Bước đầu ứng dụng hệ dung môi eutecti trong bào chế thuốc bôi tại chỗ để điều trị bệnh do nhiễm leishmamia thể da

Độ tan của các dược chất trong một số hệ dung môi eutecti .... Trong khi đó, hệ dung môi eutecti DES: deep eutecti solvents xuất hiện với những ứng dụng nổi bật trong cải thiện độ tan, t

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ MAI LAN BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG

HỆ DUNG MÔI EUTECTI TRONG BÀO CHẾ THUỐC BÔI TẠI CHỖ ĐỂ

ĐIỀU TRỊ BỆNH DO NHIỄM LEISHMANIA THỂ DA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

Người hướng dẫn:

TS Phạm Bảo Tùng ThS Nguyễn Cảnh Hưng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, đầu tiên em xin được bày tỏ sự kính trọng và

lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Phạm Bảo Tùng ThS Nguyễn Cảnh Hưng

đã dành thời gian, tâm huyết để tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, khích lệ em trong suốt

thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên,

các anh chị và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Bào chế

Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ trong quá trình em học tập và thực nghiệm

tại bộ môn

Em xin cảm ơn GVCC PGS TS Vũ Đặng Hoàng đã tận tình hướng dẫn,

giúp đỡ em trong thời gian thực nghiệm tại bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

Em xin cảm ơn TS Nguyễn Thạch Tùng đã cung cấp nguyên liệu và tạo điều

kiện để đề tài diễn ra thuận lợi

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè thân

thiết, những người đã luôn bên cạnh, ủng hộ, cổ vũ em trong trong suốt thời gian

qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Vũ Thị Mai Lan

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Hệ dung môi eutecti 2

1.1.1 Khái niệm hệ dung môi eutecti 2

1.1.2 Thành phần hệ dung môi eutecti 2

1.1.3 Phân loại hệ dung môi eutecti 3

1.1.4 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti 4

1.1.5 Đánh giá cơ chế tương tác giữa các thành phần trong hệ dung môi eutecti 5

1.1.6 Một số ứng dụng của hệ dung môi eutecti trong bào chế 6

1.1.7 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ dung môi eutecti với các mục đích điều trị, đường dùng khác nhau 8

1.1.8 Độc tính của hệ dung môi eutecti khi dùng trên da 12

1.2 Tổng quan về bệnh do nhiễm Leishmania thể da 12

1.2.1 Giới thiệu về bệnh 12

1.2.2 Điều trị 13

1.3 Thông tin về dược chất 14

1.3.1 Berberin clorid 14

1.3.2 Paromomycin sulfat 14

1.3.3 Itraconazol 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị 17

2.1.3 Động vật thí nghiệm 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti 18

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu 18

2.3.3 Phương pháp khảo sát tỉ lệ các thành phần tạo hệ dung môi eutecti 18

2.3.4 Phương pháp đánh giá độ tan của dược chất trong hệ dung môi eutecti 18

2.3.5 Phương pháp đánh giá đặc tính lưu biến 21

2.3.6 Phương pháp thử kết dính sinh học 23

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Khảo sát sự tạo thành hệ dung môi eutecti trị liệu 25

3.1.1 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu của berberin clorid 25 3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu của paromomycin sulfat 26

3.2 Đánh giá hệ dung môi eutecti 26

3.2.1 Khảo sát sự tạo thành hệ dung môi eutecti 26

3.2.2 Đánh giá đặc tính lưu biến 29

3.2.3 Đánh giá khả năng kết dính sinh học của hệ dung môi eutecti 33

3.2.4 Độ tan của các dược chất trong một số hệ dung môi eutecti 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ

3 DES Hệ dung môi eutecti (deep eutecti solvents)

4 DSC Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential scanning

calorimetry)

8 HBA Chất nhận liên kết hydro (hydrogen - bond acceptor)

9 HBD Chất cho liên kết hydro (hydrogen - bond donor)

10 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

11 kl/kl Khối lượng/khối lượng

14 NADES Hệ dung môi eutecti tự nhiên (natural deep eutectic

solvents)

15 NSAID Nhóm thuốc chống viêm không steroid

16 RSD Độ lệch chuẩn tương đối

21 TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất

22 THEDES Hệ dung môi eutecti trị liệu (theurapeutic deep eutectic

solvents)

23 TKHH Tinh khiết hóa học

24 TLTK Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sự kết hợp các thành phần tạo DES [11] 3

Bảng 1.2 Một số công thức THEDES 4

Bảng 1.3 Nguyên tắc, ưu, nhược điểm của các phương pháp bào chế DES 4

Bảng 1.4 Sự cải thiện về độ tan của các dược chất trong DES ở nhiệt độ phòng 6

Bảng 1.5 Độ tan của các chất khối lượng phân tử lớn trong một số DES [11] 7

Bảng 1.6 Các chỉ số dược động học của rutin khi dùng đường uống trên chuột, liều là 10mg 9

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm 16

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu 17

Bảng 3.1 Khảo sát khả năng tạo THEDES của berberin clorid 25

Bảng 3.2 Khảo sát khả năng tạo THEDES của paromomycin sulfat 26

Bảng 3.3 Thành phần của các công thức DES 27

Bảng 3.4 Khảo sát khả năng tạo DES 27

Bảng 3.5 Cảm quan của DES ChCl:Ure khi thêm các tỉ lệ nước khác nhau 28

Bảng 3.6 Độ nhớt của một số DES ở các nhiệt độ khác nhau 32

Bảng 3.7 Sự thay đổi độ nhớt theo thời gian của mẫu DES ChCl:Sor 32

Bảng 3.8 Kết quả đo chỉ số kết dính sinh học của các mẫu DES 33

Bảng 3.9 Mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ berberin clorid chuẩn 35

Bảng 3.10 Độ lặp lại của phương pháp đo quang phổ UV-Vis 36

Bảng 3.11 Độ tan của berberin clorid trong một số DES ở các thời điểm khuấy khác nhau 36

Bảng 3.12 Độ tan của berberin clorid trong một số DES 37

Bảng 3.13 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ itraconazol chuẩn 37

Bảng 3.14 Độ lặp lại của phương pháp HPLC 38

Bảng 3.15 Độ tan của itraconazol trong một số DES ở các thời điểm khuấy khác nhau 39

Bảng 3.16 Độ tan của itraconazol trong một số DES 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Giản đồ pha của DES 2

Hình 1.2 Sự tạo thành polyme của DES và sự giải phóng thuốc từ polyme 9

Hình 1.3 DES làm tăng thấm thuốc qua da 10

Hình 1.4 Hiệu quả của CAGE trong việc đưa insulin qua da 11

Hình 1.5 Hình ảnh của kính hiển vi quét laser đồng tiêu thể hiện tính thấm của FTIC-insulin 11

Hình 1.6 Tổn thương do Leishmania 13

Hình 1.7 Công thức cấu tạo phân tử berberin clorid 14

Hình 1.8 Công thức cấu tạo phân tử paromomycin sulfat 14

Hình 1.9 Công thức cấu tạo phân tử itraconazol 15

Hình 2.1 Sự thay đổi của tốc độ trượt và độ nhớt theo thời gian 23

Hình 2.2 Thiết bị đo chỉ số kết dính sinh học 24

Hình 3.1 Hình ảnh khảo sát khả năng tạo THEDES của berberin clorid 25

Hình 3.2 Thành phần tạo DES 27

Hình 3.3 DES cholin clorid:L-acid malic 1:1 (mol/mol) 27

Hình 3.4 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của tần số dao động đến cấu trúc mẫu DES ChCl:Sor ở các nhiệt độ khác nhau 29

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn độ nhớt theo tốc độ trượt của mẫu DES ChCl:Sor ở các nhiệt độ khác nhau 30

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn G”, η* theo tốc độ trượt của mẫu DES ChCl:Sor ở nhiệt độ 20°C 31

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn G”, η* theo tốc độ trượt tốc độ trượt của mẫu DES ChCl:Sor ở nhiệt độ 32°C 31

Hình 3.8 Đồ thị xác định tính xúc biến của mẫu DES ChCl:Sor ở nhiệt độ 32°C 33

Hình 3.9 Chỉ số kết dính sinh học của một số DES ở nhiệt độ 20ºC và 32ºC 34

Hình 3.10 Hình ảnh quét phổ của mẫu DES ChCl:Gly 34

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa độ hấp thụ và nồng độ berberin clorid 35

Hình 3.13 Khả năng hòa tan của paromomycin sulfat trong một số DES 40

Trong khi đó, hệ dung môi eutecti (DES: deep eutecti solvents) xuất hiện với những ứng dụng nổi bật trong cải thiện độ tan, tăng tính thấm qua da của dược chất Hệ dung môi eutecti là hỗn hợp các chất gồm hai hay nhiều thành phần có điểm nóng chảy thấp hơn các thành phần cấu thành nên nó Phương pháp bào chế DES đơn giản, dễ thực hiện Hơn nữa, nhiều DES đã được một số nghiên cứu chứng minh là không có độc tính trên da Do vậy, ứng dụng DES làm dung môi cho thuốc bôi là một trong những phương pháp tiềm năng trong bào chế và cải thiện sinh khả dụng của thuốc điều trị bệnh này

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “ Bước đầu ứng dụng hệ dung môi eutecti trong bào chế thuốc bôi tại chỗ để điều trị bệnh do nhiễm Leishmania thể da” được thực hiện với mục tiêu sau đây:

- Đánh giá được khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES: theurapeutic deep eutecti solvents) từ dược chất có hoạt tính kháng Leishmania (berberin clorid, paromomycin sulfat), khả năng tạo hệ dung môi eutecti từ một số tá dược

- Đánh giá được một số hệ dung môi eutecti (DES) về đặc tính lưu biến, tính kết dính

da, khả năng hoà tan một số dược chất có hoạt tính kháng Leishmania (berberin clorid, paromomycin sulfat, itraconazol)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Hệ dung môi eutecti

1.1.1 Khái niệm hệ dung môi eutecti

Hệ dung môi eutecti (DES: deep eutectic solvents) là một hỗn hợp các chất có điểm nóng chảy thấp hơn so với các thành phần cấu thành nên nó Các thành phần cho hoặc nhận electron hoặc proton để hình thành các liên kết hydro, tạo thành trạng thái lỏng ở nhiệt độ thấp hơn 150°C [36], hoặc trong một số tài liệu khác là thấp hơn 100°C [29] Tuy nhiên, hầu hết các DES ở trạng thái lỏng ở khoảng nhiệt độ phòng đến 70°C [36]

1.1.2 Thành phần hệ dung môi eutecti

Thành phần của DES bao gồm chất cho liên kết hydro (HBD: hydrogen - bond donor) và chất nhận liên kết hydro (HBA: hydrogen – bond acceptor), giữa các thành phần không có phản ứng hóa học xảy ra (do đó không có sự hình thành các sản phẩm phụ) [30], [23]

Hình 1.1 Giản đồ pha của DES

Thông thường, HBA là muối hữu cơ (amoni bậc bốn hoặc muối phospho) kết hợp với một loạt các HBD như: đường (glucose, fructose,…), rượu đường (glycerol, sorbitol, manitol, ), acid hữu cơ (acid malic, acid oxalic, acid citric, acid tartaric,…), amino acid (prolin, acid glutamic,…) Tuy nhiên các chất như là đường, rượu đường, acid hữu cơ, amino acid có thể vừa là chất cho liên kết hydro, vừa là chất nhận liên kết hydro, nên chúng được xem như là những thành phần cơ bản tạo nên DES

DES được tạo thành ở nhiệt độ và tỉ lệ mol các thành phần nhất định Đôi khi trong bào chế, người ta thêm một lượng nhỏ nước vào công thức để làm giảm độ nhớt, trong một số trường hợp còn làm giảm nhiệt độ tạo thành DES (do nước cũng tham gia

tạo thành cấu trúc của DES) hay làm tăng độ tan của dược chất Tuy nhiên, việc cho quá nhiều nước có thể làm mất các liên kết hydro hiện có, dẫn đến không tạo được cấu trúc đặc biệt của DES

1.1.3 Phân loại hệ dung môi eutecti

Dựa vào thành phần của DES, một số nghiên cứu đã đề xuất các khái niệm hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES), hệ dung môi eutecti tự nhiên (NADES)

Hệ dung môi eutecti tự nhiên (NADES: natural deep eutectic solvents) có thành phần là các phân tử được tìm thấy trong các tế bào và các cơ thể sống: acid hữu cơ đơn giản (acid malic, acid citric, acid lactic,…), acid amin, đường, cholin, ure,…[10] Nhiều nghiên cứu chứng minh các NADES là dung môi thân thiện với môi trường, không có

nguy cơ trong xử lí và nguy cơ về độc tính như dung môi hữu cơ truyền thống Vì vậy NADES được xem như là lựa chọn thay thế cho các dung môi hữu cơ phổ biến [10], [30]

Hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES: theurapeutic deep eutectic solvents) là hệ dung môi eutecti trong đó dược chất là một trong những thành phần của nó [7] Hầu hết các dược chất đều có thể đóng vai trò là HBD và/hoặc HBA, do đó THEDES cũng có thể được bào chế từ hai dược chất khác nhau THEDES đầu tiên được báo cáo, có thành phần là menthol và ibuprofen [28] Nhiềunghiên cứu sau đó cũng mô tả sự hình thành THEDES Một số công thức THEDES được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số công thức THEDES Dược chất (Thành phần 1) Thành phần 2 TLTK

1.1.4 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti

Các phương pháp bào chế DES bao gồm: phương pháp làm bay hơi ở điều kiện chân không, phương pháp nhiệt, phương pháp nghiền, phương pháp đông khô Nguyên tắc, ưu, nhược điểm của từng phương pháp được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Nguyên tắc, ưu, nhược điểm của các phương pháp bào chế DES Phương

- Hạn chế sự phân hủy các thành phần trong

hệ do thực hiện ở nhiệt

độ thấp

- Quá trình thực hiện phức tạp

- Giá thành cao

- Chỉ áp dụng với các thành phần hòa tan được trong nước

- Kĩ thuật đơn giản, dễ thực hiện

- Rẻ tiền

- Các thành phần trong hệ có thể bị phân hủy hoặc bay hơi ở nhiệt độ cao

- Kỹ thuật đơn giản

- Rẻ tiền

- Các thành phần trong hệ có thể bị phân hủy hoặc bị biến đổi do lực tác động khi nghiền

- Khó tìm thiết bị thích hợp để làm trong quy mô phòng thí nghiệm

- Khó loại hết nước

ra khỏi hỗn hợp

- Thiết bị đắt tiền, phức tạp

- Chỉ áp dụng với các thành phần hòa tan được trong nước

1.1.5 Đánh giá cơ chế tương tác giữa các thành phần trong hệ dung môi eutecti

1.1.5.1 Phân tích nhiệt

 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC)

DSC là phương pháp phân tích nhiệt mà ở đó độ chênh lệch về nhiệt độ giữa hai mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu luôn được duy trì bằng không Thay vào đó, người ta sẽ xác định sự chênh lệch nhiệt lượng (mW) cần để duy trì hai mẫu ở cùng nhiệt độ

Các thành phần trong mẫu tương tác với nhau, quá trình nhiệt bị thay đổi Khi

đó, trên giản đồ pha DSC sẽ xuất hiện pic thu nhiệt hoặc tỏa nhiệt Dựa vào đặc điểm của pic, ta có thể dự đoán tương tác giữa các thành phần

 Phương pháp kính hiển vi nhiệt

Mẫu đặc trên 1 bản trượt được đun nóng với một tốc độ gia nhiệt xác định, sau

đó mẫu được làm lạnh Nhiệt độ bắt đầu nóng chảy và nhiệt độ bắt đầu kết tinh của mẫu xác định dựa trên quan sát hình ảnh và được ghi lại bằng phần mềm

1.1.5.2 Đánh giá tương tác phân tử

Một số phương pháp để đánh giá tương tác phân tử bao gồm sử dụng phổ hồng ngoại FT - IR, phổ nhiễu xạ tia X, phương pháp Raman ( đo độ tán xạ phổ hợp), phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR)

1.1.6 Một số ứng dụng của hệ dung môi eutecti trong bào chế

1.1.6.1 Cải thiện độ tan của dược chất

Nhiều nhà bào chế đã nghiên cứu DES để sử dụng làm dung môi cho các dược chất với mục đích cải thiện độ tan Trong các nghiên cứu được thực hiện, một số DES cải thiện độ tan dược chất tốt hơn so với việc dùng dung môi hữu cơ hay đồng dung môi

 DES cải thiện độ tan của dược chất khối lượng phân tử nhỏ:

Những kết quả từ các nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.4 đều cho thấy rằng độ tan của các dược chất tan kém trong nước đều được tăng lên đáng kể trong DES Xét ví

dụ của dược chất ibuprofen, một NSAID hầu như không tan trong nước, trong trường hợp sử dụng dung môi là propylen glycol và polyethylen glycol (PEG 300), độ tan tăng lên lần lượt là 193 lần và 700 lần so với độ tan của nó ở trong nước Tuy nhiên, khi sử dụng DES làm dung môi, giá trị độ tan tăng lên là 5400 lần [23]

Bảng 1.4 Sự cải thiện về độ tan của các dược chất trong DES ở nhiệt độ phòng

Dược chất Độ tan /nước

(mg/ml) DES

Độ tan/DES (mg/ml) TLTK

Aspirin 7,03 ± 0,03 ChCl:1,2- Propandiol 1:2 202,00 ± 3,15 [20] Paracetamol 19,95 ± 0,12 ChCl:1,2- Propandiol 1:2 324,00 ± 4,23 [20] Ibuprofen 0,07 ± 0,00 Camphor:Menthol 1:1 282,11 ± 6,67 [25] Itraconazol <0,001 ± 0,00 ChCl:Acid glycolic:Acid

oxalic 1:1,6:1.4 53,60 ± 1,20 [19] Piroxicam 0,02 ± 0,00 ChCl:Acid glycolic:Acid

oxalic 1:1,7:0.3 3,10 ± 0,10 [19] Rutin 0,12 ± 0,05 ChCl:Prolin 3:1 2,79 ± 0,10 [16]

 DES cải thiện độ tan của dược chất khối lượng phân tử lớn

Tương tự như với các phân tử nhỏ, những nghiên cứu cũng chỉ ra DES là dung môi tốt cho các đại phân tử sinh học Năm 2013, Dai và cộng sự nghiên cứu ba sản phẩm

tự nhiên có khối lượng phân tử lớn: gluten (một loại protein thực vật), DNA và tinh bột [11] DES với thành phần phù hợp có thể làm tăng độ tan của các hợp chất này so với

độ tan của chúng trong nước Tinh bột không tan trong nước tinh khiết ngay cả ở 100°C, nhưng lại có độ tan là 7,55 g / mol trong glucose:cholin clorid:nước 2:5:5 ở nhiệt độ này

Bảng 1.5 Độ tan của các chất khối lượng phân tử lớn trong một số DES [11]

(Chú thích: a: độ tan được xét ở nhiệt độ 40oC, b: độ tan được xét ở nhiệt độ 100oC, PCH: 1,2-propandiol:cholin chlorid:nước 1:1:1, GCH: glucose:cholin chlorid:nước 2:5:5, LGH: acid lactic:glucose:nước 5:1:3, XoCH: xylitol:cholin chlorid:nước 1:2:3)

1.1.6.2 Cải thiện độ ổn định hóa học của dược chất

DES giúp cải thiện đáng kể độ ổn định hóa học của dược chất Nhiều dược chất

bị phân hủy qua các con đường khác nhau và không ổn định trong môi trường nước Ví

dụ, những dược chất chứa ester như aspirin bị thủy phân khi để lâu trong môi trường nước Nhưng quá trình thủy phân này trong DES ChCl:1,2-propanediol diễn ra chậm hơn 8.2 lần so với trong dung dịch nước DES betaine:ure cũng làm tăng tính ổn định của kháng sinh β-lactam, cụ thể là imipenem và acid clavulanic, lần lượt là 7 và 2,5 lần

so với độ ổn định của kháng sinh này trong môi trường nước [23]

1.1.6.3 Làm tăng tính thấm

Một số nghiên cứu đã chỉ ra DES làm tăng tính thấm qua biểu mô dạ dày - ruột đối với thuốc dùng đường uống và tăng tính thấm qua da đối với thuốc bôi dùng đường qua da, tăng tính thấm qua biểu mô niêm mạc mũi với thuốc dùng đường mũi Các nghiên cứu được trình bày ở 1.1.7.4, 1.1.7.5, 1.1.7.6

1.1.7 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ dung môi eutecti với các mục đích điều trị, đường dùng khác nhau

1.1.7.1 Ứng dụng cho hệ mang tác dụng dược lí kép

Khi dược chất tham gia tạo DES (THEDES), DES vừa mang tác dụng dược lí của dược chất vừa cải thiện độ tan và tránh sự đa hình của dược chất vì dược chất được chuyển thành dạng lỏng

Do hầu hết các dược chất đều có thể là HBD và/hoặc HBA nên DES cũng có thể được bào chế từ hai dược chất khác nhau Điều này dẫn đến các dạng bào chế lỏng mang tác dụng dược lí của cả hai thành phần (tác dụng dược lí kép)

DES tác dụng dược lí kép lâu đời nhất được biết đến là kem gây tê EMLA sử dụng trên da, được bào chế từ prilocain và lidocain Để cải thiện công thức hơn nữa, người ta nghiên cứu DES có thành phần gồm ibuprofen và lidocain Các thử nghiệm in vivo đã chỉ ra tác dụng gây tê của lidocain trong hỗn hợp eutecti này nhanh hơn và mạnh hơn so với EMLA [23]

1.1.7.2 Ứng dụng cho thuốc kháng khuẩn

Một số DES có khả năng kháng khuẩn theo cơ chế riêng của chúng, đặc biệt là ở đường dùng tại chỗ Do vậy, có thể sử dụng DES cho thuốc với chức năng kháng khuẩn

Năm 2016, Zakrewsky và cộng sự bào chế một DES cấu tạo từ cholin và acid geranic theo tỷ lệ mol 1:2 (CAGE) Công thức này có hoạt tính kháng khuẩn kháng lại một loạt các vi khuẩn, nấm và virus Đáng chú ý, một số mầm bệnh mặc dù đề kháng với các kháng sinh như rifampicin, isoniazid, doxycyclin, macrolid, vancomycin, ciprofloxacin, cephalexin và erythromycin, … nhưng đều rất nhạy cảm với CAGE [34]

1.1.7.3 Ứng dụng cho hệ kiểm soát giải phóng thuốc

Polyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình giải phóng thuốc, bao gồm cả với dược chất ưa nước và kỵ nước, có thể giải phóng dược chất kéo dài, giải phóng theo chu kì,…Mota‐Morales và cộng sự chỉ ra khả năng DES tạo thành polyme, với mục đích kiểm soát giải phóng thuốc DES acid acrylic:lidocain và DES acid methacrylic:lidocain

có khả năng tạo ra hệ giải phóng kiểm soát lidocain [22]

Hình 1.2 Sự tạo thành polyme của DES và sự giải phóng thuốc từ polyme

1.1.7.4 Ứng dụng trong thuốc dùng đường uống

DES có tác dụng tăng độ tan và tăng độ ổn định của dược chất nên thuận lợi trong bào chế thuốc dùng đường uống Các nghiên cứu cho thấy rằng DES làm tăng tính thấm

của dược chất tại ruột, làm tăng sinh khả dụng của thuốc dùng đường uống

Farggian và đồng nghiệp thực hiện nghiên cứu về dược động học của rutin trong DES prolin:acid glutamic 2:1 Độ tan của rutin trong DES được tăng lên hơn 20 lần so với trong nước Các giá trị Tmax, Cmax và AUC giữa 2 trường hợp có sự khác biệt rõ rệt cho thấy sinh khả dụng tương đối của rutin trong DES tăng khoảng 100% khi so sánh với rutin trong nước [16]

Bảng 1.6 Các chỉ số dược động học của rutin khi dùng đường uống trên chuột,

1.1.7.5 Ứng dụng cho thuốc dùng trên da

DES có tiềm năng lớn trong các chế phẩm dùng trên da vì độc tính thấp và tính chất lưu biến của chúng Hầu hết các DES có độ nhớt tương đối cao, như gel ở nhiệt độ phòng Hơn nữa, các nghiên cứu cũng cho thấy nhiều DES có thể thúc đẩy sự thấm trên các lớp ngoài của da và giúp đưa dược chất qua da

Năm 2014, Zakrewsky và cộng sự thực hiện một nghiên cứu về tính thấm qua da của DES [35] Ban đầu, nghiên cứu sử dụng manitol (một chất ưa nước có khối lượng phân tử nhỏ, tính thấm qua da thấp) làm thuốc mẫu hòa tan trong DES Thí nghiệm đánh

giá tính thấm được tiến hành trên thiết bị tế bào khuếch tán Franz, loại da sử dụng là da lợn Mức độ thấm dược chất phụ thuộc vào thành phần của DES DES được bào chế từ cholin clorid và acid geranic làm tăng thấm manitol vào các lớp mô sâu của da, vào lớp biểu bì và hạ bì, tăng thấm vào khoang nhận Sau đó nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả năng thấm bằng việc cho kháng sinh cefadroxil tích hợp vào DES Sự tăng thấm cũng được nhận thấy rõ rệt (hình 1.3)

Hình 1.3 DES làm tăng thấm thuốc qua da

(Chú thích: 4,7,8,9,10,11,12: Các DES với thành phần khác nhau, 11: DES cholin clorid: acid geranic; A: DES làm tăng tổng lượng mannitol qua da so với mẫu chứng, B: DES làm tăng tổng lượng kháng sinh cefadroxil qua da so với mẫu chứng)

Tương tự như trong việc đưa các phân tử nhỏ qua da, DES có khả năng đưa các đại phân tử sinh học qua da Năm 2017, Banerjee và các cộng sự nghiên cứu một công thức DES có thành phần là cholin:acid geranic 1:2 (CAGE) DES này được nhận thấy

có khả năng làm tăng thấm protein (albumin huyết thanh bò, ovalbumin và insulin) vào

và qua lớp da lợn, thấm sâu vào lớp biểu bì và hạ bì

Sau đó, nhóm nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của insulin/CAGE đối với mức đường huyết trên chuột không bị tiểu đường Kết quả cho thấy bôi insulin/CAGE lên da giúp duy trì tác dụng giảm nồng độ glucose trong máu lâu hơn so với tiêm insulin, trong khi đó sử dụng CAGE đơn độc hoặc insulin trong đệm bôi lên da không có tác dụng [8]

Hình 1.4 Hiệu quả của CAGE trong việc đưa insulin qua da

1.1.7.6 Ứng dụng cho thuốc dùng đường mũi

DES có thể được sử dụng làm một chất mang tiềm năng cho insulin và các protein khi sử dụng đường mũi Đường dùng này đòi hỏi một công thức có thể thúc đẩy sự hấp thu và không độc hại

Li và cộng sự đã nghiên cứu công thức của insulin trong DES cholin clorid:acid malic 2:1 (CM-DES) dùng cho đường mũi [18] Quang phổ lưỡng sắc tròn cho thấy hình dáng cấu trúc của insulin được bảo tồn trong DES Ngoài ra, các nghiên cứu in vitro đã chứng minh DES có khả năng giải phóng thuốc Sự tăng tính thấm qua biểu mô niêm mạc mũi cũng được nhận thấy dựa vào hình ảnh của FITC-insulin (insulin được đánh dấu huỳnh quang isothiocyanat) từ kính hiển vi quét laser đồng tiêu (LSM)

Hình 1.5 Hình ảnh của kính hiển vi quét laser đồng tiêu thể hiện tính thấm của

FTIC-insulin

(Chú thích: Mẫu chứng: insulin/HCl, DES: insulin/CM-DES, Hydrogel: CMC)

insulin/Na-1.1.8 Độc tính của hệ dung môi eutecti khi dùng trên da

Nhiều DES được chứng minh không có độc tính, hoặc độc tính không đáng kể khi dùng trên da [4], [26], [27], [35]

Năm 2014, Zakrewsky thực hiện nghiên cứu về tính thấm của DES cholin clorid:acid geranic trên da, đồng thời cũng đánh giá tính kích ứng da của DES này Tính kích ứng được đánh giá bằng cách sử dụng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier để theo dõi những thay đổi trong cấu trúc lớp sừng da lợn và sựbài tiết interleukin- 1 từ mô hình

da người Kết quả cho thấy các thành phần riêng lẻ thể hiện sự kích ứng cao Tuy nhiên, khi các thành phần được kết hợp trong DES, tính kích ứng là không đáng kể [35]

Một nghiên cứu khác được thực hiện để kiểm tra độc tính da tiềm ẩn của một số DES bằng cách sử dụng hai dòng tế bào: HaCaT (mô hình tế bào sừng không ung thư)

và MNT-1 (mô hình tế bào ung thư hắc tố), đánh giá độc tính bằng phương pháp MTT Các thành phần tạo DES bao gồm: HBA (cholin clorid) và HBD (acid caproic, 1-propanol, ethylen glycol, ure) đều không độc đối với các tế bào này DES cũng cho kết quả tương tự Riêng trường hợp của acid butanoic, acid này gây độc tế bào khi tồn tại độc lập nhưng lại không gây độc khi kết hợp với cholin clorid tạo DES [26]

1.2 Tổng quan về bệnh do nhiễm Leishmania thể da

1.2.1 Giới thiệu về bệnh

Bệnh do nhiễm Leishmania (Leishmaniasis) là bệnh gây ra do Leishmania - một đơn bào thuộc lớp trùng roi, sống ký sinh trong tế bào của hệ võng mô, gây nhiễm qua trung gian truyền bệnh là muỗi cát Phlebotomus Sự biến đổi khí hậu và môi trường làm

mở rộng phạm vi hoạt động của của vector truyền bệnh dẫn đến sự lan rộng của Leishmania

Có nhiều hình thức khác nhau của Leishmaniasis ở người phụ thuộc vào loại kí sinh trùng gây bệnh và tình trạng miễn dịch của người bệnh: Leishmaniasis thể da, Leishmaniasis thể nội tạng, Leishmaniasis thể niêm mạc và da, trong đó Leishmaniasis thể da là hình thức phổ biến nhất của bệnh, chiếm 50-75% các trường hợp mới mắc gây

ra các tổn thương da từ dạng nốt, mảng đến loét (chủ yếu)

Hình 1.6 Tổn thương do Leishmania

(Chú thích: A: tổn thương dạng nốt, B: tổn thương dạng loét) Bệnh trong một vài trường hợp có thể tự khỏi nhưng cũng có thể để lại sẹo suốt đời và những khiếm khuyết nghiêm trọng Leishmania thể da có thể tiến triển thành

Leishmania thể niêm mạc và da, gây ra những biến chứng nguy hiểm như sụp cầu mũi

hoặc loét từng phần hoặc toàn bộ phức hợp tai mũi họng, có thể dẫn đến tử vong Cách tốt nhất để ngăn chặn Leishmaniasis thể da và niêm mạc là phải điều trị hiệu quả nhiễm trùng da ban đầu

1.2.2 Điều trị

Bệnh do Leishmania thể da được điều trị bằng tiêm tĩnh mạch antimon, amphotericin B, dùng tại chỗ hoặc toàn thân berberin, paromomycin, azol, metronidazol,…Trong đó, sử dụng thuốc bôi tại chỗ có nhiều ưu điểm

- Ưu điểm của thuốc bôi tại chỗ

Đặc điểm trong bệnh do nhiễm Leishmania thể da là ký sinh trùng thường cư trú trong các đại thực bào ở lớp hạ bì của da Khi da bị nhiễm trùng, cấu trúc da thay đổi, suy giảm chức năng bảo vệ dẫn đến tăng thấm dược chất ở vùng da này Do vậy, điều trị Leishmaniasis bằng thuốc bôi tại chỗ là thuận lợi Khi sử dụng thuốc bôi, thuốc tiếp xúc trực tiếp với phần da nhiễm trùng, tăng nồng độ của thuốc ở vị trí đích và hạn chế

đi vào tuần hoàn chung, do đó giảm các tác dụng không mong muốn Hơn nữa, thuốc bôi đem lại sự dễ dàng trong sử dụng ở bệnh nhân Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng paromomycin (một dược chất kháng Leishmania) khi dùng đường qua da (bằng thuốc bôi tại chỗ) có hiệu quả điều trị tương tự như khi dùng đường tiêm tĩnh mạch [14]

- Lựa chọn dược chất kháng Leishmania

Berberin, paromomycin khi dùng tại chỗ có hiệu quả vượt trội so với những thuốc kháng Leishmania khác cũng dùng tại chỗ như: amphotericin B, co-trimoxazol,

neomycin, metronidazol, allopurinol,…[14] Itraconazol cũng được chứng minh về tác dụng điều trị Leishmaniasis thể da, thậm chí trong các trường hợp không đáp ứng với antimon và amphotericin B [5], [12], [13], [21]

Do vậy, đề tài được thực hiện trên ba dược chất: paromomycin sulfat, itraconazol, berberin clorid

1.3 Thông tin về dược chất

1.3.1 Berberin clorid

1.3.1.1 Công thức

Hình 1.7 Công thức cấu tạo phân tử berberin clorid

- Công thức phân tử: C20H18NO4Cl 2H2O

- Khối lượng phân tử: 407,9 g/mol

- Tên khoa học: 5,6 dihydro-8,9-dimethoxy-1,3-dioxa-6a-azoniaindeno(5,6-a)

anthracen clorid dihydrat

- Công thức phân tử: C23H45N5O14.H₂SO₄

- Khối lượng phân tử: 713,71 g/mol

- Tên khoa học: [(1R,2R,3S,5R,6S)-3,5-diamino-2-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-

(2S,3S,4R,5R,6R)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2R,3S,4R,5S)-5-

(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol sulfat

1.3.2.2 Tính chất

- Độ tan: Tan tốt trong H₂O, khoảng 50 mg/mg

- Không thấm qua vùng da lành nhưng có khả năng thấm qua vùng da nhiễm trùng, tuy nhiên tính thấm kém

1.3.3 Itraconazol

1.3.3.1 Công thức

Hình 1.9 Công thức cấu tạo phân tử itraconazol

- Công thức phân tử: C35H38Cl2N8O4

- Khối lượng phân tử: 705,64 g/mol

- Tên khoa học: 4-[4-[4-[4-[[cis-2-(2,4-diclorophenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

22 Nước cất 2 lần Trường Đại học Dược Hà Nội TCNSX

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu

3 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Agilent HP 1260 Mỹ

4 Cột sắc ký Inertsustain C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm) Nhật

7 Máy đo lưu biến Discovery Hybrid Rheometer HR-1 Mỹ

10 Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,2μm và 0,45 μm Việt Nam

12 Tủ sấy chân không Vacuum Drying LV 02040 Hàn Quốc

14 Máy đo độ bền gel Texture Analyzer CT3 1500 Mỹ

15 Tủ lạnh, tủ sấy tĩnh, các dụng cụ thủy tinh

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, khỏe mạnh nhận từ bộ môn Dược lý - trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu (THEDES) từ thành phần có hoạt tính kháng Leishmania (berberin clorid, paromomycin sulfat)

- Khảo sát và lựa chọn tỉ lệ thành phần tạo DES ở nhiệt độ 80°C trong khoảng thời gian 30 - 90 phút

- Đánh giá đặc tính lưu biến, tính kết dính, khả năng hoà tan một số dược chất có hoạt tính kháng Leishmania của một số DES đã được lựa chọn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế hệ dung môi eutecti

- Sấy chân không các thành phần rắn ở nhiệt độ 55°C; áp suất 0,8 mPa; thời gian sấy 2 tiếng

- Cân chính xác các thành phần vào trong một bình có nắp, bên trong có thanh khuấy, đun nóng ở nhiệt độ 80°C trong khoảng thời gian 30 - 90 phút cho đến khi tạo chất lỏng trong suốt, đồng nhất Thời gian đun nóng phụ thuộc vào thành phần từng hệ, khi tạo chất lỏng trong suốt đồng nhất thì dừng đun, hoặc sau 90 phút không thấy tạo chất lỏng trong suốt, đồng nhất cũng dừng đun

- Trong trường hợp DES tạo thành không ổn định, ví dụ xuất hiện vẩn đục, có thể thêm vào hệ một tỉ lệ nước nhất định

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng tạo hệ dung môi eutecti trị liệu

Đánh giá khả năng tạo THEDES giữa dược chất berberin clorid với các tá dược: ure, glycerin, L-acid malic, acid levunilic, acid glycolic, sorbitol, manitol, glucose, L-(+)-acid tartaric, acid citric; dược chất paromomycin sulfat với các tá dược: ure, cholin clorid, betain anhydrid, L-cartinin, L-acid malic, acid citric, ở các tỉ lệ dược chất là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 (mol/mol)

Đánh giá trên các tiêu chí: khả năng tạo eutecti (có tạo thành dạng lỏng trong suốt, đồng nhất không), thể chất: đặc/sánh nhớt, màu sắc: biến màu/màu không đổi, các tiêu chí được xác định bằng mắt thường

2.3.3 Phương pháp khảo sát tỉ lệ các thành phần tạo hệ dung môi eutecti

Dựa trên các tài liệu tham khảo [10], [11], [36], đánh giá khả năng tạo DES giữa HBA là cholin clorid và HBD là ure, glycerin, acid levunilic, L-acid malic, sorbitol ở các tỉ lệ lần lượt là 1:2, 1:1, 1:1, 1:1, 1:1 (mol/mol) Đánh giá trên các tiêu chí:

 Cảm quan: màu (biến màu/màu không đổi), thể chất, độ trong, độ nhớt, bọt khí, được xác định bằng mắt thường, ngay sau khi đun và để ổn định sau 24 giờ ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ 4ºC (nhiệt độ mùa đông)

 Mùi: dễ chịu/khó chịu

2.3.4 Phương pháp đánh giá độ tan của dược chất trong hệ dung môi eutecti

2.3.4.1 Phương pháp đánh giá độ tan của berberin clorid và itraconazol trong DES

a Thiết kế thí nghiệm đánh giá độ tan

- Cho một lượng dư dược chất vào, khuấy ở nhiệt độ phòng trong ít nhất là 24 giờ, kết hợp với siêu âm để tăng tốc độ tan Với mẫu DES có độ nhớt cao (ChCl:Sor) không khuấy được ở nhiệt độ phòng thì nâng nhiệt độ lên 50°C để khuấy.

- Ở các thời điểm sau khuấy 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ,… để ổn định 24 giờ với mẫu

có nâng nhiệt độ, những mẫu còn lại bỏ qua bước “để ổn định”

- Li tâm lấy dịch trong đem đi định lượng

- Dừng khuấy khi kết quả định lượng dược chất giữa 2 lần kế tiếp là không đổi Xác định thời gian khuấy tối ưu cho các DES

- Từ kết quả định lượng sau thời gian khuấy tối ưu, tính ra độ tan của dược chất trong DES

b Phương pháp định lượng:

 Định lượng berberin clorid

Phương pháp đo quang phổ UV-Vis được xây dựng để định lượng berberin clorid trong các mẫu DES:

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 10 mg berberin clorid, hòa tan

bằng ethanol tuyệt đối trong bình định mức 10 ml thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 g/ml

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các

S = D x Ct

m cân x 10-3

Trong đó:

Ct : nồng độ dược chất trong DES đã pha loãng (µg/ml)

S: độ tan berberin clorid trong DES (mg/g)

m cân: khối lượng mẫu thử cân trên thực tế (g)

 Đánh giá các chỉ tiêu:

DES chứa dược chất thử độ tan Quét phổ các mẫu DES không chứa dược chất

 Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp định lượng bằng đo quang, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu dưới đây:

- Độ tuyến tính: đo quang lần lượt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo nồng độ dược chất với hệ số tương quan R ≥ 0,995

- Độ lặp lại: tiến hành thẩm định độ lặp lại ở nồng độ 8 g/ml Đo quang lặp lại 6 mẫu với một nồng độ Độ lặp lại được xác định thông qua giá trị RSD Yêu cầu RSD < 2%

 Định lượng itraconazol

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được xây dựng để định lượng itraconazol trong các mẫu DES

 Điều kiện sắc kí:

Qua tài liệu tham khảo [31], lựa chọn điều kiện sắc kí như sau:

Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu

Cột sắc ký Inertsustain C18 với kích thước cột 150 x 4,6 mm x 5 µm

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 263 nm

Pha động là dung dịch đệm phosphat 0,01M pH 5,0 - MeOH (20:80) (tt/tt) Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút