Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hexagonia tenuis, phellinus gilvus, phellinus baumii và ganoderma australe ở vùng bắc trung bộ tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỖ XUÂN HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐỖ XUÂN HƯNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Hexagonia

tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma

Công trình được hoàn thành tại:

Viện Sư phạm Tự nhiên - Trường Đại học Vinh

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Quốc gia Việt Nam

2 Trung tâm Thông tin - Thư viện Nguyễn Thúc Hào – Trường Đại học Vinh

Ngày nay, ngày càng nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài nấm nhằm phát hiện các hoạt chất có dược tính mạnh đối với các căn bệnh nan y như viêm gan, kháng viêm ung thư, HIV…Việc đưa vào sử dụng rộng rãi các chế phẩm được tách chiết từ nấm sẽ giúp con người khỏe mạnh, phòng chống được nhiều căn bệnh tiềm ẩn, nguy hiểm

Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2010, có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận trên lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn

Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên rất đáng kể về nhiều mặt, có khoảng 50 loài là nấm ăn quý như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm

hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis Bull.), nấm chàm (Boletus aff felleus Bull.), nấm bào ngư (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius Fr.), nấm ngọc châm (Hypsizigus

marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) Có khoảng hơn 200

loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như:

linh chi (G lucidum), linh chi sò (G capense), cổ linh chi (G applanatum), vân chi (Trametes versicolor), phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), mộc nhĩ, ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris)…

Những nghiên cứu bước đầu về các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có khối lượng phân tử lớn như polysaccharit, polysaccharit-peptit, lectin… và các chất có khối lượng phân tử nhỏ như các flavonoit, steroit, terpenoit… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, suy giảm miễn dịch, tiết niệu, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường

Bắc Trung bộ là khu vực có nhiều vườn quốc gia, khu bảo tồn thiên nhiên như Phong Nha - Kẻ Bàng, Vũ Quang, Hồ Kẻ Gỗ, Pù Mát, Pù Huống, Pù Hoạt

và Bến En Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm…

Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam nói chung và khu vực Bắc Trung bộ nói riêng vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu về nấm ở vùng Bắc Trung bộ là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên của nước ta nói chung và tỉnh vùng Bắc

Trung bộ nói riêng Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Hexagonia tenuis, Phellinus

gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe ở vùng Bắc Trung bộ”

2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là quả thể bốn loài nấm H tenuis, P

gilvus, P baumii và G australe được thu hái ở vùng Bắc Trung bộ, Việt Nam

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Chiết hỗn hợp các hợp chất từ quả thể bốn loài nấm Hexagonia tenuis,

Phellinus gilvus, Phellinus baumii và Ganoderma australe

- Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của các loại nấm trên

- Xác định cấu trúc hóa học của những hợp chất phân lập được

- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, phân lập và bảo

quản ở nhiệt độ thích hợp Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng

các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích trên các pha đảo, pha silica gel

- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất được phân lập được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

(1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR,

5 Những đóng góp mới của luận án

Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống ở Việt Nam về thành phần hóa học

của quả thể bốn loài nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii

và Ganoderma australe

- Từ dịch chiết quả thể nấm Hexagonia tenuis đã phân lập và xác định cấu

trúc 5 hợp chất: 03 hợp chất triterpenoid: Hexagonin F, Hexatenuin A, Hexagonin B Các hợp chất Hexagonin F, Hexagonin B lần đầu tiên được phân lập từ loài nấm này Trong đó, Hexagonin F là hợp chất mới; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide Cả năm hợp chất đều có khả năng ức chế tế bào khối u SK-LU-1 (ung thư phổi), HepG2 (ung thư gan), Hep3B (ung thư gan), SW480 (ung thư ruột kết) và MCF-7 (ung thư vú) Đây là các hoạt tính lần đầu tiên được khảo sát đối với các hợp chất này

- Từ dịch chiết quả thể Phellinus gilvus phân lập được 5 hợp chất: 03 hợp

chất phenolic: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene,

(E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one, bi(cyclohexane)]-3,3’,6,6’-tetraene-2,2’,5,5’-tetraone; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide, các chất này đều có khả năng gây độc tế bào

4,4’-dihydroxy-3,3’,6,6’-tetramethyl-[1,1’-KB (ung thư biểu mô)

- Từ dịch chiết quả thể nấm Phellinus baumii phân lập được 5 hợp chất: 05

hợp chất polyphenol: 1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene; aldehyde dihydroxylbenzoic; methyl 3,4-dihydroxybenzoate; (E)-4-(3,4-

3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one; Inoscavin A Kết quả thử hoạt tính cho thấy

1,2,4,5-tetrachloro-3,6-dimethoxybenzene (PBE1) không có hoạt tính gây độc

tế bào ung thư biểu mô KB, hai hợp chất

(E)-4-(3,4-dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one (PBE4) và Inoscavin A (PBE5) có hoạt tính trung bình

- Từ dịch chiết quả thể nấm Ganoderma australe phân lập được 6 hợp chất:

04 hợp chất triterpenoid: Ganoderic acid Sz, Ganoderic acid Y, Ganoderal A, Ganoderol B; 02 hợp chất sterol: Ergosterol, Ergosterol peroxide

6 Cấu trúc của luận án

Luận án bao gồm 115 trang với 30 bảng số liệu, 49 hình và 4 sơ đồ với

129 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phương pháp và thực nghiệm (14 trang), kết quả và thảo luận (60 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham

khảo (9 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 90 trang công thức cấu tạo

và phổ của các hợp chất chọn lọc

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung:

1 Tổng quan về chi Hexgonia

- Giới thiệu về các hợp chất chuyển hóa bậc hai: steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid…

2 Nấm Hexagonia tenuis

- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Hexagonia tenuis

- Thành phần hóa học của nấm Hexagonia tenuis

- Hoạt tính sinh học của nấm Hexagonia tenuis

3 Tổng quan về chi Phellinus

- Giới thiệu về các hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide và polysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, flavone, styrylpyrone, furanone, polychlorinat…

protein-4 Nấm Phellinus baumii

- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Phellinus baumii

- Thành phần hóa học của Phellinus baumii

5 Nấm Phellinus gilvus

- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Phellinus gilvus

- Thành phần hóa học của Phellinus gilvus

6 Tổng quan về chi Ganoderma

- Giới thiệu về các hợp chất chuyển hóa bậc hai: polysaccharide và polysaccharide, steroid, terpenoid, sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid…

protein-7 Nấm Ganoderma australe

- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Ganoderma australe

- Thành phần hóa học của Ganoderma australe

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu:

Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát, tiến hành phân lập và bảo quản ở điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm

2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập được:

Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); các phương pháp kết tinh

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất:

Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR

2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học

Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên được thực hiện theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh

khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)

2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng

2.2.3 Phương pháp lấy mẫu

Nấm Hexagonia tenuis, Phellinus gilvus, Phellinus baumii và

Ganoderma australe được thu hái ở vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An, Việt

Nam vào tháng 08 năm 2017 PGS.TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Huế tiến hành định danh các mẫu nấm thu được Tiêu bản được lưu giữ tại Viện Công nghệ Hóa, Sinh, Môi trường - Trường Đại học Vinh

2.2.4 Phương pháp phân lập

Quả thể nấm được nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, trong thiết bị siêu âm và chưng cất dưới áp suất giảm bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol tổng Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố lần lượt với dung môi ethyl acetate, n-butanol thu được các dịch tương ứng (ethyl acetate, n-butanol và dịch nước) và chưng cất chân không thu được 3 phần: cao ethyl acetate, cao n-butanol và dịch nước

Các hợp chất trong 4 loài nấm được phân lập theo sơ đồ 2.1-2.4 như sau:

Quả thể nấm H tenuis (2,5kg)

Cao methanol (254g)

Ngâm chiết với Methanol (3x10L)

Sơ đồ 2.1: Phân lập các hợp chất từ nấm H tenuis

SKC, Silica gel

Hexane:ethyl acetate (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1)

F1.4 (0.75g)

CC, Silica gel

Hexane: ethyl acetate (100:0,

25:1, 15:1, 10:1, 4:1)

HTM4 (103mg)

(1g)

F1.6 (0,5g)

F2 (3,6g) (g) (8,6 g)

F2.5 (0,7g)

SKC, Silica gel Hexane:acetone (9:1, 6:1)

LH-20 Methanol/ nước

HTM1 (31mg)

(1g)

F3 (2,7g) (g) (8,6 g)

F3.2 (0,6g)

HTM3 (24mg)

(1g)

SKC, Silica gel Hexane:acetone (9:1, 6:1, 4:1, 1:1)

RP-18 Methanol/ nước

F5 (1,8g) (8,6 g)

CC, Silica gel

Chloroform :methanol (9:1, 6:1)

HTM5 (34mg)

(1g)

F8 (2,2g) (8,6 g)

Cao butanol (57g)

HTM2 (84mg)

(1g)

RP-18 Methanol/ nước

- Hòa tan trong nước

- Chiết lần lượt với Ethyl acetate, buthanol

Quả thể P Gilvus (2,0kg)

Cao methanol (93,0g)

Ngâm chiết với ethanol (3x10L) Chiết hỗ trợ sóng siêu âm

- Hòa tan trong nước

- Chiết lần lượt với hexane, ethyl acetate, chloroform

- Cất quay chân không thu hồi dung môi

Cao ethyl acetate (19,2g ) Dịch chiết nước (28,1g)

F-4 (2,7g)

F-5 (4,8g)

F-9 (4,8g)

- CC, Silica gel

- hexane: ethyl acetate (1:1-1:6)

Tinh chế bằng Methanol

PGE4 (20,4mg)

- SKC, Silica gel

- Hexane:ethyl acetate (1:2) (1:2)

F-5.1 F-5.2

PGE5 (4,7mg)

Cao chloroform (26,3g ) Cao hexane (7,8g )

PGE2 (11,4mg)

PGE3 (11,6mg)

- HPLC điều chế

- Hexane:ethyl acetate (1:3) (1:2)

CC, Silica gel Hexane: ethyl acetate (2:1)

Quả thể P baumi (3,0kg)

Cao methanol (99,5g)

-Ngâm chiết với methanol (3x10L) -Chiết hỗ trợ sóng siêu âm

- Hòa tan trong nước

- Chiết lần lượt với hexane, ethyl acetate, chloroform

- Cất quay chân không thu hồi dung môi

Cao ethyl acetate (20,1g ) Dịch chiết nước (27,9g)

F-1

PBE1 (20,0 mg)

Sơ đồ 2.3: Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm P baumii

- CC, Silica gel

- hexane:ethyl acetate (gradient)

Tinh chế bằng Methanol

PBE4 (10,2 mg)

PBE5 (105,1mg)

Cao chloroform (33,8g ) Cao hexane (10,5g )

PBE2 (15,0 mg)

PBE3 (8,1 mg) F-216

Quả thể G australe (6,5kg)

Cao methanol (754g)

Ngâm chiết với methanol (3x20L )

Cao ethyl acetate (442g)

GAM 3 (128mg )

GAM 2 ( 10mg )

CC, Silica gel,, chloroform: methanol (30:1-1:1)

CC, Silica gel, Chloroform: ethyl acetate (20:1)

Kết tinh phân đoạn

Sơ đồ 2.4: Phân lập các chất từ quả thể nấm cổ linh chi (G australe)

Dịch chiết H 2 O(112g)

F-4

GAM 4 (68mg)

GAM 5 (180mg )

GAM 6 (20mg)

CC, Silica gel,, chloroform: methanol (40:1-1:1)

CC, Silica gel Chloroform:ethyl acetate (15:1) Kết tinh phân đoạn CC, Silica gel, SKBMĐC

Benzene:ethyl acetate (20:1)

2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất

Sau khi xác định được cấu trúc phân tử của các hợp chất, chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của cao ethyl acetate và các hợp chất phân lập được Các nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học quả thể nấm Hexagonia tenuis

3.1.1 Phân lập các hợp chất

Quả thể nấm H tenuis được ngâm chiết bằng dung môi methanol Tiến

hành loại bỏ dung môi của dịch chiết dưới áp suất thấp được cao thô methanol Cao thô được phân bố lại vào trong nước và chiết lỏng-lỏng với dung môi ethyl acetate thu được cao ethyl acetate tương ứng

Từ cao ethyl acetate của nấm H tenuis bằng các phương pháp sắc ký cột

trên silica gel đã phân lập được 5 hợp chất và xác định các hợp chất này bằng

Phổ IR của nó thể hiện các dải hấp thụ mạnh cho nhóm hydroxy (3435

cm-1) và nhóm carbonyl không bão hòa (1646 cm-1)

Phổ 1H-NMR của HTM1 xuất hiện các tín hiệu singlet của sáu nhóm

methyl ở δH 0,83 (6H, CH3-29 & 30), 0,95 (3H, CH3-19), 1,01 (3H, CH3-28) và 1,73 (6H, CH3-18 & 27) cho thấy cấu trúc của HTM1 là một triterpene

lanostanoid Ngoài ra, các tín hiệu proton doublet và triplet đặc trưng ở δH 3,18

(t, J = 6,5 Hz), 4,22 (dd, J = 9,0, 6,0 Hz), cho thấy sự hiện diện của nhóm

hydroxy, ở δH 6,62 (t, J = 7,0 Hz) liên kết đôi carbon-carbon và một tín hiệu

singlet tại δH 9,38 nhóm chức formyl