quy trình định lượng e coli và coliform bằng phương pháp màng petrifilm trong thịt và thủy sản

tìm hiểu về e.coli và coliform, nguồn thực phẩm chứa e.coli, coliform, các bệnh và triệu chứng khi nhiễm khuẩn E.coli, coliform, kĩ thuật màng p, đinh lượng escherichia coli và coliform bằng phương pháp sử dụng đĩa đếm petrifilm trong thịt và thủy sản

Quy trình định lượng E coli và Coliform bằng phương pháp màng

petrifilm trong thịt và thủy sản

Quy trình định lượng E coli và Coliform bằng phương pháp màng

petrifilm trong thịt và thủy sản

NỘI DUNG

Tìm hiểu về E

coli và Coliform

Nguồn thực phẩm

Các bệnh và

Quy trình định lượng

Đặc điểm

Trực khuẩn, Gram(-)

Không sinh bào tử

Hiếu khí hoặc kỵ khí

tùy ý

Lên men lactose và sinh hơi

Tổng quan về Coliforms

Phân loại

Coliforms Coliforms chịu nhiệt Coliforms phân

E.coli

Coliforms

Sơ lược về Escherichia (E.coli)

 Hầu hết có lông roi và có khả năng di động

 Phát triển ở 5-40oC, thích hợp nhất là 37oC.

Tính hóa sinh

 Lên men nhiều loại đường và sinh hơi

 Có khả năng sinh indole

 Không sinh H2S

Betagalactosidase dương tính.

Kháng nguyên K

Kháng nguyên H

Kháng nguyên O

Kháng nguyên

NGUỒN THỰC PHẨM

Nguồn thực phẩm chứa E.coli

• Phân bố rất rộng trong môi trường sống trên Trái Đất, hay có mặt ở thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh trong ruột già của người và động vật máu nóng.

Nguồn thực phẩm chứa Coliform

cải và trong phân động vật.

• Ngoài ra, Coliform còn xuất hiện ở rau ngổ, lá mơ

• Tuy nhiên Coliform không phải là nguyên nhân gây ra bệnh tả Phần lớn Coliform còn có lợi

vì chúng hấp thụ cặn bã và do đó có thể giảm nhu cầu oxygen trong nước, tiêu hủy mùi

• Mặc dù Coliform không gây bệnh nhưng với sự xuất hiện của chúng “có thể” làm nước bị

nhiễm phân người hay động vật

CÁC BỆNH VÀ TRIỆU CHỨNG

Các triệu chứng phổ biến của nhiễm khuẩn E.coli là:

 Tiêu chảy xuất hiện đột ngột đôi khi kèm theo máu trong phân

 Đau bụng âm ỉ hoặc quặn thắt;

 Buồn nôn, ói mửa, chán ăn;

 Mệt mỏi;

 Sốt.

CÁC TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH

Các triệu chứng nhiễm khuẩn E coli nặng bao gồm:

Nước tiểu có máu;

Giảm lượng nước tiểu;

Da nhợt nhạt;

Xuất hiện những vết bầm mặc dù trước đó không có va chạm;

Mất nước

Các chủng E.coli gây bệnh là nguyên nhân gây ra ba loại bệnh nhiễm

trùng ở người:

 Nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI)

 Viêm màng não sơ sinh

 Các bệnh đường ruột (viêm dạ dày ruột).

CÁC TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH

QUY ĐỊNH GIỚI HẠN CHO PHÉP CỦA VI SINH VẬT

( E.COLI)

Các kết quả phân tích E coli dựa trên tiêu chuẩn quyết định 46/2007 của Bộ Y Tế về giới hạn các vi

sinh vật có trong thực phẩm

BẢNG 1: Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt

TT Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn vi sinh vật

(trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)

1 Thịt tươi, đông lạnh

2 Thịt và sản phẩm thịt chế biến không xử lý nhiệt (sử dụng trực tiếp)

3 Thịt và sản phẩm thịt đã qua xử lý nhiệt

BẢNG 2: Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong cá và thuỷ sản

TT Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn vi sinh vật

(trong 1g hoặc 1ml sản phẩm)

1 Cá và thủy sản tươi: cá đông lạnh, cá tươi, các loại

nhuyễn thể, các sản phẩm của cá (phải xử lý nhiệt trước

khi sử dụng)

E coli 102

2 Sản phẩm chế biến từ cá và thủy sản: tôm, cá hấp nóng,

hun khói, chả cá, chả mực, các loại giáp xác, nhuyễn thể

luộc, hấp (dùng trực tiếp, không qua xử lý nhiệt trước khi

sử dụng)

E coli 3

3 Thủy sản khô sơ chế (Phải xử lý nhiệt trước khi sử dụng) E coli 10

KỸ THUẬT MÀNG PETRIFILM

là Petrifilm Lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên để nhỏ vào giữa Petrifilm 1ml dung dịch mẫu rồi đậy lại Một đĩa nhựa được đặt len trên màn bảo vệ để tạo thành một khuôn tròn Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ.

• Petrifilm đã được dung để kiểm tra

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Bước 1: Bảo quản đĩa petrifilm trong

bao ở nhiệt độ 8

Bước 2: Đối với hộp đã mở, có thể gấp một đầu và dán kín lại bằng bằng keo.

Bước 3: Bảo quản ở nhiệt độ 25, không được để ở tủ lạnh khi

hộp đã được mở, đĩa petrifilm phải được sử dụng trong vòng

một tháng sau khi đã mỡ hộp

Bước 4: Chuẩn bị mẫu: Sữa dạng lỏng có thể phân tích trực tiếp, các mẫu thực phẩm khác hoặc các sản phẩm rắn từ sữa phải được pha loãng tối thiểu 1:10, chuyển một lượng mẫu nhất định vào bao

PE vô trùng

Bước 5: Thêm vào mẫu một số lượng dung dịch pha loãng với tỷ lệ tương

ứng, dung dịch pha loãng có thể là đệm phosphate, nước pepton 0,1%, nước

muối ính lý Không sử dụng dung dịch đệm có chứa citrate hay sodium

thiosunfate Đối với mẫu có tính acid, điều chỉnh pH 6,5 – 7,5 bằng dung

dịch NaOH 1N, đối với mẫu có tính kiềm, điều chỉnh pH bằng HCL 1N

Bước 6: Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher)

Bước 7: Đặt đĩa petrifilm lên một mặt phẳng, lậy màng bảo vệ

một cách nhẹ nhàng, tránh chạm vào vùng nuôi cấy

Bước 8: Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch

đã đồng nhất vào giữa đĩa film

Bước 9: Đậy nhẹ nhàng màng bảo vệ,

cẩn thận tránh bọt khí

Bước 10: Dùng miếng dàn bằng nhựa, đặt mặt phẳng lên màng phía trên khu vực đã cấy

Bước 11: Nhẹ nhàng ấn miếng dàn nhựa

để dịch mẫu dàn đều lên mặt film, đừng

đảo hoặc nghiêng miếng dàn nhựa

Bước 12: Nhấc miếng dàn nhựa

ra, chờ ít nhất một phút để môi trường đông cứng

Bước 13: Ủ

Đặt các đĩa vào bao, dán miệng bao Đặt đĩa với màng bảo

vệ hướng lên trên, ủ đĩa ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

tùy theo chỉ tiêu và hướng dẫn của nhà sản xuất

Đếm khuẩn lạc dưới nguồn sáng gián tiếp hoặc dưới nguồn sáng đã khuếch đại (bằng máy đếm khuẩn lạc).

Bước 15: Có thể trích biệt khuẩn lạc để thực hiện các test thử xác định khác.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

NGUYÊN TẮC

Sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh

Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm2

Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lại Đĩa được ủ ấm ở 35°C ± 1°C trong 24 h

± 1 h rối đếm khuẩn lạc

Phần lớn các chủng E coli đều sản sinh glucuronidase, chất này phản

ứng với chất chỉ thị màu để tạo kết tủa màu xanh bao quanh khuẩn lạc

Do vậy, các chủng E.coli dương tính với glucuronidase cho các khuẩn

lạc màu xanh kèm theo bọt khí Các Coliform không phải E.coli là các

khuẩn lạc âm tính với glucuronidase cho màu đỏ kèm theo bọt khí

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Thuốc thử và môi trường

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác

Hòa tan 34 g kali hydro phosphat (KH2PO2) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng

khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1 M và thêm nước đến vạch Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng

nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 phút ở 121°C

Nước dùng để pha loãng (dung dịch nước đệm phosphat)

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

Chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (violet red bile nutrients).

Chất tạo đông tan được trong nước

Thiết bị và dụng cụ

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Đĩa đếm E.coli/Coliform Petrifilm

Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím, chất tạo đông tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium

clorua và chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-b-D-glucuronid, có thể đếm Coliform và E.coli

trên cùng một đĩa Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng 20 ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm2 trên màng nền.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Thiết bị và dụng cụ

Dụng cụ dàn mẫu bằng chất dẻo (gồm một mặt có gờ và một mặt láng), được cung cấp cùng với đĩa đếm, để dàn đều huyền

phù lên khắp vùng sinh trưởng của đĩa

Pipet, đã được hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật hoặc pipet dạng xyranh có thể phân phối 1,0 ml, chia vạch đến 0,1

ml Có thể dùng pipet tự động

Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại và độ nhìn thấy tương đương3).

Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.

Thiết bị trộn tốc độ cao, có bình chứa vô trùng.

Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 35°C ± 1°C.

Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121°C.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

LẤY MẪU

Việc lấy mẫu phải đúng nguyên tắc.

Phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Theo TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003) hoặc TCVN 6507-3:2005 (ISO 6887-3:2003).

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo bằng cách dùng 90 ml nước dùng để pha loãng (4.1) với 10 ml dung dịch pha loãng trước

đó, trừ khi có quy định khác Lắc các dung dịch 25 lần với biên độ dao động 30 cm trong thời gian 7 s.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Đếm E coli

Đặt đĩa đếm E.coli/Coliform PetrifilmTM lên bề mặt phẳng Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử vào

chính giữa màng nền Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy Dàn đều huyền phù trên diện tích 20 cm2 bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới)

Để yên đĩa trong ít nhất 1 min cho gel đông đặc lại Đặt các đĩa vào tủ ấm (5.7) theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35°C ± 1 oC trong 24 ± 1 h Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng - 15 oC đến 7 ngày, nếu cần.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Đếm E coli

Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị

đếm khuẩn lạc Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận

tiện cho việc đếm Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh kèm theo

một hoặc nhiều bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các

đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc

Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới hạn

của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể

được tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên

đĩa.

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Đếm Coliform

Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm

khuẩn lạc Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho

việc đếm Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu đỏ kèm theo một hoặc nhiều

bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 15

khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc

Các khuẩn lạc có màu đỏ nhưng không có bọt khí không được coi là

Coliform Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới

hạn của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể được

tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Tính và hiển thị kết quả

Nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa

kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng

Nếu không có đĩa nào có số đếm lớn hơn 10 khuẩn lạc với màu đặc trưng kèm bọt khí trở lên (màu đỏ đối với khuẩn lạc

Coliform, màu xanh đối với khuẩn lạc E coli) thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng

với dung dịch ít pha loãng nhất)

ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI VÀ COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM TRONG

THỊT VÀ THỦY SẢN

Tính và hiển thị kết quả

Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một

hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích

vùng sinh trưởng khoảng 20 cm2) Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.

Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là "quá nhiều để đếm"