia vách ngăn ngang giữa các tế bào, như vậy trong mỗi sợi nấm có nhiều nhân

Một số nấm mốc có bào tử đặc trưng sau: bào tử động (Zoospore), bào tử đính (Conidium), cuống bào tử đính (Conidispore), bào tử tán (Thallospore) (Cao Ngọc Điệp, 2000)

2.2.6.Khuẩn lạc nấm mốc

Khi một bào tử mốc gặp môi trường thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm Tùy theo môi trường, hệ sợi nấm thường có những đặc điểm sinh trưởng, hình thái, cấu tạo đặc trưng cho mỗi loài, mỗi chủng nấm

Thường khuẩn lạc nấm mốc có dạng hình tròn, tuy nhiên trong môi trường thạch của đĩa petri một số loại nấm tăng trưởng rất mạnh theo cả ba chiều nên dạng khuẩn lạc không rõ rệt

Tốc độ tăng trưởng của các loài nấm mốc thường tính bằng đường kính và đôi khi cả chiều dày khuẩn lạc Khuẩn lạc môt số loài còn đặc trưng bởi màu sắc của sợi nấm, của bào tử, của bộ phận mang bào tử đó

Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng

xốp, … Mặt khuẩn lạc thường phẳng như nhiều loài thuộc giống Penicillium, mặt

khuẩn lạc có vết khía xuyên tâm đặc sắc, thấp dần từ trung tâm ra mép hoặc lồi lõm không đều Mép khuẩn lạc thông thường được tạo bởi các sợi nấm cơ chất (địa sinh)

thường mỏng hơn phần bên trong, đặc biệt trong trường hợp khối sợi nấm khá dày (gồm cả sợi nấm địa sinh và sợi nấm khí sinh) có thể thấy rõ phần mép và bên trong khuẩn lạc

Một số đặc điểm qan trọng trong sự tương quan phát triển giữa sợi nấm địa sinh ở dưới và phần sợi nấm khí sinh ở trên, nguồn gốc phát sinh của các giá bào tử trần Các đặc điểm hình thái khác như sự có mặt của các bó sợi, bó giá, các thể quả, hạch nấm, các giọt tiết, các sức tố hòa tan, …làm cho khuẩn lạc của một số nấm mốc có tính đặc trưng loài (Bùi Xuân Đồng, 2004)

2.3.Giới thiệu về nấm Actinomucor elegans

2.3.2 Sinh sản vô tính

Nấm Mucor sinh sản vô tính như nấm Rhizopus bằng cách thành lập cọng mang

bọc bào tử và bào tử vách dày

Cọng mang bọc bào tử với những bào tử bất động hình thành trong cái bao hay bọc bào tử mỗi bọc bào tử phát triển tận ngọn, không phân nhánh và cọng mang bọc bào tử phát triển riêng biệt, không cùng nhóm nhiều khi có nhiều loài cá biệt có thể

mang bọc bào tử phân nhánh như Mucor rasemosus và Mucor plumbeus

Trong tế bào chất chứa nhiều nhân nhưng ở bào tử chỉ có 1 nhân, túi bào tử đổi sang màu nâu khi bào tử trưởng thành và dể dàng vỡ ra để phóng tích bào tử theo gió, nhiều khi bào tử dính vào chân côn trùng để phát tán tới những nguồn thức ăn khác và khi có điều kiện thuận tiện, bào tử nảy mầm cho ra 1 khuẩn ty mới

Không giống như những loài khác trong giống Mucor, Mucor rouxii có bào tử

nảy mầm như mấm men trong điều kiện kỵ khí, đặc biệt khi có sự hiện diện của khí

CO2; tuy nhiên, khi có đủ oxi thì bào tử nảy mầm cho ra một khuẩn ty bình thường Bào tử nang chỉ thành lập khi khuẩn ty tạo ra những tế bào có thành dầy như

trường hợp Mucor racemosus

2.3.3 Sinh sản hữu tính

Trong sinh sản hữu tính, Mucor có những đặc điểm chung với Rhizopus,

M.genevensis và nhiều loài khác là những loài đồng tán (tất cả sinh ra từ một khuẩn ty

thành lập bào tử tiêp hợp), tuy nhiên, M.mucedo và những loài khác lại là dị tán

2.4 Giới thiệu về phương pháp lên men bề mặt

Phương pháp này được phát triển rất rộng rãi, không chỉ để thu nhận chế phẩm enzim mà trước tiên đó là phương pháp thu nhận kháng sinh và một số quá trình lên men truyền thống

2.4.1 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp này

Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp Lượng enzim được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại

Chế phẩm enzim thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzim và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dể bảo quản

Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém

Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc

là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó không cần bỏ toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn Nhược điểm lớn nhất và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn diện tích khá lớn cho nuôi cấy

2.4.2 Các phương pháp nuôi cấy bề mặt

2.4.2.1 Nuôi cấy bề mặt trong môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Ở đây vi sinh vật

sẽ xử dụng các chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí tiến hành quá trình tổng hợp enzim Enzim ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzim nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật

Nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng trong các khay: Phương pháp này thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thướt phòng nuôi sao cho thuận tiện trong thao tác Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn vi sinh vật sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phái đáy khay nuôi cấy Nếu chiều cao môi trường quá nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzim sẽ không cao Trong nhiều nhà máy người ta thường tạo môi trường trong khay nuôi cấy có chiều cao từ 5-7 cm là hợp lý

2.4.2.2 Nuôi cấy bề mặt trong môi trường đặc

Khi nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzim người ta thường sử dụng môi trường đặc

Để làm tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Trong trường hợp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzim ngoại bào và nội bào Các enzim ngoại bào sẽ thẩm thấu và trong các hạt môi trường, còn các enzim nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bét môi trường lại, không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu môi trường có độ ẩm thấp sẽ không thuận lợi cho

vi sinh vật phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65%W là hợp lý

Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzim người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi để không khí dễ dàng xâm nhập vào lòng môi trường

2.5 Qui trình sản xuất nấm mốc giống

2.5.1 Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống

Gạo nếp: Nước 14%, Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và Protein 8,2% Trong đo protein của gạo nếp chủ yếu là glutein (oryzaine) và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, ngoài ra còn có chứa một số vitamin như B1, B2, B6, PP và E

Gạo tẻ: Nước 13,84%, Glucid 77,55%, Protein7,35%, Lipid 0,52%, Cellulose 0,18% và muối khoáng 0,54%

Bột mì: Nước 11,6%, Glucid 72%, Protein 9%, Lipid 4,8%, Cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%

Bắp mảnh: Nước 11,4%, Glucid 78,9%, Protein 8,5%, Lipid 0,8%, Cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%

2.5.2 Chuẩn bị mốc giống

Nuôi cấy giống bao gồm: Trong ống thạch nghiêng hay giữ ống trong ống nghiệm, trong bình tam giác (nhân giống nhỏ), trong sàng, khay (nhân giống lớn)

2.5.2.1 Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng

Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển mốc sợi sang ống thạch khác Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ loại vi sinh vật nào khác Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng

2.5.2.2 Nuôi cấy giống trong bình tam giác

Cách làm môi trường trong bình tam giác:

Môi trường gạo: Gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như bình thường, hạt gạo chín đều không quá nhão, không quá khô Độ ẩm khoảng 45% để nguội bóp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1 cm Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống thấm Hấp thanh trùng ở ấp suất 1 atm trong vòng 30-45 phút

Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho vào nước theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều Bóp tơi cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1 cm Đậy nút bằng giấy chống thấm Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở ấp suất 1 atm, 1200C trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi ván cục

Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh

Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng Sau khi chuẩn bị môi trường trong bình thủy tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc Trước tiên cần chuẩn bị lấy 5 ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm, Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hòa vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích

1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khỏe Trường hợp thấy bình bị nhiễm phải loại bỏ ngay

2.5.2.3 Nuôi cấy mốc trên khay

Chuẩn bị môi trường mốc trên khay:Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5 mm Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới ấp lực cao Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô thấm nước đều rồi hấp chín.Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bét hay quá khô Độ ẩm còn lại khoảng 45-50% là vừa

Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra làm nguội nhanh, nếu ít

có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều quá có thể cho qua may đánh tơi và dùng quạt thổi Sau khi làm nguội đến 26-28% thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với

tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn

Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3 m) Đặt ở nhiệt

độ 30-320C, độ ẩm 85-100% Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độn khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài Lúc này cần trãi môi trường thành lớp mỏng 2-3 cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C

Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống Sau khi nuôi

36 giờ nhiệt độ khối trong môi trường bắt đầu giảm, cần phải chỉnh nhiệt độ lên

34-350C để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc

Thời gian nuôi mốc trên khay khoảng 60 giờ Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 30-35% có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất Nếu không dùng ngay thì có thể sấy khô đến độ ẩm 8% Các bao mốc giống thường được bảo quản nơi thoáng mát (có thể bảo quản lạnh 4-50C) tránh ánh nắng Thời gian bảo quản tùy thuộc vào điều kiện có thể từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn

2.6.Quá trình phát triển của nấm mốc trong điều kiện bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt

Quá trình phát triển của nấm mốc trong điều kiện bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn:

Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu cấy Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

- Nhiệt độ tăng rất chậm

- Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

- Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

- Khối môi trường còn rời rạc

- Enzim mới bắt đầu được hình thành

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ, trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

- Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm phát triển rất mạnh, các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường

- Trong giai đoạn này ta có thể nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám

Môi trường được kết lại rất chặt

- Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên đến 40-450C

- Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hóa mạnh của nấm sợi

- Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đổi như sau:

- Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

- Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí/ thể tích phòng nuôi cấy/ 1 giờ Nhiệt độ nuôi cấy duy trì 300C trong giai đoạn này

2.7.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt

Độ ẩm môi trường: độ ẩm thích hợp cho việc hình thành bào tử là 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển Cần thiết phải giữ

ẩm cho môi trường ở mức tối thích Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc Tuy nhiên việc này cũng còn tùy thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi

Nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của nấm mốc Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzim là 28-

300C Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể bị nóng lên 400C hoặc hơn Do vậy cần giữ nhiệt độ môi trường không xuống 270C và không cao hơn 360C Toàn bộ chu trình sinh trưởng của nấm mốc có thể chia thành hai thời kỳ:

- Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu Trong thời kỳ này cần giữ nhiệt độ phòng nuôi không hơn 23-300C Độ ẩm tương đối của không khí

là 96-100%

- Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi nấm (có thể đạt từ 4-18 giờ)

Thời gian nuôi mốc: Ảnh hưởng đến lượng bào tử sinh, mỗi loại nấm mốc sẽ có một thời gian nuôi cấy thích hợp, ở thời điểm này nấm mốc sẽ sản sinh lượng bào tử nhiều nhất

pH: Các môi trường tự nhiên như cám, ngô thường có sẵn pH trong khoảng

5,5-mất hẳn Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng khuếch tán trong vài thế hệ

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1.Phương tiện nghiên cứu

3.1.1.Dụng cụ và thiết bị

Sử dụng phương tiện nghiên cứu của phòng Công nghệ sinh học thực phẩm Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ

a Dụng cụ

- Ống nghiệm, ống/ tuýp Eppendorf

- Túi nhựa PP (polypropylene)(16cm x 25cm)

- Máy đếm khuẩn lạc WTW (Wissenschftlich- technische- werksatten) BZG30

- Đĩa Petri của Đức

- Pipet, miro-pipet

b Thiết bị

- Buồng đếm hồng cầu Burk- Turk

- Kính hiển vi thường olympus- Japan- CTH, kính hiển vi huỳnh quang olympus- BH2- RFL- T2

- Bếp đun cách thủy

- Tủ sấy Sanyo- MOV- 112F

- Tủ lạnh Sanyo- MIR- 162

- Tủ ủ National NR- B26A1

- Buồng cấy vô trùng Testar- AV100

- Máy ly tâm Eppendorf HERMLE- Z233M- 2

- Máy xay mẫu Bioblock (Đức) HERMLE- Z233M- 2 cỡ lưới 14

- Máy xay sinh tố (xay khô) National- MX- 119N

3.1.2.Nguyên vật liệu

Chủng giống mốc thuần Actinomucor elegans lấy từ Viện Nghiên Cứu và Phát

Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ

Tấm, cám gạo

b.Hóa chất

- Hóa chất thông thường: NaCl, (NH4)2SO4, K2HPO4, H2SO4…

- Chất chỉ thị huỳnh quang: cFDA (Carboxy- fluorescence diacetate), PI (Propidium iodide)

3.2.Phương pháp nghiên cứu

3.2.1.Nuôi mốc

Mục đích thí nghiệm: Nhằm chuẩn bị tạo ra dịch trích bào tử cho các thí nghiệm sau

Từ nguồn mốc chủng Actinomucor elegans, tiến hành:

+ Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng: sử dụng môi trường MEA

+ Chủng Actinomucor elegans vào ống thạch nghiêng

+ Ủ ở 300C trong 5 ngày

Quan sát sự phát triển của nấm sau 5 ngày ủ

3.2.2.Xác định độ ẩm của nguyên liệu ban đầu

Mục đích thí nghiệm: Tìm được độ ẩm ban đầu của nguồn nguyên liệu được sử dụng làm cơ chất, từ đó có thể xác định được lượng nước cần thêm vào để cơ chất đạt được độ ẩm tối thích là 40%

Tiến hành:

Sấy khô đĩa ở 1050C đến trọng lượng không đổi Cho vào mỗi đĩa 5 g mẫu, tiếp tục sấy 1050C đến trọng lượng không đổi Độ ẩm của mẫu được xác định như sau:

x = 100

0 1

2

m m

m m





Trong đó: - x là độ ẩm của mẫu

- m0: khối lượng đĩa đã sấy khô

- m1: khối lượng đĩa và mẫu trước khi sấy

- m2: khối lượng đĩa và mẫu sau khi sấy

- Lượng nước cần thêm vào dựa vào công thức:

h =

a

x a



10

- h: là ẩm độ mong muốn

- a: lượng nước cần thêm vào 10g cơ chất

- x: độ ẩm của mẫu

3.2.3.Quy trình chung sản xuất bào tử nấm Actinomucor elegans

Giải thích quy trình:

 Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng:

+ Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng: sử dụng môi trường MEA

+ Chủng Actinomucor elegans vào ống thạch nghiêng

Hình 3: Quy trình chung sản xuất bào tử nấm Actinomucor elegans

Chuẩn bị môi trường trong ống thạch nghiêng Chủng mốc Actinomucor

elegans

Ủ 300C trong 5-7 ngày

Giống trong ống thạch

nghiêng Nước cất vô trùng

Dịch trích bào tử

Cơ chất Nước

+ Ủ ở 300C trong 5 ngày

+ Chuẩn bị dịch trích bào tử: cho 5ml nước cất vô trùng vào ống thạch nghiêng Dùng kim cấy vô trùng trích bào tử vào dung dịch, lúc này ta thu được dịch trích khoảng 107/ml Ta sử dụng dịch trích này để chủng vào cơ chất đã thanh trùng theo các nghiệm thức của bố trí thí nghiệm Các ống này vừa được dùng để bảo quản giống và vừa được dùng trong sản xuất nên ống giống phải tuyệt đối thuần khiết Môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy nấm mốc phải có đầy đủ chất dinh dưỡng

 Nuôi cấy nấm mốc trong túi nhựa polypropylen

- Cho vào mỗi túi polypropylen 10g cơ chất (nguồn cơ chất tương ứng với từng thí nghiệm) và thêm vào đủ lượng nước đã tính toán ở trên để độ ẩm của cơ chất đạt 40%, ta trộn đều sau đó đem khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong 30 phút Sau đó các túi

cơ chất được để nguội đến 38-400C

- Các túi polypropylen chứa cơ chất được thanh trùng đều được bổ sung 0,3ml (NH4)2SO4 1,5M và 0,2ml H2SO41M, sau đó ta chủng vào 0,1ml dịch trích bào tử với mật số tương ứng với từng thí nghiệm

- Trộn đều cơ chất trong túi polypropylen với mục đích làm cho giống phân bố tương đối đồng đều, sau đó đem ủ ở 300C trong 5-7 ngày Các thao tác đều phải thực hiện trong đều kiện vô trùng (trong buồng cấy) Yêu cầu của giai đoạn này là đảm bảo cho nấm sợi phát triển tốt và sinh ra bào tử có mật số cao nhất (đạt 1010 bào tử/g)

3.2.4 Bố trí thí nghiệm

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu sản xuất mật số cao bào tử Actinomucor elegans

Mục đích: Thí nghiệm nhằm tìm ra loại cơ chất, mật số bào tử chủng vào và thời

gian thu hoạch thích hợp để cho mật số bào tử Actinomucor elegans cao đạt 1010bào tử/g cơ chất khô

3.2.4.1.1 Thí nghiệm thăm dò lần 1

Thí nghiệm thăm dò lần 1 được tiến hành theo các bước của quy trình với lượng nước và lượng ammonium sulphat bổ sung vào cơ chất được giữ cố định, với 40% lượng nước thêm vào và 0,0594 g ammonium sulphat/g cơ chất khô Thí nghiệm được

bố trí theo thể thức thừa số 3 nhân tố 2,3 mức độ và 2 lần lặp lại

Các nhân tố là:

+ Cơ chất (A): Tấm + cám (A1), tấm (A2)

+ Mật số bào tử chủng/g cơ chất khô (B): 103 (B1), 104 (B2), 105 (B3) bào tử/g tương ứng với sử dụng dịch trích có mật số bào tử 105, 106, 107 bào tử/ml

+ Thời gian thu hoạch (C): 4 (C1), 5 (C2), 6 (C3) ngày

Tổng số nghiệm thức: 2 x 3 x 3 x 2 = 36 đơn vị thí nghiệm

Nhân tố Mức độ Đơn vị

Cơ chất (A) Tấm + Cám gạo (A1), Tấm (A2) g Mật số bào tử chủng vào cơ chất khô (B) 103 (B1), 104 (B2), 105 (B3) bào tử/g Thời gian thu hoạch (C) 4 (C1), 5 (C2), 6 (C3) ngày

Nghiệm thức Tổ hợp nghiệm thức Nghiệm thức Tổ hợp nghiệm thức

Gồm các nhân tố:

+ Cơ chất (A) : Vì ở thí nghiệm thăm dò lần 1 ở nghiệm thức với nguồn cơ chất

là tấm cho sản lượng bào tử không cao nên trong thí nghiệm thăm dò lần 2 ta sử dụng nguồn cơ chất là: Tấm + Cám gạo (1:1) (A1), Tấm + Cám gạo (2:1) (A3)

+ Mật số bào tử chủng vào/g cơ chất khô (B) : 103 (B1) , 104 (B2), 105 (B3)

+ Thời gian thu hoạch (C) : 5 (C2), 6 (C3), 7(C4) ngày

Tổng số nghiệm thức: 2 x 3 x 3 x 2 = 36 đơn vị thí nghiệm