Độc Tính Của Hỗn Hợp Vibasu 50nd (Diazinon) Và Bassan 50ec (Fenobucarb) Lên Cá Rô Đồng

DANH SÁCH BẢNG 2.2 Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam trong nông nghiệp 4.8 Giá trị DO mg/L ở các nghiệm thức qua các ngày thí nghiệm 38 4.9 Giá trị pH đo được

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA MÔI TRƯỜNG & TNTN

TS NGUYỄN VĂN CÔNG

Năm 2010

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận văn kèm theo sau đây với tên đề tài “Độc tính của hỗn hợp Vibasu 50ND

(diazinon) và Bassan 50EC (fenobucarb) lên cá rô đồng (Anabas testudineus) cỡ

giống” được Trần Văn Thạnh thực hiện nghiên cứu và báo cáo

Hôi đồng chấm luận văn và thông qua

Cần Thơ, Ngày 22 tháng 06 năm 2010

Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Văn Công

Cán bộ phản biện Cán bộ phản biện

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng Cha Mẹ đã luôn bên con trong thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn Trường đại học Cần Thơ, Khoa Môi Trường & TNTN, Bộ môn Khoa Học Môi trường đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài của mình

Em xin chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Văn Công, Anh Trần Sỹ Nam đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Môi trường đã tạo điều kiện và hướng dẫn

em hoàn thành đề tài Cảm ơn các bạn bè trong lớp Khoa Học Môi Trường K32 đã giúp đỡ, động viên tôi thực hiện tốt đề tài

Xin chân thành cảm ơn!

Người thực hiện Trần Văn Thạnh

TÓM LƯỢC

Việc xác định độc tính của hỗn hợp Vibasu 50ND (diazinon) và Bassan 50EC

(fenobucarb) lên cá rô đồng (Anabas testudineus) cỡ giống được thực hiện tại

Khoa Môi Trường và Tài Nguyên Thiên Nhiên từ tháng 01 năm 2010 đến tháng

04 năm 2010 Trong đó, giá trị LC50 – 96 giờ đựơc xác định bằng phương pháp nước tĩnh (APHA, 1998), mức độ nhạy cảm của hoạt tính ChE được bố trí với bốn nồng độ hỗn hợp diazinon – fenobucarb 0,30, 0,60, 3,04 và 7,6ppm của hỗn hợp diazinon – fenobucarb với cá rô đồng đã được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bể kiếng 40 lít (chứa 20 lít nước) với 3 lần lập lại trong 4 ngày Khả năng phục hồi hoạt tính này bố trí với hai nồng độ 0,30 và 3,04ppm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bể kiếng 40 lít (chứa 20L nước) trong vòng 72 giờ, sau đó cho cá ra bể composite 600L cho ăn và thay nước máy hàng ngày để theo dõi khả năng phục hồi AChE Kết quả cho thấy hỗn hợp hoạt chất 30% diazinon và 20% fenobucarb

ít độc với cá rô đồng thể hiện qua LC50 – 96 giờ bằng 30,4ppm Hoạt tính ChE trong não cá rất nhạy cảm với hỗn hợp thuốc diazinon và fenobucarb Tốc độ phục hồi của hoạt tính ChE trong não cá sau khi bị ức chế bởi hỗn hợp diazinon và fenobucarb nhanh, trong 5 ngày đầu phục hồi >70% so với đối chứng và hầu như hoàn toàn sau 2 tuần Kết quả cũng đã chỉ ra rằng việc phối trộn 2 hoạt chất lại sẽ làm giảm độc tính và ChE trong não cá rô đồng có thể bị ức chế ở nồng độ rất thấp Có thể dùng enzime này đánh dấu cá tiếp xúc với nước ô nhiễm hỗn hợp thuốc trên

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Chấp thuận của hội đồng

Lời cảm tạ

Tóm lược

Mục lục

Danh sách bảng

Danh sách hình

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

1 Khái niệm về thuốc bảo vệ thực vật và tình hình sử dụng trong canh tác nông nghiệp 3

1.1 Khái niệm và phân loại 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Một số khái niệm cần biết khi sử dụng nông dược 5

1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong nông nghiệp 6

1.3 Đặc điểm thuốc sử dụng trong nghiên cứu 9

1.3.1 Bassan 50EC 9

1.3.2 Vibasu 50ND 10

2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV lên sinh vật 12

2.1 Ảnh hưởng cấp tính 12

2.2 Ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật lên enzyme Cholinesterase (ChE) 13

2.2.1 Sơ lược về Enzyme Cholinesterase 13

2.2.2 Nhạy cảm của ChE đối với thuốc trừ sâu 14

2.2.3 Ý nghĩa nghiên cứu ChE trong đánh giá ô nhiễm thuốc BVTV 14

2.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến độc tính của độc chất 15

2.3.1 Nhiệt độ 15

2.3.2 Oxy hòa tan (DO) 15

2.3.3 pH 15

3 Sơ lược về loại cá thí nghiệm 16

3.1 Phân loại 16

3.2 Đặc điểm hình thái 16

3.3 Phân bố 16

3.4 Sự phát triển của cá rô đồng 17

3.5 Dinh dưỡng 17

3.6 Sinh trưởng 18

3.7 Sinh sản 18

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 20

3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21

4 Sinh vật thí nghiệm 21

5 Phương pháp xác định giá trị LC50 – 96 giờ 22

5.1 Cách pha dung dịch mẹ 22

5.2 Xác định khoảng gây độc 22

5.3 Xác định giá trị LC50-96 giờ 23

6 Phương pháp xác định mức độ nhạy cảm và khả năng phục hồi ChE…23 6.1 Xác định mức độ nhạy cảm của enzyme cholinesterase trong não cá rô đồng với hỗn hợp diazinon – fenobucarb 23

6.2 Xác định khả năng phục hồi enzyme cholinesterase trong não cá rô

đồng cỡ giống 23

6.3 Cách đo AChE 24

7 Tính toán kết quả và xử lý số liệu 24

7.1 Tính toán kết quả 25

7.1.1 LC50 25

7.1.2 ChE 25

7.2 Xử lý số liệu 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

1 Xác định nồng độ hỗn hợp 30% diazinon và 20% fenobucarb gây chết 50% sinh vật thí nghiệm 26

1.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 26

1.2 Tỷ lệ cá chết theo thời gian 29

2 Xác định mức độ nhạy cảm của ChE ở cá rô đồng với thuốc 31

2.1 Các yếu tố môi trường 31

2.2 Hoạt tính ChE của cá rô đồng theo thời gian 34

3 Khả năng phục hồi ChE ở cá rô đồng sau khi tiếp xúc với thuốc 36

3.3.1 Yếu tố môi trường 36

3.3.2 Khả năng phục hồi ChE ở cá rô đồng theo thời gian 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

2.2 Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam

trong nông nghiệp

4.8 Giá trị DO (mg/L) ở các nghiệm thức qua các ngày thí nghiệm 38 4.9 Giá trị pH đo được ở các nghiệm thức qua các ngày thí nghiệm 39

DANH SÁCH HÌNH

4.1 Tỷ lệ chết (%) của cá sau thời gian 96 giờ tiếp xúc thuốc 30 4.2 Hoạt tính ChE (µM/gam/phút, trung bình ± SE) trong não cá rô

đồng trong 96 giờ tiếp xúc với hỗn hợp diazinon và fenobycarb

Tại một thời điểm thu mẫu, hoạt tính ở các nghiệm thức có chữ

cái giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa thống kê (p>0.05)

35

4.3 Hoạt tính ChE (%) ở các nghiệm thức trong giai đoạn tiếp xúc

thuốc và phục hồi trong nước máy Trong cùng thời điểm thu

mẫu, ChE ở các nghiệm thức có cùng chữ cái thì khác biệt không

có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

40

Chương 1

GIỚI THIỆU

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) được xem là vựa lúa lớn nhất của

Việt Nam Sản lượng lương thực chiếm ½ sản lượng của cả nước, trong khi đó sản

lượng xuất khẩu gạo ở ĐBSCL chiếm 80% so với cả nước (De, 2006) Đi đôi với sản xuất nông nghiệp, là việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Mỗi ngày hàng triệu hecta đất nông nghiệp và nhiều dòng kênh phải hứng chịu chất độc hại từ phân bón, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) trong quá trình sản xuất (Thế Nghĩa, 2000) Theo Berg (2001) lượng thuốc trừ sâu phun trên đồng ruộng ở ĐBSCL là 1.79 kg hoạt chất trong một hecta trong một vụ và được chia ra làm 5.7 đến 7.2 lần Ngoài

ra, sự phối trộn cũng được quan tâm với nhiều tên thương mại như Vibaba 50ND

là sự phối trộn của 30 % diazinon và 20% fenobucarb, Vibaba 10H (6% diazinon + 4% fenobucarb), Difetigi 75EC (75% fenitrothion + 30% fenobucarb), Cruiser Plus 312.5FS (262.5 g/L thiamethoxam + 25 g/L difenoconazole + 25 g/L fludioxonil)…(Danh mục thuốc BVTV, 2005) với cộng dụng diệt trừ sâu hại, cỏ dại…được sử dụng khá phổ biến Trong đó, Basudin với hoạt chất diazinon thuộc

nhóm Lân hữu cơ được nông dân sử dụng khá phổ biến (Heong et al., 1998)

Diazinon phân hủy trong khoảng 1 tuần ở môi trường kiềm (pH = 10.4) và acid (pH = 3.1) nhưng tồn tại rất lâu (185 ngày) ở môi trường trung tính (pH = 7.5) (Tomlin, 1994) Ngoài ra, Bassan 50EC với hoạt chất fenobucarb cũng là loại thuốc khá phổ biến, thuốc nằm trong danh mục các loại thuốc BVTV được sử dụng ở Việt Nam Đây là loại thuốc chứa gốc cacbamate, chứa hoạt chất fenobucarb Diazinon và fenobucarb và gây hại cho động vật bằng cơ chế làm giảm hoạt tính enzyme cholinesterase (ChE) (Stenerson, 2004) Khi ChE bị ức chế đến 70% sẽ làm chết hầu như các loài thủy sinh vật (Fulton và Key, 2001) và 30%

bị ức chế được xem như giới hạn cho phép tối đa cho hầu hết sinh vật (Aprea et

al.,2002)

Cá rô đồng (Anabas testudineus) sống ở nước ngọt, phân bố ở ao, hồ, kênh rạch và

ruộng lúa (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thanh Hương, 1993) Đây là loại cá có giá trị thương phẩm cao và đang là đối tượng được chọn nuôi thâm canh quan trọng ở ĐBSCL Cá rô là loại cá ăn tạp thức ăn chủ yếu là động vật Ở ĐBSCL, nơi cư trú chủ yếu và lâu dài của cá rô là ruộng lúa (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thanh Hương, 1993) Do đó, loài cá này không thể tránh khỏi những ảnh hưởng

có hại đến sức sống và khả năng sinh trưởng khi người dân sử dụng hóa chất BVTV trên đồng ruộng Điều đáng lưu ý là nông dân sống tại đây ngoài thói quen trộn nhiều loại thuốc lại với nhau nhằm mục đích diệt trừ nhiều loại bệnh trên cây trồng, còn sử dụng liều lượng thuốc từ bằng cho đến cao hơn so với hướng dẫn của nhà sản xuất (Phạm Minh Tri, 2005; Lê Quốc Hội, 2005) Đánh giá độc tính riêng

lẽ của hoạt chất diazinon và fenobucarb lên cá rô đã được thực hiện (Trịnh Thị

Lan, 2004) Nghiên cứu “ĐỘC TÍNH CỦA HỖN HỢP VIBASU 50ND

(Diazinon) VÀ BASSAN 50EC (Fenobucarb) LÊN CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas testudineus) CỠ GIỐNG” được thực hiện nhằm xác định được độc tính của hỗn

hợp hoạt chất diazinon và fenobucarb lên cá rô đồng nhằm làm cơ sở cho định hướng nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng thuốc trừ sâu trên đồng ruộng đến loài cá này trong tự nhiên

Để đạt được mục tiêu trên cần thực hiện những nội dung sau:

Xác định nồng độ gây chết 50% cá rô thí nghiệm (LC50) của sự phối trộn hoạt chất diazinon (30%) và fenobucarb (20%) lên cá rô đồng Xác định mức độ nhạy cảm và khả năng phục hồi của enzyme cholinesterase trong não cá rô đồng cỡ giống với hỗn hợp hoạt chất diazinon (30%) và fenobucarb (20%)

Chương 2

LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU

1 Khái niệm về thuốc bảo vệ thực vật và tình hình sử dụng trong canh tác nông nghiệp

1.1 Khái niệm và phân loại

1.1.1 Khái niệm:

Thuốc bảo vệ thực vật (còn gọi là thuốc trừ dịch hại hoặc sản phẩm nông dược)

là những hợp chất độc có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học được dùng để phòng và trừ các loài sinh vật hại cây trồng và nông sản (Trần Quang Hùng, 1999)

1.1.2 Phân loại

Thuốc BVTV được phân loại theo nhiều cách với nhiều dạng khác nhau

a Phân loại theo nguồn gốc và thành phần hóa học: Trong cách phân loại này thuốc BVTV được chia làm bốn nhóm chính: clo hữu cơ, lân hữu cơ, cacbamate, nhóm cúc tổng hợp

- Các thuốc chứa gốc clo hữu cơ là thuốc luôn có clo trong công thức cấu tạo Là thuốc bền vững trong môi trong trường tự nhiên, thời gian bán rã lâu và tích lũy trong chuỗi thức ăn của hệ sinh thái (Lê Văn Khoa, 1999) Các thuốc clo hữu cơ làm tê liệt sự dẫn truyền xung điện trên sợi trục tế bào thần kinh, chủ yếu là hệ thần kinh ngoại biên Khi côn trùng trúng độc cơ thể run rẩy, co giật, các chi tê liệt

và tử vong (Nguyễn Trần Oánh, 1997)

- Nhóm lân hữu cơ có chứa phospho trong công thức cấu tạo Nhóm này có độc tính cao, tác động nhanh qua ức chế enzime cholinesterase (Trần Văn Hai, 2002) Côn trùng sau khi trúng độc thần kinh bị tê liệt, rối loạn sự trao đổi nước, gây ứ động dịch trong xoang phủ tạng và xuất huyết qua miệng, trọng lượng giảm Thuốc không tích lũy trong cơ thể của động vật máu nóng, nhưng nếu cơ thể tiếp xúc thường xuyên với thuốc, hàm lượng enzime ChE có trong cơ thể cũng bị giảm (Nguyễn Trần Oánh, 1997)

- Nhóm cacbamate là dẫn xuất của acid cacbamic Thuốc có độ độc cấp tính tương đối cao, tác động nhanh đến hệ thần kinh và khả năng phân hủy trong môi trường lâu (Trần Văn Hai, 2002) Các hợp chất cacbamate có trong cơ thể sinh vật sẽ kiềm hãm sự hoạt động của men ChE tương tự lân hữu cơ Trong các hợp chất cacbamate thì hợp chất thuốc trừ sâu có độ độc cấp cao nhất, tiếp đến là các loại thuốc trừ cỏ và cuối cùng là các thuốc trừ nấm (Nguyễn Trần Oánh, 1997)

- Nhóm pyrethoid được tổng hợp từ thực vật (cây họ cúc – pyrethium) Có công thức cấu tạo phức tạp, có tác dụng diệt sâu mà chủ yếu bằng con đường tiếp xúc,

vị độc, hiệu lực nhanh, một số có tác dụng xua đuổi côn trùng Đây là loại thuốc

có phổ tác động rộng, nhưng gây độc cấp tính yếu, tác động lên hệ thần kinh, gây thiếu oxy Thuốc ít độc cho người và động vật máu nóng, ít tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ phân hủy nhanh trong môi trường (Trần Văn Hai, 2002)

b Phân loại theo đối tượng tiêu diệt (Trần Văn Hai, 2004)

- Thuốc trừ sâu: là những thuốc phòng trừ các loại côn trùng gây hại cây trồng,

nông sản, gia súc, con người

- Thuốc trừ bệnh: là những thuốc phòng trừ các loài vi sinh vật gây bệnh cho cây

- Thuốc trừ cỏ dại: là những loại thuốc phòng trừ các loại thực vật, rong, tảo mọc lẫn với cây trồng, làm cản trở sinh trưởng của cây trồng…

- Thuốc trừ nhện: dùng để diệt nhện, ve, gây hại

- Thuốc điều tiết sinh trưởng cây còn gọi là thuốc kích thích sự sinh trưởng, kích thích sự ra rễ, tăng độ nảy mầm, tăng sinh trưởng và phát triển của cây trồng…(Trần Văn Hai, 2002)

c Phân loại theo độc tính:

Độc tính của thuốc trừ sâu được đánh giá dựa vào nồng độ hay liều lượng gây chết 50% sinh vật (LC50 hay LD50) trong khoảng thời gian xác định Phân loại độc tính của thuốc được chia làm 5 mức dự theo hệ thống phân loại của thuốc đối với cá của Farm Chemical Handbook (Meister Và Sine, 1997)

Rất độc: LC50-96h < 0,1 ppm Độc cao: LC50-96h : 0,1 – 1 ppm

Đôc trung bình: LC50-96h : 1 – 10 ppm

Ít độc: LC50-96h : 10 – 100 ppm Hầu như không độc: LC50-96h > 100 ppm

d Phân loại theo khả năng tích lũy

Dựa vào chu kỳ bán rã (DT50: Disappear Time) của hóa chất và thời gian phân hủy 50% chất độc DT50 < 1 tháng có độ bền vững thấp, DT50 từ 1 đến 6 tháng có độ bền vững trung bình, DT50 từ 6 đến 12 tháng thuộc nhóm có độ bền vững cao, DT50 > 1 năm có độ bền vững rất cao (Trần Văn Hai, 2002)

1.1.3 Một số khái niệm cần biết khi sử dụng nông dƣợc

Các ký hiệu trên nhãn thuốc

Bảng 2.1: Các ký hiệu trên nhãn thuốc thường gặp

(Nguồn: Trần Văn Hai, 2004)

Dung dịch DD, SL, AS, L Bonanza 100EC;Baythroid 5L

Bột hòa nước BTN; PHN; WP;

DF; WDG; SP

Viappla 10PTN; Vialphos 80PHN; copper-zinc 85WP; Padan 95SP

- Độc cấp tính:

+ LC50 (median lethal concentration) là nồng độ của chất độc gây chết 50% sinh vật thí nghiệm sau một khoảng thời gian thí nghiệm, đơn vị mg/L (trong môi trường nước hoặc không khí)

+ LD50 (median lethal dose) là lượng chất độc mà ở đó gây chết 50% sinh vật thí nghiệm qua đường miệng LD50 dùng để định giá độc cấp tính của một chất đối với sinh vật trên cạn, đơn vị mg/kg trọng lượng cơ thể sinh vật thí nghiệm

- Độc mãn tính: Là độ độc của một chất mà ở nồng độ đó có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phát triển bình thường của sinh vật như làm giảm sinh trưởng, sức sinh sản, sức chống chịu với môi trường, khả năng bắt mồi

+ Nồng độ cao nhất có thể chấp nhận được (MATC) là giới hạn nồng độ cao nhất của chất độc mà không gây hại đến sức sản xuất của sinh vật

+ Nồng độ thấp nhất thấy ảnh hưởng (LOEC) đây là giới hạn nồng độ thấp nhất của một chất có thể gây ảnh hưởng xấu đến sinh vật (sai khác có ý nghĩa thống kê so với đối chứng) (Nguyễn Văn Công, 2002)

1.2 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong nông nghiệp

Thuốc bảo vệ thực vật là các loại hoá chất do con người sản xuất ra để trừ sâu bệnh và cỏ dại có hại cho cây trồng Các loại thuốc này có ưu điểm là diệt sâu bệnh, cỏ dại nhanh, sử dùng lại đơn giản, nên được nông dân ưa thích Nhưng thuốc bảo vệ thực vật cũng có rất nhiều tác hại, ví dụ điển hình như trong tự nhiên

có rất nhiều loại sâu hại khác nhau, có loại sâu ẩn núp dưới lá, có loại đục vào thân cây, có loại lại chui vào đất, nên phải dùng nhiều loại thuốc khác nhau để tiêu diệt chúng Việc này gây khó khăn cho người sử dụng, nhất là những người nông dân

có trình độ văn hoá thấp Nhiều người chỉ thích mua thuốc rẻ để phun, không cần biết phạm vi tác dụng của chúng ra sao Có người hay phun quá liều chỉ dẫn để cho "chắc ăn", làm tăng lượng thuốc thừa tích đọng trong đất và nước Thuốc BVTV được sử dụng ở Việt Nam rất đa dạng, số tên hoạt chất của tất cả các nhóm

thuốc BVTV đều tăng theo thời gian nhưng tập trung chủ yếu vào nhóm thuốc trừ sâu, trừ bệnh, điều hòa sinh trưởng

Bảng 2.2: Danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam trong nông nghiệp

Thuốc bảo quản lâm sản 5 hoạt chất 6 tên thương phẩm

Chất hỗ trợ (chất trải) 4 hoạt chất 4 tên thương phẩm

Chất dẫn dụ côn trùng 3 hoạt chất 4 tên thương phẩm

Thuốc điều hoà sinh trưởng cây trồng 25 hoạt chất 54 tên thương phẩm

Thuốc trừ bệnh hại cây trồng 145 hoạt chất 419 tên thương phẩm

(Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn , số: 22/2005/QĐ-BNN)

Những năm gần đây liều lượng thuốc mỗi ngày một tăng lên và tăng gấp đôi trong vòng 5 năm qua (bảng 2.3) Năm 1990 có khoảng 20.000 tấn thuốc

BVTV được sử dụng, đến năm 1994 đã tăng lên 30.000 tấn (Dung et al, 1999) So

với năm 2002 thì năm 2007 số tên hoạt chất thuốc trừ sâu tăng 2.15 lần và thuốc điều hòa sinh trưởng tăng 2.1 lần, trừ bệnh tăng 2.4 lần, trừ cỏ tăng 1.5 lần và thuốc điều hòa sinh trưởng tăng 2.1 lần Trong số đó thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ

và nhóm cacbamate được sử dụng nhiều nhất, kế đến là nhóm pyrethoid (Cục Bảo

Vệ Thực Vật, 2008)

Bảng 2.3: Số lượng thuốc dùng trong nông nghiệp được phép sử dụng ở Việt Nam từ năm 2002 – 2007

Việc sử dụng nông dược tại ĐBSCL đã đến mức báo động, người nông dân

sử dụng tùy tiện, không đúng quy định về an toàn lao động, không theo đúng nguyên tắc “bốn đúng” Đa số họ muốn thấy hiệu quả ngay sau khi sử dụng thuốc

Ví dụ người dân ở Cần Thơ và Tiền Giang sử dụng trung bình khoảng 1.8 kg hoạt chất/ha/vụ cho ruộng độc canh cây lúa, và 1.04 kg hoạt chất/ha/vụ cho ruộng áp dụng mô hình kết hợp lúa - cá (Berg, 2001) Điều này chúng tỏ nếu kết hợp mô hình lúa – cá sẽ giảm được lượng thuốc BVTV sử dụng

Báo cáo tổng hợp của Tổng cục Môi trường, Bộ Tài nguyên & Môi trường, mỗi năm hoạt động nông nghiệp phát sinh khoảng 9.000 tấn chất thải nông nghiệp nguy hại, chủ yếu là thuốc BVTV, trong đó không ít loại thuốc có độ độc cao đã bị

cấm sử dụng (www.agroviet.gov.vn)

Tần suất sử dụng thuốc cũng là vấn đề cần được quan tâm Theo thống kê tần suất thuốc BVTV ở ĐBSCL là cao nhất, trung bình năm 1994 thuốc BVTV được sử dụng là 5.7 lần/vụ và tăng 8.2 lần/vụ năm 1999 (Berg, 2001) Những năm

gần đây nhiều bệnh mới xuất hiện như vàng lùn, lùn xoắn lá, hoặc rầy nâu, rệp hại lúa do đó mà liều lượng và tần suất cũng ngày càng tăng thêm

1.3 Đặc điểm thuốc sử dụng trong nghiên cứu

1.3.1 Bassan 50EC

Bassan 50EC là loại thuốc trừ sâu nằm trong danh sách các loại thuốc BVTV được phép sử dụng Là thuốc sử dụng khá phổ biến ở Việt Nam cũng như Đồng bằng Sông Cửu Long, thuốc có phổ tác dụng rộng dùng để trị rầy nâu hại trên lúa, rệp sáp hại cà phê, rệp muội trên cây có múi

Hoạt chất Fenobucarb

Một số tên thương mại: Bassa 50EC, Bassan 50EC, Bascide 50EC, Dibacide 50EC,…

Tên gọi khác: BPMC, Fenobucarb, Baycarb, Osbac

Tên hóa học: 2- sec- butylphenyl methylcarbamat

Fenobucarb có tác động tiếp xúc, vị độc, thích hợp cho việc trừ các loại sâu

có miệng chích hút nên có thể dùng để dập dịch khi rầy có mật độ cao Thuốc diệt rầy non và rầy trưởng thành không diệt trứng nên hiệu lực thuốc không kéo dài Nếu mật số rầy cao phải phun 2 - 3 lần, cách nhau 5 - 7 ngày, hiệu quả sẽ cao hơn Liều dùng pha 30 - 40ml thuốc/bình 8 lít, phun ướt đều lên cây lúa tối thiểu 5 bình

8 lít/1.000 m2, phun định kỳ ở gốc lúa nơi rầy nâu trú ẩn, phun sớm khi rầy ở tuổi nhỏ (rầy cám)

Fenobucarb được gia công thành dạng sữa 50% (Bassan 50EC) Hướng dẫn

sử dụng thuốc Bassan 50EC: dùng với liều lượng chế phẩm 1L/ha lúa để trừ rầy nâu, rầy xanh, bọ xít và bọ trĩ

1.3.2 Vibasu 50ND

Vibasu 50ND là loại thuốc trừ sâu nằm trong danh sách các loại thuốc sử dụng phổ biến nhất trong ruộng lúa ở ĐBSCL Vibasu 50ND dùng trừ bọ xít hại lúa, rệp hại cây có múi

Tên hoạt chất: diazinon (Thuốc thuộc nhóm lân hữu cơ)

Tên hoá học: 0,0-Dietyl-0-(2-isopropyl-4)metyl-6-pyrimidinyl photphorothioat

Diazinon

Tính chất hóa học: Bị thủy phân trong môi trường axit, kiềm Thuốc thuộc nhóm độc nhóm II, LD50 qua miệng 300 - 400mg/kg, qua da 2150 mg/kg Thuốc độc với chim, ong

Thuốc được khuyến cáo sử dụng 2 lần trong vụ lúa, 25 ngày và 45 hoặc 65

ngày sau khi cấy; hoặc 40 ngày và 60 hoặc 80 ngày sau khi sạ Liều lượng sử dụng đối với Vibasu 50ND là 1 - 1,5 lít pha với 400 - 600 lít nước phun cho 1ha (10.000m2)

Vibasu chứa hoạt chất diazinon gây hại sinh vật đầu tiên qua ức chế enzyme cholinesterase (ChE) (Stenersen, 2004) Ở nồng độ thấp, diazinon không gây chết

cá lập tức nhưng làm ức chế enzyeme ChE trong huyết thanh cá chép Cyprius

carpio, mè vinh, rô phi (Đỗ Thị Thanh Hương 1999), và ChE trong não cá lóc Channa striata (Cong et al, 2006) Diazinon còn làm giảm tốc độ bơi lội cá Oncorhynchus mykiss (Beauvais et al, 2000), làm gia tăng tần suất đớp khí ở cá

lóc C striata (Cong et al., 2006) Ngoài ra, diazinon cũng làm giảm hàm lượng protein trong thịt cá Danio rerio (Roex et al., 2003), giảm tăng trọng cá chép

Cyprius carpio, mè vinh, rô phi (Hương 1999) và cá lóc C striata (Cong et al.,

Bảng 2.4: Giá trị LC50 của diazinon (Basudin) và fenobucarb (Bassa) đối với một

và 96 giờ (hoặc ít hơn) là thời gian ngộ độc tiêu chuẩn do đó là thời gian cần thiết cho sự ngộ độc gây chết Đại lượng LC50-96 giờ thường dùng cho độ độc cấp tính trên cá hay động vật không xương cở lớn

Giá trị LC50 – 96 giờ của các loại cá khác nhau thì khác nhau Cùng hoạt

chất diazinon 60EC nhưng giá trị LC50 – 96 giờ đối với cá rô đồng (Anabas

testudineus) là 6.55 ppm, cá lóc (Channa punctatus) là 3.09 ppm (Rahman et al.,2002) Ngoài ra ảnh hưởng của thuốc trừ sâu cũng khác nhau theo kích cỡ

Nghiên cứu của Nguyễn Văn Công và cộng sự (2008) cho thấy cá lóc ở giai đoạn bắt đầu đớp khí nhạy cảm với diazinon hơn giai đoạn vừa tiêu hết noãn hoàng và

giai đoạn phôi Theo Murty (1988) thì khả năng chịu đựng của cá lớn lớn hơn so với cá bé do hàm lượng lipit trong cơ thể cá lớn nhiều hơn cá nhỏ nên lượng chất độc hấp thụ qua màng so với trọng lượng cơ thể ít hơn

Độc tính của thuốc trừ sâu lên cá khác nhau tùy thuộc vào từng loại hoạt chất nếu xếp theo thứ tự độ độc từ cao đến thấp thì thuốc BVTV có gốc Clo hữu

cơ là có độ độc cao nhất, kế đến là gốc lân hữu cơ và sau cùng là gốc cacbamate (Đỗ Thị Thanh Hương và cộng sự, 1997) Diazinon có độc tính cao đối với cá lóc

đồng (Channa striata) với LC50 – 96 giờ là 0,79 mg/lít, nhưng đối với hoạt chất fenobucarb thì ít độc hơn LC50 – 96 giờ là 11.2 mg/lít (Cong et al, 2006)

2.2 Ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật lên enzyme Cholinesterase (ChE)

2.2.1 Sơ lược về Enzyme Cholinesterase

Xinap là nút trung tâm điện hóa của hệ thần kinh, ở đây các xung động thần kinh được chuyển từ tế bào thần kinh này sang tế bào thần kinh khác (gọi là nơron) hay từ tế bào thần kinh này sang cơ bắp Khi xung động thần kinh đến gần xinap, ở khe xinap, các hợp chất acetylcholine được hình thành Acetylcholine có tác dụng như một cầu nối dẫn truyền xung động đi qua khe xinap của tế bào thần kinh Sau khi làm nhiệm vụ cầu nối, acetylcholine được thủy phân thành choline

và acid acetic nhờ men cholinesterase (ChE) có sẵn trong não Phản ứng này xảy

ra nhanh chóng và ổn định (Hart, 1993)

Có 2 loại men ChE: Acetylcolinesterase (AChE) có nhiều trong não động vật, mô thần kinh, huyết tương và hồng cầu của động vật có xương sống và có chức năng chuyên biệt thủy phân acetylcholine nhanh (Peakall, 1992) Nó đóng vai trò quan trọng trong chức năng điều tiết bình thường và dẫn truyền xung thần kinh AChE và cá Synapse của hệ thống thần kinh Hoạt tính AChE bị ức chế cao

có thể gây chết sinh vật do làm nghẽn hệ thống thần kinh (Peakall, 1992) Hoạt tính butyrylcholinesterase (BChE) còn gọi là pseudocholinesterase cũng có khả năng phân hủy acetylcholine như AChE nhưng tốc độ xảy ra chậm hơn (Peakall, 1992) Hoạt tính này được tìm thấy ở các bộ phận khác như gan, cơ, tuyến tụy và

phân bố nhiều nhất trong huyết tương của động vật có xương sống (Thomson and Walker, 1994) Trong khi vai trò của AChE rõ ràng thì vai trò của BChE vẫn chưa

rõ mặc dù nó được tìm thấy ở nhiều mô khác nhau trong sinh vật sống Hoạt tính BChE thì nhạy cảm với hoạt chất thuốc gốc lân hữu cơ và cacbamate hơn so với AchE và gần như bị ức chế hoàn toàn mà không làm chết sinh vật (Peakall, 1992) Tổng ChE, AChE và BChE thường được sử dụng để đánh giá độc tính và ảnh hưởng của thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc cacbamate (Peakall, 1992)

2.2.2 Nhạy cảm của ChE đối với thuốc trừ sâu

Thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và cacbamate chuyên biệt ức chế enzyme acetylcholinestase (AChE) (Peakall, 1992) Chúng giống như chất đệm sinh học nhưng phản ứng chậm đến nỗi acetylcholine bị tích lũy tại synapse làm chức năng thần kinh bị gián đoạn và chúng được xem như chất độc tác động ở synapse (Peakall, 1992) Trong hai loại enzyme thì chỉ có hoạt tính AChE có liên quan trực tiếp đến khả năng chết, khả năng chịu đựng này cũng khác nhau giữa các loài (Nguyễn Văn Công, 2002) Cũng theo Nguyễn Văn Công và cộng sự (2002) cũng cho thấy khi cá lóc vẫn sống khi hoạt tính AChE não bị ức chế khoảng 91% bởi diazinon Qua đó cho thấy hoạt tính enzyme trong não cá bị ức chế lớn hơn 70% được xem là nguyên nhân gây chết cho hầu hết các loài và ngưỡng giới hạn sinh học cho phép hoạt tính AChE bị ức chế không quá 30% mức bình thường (Fulton and Key, 2001)

2.2.3 Ý nghĩa nghiên cứu ChE trong đánh giá ô nhiễm thuốc BVTV Enzime ChE có chức năng quan trọng trong động vật sống, đặc biệt là trong

truyền tải tín hiệu thần kinh Đồng thời ChE cũng rất nhạy cảm với môi trường ô nhiễm, đặc biệt là hóa chất thuốc BVTV gốc lân hữu cơ và gốc cacbamate Do đó, nghiên cứu hoạt tính ChE có thể phát hiện sớm ảnh hưởng bất lợi của môi trường sống đến sinh vật (Peakall, 1992) Vì thế, hoạt tính ChE được sử dụng cho chỉ thị

ô nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc cacbamate Hoạt tính ChE ở loài

chim và cá đã từng được sử dụng để đánh dấu sinh học chỉ sự tiếp xúc của sinh vật với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc cacbamate (Peakall, 1992)

2.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến độc tính của độc chất

2.3.1 Nhiệt độ

Theo Murty (1988) trong số tất cả các nhân tố môi trường thì ảnh hưởng của nhiệt độ lên chất độc hóa học được nghiên cứu nhiều nhất Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên các yếu tố như hoạt tính của enzyme, tốc độ trao đổi chất,… Nhiệt độ tăng hay giảm sẽ làm cho độ độc của một số chất tăng hay giảm theo Nhiệt độ trong môi trường nước có thể tăng, giảm hoặc không ảnh hưởng đến độc chất, tùy thuộc vào từng loại độc tố, loài sinh vật và điều kiện sống Ví dụ LC50 – 48 giờ của DDT đối với Simocephalus serrulantus tại 100C và

270C là 1,7 và 4,3 ug/L

2.3.2 Oxy hòa tan (DO)

Đối với ngộ độc cấp tính thì lượng oxy hòa tan trong nước giảm sẽ làm tăng độc tính của độc chất trong môi trường nước Theo Lloyd, 196a, nếu độc tính của một chất phụ thuộc vào pH sẽ gia tăng khi lượng oxy hòa tan giảm Khi hàm lượng oxy thấp lượng nước qua mang cá tăng lên, gây tăng pH cục bộ, làm cho lượng amonia chưa bị ion hóa tăng lên, dẫn đến độc tính tăng lên - gấp 2,5 lần (Lê Huy Bá, 2000) Ở mức nồng độ oxy 1-5 ppm cá vẫn sống bình thường nhưng phát triển chậm, ở nồng độ 0,1-1 ppm thì cá sẽ chết nếu nhiệt độ của nước cao và cá con có thể sống ở nồng độ từ 0-0,3 ppm nếu nhiệt độ nước thấp Hàm lượng oxy lớn hơn 5 ppm là môi trường lý tưởng cho các loài tôm, cá phát triển (Nguyễn Hoàng Phúc, 2004 trích từ Swingle, 1969) Khi DO giảm còn 21% bảo hòa thì độc tính tăng gấp 1,5 lần so với độc tính ở DO bằng 67%

2.3.3 pH

Tính kiềm, axit hay môi trường trung tính là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến tính tan, độ pha loãng và hoạt tính của tác chất gây độc pH thay đổi dưới sự ion hóa, ảnh hưởng chủ yếu đến độc chất Làm các phân tử không liên kết dễ xâm

nhập vào mô, tế bào Như Cyanide độc tính giảm khi pH bằng 8,5 so với môi trường Cyanide trung tính Do đó, độc tính của thuốc sẽ tăng lên Có một số độc chất phụ thuộc vào pH, còn lại số khác thì không (Phenol và chất hoạt động

bề mặt Alkyl benzenesulfonate – ABS) Độc tính của thuốc diệt cỏ Dinitrophenol giảm 5 lần khi pH tăng từ 6,9 đến 8 Điều này có thể giải thích là do pH tăng sẽ làm giảm dạng không liên kết làm cho độc tính của 2- 4 dichlorophenol giảm đi (Lê Huy Bá, 2000)

3 Sơ lƣợc về loại cá thí nghiệm

3.1 Phân loại

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thanh Hương (1993) thì cá rô đồng thuộc:

Giới (egnum): Animalia

Ngành(phylum): Chordata

Lớp (class): Actinopterygii

Bộ(ordo): Cá Vược (Perciformes)

Phân bộ (subordo): Anabantoidei

Họ (familia): Anabantidae

Chi (genus): Anabas

Loài (species): Anabas testudineus

Tên thông thường: Cá rô đồng

3.2 Đặc điểm hình thái

Theo Đoàn Khắc Độ (2008) cá rô đồng có thân hính thon dài, đầu rộng, miệng ngắn và tròn, mắt to Cơ thể có màu xanh từ xám đến nhạt, phần bụng có màu sáng hơn phần lưng, với một chấm màu thẫm ở đuôi và chấm khác ở sau mang Toàn thân phủ một lớp vảy khá cứng Các gờ của vảy và vây có màu sáng Nắp mang cá có hình răng cưa Kích cỡ cá lớn nhất khoảng 25cm

3.3 Phân bố

Cá rô đồng là loại cá nước ngọt phân bố rộng từ Nam Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia đến Thái Lan, Ấn Độ và các quần đảo giữa Ấn

Độ và Úc Châu Chúng sống ở khắp các địa hình: ao, hồ, sông, kênh rạch, ruộng

lúa (www.fishbase.org)

Ở Việt Nam, cá trong các thủy vực nước tỉnh: ao, hồ, đầm lầy, ruộng trủng

ở hai miền Nam và Bắc, miền núi và đồng bằng (Bộ thủy sản, 1996)

Cá rất khoẻ, có cơ quan cung cấp khí trời nằm ở cung mang thứ nhất gọi là

mê lộ nên có thể giúp cho cá sống được môi trường oxy thấp Ngoài ra cá cũng sống ở nước lợ, nhưng sống chính ở các suối nhỏ, ruộng lúa và đầm lầy và ngay cả nước thải từ cống rãnh pH= 3-5 (Ngô Trọng Lư, 2003)

3.4 Sự phát triển của cá rô đồng

Trứng cá rô đồng có màu vàng hoặc trắng, đường kính trứng là 0,8mm, trứng trôi nổi trên mặt nước khoảng 18-24 giờ thì nở nhiệt độ tối ưu cho trứng nở

là 28-29oC (Doolgindachabaporn, 1988) Cá bột mới nở dài 1,9mm Cá bắt đầu ăn động vật và thực vật phù du ở ngày thứ ba sau khi nở Thức ăn sống ban đầu cá ưa

thích nhất là Moina Suốt giai đoạn ấu trùng, từ ngày thứ 3-17 ngày sau khi nở, cá

chỉ ăn thức ăn sống Tuy nhiên, sau một tuần từ lúc biết ăn thức ăn ngoài, cá bột ăn được bột cá và bột cám mịn với tỷ lệ 1:2 Sau 6 tháng nuôi cá có chiều dài 11.6cm

và trọng lượng 34.5g (Doolgindachabaporn, 1994)

3.5 Dinh dƣỡng

Cá rô đồng có ống tiêu hoá ngắn hơn chiều dài thân Theo Phạm Văn Khánh và ctv (2002), cá rô đồng có ruột ngắn, đoạn ruột trước phình to thành dạ dày, tỷ lệ chiều dài ruột trên chiều dài thân trung bình 0,95-0,34cm, chứng tỏ cá có tính ăn thiên về động vật

Tập tính ăn của cá rô thay đổi tuỳ theo giai đoạn phát triển Theo Phạm Văn Khánh và ctv (2002) trong giai đoạn cá bột lên cá hương, cá ăn chủ yếu phù du, động vật và những thức ăn nhân tạo như bột trứng và bột đậu nành Từ tuần lể thứ hai trở đi, cá sử dụng chủ yếu phù du động vật, giun ít tơ, giun nhiều tơ, ấu trùng

Chironomus Từ cở cá giống (cám, ruốc, bột cá,…) Cá cũng ăn nhiều mùn bã hữu

cơ

Phổ thức ăn của cá có 4 loại chính: cá, giáp xác, hạt nhỏ và mùn bã hữu cơ Trong đó: cá, giáp xác xuất hiện với tần số lớn nhất (60-80%) Như vậy có thể cho thấy rằng khi trưởng thành cá ăn tạp thiên về động vật, điều này còn thể hiện rỏ hơn ở chiều dài ruột trên chiều dài chuẩn < 1 Kích thước miệng cá tương quan với kích thước của thức ăn tự nhiên (Nguyễn Thanh Nghị, 2001)

3.6 Sinh trưởng

Cá rô đồng là loài cá có kích thước nhỏ, thể trọng thường gặp 50-100g/con, kích thước lớn nhất của cá có thể đạt tới 25cm (Axelrod et al, 1971; Sterba, 1983; Talwar và Jhingran, 1991)

Tuy cá có tính ăn rộng nhưng là loài cá có tốc độ tăng trưởng chậm hơn so với nhiều loài cá khác (Phạm Văn Khánh và ctv, 2002) Trong tự nhiên tuổi thọ của cá có thể đạt được 5-6 năm Năm đầu tiên, chiều dài của cá 9-10cm, trọng lượng 50-60g đối với cá đực và 50-80g đối với cá cái, năm thứ hai: 12-13cm, năm thứ ba: 14-15cm, năm thứ tư: 16-17cm Trong quần thể cá ở đồng ruộng, cá 2 tuổi,

3 tuổi thường chiếm ưu thế (60-70%), loại cao tuổi rất ít (Bộ Thủy Sản,1996)

3.7 Sinh sản

+ Tuổi thành thục: trong tự nhiên, cá thành thục trong một năm tuổi, chiều

dài khoảng 12cm (Mai Đình Yên, 1983) Khi đến tuổi thành thục cá cái lớn hơn cá đực Tuy nhiên, theo Nguyễn Thành Trung (1998) thì cá thành thục lần đầu sau 8-

10 tháng tuổi Cá đực có kích thước 12.20 ± 0.96cm và tương ứng cá cái là 10.32

± 0.89cm, trọng lượng trung bình 50-60g

+ Mùa vụ sinh sản: trong tự nhiên cá thành thục tập trung vào các tháng 4

trở đi và cao điểm vào giữa mùa mưa (tháng 8) (Phạm Văn Khánh và ctv, 2002)

Bộ Thủy Sản (1996), mùa vụ sinh sản của cá từ tháng 5 đến tháng 10 trong đó, Mai Đình Yên (1983) cho rằng mùa vụ sinh sản của cá rô từ tháng 4 đến tháng 6

Trong điều kiện nuôi vỗ nhân tạo, do chủ động nuôi vỗ sớm nên cá thành thục sớm hơn ngoài tự nhiên 1-3 tháng đồng thời kết thúc mùa sinh sản cũng muộn hơn tới tháng 10-11 (Phạm Văn Khánh và ctv, 2002)

+ Đặc điểm và tập tính sinh sản: cá thường đẻ vào những lúc mưa to, cá bố

mẹ di cư ngược dòng lên ruộng để tìm bãi sinh sản bắt cặp và đẻ trứng (Mai Đình

Yên,1983) Sức sinh sản: Các phase của tế bào trứng trong noãn sào cá rô đồng

không hoàn toàn đồng nhất, đây là đặc điểm của loài cá đẻ nhiều lần trong năm Sức sinh sản của cá dao động từ 2200-28000 trứng/cá cái (Bộ Thủy Sản, 1996)

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được triển khai và thực hiện từ tháng 01 đến tháng 04 năm 2010, tại phòng thí nghiệm Khoa Môi trường và Tài nguyên thiên nhiên thuộc khu II trường Đại học Cần Thơ

2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Bể Composite 600 lít sử dụng để trữ cá và bố trí thí nghiệm theo dõi khả năng phục hồi Enzime trong não cá

Bể kiếng 40 lít bố trí thí nghiệm xác định LC50 – 96 giờ và xác định nhạy cảm của Enzime trong não với thuốc

Máy so màu quang phổ (U2800, Hitachi, Japan) dùng để đo hoạt tính AChE

Máy li tâm (Sigma, Germany) li tâm mẫu sau khi nghiền Máy đo oxy (Hanna HI 9146) để đo DO, máy đo pH (EUTECH Intruments) đo pH và nhiệt kế rượu đo nhiệt độ nhằm xác định các yếu tố môi trường trong thời gian bố trí thí nghiệm

Máy sục khí sử dụng để đảm bảo oxy hòa tan không thiếu hụt cho cá sống

Cân Genius độ chính xác 0.001 gam, 0.0001 gam sử dụng để cân trọng lượng cá và hóa chất

Thước đo 20cm dùng để đo chiều dài cá

Bộ giải phẩu gồm: dao mổ, kim mũi giáo, ben dùng để mổ lấy não cá

Cối nghiền não (Uniform Tencons England) để nghiền não trước khi

ly tâm để phân tích AChE Bình định mức 1000ml, 500ml, 250ml, 100ml, 50ml, 25ml và cốc thủy tinh 500ml, 100ml, 20ml để pha và trử hóa chất

Vợt lưới để vớt cá bố trí và thu cá (lấy não, chết…)

3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Thuốc trừ sâu Bassan 50EC chứa 50% hoạt chất Fenobucarb và thuốc trừ sâu Vibasu 50ND chứa 50% Diazinon do Công ty dịch vụ Bảo vệ thực vật An Giang sản xuất được dùng để xem xét ảnh hưởng của sự phối trộn hai hoạt chất này lên cá rô đồng

Hóa chất NaH2PO4.2H2O (98%) natridihydrogenphosphat dihydrat (Merck)

và NaH2PO4.2H2O (99.5%) dinatriumhydrogenphosphat dihydrat (Merck) dùng để pha dung dịch đệm pH 7.4 (sử dụng để nghiền mẫu, phân tích mẫu và pha dung dịch Acetylcholine iodide)

Hóa chất 5,5-dithio-bis 2nitrobenzoic acid (DTNB, Sigma Aldrich, Đức), Acetylthiocholine iodide (Sigma Aldrich, Đức), sử dụng để đo hoạt tính ChE Hóa chất Aceton (Trung quốc) và nước cất dùng để rửa dụng cụ nghiền mẫu trước khi

sử dụng nghiền mẫu tiếp theo

4 Sinh vật thí nghiệm

Cá rô đồng (Anabas testudineus) cỡ giống có trọng lượng 3,7 ± 0,9g và

chiều dài 5,6 ± 4,4 cm, cá được mua từ trại cá giống quanh Thành phố Cần Thơ về

trử trong bể composite từ 1-2 tuần cho quen với môi trường trước khi bố trí thí nghiệm Cá được sụt khí liên tục, thay nước (nước máy) mỗi ngày và cho ăn thức

ăn dạng viên (thức ăn thương mại) khoảng 3-5% khối lượng cá

5 Phương pháp xác định giá trị LC50 – 96 giờ

5.1 Cách pha dung dịch mẹ

Công thức sau được áp dụng để tính toán nồng độ dung dịch muốn chuẩn bị

V C V

C Trong đó:

C: Nồng độ hoạt chất có trong thuốc

V: Thể tích thuốc

C’: Nồng độ thuốc cần tìm V’: thể tích dung dịch lúc sau Chuẩn bị dung dịch 30% diazinon và 20% fenobucarb bằng cách cách lấy 6 ml dung dịch Vibasu 50ND và 4 ml dung dịch Bassan 50EC Dung dịch này gọi là dung dịch A Lấy 5 ml dung dịch A vào bình định mức 50 ml rồi pha đầy bằng nước cất

Mỗi nghiệm thức được chuẩn bị 20L dung dịch cho vào một bể kiếng, thả

10 con cá rô đồng cỡ và khỏe mạnh Trong thời gian thí nghiệm không cho cá ăn hay thay nứơc

5.3 Xác định giá trị LC50-96 giờ

Dựa vào kết quả thí xác định khoảng gây độc, chọn 6 nồng độ hỗn hợp diazinon + fenobucarb nằm trong khoảng 23,8 – 36,4 ppm và đối chứng để bố trí thí nghiệm theo cách hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Nước trong bể thí nghiệm không được sục khí, không thay nước trong suốt thời gian thí nghiệm nhưng nước thí nghiệm được sục khí trước khi sử dụng, cá không được cho ăn Nhiệt độ, pH, DO được đo hàng ngày vào lúc 6-7 giờ và 14-15 giờ Cá thí nghiệm được theo dõi thường xuyên và ghi nhận cá chết theo thời gian 3, 6, 9,12, 24, 36,

48, 60, 72, 84 và, 96 giờ Cá chết được vớt ra để hạn chế sự thối rửa cá làm giảm oxy hòa tan

6 Phương pháp xác định mức độ nhạy cảm và khả năng phục hồi ChE

6.1 Xác định mức độ nhạy cảm của enzyme cholinesterase trong não cá rô đồng với hỗn hợp diazinon - fenobucarb

Bốn nồng độ hỗn hợp diazinon – fenobucarb tương ứng với 1%, 2%, 10%

và 25% LC50-96 giờ (0,30, 0,60, 3,04 và 7,60 ppm) của hỗn hợp diazinon – fenobucarb với cá rô đồng và đối chứng sẽ được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong

bể kiếng 40 lít (chứa 20 lít nước) với 3 lần lập lại trong 4 ngày Trong thời gian bố trí cá không được cho ăn hay thay nước

Hàng ngày đo nhiệt độ, oxy hòa tan và pH vào lúc 6-7 giờ và 14-15 giờ bằng nhiệt kế, máy đo pH và máy đo oxy hòa tan

Chu kỳ thu mẫu cá để đo enzyme ChE: trước bố trí, 6, 12, 24, 48, 72, 96 giờ sau khí bố trí cá vào thuốc Mỗi lần thu mẫu thu 6 cá cho mỗi nghiệm thức (mỗi bể 2 cá)

6.2 Xác định khả năng phục hồi enzyme cholinesterase trong não cá rô đồng

cỡ giống

Hai nồng độ hỗn hợp diazinon – fenobucarb tương ứng 1% và 10%

LC50-96 giờ (0,30, 3,04 ppm) và đối chứng được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong bể kiếng 40 lít (chứa 20L nước) trong vòng 72 giờ Sau đó cho cá ra bể composite 600L (chứa 100L nước) chuẩn bị sẵn chứa nước máy được sục khí 24h để theo dõi khả năng phục hồi AChE Hệ thống thí nghiệm không được sục khí và thay nước

Cá không cho ăn trong thời gian tiếp xúc thuốc

Chu kỳ thu mẫu: Oxy hòa tan, DO, nhiệt độ được đo hàng ngày Chu kỳ thu mẫu cá: trước khi bố trí, trước khi cho cá ra nước sạch (3 ngày tiêp xúc thuốc), 1,

3, 5, 7 và 14 ngày sau khi cho ra nước sạch Mỗi nghiệm thức thu 6 cá (2 con/bể)

6.3 Cách đo AChE

Cá sau khi thu và giết bằng nước đá, từng não được lấy ra và cho vào từng Eppendorf nhựa 1,5mL riêng biệt đã cân trước trọng lượng Từng Eppendorf đã chứa não được cân lần hai để tính trọng lượng não của từng cá Nghiền riêng biệt từng não cá bằng cối nghiền não được trữ lạnh trong nước đá và cho vào 3ml dung dịch đệm 0.1M phosphate pH 7.4 vào nhằm đồng nhất nồng độ giữa các mẫu nghiền Trộn đều, lấy 1.5mL dung dịch này cho vào ống típ nhựa và ly tâm ở 40

C, tốc độ 2000 vòng/phút trong 20 phút bằng máy ly tâm (Sigma, Germany) Sau khi

ly tâm phần trong phía trên của mẫu ly tâm được xem là nguồn enzyme Hoạt tính của enzyme ChE được đo bằng máy so màu quang phổ (U-2800, HITACHI, Nhật)

ở bước sóng 412nm trong 200 giây (Ellman et al, 1961) Kết quả sẽ được ghi nhận

khi hệ số tương quan (R2) sau mỗi lần đo đạt từ 0,9 trở lên Mỗi mẫu đo được chuẩn bị bằng cách cho 2,65 mL dung dịch 0.1M phosphate pH 7,4 vào cuvet nhựa, tiếp tục cho 0,1mL dung dịch 3mM DTNB và 0.05 mL 10mM acetylthiocholine iodide Sau đó cho 0,2 mL dung dịch mẫu não đã ly tâm vào và bắt đầu đo Mẫu trắng cũng cho hoá chất tương tự như mẫu não nhưng lấy 0,2 mL

dung dịch đệm 0,1M phosphate pH 7,4 thay cho dung dịch mẫu não

7 Tính toán kết quả và xử lý số liệu

v vxP FxLxS

xH

AxC HT

- L: Chiều dài cuvest (cm)

- Sv: thể tích mẫu sau khi ly tâm (ml)

- Pv: trọng lượng mẫu lấy nghiền (g)

7.2 Xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel và SPSS để tổng hợp và xử lý thống kê

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Xác định nồng độ hỗn hợp 30% diazinon và 20% fenobucarb gây chết 50% sinh cá rô đồng cở giống

1.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong nhà che nên nhiệt độ tương đối đồng đều

ở các nghiệm thức Sai khác giữa các ngày cũng không quá 1,5 o

– 29,2 o

- 30oC

(http://Aquaworld.netfirms.com) Ngoài ra, nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến khả năng

hòa tan, làm gia tăng tốc độ phản ứng, tăng hoạt tính của các chất ô nhiễm Thuốc trừ sâu và DDT sẽ tăng độc tính khi nhiệt độ tăng từ 10 - 30 o

o

C nên không l

Trung bình DO ở các bể thí nghiệm trong ngày đầu bố trí có sự dao động nhưng không lớn giữa các nghiệm thức (bảng 4.2) DO buổi sáng ở nghiệm thức đối chứng vào buổi sáng là 6,5±0,2 mg/L, các nghiệm thức còn lại ổn định ở mức 5,2±

chuyển, hô hấp, cùng với quá trình vớt cá chết làm xáo trộn phần nước trong bể thí nghiệm

Sang ngày thứ 2 DO bắt đầu giảm ở các nghiệm thức, kể cả nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức có thuốc Giá trị DO vào buổi sáng cũng thấp hơn

buổi sáng là 2,9±0,1 mg/L và cao nhất là 3,5±0,2 mg/L Buổi chiều DO thấp nhất

là 2,8±0,2 mg/L và cao nhất là 3,5± 4.2)