Đánh giá ảnh hưởng của hệ phân tán rắn đa cấu tử tới khả năng khuếch tán và sinh khả dụng của itraconazol

Xây dựng và thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng nồng độ itraconazol và hydroxyitraconazol trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật LC- MS/MS, ứng dụng đánh giá sinh khả dụng

DỤNG CỦA ITRACONAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS TS Nguyễn

Thạch Tùng, TS Trần Cao Sơn, DS Bùi Quang Đông đã luôn động viên, hướng dẫn,

giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn

Bào chế, các anh chị đang công tác tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc

gia đã hết lòng quan tâm, hỗ trợ và tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà

Nội đã tâm huyết truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại

trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn các anh, chị, em,

các bạn đã luôn ở bên ủng hộ, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong cuộc sống và học tập,

cho em thêm động lực để học tập, rèn luyện bản thân

Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Sinh viên

Phạm Thế Anh

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1Tổng quan về itraconazol 2

1.1.1 Công thức cấu tạo 2

1.1.2 Tính chất lý hóa 2

1.1.3 Đặc điểm dược động học 2

1.1.4 Tác dụng dược lý, chỉ định 3

1.1.5 Một số chế phẩm trên thị trường 4

1.2 Một số phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ phân tán rắn 4

1.2.1 Phương pháp thử hòa tan 4

1.2.2 Phương pháp thử khuếch tán 5

1.3 Khái niệm về hệ phân tán rắn 6

1.4Các phương pháp xử lý mẫu trong phân tích huyết tương 7

1.4.1 Mục đích của xử lý mẫu phân tích dịch sinh học 7

1.4.2 Một số loại dịch sinh học 8

1.4.3 Các phương pháp xử lý mẫu trong phân tích huyết tương 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp bào chế 19

2.3.2 Phương pháp đánh giá 20

2.3.3 Công cụ xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1Nghiên cứu phương pháp định lượng 27

3.1.1 Phương pháp định lượng itraconazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 27

3.1.2 Phương pháp định lượng itraconazol trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS 28

3.2 Ảnh hưởng của các thành phần trong hệ phân tán rắn tới khả năng khuếch tán của dược chất 34

3.2.1 Ảnh hưởng của một polyme 35

3.2.3 Ảnh hưởng của hỗn hợp 2 polyme 37

3.2.4 Ảnh hưởng của 2 tá dược acid: acid fumaric và maleic 39

3.3 Kết quả thử hòa tan chuyển pH 42

3.4 Kết quả theo dõi độ ổn định vật lý của các hệ phân tán rắn bằng nhiễu xạ tia X 43

3.4.1 Ảnh hưởng của polyme 43

3.4.2 Ảnh hưởng của tá dược acid 43

3.5 Kết quả đánh giá sinh khả dụng trên động vật thí nghiệm 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

Kết luận 48

Đề xuất 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CR Controlled release - Giải phóng kiểm soát

DĐVN Dược điển Việt Nam

HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose

HPMCP Hydroxy propyl methyl cellulose phthalat

HPTR Hệ phân tán rắn

ITZ Itraconazol

OH-ITZ Hydroxyitraconazol

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TLTK Tài liệu tham khảo

XRD Nhiễu xạ tia X

SE Standard error – Sai số chuẩn

AUC Diện tích dưới đường cong

Tmax Thời điểm đạt nồng độ thuốc tối đa

Cmax Nồng độ thuốc tối đa

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất làm nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu 18

Bảng 2.3 Chương trình pha động trong LC-MS/MS 25

Bảng 3.1 Điều kiện kiểm soát đa phản ứng trong phân tích ITZ và OH-ITZ 28

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phương pháp chiết 29

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nội chuẩn 30

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát điều kiện kiềm hóa 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát muối chiết 31

Bảng 3.6 Thông số dược động học của ITZ và OH-ITZ trên mô hình thỏ 46

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử của itraconazol 2Hình 1.2 Nồng độ felodipin để đạt thông lượng tối đa khi có mặt Vit E TPGS 0,04% 6Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giữa nồng độ và diện tích pic của ITZ bằng phương pháp HPLC 27Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ dung dịch chuẩn ITZ với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn bằng phương pháp LC – MS/MS 33Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ dung dịch chuẩn OH-ITZ với tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn trên diện tích pic nội chuẩn bằng phương pháp LC – MS/MS 33Hình 3.4 Kết quả thử khuếch tán của ITZ trong HPTR 2 thành phần và ITZ nguyên liệu trong môi trường pH 1,2 35Hình 3.5 Kết quả thử khuếch tán của ITZ trong HPTR 2 thành phần và ITZ nguyên liệu trong môi trường pH 6,8 35Hình 3.6 Kết quả thử hòa tan dược chất của HPTR 2 thành phần trong môi trường pH 1,2 36Hình 3.7 Kết quả thử khuếch tán của ITZ trong HPTR 2 thành phần, 3 thành phần và ITZ nguyên liệu trong môi trường pH 1,2 37Hình 3.8 Kết quả thử khuếch tán của ITZ trong HPTR 2 thành phần, 3 thành phần và ITZ nguyên liệu trong môi trường pH 6,8 38Hình 3.9 Kết quả thử hòa tan của dược chất từ HPTR 2 và 3 thành phần trong môi trường

pH 1,2 38Hình 3.10 Kết quả thử khuếch tán của ITZ trong HPTR 3 thành phần ITZ-HPMC-HPMCP (1,5:3:1) trong môi trường pH 1,2 có và không có mặt của natri lauryl sulfat nồng độ 0,5% 39Hình 3.11 Kết quả thử khuếch tán của HPTR 3 thành phần F3, HPTR 4 thành phần F4, mẫu trộn vật lý F3 với acid, ITZ nguyên liệu và chế phẩm đối chiếu trong môi trường pH 1,2 40Hình 3.12 Kết quả thử khuếch tán của HPTR 3 thành phần F3, HPTR 4 thành phần F4, mẫu trộn vật lý F3 với acid, ITZ nguyên liệu và chế phẩm đối chiếu trong môi trường pH 6,8 41

Hình 3.13 Kết quả thử hòa tan chuyển pH 42Hình 3.14: Kết quả X-ray của: A (Itraconazol nguyên liệu); B (F4 sau 1 tháng); C (F4 mới bào chế) 44Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ ITZ trong huyết tương thỏ theo thời gian của chế phẩm đối chiếu và mẫu trộn vật lý HPTR 3 thành phần với acid 45Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ OH-ITZ trong huyết tương thỏ theo thời gian của chế phẩm đối chiếu và mẫu trộn vật lý HPTR 3 thành phần với acid 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Itraconazol là một thuốc chống nấm phổ rộng nhóm triazol được sử dụng để điều trị nhiều loại nấm xâm lấn và nấm cơ hội [34] Itraconazol có tính base yếu, độ tan kém nên khả năng hấp thu phụ thuộc nhiều vào pH đường tiêu hóa và sinh khả dụng thay đổi lớn giữa các cá thể Do đó, nhóm nghiên cứu sử dụng hệ phân tán rắn để cải thiện các đặc điểm này của itraconazol Trong hai nghiên cứu trước [3], [5], thành phần của hệ phân tán rắn đã được lựa chọn như sau: hỗn hợp 2 polyme HPMC E606 – HPMCP 55 (3:1) để đưa vào hệ phân tán rắn chứa itraconazol làm chất mang đồng thời cũng đã lựa chọn được hỗn hợp hai

tá dược acid là acid maleic – acid fumaric (2:1) để tăng khả năng hòa tan của dược chất Tuy nhiên còn tồn tại một số vấn đề là chưa đánh giá được khả năng khuếch tán, độ ổn định

và sinh khả dụng của hệ phân tán rắn để thấy được các ưu điểm của hệ

Để tiếp tục hoàn thiện bào chế HPTR chứa itraconazol, nghiên cứu thực hiện đề tài

khóa luận mang tên: “Đánh giá ảnh hưởng của hệ phân tán rắn đa cấu tử tới khả năng

khuếch tán và hấp thu của itraconazol” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Đánh giá ảnh hưởng của các thành phần trong hệ phân tán rắn tới khả năng khuếch tán và độ ổn định vật lý của itraconazol

2 Xây dựng và thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng nồng độ itraconazol và hydroxyitraconazol trong huyết tương thỏ bằng kỹ thuật LC- MS/MS, ứng dụng đánh giá sinh khả dụng của các chế phẩm chứa itraconazol

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về itraconazol

1.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo phân tử của itraconazol

‐ Công thức phân tử: C35H38Cl2N8O4

‐ Khối lượng phân tử: 705,64 g/mol

‐ Tên khoa học: 1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin-1-yl]phenyl]-2-[(1RS)-1-methylpropyl]-2,4-

‐ Độ tan: Dược chất thực tế không tan trong nước (khoảng 1 ng/ml ở pH 7, khoảng 5 µg/ml

ở pH 1) [31], [35]; rất khó tan trong alcol và tan tốt trong dicloromethan [7]

1.1.3 Đặc điểm dược động học

Itraconazol là dược chất thuộc nhóm II trong hệ thống phân loại sinh dược học (có độ tan trong nước kém và tính thấm tốt qua màng sinh học), do đó còn hạn chế về khả năng hấp thu khi dùng đường uống SKD tương đối đường uống trên người của dạng viên nang

và dung dịch uống lần lượt chỉ khoảng 30% và 55% [27], [40] Hơn nữa, nhiều nghiên cứu

đã chứng minh DC này có sự dao động rất lớn về SKD đường uống giữa các cá thể [22], [28], [43]

Môi trường acid dịch vị làm tăng khả năng hòa tan và tối ưu hóa sự hấp thu của ITZ [1], [43] Do đó, sự hấp thu dược chất này bị giảm khi sử dụng đồng thời với các thuốc gây

giảm độ acid dịch vị, như các thuốc ức chế bơm proton hoặc các thuốc kháng thụ thể H2 [20] Sau khi uống các liều 50, 100 và 200 mg, nồng độ đỉnh trong huyết tương của itraconazol đạt được lần lượt là 45, 132 và 289 ng/ml, trong khoảng 2 – 5 giờ

Itraconazol có thể tích phân bố lớn (10,7 L/kg), liên kết 99,8% với protein huyết tương

và tập trung chủ yếu vào các mô và tổ chức trong cơ thể

Itraconazol được chuyển hóa chủ yếu bởi hệ CYP3A4 ở gan, tạo ra hơn 30 chất chuyển hóa Trong đó, hydroxyitraconazol (OH - ITZ) là chất chuyển hóa chính, cũng có hoạt tính kháng nấm tương đương ITZ [1], [23] Trong một số nghiên cứu, chất chuyển hóa chính là hydroxyitraconazol với nồng độ trong huyết tương cao hơn itraconazol [19], hoặc gấp khoảng 2 lần so với ITZ [27] Vậy nên khi đánh giá sinh khả dụng của itraconazol, cần định lượng cả nồng độ chất chuyển hóa chủ động OH-ITZ để có được nồng độ hoạt chất toàn phần

Thời gian bán thải của itraconazol khi dùng một liều đơn đường uống ở người là 15 –

24 giờ [11], [43] Khoảng 3 – 18% liều uống được bài xuất qua phân dưới dạng không biến đổi Khoảng 40% liều được bài xuất qua nước tiểu ở dạng không còn hoạt tính [1], [23]

1.1.4 Tác dụng dược lý, chỉ định

1.1.4.1 Tác dụng dược lý

Itraconazol là tác nhân chống nấm nhóm triazol, có phổ hoạt tính rộng trên nhiều

chủng nấm như Aspergillus, Coccidioides, Cryptococcus, Candida, Histoplasma,

Blastomyces, Sporotrichosis… Itraconzol ức chế các enzym cytochrom P450 tham gia quá

trình sinh tổng hợp ergosterol - một thành phần thiết yếu của màng tế bào nấm, từ đó làm ảnh hưởng đến sự sống và phát triển của tế bào nấm [1], [23], [36]

1.1.4.2 Chỉ định

Itraconazol được chỉ định trong điều trị các trường hợp nhiễm nấm ở cả bệnh nhân

suy giảm miễn dịch và bệnh nhân không suy giảm miễn dịch sau đây [1], [23]:

‐ Bệnh nấm Candida ở miệng, thực quản

‐ Bệnh nấm Candida ở âm đạo, âm hộ

‐ Bệnh nấm da nhạy cảm với itraconazol (như bệnh do nhóm dermatophytes)

‐ Bệnh nấm móng chân, móng tay (tinea unguium)

‐ Bệnh nấm Blastomyces hoặc Histoplasma phổi và ngoài phổi

‐ Bệnh nấm Aspergillus phổi và ngoài phổi ở bệnh nhân không dung nạp hoặc kháng với

amphotericin B

‐ Lang ben

‐ Một số bệnh nấm khác

1.1.5 Một số chế phẩm trên thị trường

‐ Viên nang cứng: Sporanox® 100 mg; Sporal 100 mg; Orungal 100 mg

‐ Dung dịch uống: Sporanox® 10 mg/ml

‐ Dạng tiêm tĩnh mạch: Sporanox® IV 10 mg/ml

1.2 Một số phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ hệ phân tán rắn

1.2.1 Phương pháp thử hòa tan

1.2.1.1 Mục đích

Phương pháp này nhằm xác định sự phù hợp của chế phẩm đối với yêu cầu về độ hòa tan dược chất của các dạng thuốc rắn phân liều dùng đường uống Bên cạnh đó, thí nghiệm thử hòa tan còn được sử dụng để đánh giá chất lượng các lô và định hướng nghiên cứu công thức mới [9]

Bằng thí nghiệm thử hòa tan, nghiên cứu [24] đã chỉ ra:

- Hệ phân tán rắn itraconazol với chất mang là các polyme thân nước phụ thuộc pH như AEA và Eudragit E100 làm tăng độ tan của dược chất so với khi dùng các polyme thân nước không phụ thuộc pH như PEG 2000, PVP, Poloxamer 188

- Các viên nén chứa hệ phân tán rắn bào chế bằng phương pháp phun sấy cải thiện khả năng hòa tan của itraconazol tốt hơn chế phẩm đối chiếu

1.2.2 Phương pháp thử khuếch tán

Hệ phân tán rắn vô định hình có ưu điểm là độ tan cao hơn và khi hòa tan tạo dung dịch quá bão hòa Theo quan điểm nhiệt động học, sự tăng nồng độ dược chất của dung dịch quá bão hòa về cơ bản khác với sự tăng nồng độ của dung dịch nhờ các chất làm tăng

độ tan (solubilizing additives) như chất diện hoạt [32] Đặc biệt, hóa thế và hoạt động nhiệt động của chất tan trong dung dịch quá bão hòa cao hơn so với trong dung dịch bão hòa thông thường: dung dịch quá bão hòa sẽ làm tăng thông lượng qua màng [32] Vì thế, phương pháp thử khuếch tán được sử dụng để đánh giá thông lượng của dược chất trong hệ phân tán rắn

- Nhiệt độ được duy trì bằng một bể điều nhiệt

- Ngăn cho và ngăn nhận được khuấy ở tốc độ thích hợp bằng khuấy từ

Cách tiến hành:

- Lắp đặt thiết bị và gắn màng vào thiết bị

- Cho môi trường vào ngăn cho và ngăn nhận, cân bằng nhiệt độ môi trường

- Cho mẫu vào thiết bị, vận hành thiết bị ở tốc độ khuấy quy định

- Tại các thời điểm, lấy thể tích mẫu xác định để định lượng nồng độ dược chất

1.2.2.3 Kết quả đạt được

Trong nghiên cứu của Stewart Aaron và cộng sự, thông lượng khuếch tán (flux) in

vitro của itraconazol trong môi trường pH 6,5 chứa 2% muối mật có xu hướng gần với sự

hấp thu thuốc ở chuột (thông lượng khuếch tán gấp khoảng 2 lần so với nồng độ thuốc trong máu) Khi thay đổi nồng độ muối mật phù hợp, phương pháp có tiềm năng dự đoán kết quả

in vivo chính xác hơn [37]

Nghiên cứu của Raina và cộng sự về ảnh hưởng của các tá dược làm tăng độ tan tới thông lượng của hệ phân tán rắn quá bão hòa felodipin (hình 1.2): thông lượng tối đa đạt được khi nồng độ dược chất đạt nồng độ tách pha lỏng-lỏng (khoảng 50 µg/ml); sự xuất hiện của các tá dược như Vit E TPGS có thể ảnh hưởng tới thông lượng tùy thuộc vào nồng

độ và mức độ ảnh hưởng của nó tới sự quá bão hòa của thuốc Nồng độ Vit E TPGS khi cao hơn nồng độ micell tới hạn, sẽ làm tăng độ tan tinh thể của felodipin và làm giảm đáng

kể thông lượng Ngược lại, khi nồng độ nhỏ hơn nhiều so với nồng độ micell tới hạn thì thông lượng không đổi so với khi không có tá dược tăng độ tan Nói chung, sự có mặt của các tá dược làm tăng độ tan tinh thể cân bằng của thuốc sẽ làm giảm đáng kể thông lượng Tuy nhiên, nếu sự có mặt này làm thay đổi ít hoặc không thay đổi độ tan của thuốc thì thông lượng vẫn được duy trì như tại nồng độ tách pha lỏng-lỏng Khi thêm felodinpin ở ngăn cho để làm tăng thông lượng lại như cũ thì nồng độ bị đẩy lên rất cao (175 µg/ml) mới lập lại được thông lượng như khi không có Vit E TPGS và hệ ở nồng độ tách pha lỏng-lỏng Ngoài ra, các chất diện hoạt như Cremophor RH40, Cremophor EL, Tween 20 cũng làm giảm thông lượng của felodipin và nifedipin Điều này không thể thấy được bằng các thí nghiệm hòa tan thông thường [32]

Hình 1.2 Nồng độ felodipin để đạt thông lượng tối đa khi có mặt Vit E TPGS 0,04%

1.3 Khái niệm về hệ phân tán rắn

Hệ phân tán rắn (HPTR) là hệ thống trong đó một hay nhiều dược chất được phân tán hoặc hòa tan trong một chất mang trơ hay cốt ở trạng thái rắn, được bào chế bằng phương pháp đun chảy, dung môi hay kết hợp cả 2 phương pháp

HPTR cải thiện độ tan của dược chất đồng thời cũng tăng diện tích tiếp xúc của dược chất với môi trường khi chất mang được hòa tan Do vật hệ phân tán rắn làm tăng khả năng cũng như tốc độ giải phóng dược chất, qua đó làm tăng sinh khả dụng của dược chất

Cơ chế làm tăng độ hòa tan của dược chất:

- Giảm kích thước tiểu phân dược chất, có thể dược chất ở dạng phân tử nếu hệ

có cấu trúc dung dịch rắn

- Làm thay đổi trạng thái kết tinh của dược chất hoặc dược chất từ trạng thái kết tinh chuyển sang dạng vô định hình dể tan hơn Khi tồn tại ở dạng vô định hình, dược chất dễ bị tái kết tinh trong quá trình bảo quản

- Làm thay đổi tính thấm của dược chất với môi trường hòa tan do sự có mặt của chất mang thân nước, đặc biệt khi có chất diện hoạt

- Làm giảm năng lượng hòa tan của dược chất trong quá trình hòa tan

- Tạo phức dễ tan

1.4 Các phương pháp xử lý mẫu trong phân tích huyết tương

1.4.1 Mục đích của xử lý mẫu phân tích dịch sinh học

Phân tích thuốc trong dịch sinh học cung cấp những thông tin quan trọng cần thiết để đánh giá tính an toàn, hiệu quả và cơ chế tác dụng của thuốc [42] Một số ứng dụng có thể

kể đến của phân tích thuốc trong dịch sinh học như:

- Nghiên cứu phát triển thuốc mới: trong tất cả các giai đoạn đều cần các phép phân tích để đánh giá chất lượng của sản phẩm [42]

- Quản lý chất lượng thuốc: đánh giá tương đương sinh học

- Theo dõi thuốc trong điều trị: các phép phân tích có thể sử dụng để theo dõi quá trình điều trị bằng cách định lượng nồng độ thuốc trong cơ thể [38]

- Theo dõi và xử lý độc tính của thuốc: các trường hợp quá liều thuốc, ưu tiên hàng đầu là xác định mức liều gây quá liều để điều chỉnh và xây dựng phác đồ điều trị hợp lý

Sự cần thiết của việc phân tích được thể hiện khi bệnh nhân hôn mê, không thể kể cho bác

sĩ về liều dùng, tình trạng hiện tại và khi không có bằng chứng để xác định ngay nguyên nhân gây ra tình trạng bệnh lý Trong các trường hợp đó, mức nồng độ của thuốc hoặc chất chuyển hóa ở trong máu và hiểu biết về đặc điểm thải trừ của thuốc trong cơ thể người có

thể giúp người điều trị quyết định có nên loại bỏ thuốc hay tuân theo cơ chế thải trừ của cơ thể [38]

Ngày nay với các kỹ thuật phân tích hiện đại với độ nhạy được sử dụng rộng rãi cho phân tích thuốc trong dịch sinh học, một yêu cầu đặt ra là cần xử lý mẫu sạch trước khi phân tích Việc xử lý mẫu cần phải loại bỏ những thành phần nội sinh gây nhiễu Ví dụ, loại bỏ các phân tử lớn như protein huyết tương để loại bỏ ảnh hưởng xấu tới thiết bị phân tích và tăng tính ổn định cho phép phân tích [26]

1.4.2 Một số loại dịch sinh học

Dịch sinh học là là bất kỳ chất lỏng nào được sản xuất bởi một sinh vật sống Trong

cơ thể người, dịch sinh học bao gồm: máu, nước tiểu, tinh dịch, dịch tiết âm đạo, dịch não tủy, hoạt dịch, dịch màng phổi, dịch màng tim, dịch màng bụng, nước ối, dịch mũi, sữa mẹ, nước bọt Các dịch này thường chứa nhiều các thành phần khác nhau vậy nên vấn đề đầu tiên trong phân tích các dịch sinh học là tách thuốc ra khỏi các vật liệu nội sinh nhiều nhất

có thể Phương pháp xử lý mẫu khi phân tích mỗi loại dịch sinh học cần được xây dựng dựa trên đặc điểm và thành phần của chúng [38]

1.4.2.1 Máu

Máu là dịch sinh học phổ biến nhất Máu được cấu tạo bởi một số loại tế bào gồm thành phần hữu hình (40%, trong đó hồng cầu chiếm 96%, bạch cầu 3% và tiểu cầu 1%) và huyết tương (60%) Máu người có độ pH 7,40 ± 0,05 Thành phần chủ yếu của máu là hồng cầu có thể được tách ra khỏi huyết tương đơn giản bằng cách ly tâm, tuy nhiên nếu không

xử lý cần thận có thể dẫn tới vỡ hồng cầu và giải phóng nhiều thành phần không mong muốn (ví dụ: giải phóng ion sắt tạo phức chelat với chất phân tích) Một số nguyên nhân gây vỡ hồng cầu có thể kể đến là nhiệt độ, tác động cơ học nhưng nguyên nhân phổ biến nhất là tế bào bị nhược trương do làm thay đổi lực liên kết xung quanh khi thêm nước Máu thường không dùng để chiết làm mẫu phân tích, thay vào đó là huyết tương và huyết thanh [38] Trong một số trường hợp, đích tác dụng của thuốc ở trong hồng cầu như cloroquin, cần xác định nồng độ của chất phân tích trong máu toàn phần [25]

1.4.2.2 Huyết tương và huyết thanh

Huyết tương là phần lỏng của máu, là dịch trong, hơi vàng, vị hơi mặn và có mùi đặc biệt của acid béo Thành phần bao gồm 92% nước, còn lại là các chất hữu cơ, vô cơ gồm:

protein huyết tương, ure, acid amin, acid uric, creatinin, bilirubin, amoniac, glucose, lipid, cholesterol, phospholipid, các ion Ca2+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, Na, HCO3-, SO42-… Các protein trong huyết tương bao gồm: Albumin, Globulin, Fibrinogen [6]

Huyết thanh là huyết tương loại fibrinogen, là dịch thu được khi ly tâm máu đã đông Đặc điểm chính của huyết tương và huyết thanh là chứa 1 lượng lớn protein Các protein này có sự khác biệt rõ ràng về cả vật lý và hóa học với các phân tử thuốc nhỏ Các phân tử thuốc tự do rất quan trọng vì đây là dạng có hoạt tính chủ yếu, nhưng đa số lượng thuốc tồn tại ở dạng liên kết với protein Cần xác định lượng thuốc toàn phần trong huyết tương và huyết thanh vì vậy vấn đề đặt ra là phá vỡ liên kết của thuốc và protein rồi chiết lượng thuốc toàn phần để phân tích [38]

1.4.2.3 Nước tiểu

Thành phần nước tiểu người chứa 91-96% nước với các chất tan như ure, creatinin, acid uric và vết của enzyme, carbohydrat, hormon, acid béo, chất màu, chất nhầy, các ion natri, kali, calci, clorid, magnesi, amoni, sulfat, phosphat [33] Nước tiểu có pH khoảng từ 5,5-7 [38]

Không giống như huyết tương và huyết thanh, nước tiểu thường không chứa protein

và lipid nên ta có thể chiết trực tiếp bằng dung môi hữu cơ Nước tiểu có sự thay đổi lớn trong thành phần, điều này thường quan sát thấy ở sự khác biệt giữa mẫu nước tiểu lấy buổi sáng sau 1 đêm và mẫu nước tiểu được thu trong ngày Nồng độ các thành phần trong nước tiểu phụ thuộc lớn vào chế độ ăn

Các thành phần thông thường của nước tiểu thường tan trong nước, còn các dược chất thì thường thân lipid, nên ta có thể chiết chúng ra một cách dễ dàng bằng dung môi thích hợp

1.4.3 Các phương pháp xử lý mẫu trong phân tích huyết tương

Dịch sinh học không phải là 1 hỗn hợp đơn giản, nó chứa nhiều thành phần khác nhau, các thành phần này có thể phản ứng với nhau và góp phần gây ra nhiễu khi phân tích bằng cách tăng mức độ phản ứng, che dấu, thay đổi những giá trị thực tế bằng cách giáng hóa dưới tác dụng của pH, enzyme,…[38] Do đó, cần lựa chọn phương pháp thích hợp để xử

lý từng loại mẫu

Cơ sở để lựa chọn các phương pháp xử lý mẫu dựa trên các yếu tố:

‐ Loại mẫu và nền của mẫu

‐ Bản chất và tính chất của chất phân tích

‐ Trạng thái tồn tại và cấu trúc vật lý, hóa học của chất phân tích trong mẫu

‐ Các phương pháp phân tích có thể được sử dụng

‐ Nồng độ chất phân tích trong mẫu

Dưới đây là một số phương pháp phân tích hay được sử dụng trong phân tích huyết tương

1.4.3.1 Phương pháp tủa protein

- Loại bỏ protein đã biến tính/kết tủa Thông thường, người ta hay sử dụng phương pháp lọc hoặc ly tâm

Một số phương pháp tủa protein được trình bày ở Phụ lục 2

Có nhiều nhóm chất được sử dụng để biến tính và kết tủa protein Các chất có tính kiềm có thể làm protein biến tính và kết tủa nhưng thường không được sử dụng vì chúng tạo dạng xà phòng, khó khăn trong quá trình chiết Các dung dịch acid hay được sử dụng trong tủa protein như là acid trichloroacetic, acid perchloric, acid tungstic Tuy nhiên những acid này có thể có tác dụng bất lợi lên phân tử dược chất, nên các phương pháp sử dụng acid cần được thử trước với chất chuẩn trước khi được sử dụng làm thuốc thử Đối với các dược chất kém bền ở pH thấp, có thể gây biến tính và tủa protein bằng dung môi hữu cơ như là ethanol, methanol, ACN

Trong nghiên cứu [12] Beste và cộng sự đã sử dụng phương pháp tủa protein để chiết

4 triazol: itraconazol, fluconazol, voriconazol, posaconazol từ huyết tương như sau: Hút

100 µl huyết tương cho vào ống ly tâm polypropylen Sau đó protein được kết tủa bằng

cách cho 200 µl hỗn hợp 2 dung dịch: dung dịch ketoconazol 500 ng/ml (ketoconazol là nội chuẩn) và dung dịch ZnSO4 0.2M với tỷ lệ thể tích là 80:20 Mẫu được trộn mạnh và ly tâm ở 14000g trong 10 phút Lấy 150 µl lớp dịch trên được phân tích trên thiết bị LC-MS/MS

Kết quả thu được: Độ thu hồi của phương pháp với fluconazol, itraconazol, posaconazol, voriconazol lần lượt là 61,4 ± 5,5 %; 64,7 ± 2,7 %; 65,3 ± 1,5 %; 159,6 ± 1,1

%

c, Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm:

- Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện

- Có thể áp dụng cho nhiều chất phân tích

- Có thể biến tính protein bằng các enzyme phân giải protein, đây là một phương pháp

để tránh những tác động của hóa chất lên chất phân tích

- Phương pháp tủa protein cho phép xử lý nhanh, nhưng lại có độ nhạy thấp với mẫu

có nồng độ từ 25-100 ng/ml, mức nồng độ này hay gặp trong nghiên cứu về dược động học và đánh giá sinh khả dụng của thuốc [13]

1.4.3.2 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng (LLE)

a, Nguyên lý

Chiết lỏng lỏng là kỹ thuật để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất Thông thường, một pha là dung dịch nước, một pha là dung môi hữu cơ không trộn lẫn với nước [2] Yếu tố quyết định tỷ lệ chiết là hệ số phân bố của chất phân tích trong hai pha và điều kiện lắc chiết

Hệ số phân bố D= 𝐶𝑆

𝐶 𝑁 trong đó CS, CN là nồng độ của chất phân tích trong dung môi hữu cơ và nước ở trạng thái cân bằng [2] Hệ số này đặc trưng cho một chất phân tích và

một cặp dung môi A, B ở một nhiệt độ xác định và trong các điều kiện lý tưởng D càng lớn, quá trình chiết càng hiệu quả

Đối với các trường hợp cụ thể: chất phân tích là acid yếu/ base yếu ta có:

Với acid yếu, khi chiết sẽ tồn tại 2 cân bằng:

𝐻𝐴 ⇆ 𝐻++ 𝐴−

𝐻𝐴𝑁 ⇆ 𝐻𝐴𝑆Với base yếu, khi chiết sẽ tồn tại 2 cân bằng:

𝑉 𝑆 , d = 𝐷𝐻𝐴

1 + 𝑘𝑎⁄[𝐻+] đối với acid yếu, d = 𝐷𝐵

1 + [𝐻+]𝑘

𝑎

⁄ đối với base yếu

VN, VS lần lượt là thể tích pha nước, pha dung môi hữu cơ

ka là hằng số phân ly của chất phân tích

b, Cách tiến hành

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng được chia làm 3 loại [2]: Chiết gián đoạn, chiết liên tục và chiết ngược dòng

- Chiết gián đoạn: chiết bằng bình chiết một lần hay nhiều lần lặp lại một mẫu

- Chiết liên tục: Dung môi liên tục đi qua mẫu chiết Dụng cụ hay được sử dụng trong phòng thí nghiệm là bình Lormand

- Chiết ngược dòng: Dung môi và mẫu chiết đi ngược chiều nhau Trong quá trình chiết hai pha liên tục tiếp xúc với nhau, pha trộn vào nhau và di chuyển ngược chiều nhau Chiết ngược dòng thường được áp dụng trong công nghiệp

Trong nghiên cứu [16], Choi và cộng sự sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng để chiết ITZ từ trong huyết tương Quy trình xử lý mẫu được tiến hành như sau: hút 20 µl dung dịch nội chuẩn làm việc loratadin (200 ng/ml) vào 0,5 ml huyết tương và trộn đều bằng cách lắc vortex Kiềm hóa huyết tương bằng 50 µl dung dịch Na2CO3 1 M Chiết ITZ và loratadin với 1200 µl hỗn hợp heptan và isoamylalcohol với tỷ lệ thể tích (98:2) bằng cách lắc 5 phút

Pha dung môi hữu cơ và pha nước được phân tách bằng cách ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Hút lớp hữu cơ đem đi thổi khô và hòa tan lại bằng 100 µl pha động Mẫu được phân tích trên thiết bị LC-MS/MS

Kết quả thu được: độ thu hồi của ITZ lần lượt là 111,3 %; 96,6 %; 88,6 %; 85,16 %; 85,52 % với các nồng độ 0,2; 0,5; 5; 50; 100 ng/ml

c, Ưu nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm:

- Phương pháp phổ biến, đơn giản

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng cho phép chiết xuất chọn lọc nhiều loại chất phân tích bằng cách thay đổi điều kiện chiết

Nhược điểm:

- Hiệu suất chiết thấp khi chiết các hợp chất phân cực

- Tốn thời gian và dung môi

- Phương pháp này còn có thể có sai sót trong chuẩn bị mẫu và thao tác của người làm thí nghiệm dẫn đến hình thành nhũ tương

- Khó khăn trong việc loại bỏ hoàn toàn lớp hữu cơ

- Cần lựa chọn pH thích hợp cho pha nước để dược chất ở dạng phù hợp, nâng cao hiệu suất chiết

- Khó khăn trong lựa chọn dung môi chiết hòa tan tốt chất phân tích, nhưng không hoàn tan tốt các chất khác trong mẫu, sự phân lớp giữa hai pha phải rõ ràng, nhanh

1.4.3.3 Chiết pha rắn

a, Nguyên lý

Chiết pha rắn là quá trình phân bố chất tan giữa pha lỏng và pha rắn [17] Trong đó chất cần chiết ban đầu tan ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ) và chất để hấp thụ chất cần chiết ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ, xốp) gọi là pha rắn

b, Cách tiến hành

Trước khi tiến hành chiết, ta cần xác định thành phần của mẫu chiết và lựa chọn cơ chế chiết thích hợp Có 2 cơ chế chiết hay được sử dụng trong chiết pha rắn là: lưu giữ chất phân tích, rửa giải chất cản trở và lưu giữ chất cản trở, rửa giải chất phân tích

- Cơ chế lưu giữ chất phân tích, rửa giải chất cản trở: Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết, pha rắn tương tác với chất phân tích và giữ chúng trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi Quá trình rửa giải chất được lưu giữ được thực hiện bằng dung môi thích hợp và có thể tích nhỏ hơn nhiều so với thể tích dung dịch ban đầu để làm giàu nồng độ

- Cơ chế lưu giữ chất cản trở, rửa giải chất phân tích: Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết, pha rắn tương tác với chất cản trở và giữ chúng lại trên cột, chất phân tích cùng với dung môi sẽ đi ra khỏi cột

Với mỗi chất phân tích, ta cần lựa chọn điều kiện chiết phù hợp: loại pha rắn (pha thuận, pha đảo), cỡ chất hấp phụ, dung môi rửa giải

Đối với các loại pha rắn, ta lựa chọn theo chất cần lưu giữ: chất không phân cực dùng chất nhồi pha đảo; chất phân cực dùng chất nhồi pha thuận; chất ion hóa dùng chất nhồi trao đổi ion (do cùng ái lực)

Một số loại hạt nhồi thông dụng được trình bày ở Phụ lục 3

Ngoài ra còn có: pha rắn trao đổi mạnh cation (dẫn chất phenylsulphonic, -C6H4,

-SO3H), pha rắn trao đổi mạnh anion (dẫn chất amoni bậc 4)

Các bước chiết pha rắn với chất nhồi pha đảo:

‐ Hoạt hóa cột: rửa lần lượt bằng 3-5 ml MeOH, 3-5 ml H2O/Đệm, không để ống khô

‐ Đưa mẫu lên cột: cho chảy với tốc độ thích hợp bằng áp suất (thường dùng 1-5 ml/phút) Nếu mẫu không bị lưu giữ lại, thu lấy mẫu

‐ Rửa tạp: nếu mẫu lưu giữ, rửa với 5 ml dung môi phân cực (nước, đệm, hỗn hợp dung môi) rửa giải chất cản trở

nước-‐ Rửa giải bằng 1-5 ml dung môi không phân cực để thu lấy chất phân tích

Trong nghiên cứu [21], phương pháp chiết pha rắn đã được sử dụng để chiết fluconazol, posaconazol, voriconazol, ketoconazol, itraconazol và chất chuyển hóa của nó hydroxylitraconazol từ huyết tương Phương pháp được tiến hành như sau: Hoạt hóa cột Bond Elute Plexa bằng 1 ml MeOH và 1 ml nước cất 300 µl huyết tương được trộn với

500 µl đệm phosphat 100 mM pH 2 và 250 µl dung dịch nội chuẩn linezolid nồng độ 4 µg/ml trong nước 1 ml mẫu được nạp lên cột Cột được rửa với 1 ml dung dịch NH4OH và

1 ml hỗn hợp nước và MeOH với tỷ lệ thể tích 70:30 Cuối cùng, chất phân tích được rửa giải với 1 ml MeOH Dung dịch thu được thổi khô bằng N2 rồi hoà tan lại bằng 80 µl hỗn hợp nước và MeOH với tỷ lệ thể tích 50:50

Kết quả thu được: độ thu hồi với tất cả các chất phân tích đều cao ITZ có độ thu hồi lần lượt là 81,2; 82,8; 84,5; 83,7 % với mức nồng độ 0,3; 1,5; 7,5; 30 µg/ml

c, Ưu nhược điểm

Ưu điểm:

- Dịch chiết tinh khiết hơn giúp tăng tuổi thọ của hệ thống sắc ký [30]

- Độ đặc hiệu tốt, đa phần các tạp chất gây nhiễu bị loại bỏ nhờ có tính chọn lọc của hạt nhồi trong cột và những giai đoạn rửa giải hiệu quả [30]

- Phương pháp này có thể được tự động hóa trên thiết bị Aspec system để có độ lặp cao và tiết kiệm thời gian [15]

- Phương pháp này có thể sử dụng dễ dàng trong phòng thí nghiệm để quản lý hiệu quả việc giám sát thuốc điều trị [21]

- Tạo nhũ dịch, làm sai lệch kết quả

1.4.3.4 Phương pháp chiết QuEChERS

Thuật ngữ QuEChERS là viết tắt của các từ quick, easy, cheap, effective, rugged, safe [10] (nhanh chóng, dễ thực hiện, giá thành rẻ, hiệu quả cao, ổn định và an toàn)

a, Nguyên lý

Làm tăng tính phân cực của pha nước khi thêm muối chiết từ đó làm pha dung môi hữu cơ không đồng tan với pha nước và bị tách ra khỏi pha nước, khi tách ra dung môi hữu

cơ mang theo lượng chất phân tích trong pha nước lúc đầu

Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp:

‐ Loại và thể tích dung môi chiết

‐ Loại và lượng muối chiết

‐ Loại chất dùng để tinh chế sau chiết

‐ pH của dung môi chiết

Một số chất thông dụng dùng trong phương pháp chiết QuEChERS được trình bày ở Phụ lục 4

b, Cách tiến hành

‐ Trộn lẫn mẫu chiết với dung môi chiết (nếu mẫu chiết là chất rắn thì cần phải xay và thêm một phần nước)

‐ Thêm muối chiết vào để pha nước và pha dung môi hữu cơ tách nhau

‐ Ly tâm để tách 2 pha hoàn toàn, rồi thu lấy pha dung môi hữu cơ

‐ Tinh chế bằng các chất phù hợp hoặc dùng dịch để định lượng luôn nếu đủ sạch

Dược sĩ Phạm Thành Đạt đã sử dụng phương pháp chiết QuEChERS để chiết esomeprazol từ huyết tương thỏ [4]

Kết quả thu được: độ thu hồi esomeprazol lần lượt là 61,00; 99,16; 91,92 % với các nồng độ 0,1; 5; 20 ng/ml

c, Ưu nhược điểm phương pháp

Ưu điểm:

- Giảm được khối lượng mẫu, thời gian chiết [10]

- Nhanh chóng, dễ thực hiện, giá thành rẻ, hiệu quả cao, ổn định và an toàn

- Phương pháp được thiết kế hợp lý tránh những thao tác phức tạp từ các phương pháp chiết truyền thống [10]

- Hạn chế tối đa việc mất mẫu chiết do không có các bước: lọc bỏ nền mẫu ban đầu, chuyển dung môi, bay hơi dung môi Thêm nội chuẩn sau bước thêm dung môi có thể loại bỏ được sai số ngẫu nhiên và sai số hệ thống

Nhược điểm:

- Dịch chiết không sạch như chiết pha rắn

- Không phù hợp với các chất phân tích tan tốt trong nước

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

Bảng 2.1 Nguyên liệu và các hóa chất làm nghiên cứu

thuốc Trung ương

Chemicals

TCNSX

17 Viên nang sporal 100 mg, số lô

sản xuất: 1943011, ngày sản xuất: 09/01/2019, hạn dùng:

Bảng 2.2 Thiết bị nghiên cứu

Instruments

7 Máy ghi phổ nhiễu xạ tia X BRUKER D8-Advance Đức

2.2 Nội dung nghiên cứu

• Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần trong hệ phân tán rắn tới khả năng khuếch tán và độ ổn định vật lý của hệ phân tán rắn chứa ITZ

• Xây dựng phương pháp định lượng ITZ trong huyết tương và ứng dụng để đánh giá sinh khả dụng trên động vật thí nghiệm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

Tham khảo các nghiên cứu trước [3], [5], khóa luận bào chế các công thức hệ phân tán rắn theo phương pháp bay hơi dung môi bằng kỹ thuật phun sấy Các bước chính như sau:

- Cân các thành phần theo tỷ lệ

- Chuẩn bị dịch phun sấy: hòa tan các thành phần vào hỗn hợp dung môi DCM – MeOH (1:1) với nồng độ chất tan là 10% (kl/tt) Dịch được khuấy liên tục trong quá trình phun sấy Thành phần các mẫu như sau:

- Đem dịch phun sấy với các thông số:

• Nhiệt độ khí vào: 60 ºC

• Tốc độ bơm: 10 ml/phút

• Áp suất khí nén: 1atm

- Mẫu phun sấy được tiếp tục sấy chân không ở nhiệt độ 30 ºC và áp suất -0,08 kPa trong 2 giờ

- Bảo quản HPTR trong túi PE Túi để trong lọ thủy tinh có nắp cao su, bên trong lọ

có chứa hạt hút ẩm silicagel Bảo quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

Mẫu trộn vật lý của F3 và acid được bào chế như sau: Mẫu F3 được trộn vật lý với acid maleic và acid fumaric Trong đó F3 chiếm 80% khối lượng và 2 acid chiếm 20% khối lượng Tỷ lệ của acid fumaric và acid maleic là 1:2 ((ITZ-HPMC-HPMCP)+acid)

Định lượng lại lượng itraconazol trong HPTR: Cân chính xác 1 lượng 100 mg itraconazol cho vào bình định mức 100 ml Thêm MeOH đến vạch, siêu âm trong 30 phút Lọc qua màng lọc cellulose acetat kích thước lỗ lọc 0,45 µm Dịch thu được định lượng bằng HPLC

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Điều kiện định lượng ITZ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được tham khảo nghiên cứu của Vikrant [39] như sau:

+ Pha dung dịch chuẩn: cân chính xác một lượng khoảng 0,05 g ITZ hòa tan trong 100,0 ml MeOH Pha loãng bằng MeOH để thu được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0,5-15 µg/ml

+ Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ ITZ để tính toán kết quả

2.3.2.2 Phương pháp thử khả năng khuếch tán qua màng thầm tích

Để đánh giá khả năng khuếch tán của ITZ qua màng thẩm tích, nghiên cứu tiến hành như sau:

a Chuẩn bị

- Môi trường ngăn cho:

+ Môi trường acid: dung dịch đệm HCl 0,1 M pH =1,2

+ Môi trường base: dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6,8

- Môi trường ngăn lấy mẫu phân tích:

+ Môi trường acid: dung dịch đệm HCl 0,1 M pH = 1,2

+ Môi trường base: dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6,8 có 1% natri lauryl sulfat

b Tiến hành

- Thiết bị: máy thử hòa tan ERWEKA DT720 có thêm ống ngăn nhận (hình PL 1.2)

- Ngăn cho: 500 ml dung dịch đệm pH 1,2 hoặc pH 6,8 như đã chuẩn bị ở phần a

- Ngăn nhận: 10ml dung dịch đệm giống ngăn cho

- Tốc độ cánh khuấy 100 vòng/phút

- Nhiệt độ 37±0,5ºC

- Màng ngăn cách 2 ngăn: Spectra/Por Regenerated Cellulose Membranes

- Thời gian lấy mẫu: 15, 30, 60, 90, 120; mỗi lần lấy 0,5 ml dịch trong ngăn nhận đem

đi định lượng nồng độ ITZ bằng HPLC

- Cho vào ngăn cho (cốc thử hòa tan) một lượng mẫu tương ứng với 40 mg ITZ

- Xác định hàm lượng ITZ khuếch tán qua một đơn vị diện tích khuếch tán: Lượng ITZ khuếch tán qua màng thẩm tích sau khoảng thời gian t phút (t = 15, 30, 60, 90,

120 phút) tính theo công thức:

Xt = 𝐶𝑐

𝑆𝑐 x 1

𝑆𝑚 x (V1 x Sk + V2 x ∑𝑘𝑡=2𝑆t-1) Trong đó:

- Xt là là hàm lượng ITZ khuếch tán qua một đơn vị diện tích (μg/cm2)

Sc, Sk (k là thứ tự các thời điểm lấy mẫu, k= 1, 2, 3, 4, 5) lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn và dung dịch thử tại các thời điểm 15, 30, 60, 90, 120 phút (mAU.s)

- Cc là nồng độ dung dịch chuẩn (μg/ml)

- V1 là thể tích môi trường có trong ngăn nhận (ml)

- V2 là thể tích môi trường lấy tại các thời điểm t (ml)

- Sm là diện tích màng thẩm tích đem thử tính thấm (cm2)

Thông lượng khuếch tán J (μg cm-2 min-1) được xác định bằng cách hồi quy tuyến tính

Xt sau khi khuếch tán đến 120 phút

2.3.2.3 Phương pháp thử hòa tan chuyển môi trường

Để đánh giá độ tan cũng như khả năng ức chế kết tinh dược chất trong mẫu bào chế khi chuyển từ pH dạ dày sang môi trường pH ruột non, nghiên cứu tiến hành phương pháp thử hoà tan chuyển pH như sau [29]:

Thử hòa tan HPTR chứa khoảng 100 mg ITZ qua hai môi trường: 2 giờ đầu thử ở môi trường pH 1,2; sau đó chuyển sang môi trường pH 6,8 bằng cách dùng xi lanh thêm nhanh

250 ml Na3PO4 0,2 M

‐ Thiết bị: máy thử hòa tan ERWEKA DT720

‐ Môi trường: 750 ml dung dịch HCl pH 1,2 trong 2 giờ đầu, 1000 ml dung dịch đệm pH 6,8 trong 4 giờ sau

‐ Tốc độ khuấy: 50 vòng/phút

‐ Nhiệt độ: 37 ± 0,5oC

‐ Thời gian lấy mẫu: 15, 30, 60, 90, 120, 125, 135, 150, 180, 240, 360 phút

Mỗi lần hút 5 ml dịch, lọc qua màng lọc cellulose acetat 0,2 μm, bổ sung lại thể tích cho cốc thử hòa tan Mẫu thu được đem pha loãng 2 lần bằng MeOH rồi định lượng nồng

độ ITZ bằng HPLC

Công thức tính nồng độ itraconazol giải phóng:

2.3.2.4 Phương pháp nhiễu xạ tia X

Trạng thái tồn tại của ITZ được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X trên các mẫu: nguyên liệu ITZ, HPTR chứa ITZ tại thời điểm sau khi bào chế và sau các khoảng thời gian bảo quản nhất định ở điều kiện lão hóa cấp tốc (Nhiệt độ 40°C, độ ẩm 75%) Mẫu phân tích được ghi phổ nhiễu xạ tia X trên máy D8-Advance Brucker với các thông số: điện thế của anod Cu 40 kV, cường độ dòng điện 40 mA, góc quét 2-theta biến đổi từ 2o đến 60o, bước quét 0,03o/0,05s

2.3.2.5 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng trên động vật thí nghiệm

a) Thiết kế mô hình đánh giá sinh khả dụng trên thỏ

Chuẩn bị động vật thí nghiệm: thỏ trắng giống đực trưởng thành (4 – 6 tháng tuổi),

khối lượng khoảng 2 – 2,5 kg, do Học viện Quân Y cung cấp

Chuẩn bị mẫu thuốc: Viên thuốc Sporal và mẫu trộn vật lý của HPTR 3 thành phần

và acid

Mô hình đánh giá sinh khả dụng: ngẫu nhiên, chéo đôi, thỏ không được cho ăn trong

vòng 12 tiếng trước khi uống thuốc, mức liều tham khảo hướng dẫn của FDA [8]

+ Đợt 1: thỏ được cho uống chế phẩm đối chiếu với liều tương ứng 16,1 mg/kg ITZ

+ Đợt 2: thỏ được cho uống mẫu thử với liều tương ứng 16,1 mg/kg ITZ

Lấy mẫu và xử lý huyết tương: sau khi cho thỏ uống thuốc, tiến hành lấy 3 ml máu thỏ

cho vào ống có chứa EDTA vào các thời điểm 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 24; 28; 32 giờ

Ly tâm mẫu máu với tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút Thu lấy huyết tương, bảo quản

ở -10oC trước khi đem đi phân tích

b) Khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương thỏ chứa ITZ

- Phương pháp chiết lỏng-lỏng

Hút 0,5 ml huyết tương chứa ITZ với nồng độ 250 ng/ml và OH-ITZ với nồng độ 250 ng/ml, Thêm 50 µl Na2CO3 1 M vào để kiềm hóa, lắc vortex trong 1 phút Sau đó thêm 500

µl methyl tert-butyl ether, lắc xoáy trong 2 phút rồi ly tâm ở 20627g trong 5 phút Lấy 300

µl lớp hữu cơ, đem thổi khô bằng nitrogen, pha lại bằng 300 µl ACN

- Phương pháp chiết QuERChERS

Hút 0,5 ml huyết tương chứa ITZ với nồng độ 250 ng/ml và OH-ITZ với nồng độ 250 ng/ml, Thêm 50 µl Na2CO3 1 M vào để kiềm hóa, lắc vortex trong 1 phút Thêm 500 µl ACN, lắc vortex 1 phút Thêm 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl, lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 p Hút 300 µl dịch trên, đem đi định lượng

- Phương pháp tủa protein

Hút chính xác 100 µl HT chứa ITZ với nồng độ 300 ng/ml và OH-ITZ với nồng độ

300 ng/ml vào ống polyprolylene 2ml Sau đó tủa protein bằng cách thêm 200 µl dung dịch chứa MeOH/ZnSO4 0,2 M tỷ lệ 80/20 Dung dịch được trộn mạnh và ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 10 phút Hút 150 µl lớp dịch phía trên, đem đi định lượng bằng LC/MS-

MS

c) Phân tích thuốc trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Để tối ưu hóa điều kiện phân tích, tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn ITZ 1 µg/ml, OH-ITZ 1 µg/ml vào detector MS với nguồn ion hóa phun điện tử ESI chế độ dương Ion phân tử được lựa chọn dựa vào khối lượng phân tử, có dạng [M-H]+ Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử thành các ion con, lựa chọn ion con có cường độ tín hiệu cao nhất để định lượng và ion con có cường độ thấp hơn

để định tính Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) tự động theo phần mềm Analyst 1.7 của thiết bị

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: Sử dụng để định lượng dung dịch chứa ITZ và ITZ trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với điều kiện HPLC như sau:

OH-+ Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm), kích thước hạt nhồi 3,5 µm

+ Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

+ Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút

+ Chương trình pha động như sau:

Bảng 2.3 Chương trình pha động trong LC-MS/MS

Thời gian (phút)

Pha động Dung dịch acid formic 0,1

▪ Mẫu trắng không có tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải

có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

▪ Tỷ lệ ion của 2 mảnh trong mẫu thêm chuẩn phải tương ứng với mẫu chuẩn

▪ Ngoài ra, tính chọn lọc còn có thể được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP – identification point) yêu cầu có ≥ 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/2002 của châu Âu

o Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) LOD là nồng độ mà tại

đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N ≥ 3) LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N ≥ 10)

o Đường chuẩn làm việc: Để xác định khoảng làm việc, khoá luận thực hiện phân tích các dung dịch huyết tương trắng thêm chuẩn itraconazol có nồng

độ thay đổi từ 10,0 đến 500,0 ng/ml, nồng độ nội chuẩn ketoconazol là 250 ng/ml và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường

phụ thuộc giữa nồng độ ITZ với tỷ lệ giữa diện tích pic chất chuẩn và diện tích pic nội chuẩn, và quan sát sự phụ thuộc tuyến tính

o Độ lặp và độ thu hồi:

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, khoá luận tiến hành thí nghiệm xử lý mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn ITZ ở 3 mức nồng độ khác nhau là 10 ng/ml; 250 ng/ml và 500 ng/ml (n = 6), nồng độ nội chuẩn ketoconazol là 250 ng/ml và tính toán kết quả theo các công thức sau:

▪ Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%):

𝑅𝑆𝐷% = 𝑆

ā × 100

S = √∑ (𝑎𝑖−ā)

2 𝑁

Yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại tại mỗi nồng độ được quy định bởi tiêu chuẩn của AOAC (phụ lục 14)

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu phương pháp định lượng

3.1.1 Phương pháp định lượng itraconazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Để định lượng nồng độ itraconazol trong mẫu khi thử giải phóng tiến hành xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, thu được kết quả như sau:

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa giữa nồng độ và diện tích pic của ITZ

bằng phương pháp HPLC

Giá trị R2 = 0,9997 (R2 ≥ 0,9900) chứng tỏ trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ ITZ trong mẫu chuẩn và diện tích pic

y = 34544x - 5939.7 R² = 0.9997

0 100000 200000 300000 400000 500000 600000

3.1.1.3 Độ tích hợp hệ thống

Tiến hành phân tích dung dịch chuẩn ITZ 10 µg/ml (n=6) Tính tích hợp hệ thống của phương pháp được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu không quá 2% Kết quả thu được như sau:

Lần đo Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)

3.1.2 Phương pháp định lượng itraconazol trong huyết tương bằng phương pháp

LC-MS/MS

Để xác định nồng độ của ITZ và OH-ITZ trong huyết tương thỏ, tiến hành khảo sát phương pháp định lượng ITZ trong huyết tương bằng phương pháp LC – MS/MS

3.1.2.1 Khảo sát phương pháp phân tích

Điều kiện detector khối phổ

Tiến hành như trong mô tả ở phần c mục 2.3.2.5 ta thu được kết quả:

Bảng 3.1 Điều kiện kiểm soát đa phản ứng trong phân tích ITZ và OH-ITZ

Điều kiện khác của detector MS được trình bày ở phụ lục 6

Sau khi lựa chọn được ion phân tử, ion con, các điều kiện tối ưu, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn có nồng độ ITZ và OH-ITZ và nội chuẩn KTZ Sắc ký đồ thu được ở hình

phụ lục, pic thu được cân đối, nhọn, không có hiện tượng dính pic Vậy điều kiện sử dụng

để phân tích là phù hợp để định lượng được cả ITZ và OH-ITZ trong huyết tương

3.1.2.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

a) Khảo sát phương pháp chiết

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết: phương pháp chiết lỏng-lỏng, phương pháp chiết QuEChERS, phương pháp tủa protein như trong quy trình đã trình bày ở mục 2.3.2.4, mỗi mẫu làm lặp 3 lần, thu được kết quả như bảng sau:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát phương pháp chiết

Mẫu chiết Độ thu hồi ITZ

Từ kết quả thu được ta thấy phương pháp QuEChERS có hiệu suất chiết cao nhất trong các phương pháp (67,7% với ITZ và 78% với OH-ITZ), nên ta chọn phương pháp QuEChERS cho các khảo sát tiếp theo

b) Khảo sát nội chuẩn

Do hiệu suất chiết chưa cao nên cần khảo sát và chọn nội chuẩn thích hợp Tiến hành khảo sát các nội chuẩn: naproxen, felodipin, ketoconazol theo phương pháp QuEChERS như sau: Hút 500µl huyết tương chứa ITZ với nồng độ 250 ng/ml và OH-ITZ với nồng độ

250 ng/ml cho vào ống ly tâm 2 ml Thêm 25 µl dung dịch nội chuẩn làm việc có nồng độ

5 µg/ml Lắc xoáy 30s cho dung dịch đồng nhất Thêm 50 µl Na2CO3 1 M vào để kiềm hóa, lắc vortex trong 1 phút Thêm 500 µl ACN, lắc vortex 1 phút Thêm vào mỗi ống ly tâm hỗn hợp 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl, lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Hút 300 µl dịch trên, đem đi định lượng bằng LC-MS/MS Với mỗi chất làm lặp 3 lần

Ta thu được kết quả:

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nội chuẩn

Nội chuẩn

trong mẫu

Độ thu hồi ITZ (%)

Độ thu hồi OH-ITZ (%)

Độ thu hồi

IS (%)

Tỷ lệ ITZ/IS trước và sau khi chiết

Tỷ lệ ITZ/IS trước

OH-và sau khi chiết

c) Khảo sát điều kiện kiềm hóa

Trong các nghiên cứu [14], [18], [29], [31] có sử dụng các dung dịch kiềm để kiềm hóa đưa ITZ về dạng base để quá trình chiết có hiệu suất chiết cao Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát các điều kiện kiềm hóa cho phương pháp chiết QuERChERS với các chất kiềm hóa: Dung dịch Na2CO3 1M, dung dịch NH4OH 1M, dung dịch đệm phosphat 1M pH

8, dung dịch NaOH 1M Mỗi chất kiềm hóa làm lặp 3 lần Kết quả thu được như bảng sau:

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát điều kiện kiềm hóa

Chất kiềm hóa Độ thu hồi

ITZ (%)

Độ thu hồi OH-ITZ (%)

Trong các mẫu tiến hành thí nghiệm, mẫu không kiềm hóa và kiềm hóa bằng dung dịch Na2CO3 1M cho kết quả tốt nhất gần như tương đương nhau với độ thu hồi của ITZ, OH-ITZ, IS gần 100% Các mẫu được kiềm hóa bằng: dung dịch NH4OH 1M, dung dịch đệm phosphat 1M pH 8, dung dịch NaOH 1M cho độ thu hồi thấp hơn Điều này cho thấy việc kiềm hóa trong phương pháp chiết QuERChERS là không cần thiết Vì vậy nhóm nghiên cứu chọn phương pháp không kiềm hóa khi tiến hành chiết ITZ từ huyết tương d) Khảo sát muối chiết

Với một số muối chiết thông thường sử dụng cho phương pháp QuEChERS là: MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 + PSA, MgSO4 + C18, MgSO4 + CH3COONa,

CH3COONH4, NH4Cl Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát theo quy trình chiết như sau: Hút 500 µl huyết tương chứa ITZ với nồng độ 250 ng/ml và OH-ITZ với nồng độ 250 ng/ml cho vào ống ly tâm 2 ml Thêm 25 µl dung dịch nội chuẩn làm việc có nồng độ 5 µg/ml Lắc xoáy 30s cho dung dịch đồng nhất Thêm 500 µl ACN, lắc vortex 1 phút Thêm vào mỗi ống ly tâm lần lượt một hỗn hợp: 0,2 g MgSO4, 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl, 0,2 g MgSO4 + 0,05 g PSA, 0,2 g MgSO4 + 0,05 g C18, 0,2 g CH3COONH4, 0,2 g NH4Cl, 0,2 g MgSO4 + 0,05 g CH3COONa lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Hút

300 µl dịch trên, đem đi định lượng bằng LC-MS/MS Mỗi muối chiết làm lặp 3 lần

Kết quả thu được như sau:

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát muối chiết

Mẫu Độ thu hồi ITZ (%) Độ thu hồi OH-ITZ

(%)

Độ thu hồi ketoconazol (%)