Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen cyp2c192, CYP2C193 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại viện tim mạch việt nam

Do đó, để giảm tỷ lệ tử vong cùng các bi ế n cố tim mạch chobệnh nhân ĐTNKÔĐ thì một trong những điều trị cốt lõi là chống hình thành huyếtkhối thông qua ức chế hoạt động của tiểu cầu [5

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

VŨ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT

SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: VŨ PHƯƠNG THẢO

ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT

SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y

Người hướng dẫn: 1 ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu

2 ThS.BS Vũ Ngọc Trung

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rấ t nhiều

sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin trân trọngcảm ơn ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu và ThS.BS Vũ Ngọc Trung là người hướngdẫn khoa học, người thầy đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và những kinhnghiệm quý báu, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoànthành nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp ĐHQGHN, mã số QG.15.32

đã cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Y Dược cùng các thầy cô bộmôn Y Dược học cơ sở đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôithực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các bác sỹ và nhân viên ViệnTim mạch Việt Nam đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình, người thân và bạn bè,những người đã luôn ở bên cổ vũ, khuyến khích, động viên và tạo mọi điều kiệngiúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này

Cuối cùng tôi xin g ửi lời tri ân tới những bệnh nhân đã tham gia vào nhómnghiên cứu, sự đóng góp của các bệnh nhân đã giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốtnghiệp này

Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Vũ Phương Thảo

Creatine Kinase Myocardial Band isoenzymeCyclooxygenase

C-Reactive Protein: Protein phản ứng CDeoxyribonucleic Acid

DeoxyrinucleotidtriphosphateĐộng mạch vành

Đau thắt ngực không ổn địnhĐái tháo đường

Ethylendiamin Tetraacetic AcidGiải trình tự

GlycoproteinGroup proteinHội chứng động mạch vành cấpHigh Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử caoLow Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử thấpMean Corpuscular Volume: Thể tích trung bình hồng cầuMean Platelet Volume: Thể tích trung bình tiểu cầuNhồi máu cơ tim

Ngưng tập tiểu cầuPolymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi polymeraseProstaglandin H2

Prostaglandin I2Platelet Count: Số lượng tiểu cầuRed Blood Cell: Số lượng hồng cầuRối loạn chuyển hóa lipid

Restriction fragment length polymorphism: Đa hình chiều dàiđoạn cắt giới hạn

Single Nucleotide polymorphism: Đa hình đơn nucleotideTăng huyết áp

XVĐM

Thromboxan A2von Willebrand factor: yếu tố von WillebrandWhite Blood Cell: Số lượng bạch cầu

Xơ vữa động mạch

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 24

Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 25

Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3 25

Bảng 2.4 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2 26

Bảng 2.5 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3 26

Bảng 2.6 Cách đọc kết quả kiểu gen CYP2C19 27

Bảng 3.1 Phân bố các yếu tố nguy cơ ở nhóm nghiên c ứu 32

Bảng 3.2 Kết quả cận lâm sàng của nhóm nghiên cứ u 33

Bảng 3.3 Kết quả đo độ NTTC của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 34

Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch c ủa sản phẩm tách DNA 34

Bảng 3.5 Kết quả kiểu gen và tần số alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 39

Bảng 3.6 Tần số phân bố các kiểu gen CYP2C19 của nhóm nghiên cứu 39

Bảng 3.7 Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý do kiểu gen quy định 40

Bảng 3.8 Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*3 40

Bảng 3.9 Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 40

Bảng 3.10 Độ NTTC giữa các kiểu tác dụng dược lý do kiểu gen quy định 41

Bảng 3.11 Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA và béo phì 42 Bảng 3.12 Mối liên quan giữa độ NTTC với số lượng yếu tố nguy cơ 43

Bảng 3.13 Mối liên quan giữa độ NTTC với một số yếu tố cận lâm sàng 43

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới 31

Biểu đồ 3.2 Đặc điểm về tuổi của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 31

Biểu đồ 3.3 Phân bố số lượng yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ĐTNKÔĐ 32

Biểu đồ 3.4 Độ NTTC giữa các kiểu gen trong CYP2C19*2 41

Biểu đồ 3.5 Độ NTTC giữa tác dụng (giảm + kém) và tác dụng bình thường 41

Biểu đồ 3.6 Tần số alen của gen CYP2C19 51

Biểu đồ 3.7 So sánh tần số phân bố các alen CYP2C19 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ 4

Hình 1.2 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng 5

Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu 7

Hình 1.4 Cơ chế tác dụng của aspirin lên quá trình NTTC 8

Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo của các chất sau mỗi bước chuyển hóa 9 Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC 10

Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) 10

Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10 12

Hình 1.9 Vị trí của các exon (hộp đen) và một s ố alen trên gen CYP2C19 12

Hình 1.10 Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc 15

Hình 1.11 Quy trình PCR 16

Hình 1.12 Các kiểu cắt RE 17

Hình 2.1 Nguyên lý của xét nghiệm độ NTTC 28

Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel Agarose 0,7% 35

Hình 3.2 Điện di sản ph ẩ m PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) và CYP2C19*3 (898 bp) trên gel agarose 1% 35

Hình 3.3 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*2 36

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự alen CYP2C19*3 37 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*2 trên gel agarose 1,5%

38

Hình 3.6 K ế t quả điện di sản phẩm cắt của alen CYP2C19*3 trên gel agarose 1,5%

38

1.2 Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu 5

1.3.2.1 Gen CYP2C19……… 11

1.4 Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen

CYP2C19 và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 21

2.4.1 Hóa chất 21

2.5 Các bước nghiên cứu 22

2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3

2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2,

2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sả n phẩm PCR……… 24

2.5.6 Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp

cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp

2.6 Xử lý và phân tích số liệu 29

2.7 Các loại sai số và cách khắc phục 29

2.8 Đạo đức nghiên cứu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1.5 Mối quan hệ giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và

CYP2C19*3 40

3.1.6 Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố khác 42

3.2 Bàn luận 44

3.2.1 Một số đặc điểm chung……….……… 45

3.2.1.1 Đặc điểm về giới……….… 45

3.2.1.2 Đặc điểm về tuổi……… 45

3.2.1.3 Các yếu tố nguy cơ của ĐTNKÔĐ……….…… 45

3.2.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng 47

3.2.3 Kết quả đo độ NTTC 48

3.2.4 Kết quả phân tích kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 49

3.2.5 Mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3………54

3.2.6 Mối liên quan giữa độ NTTC v ới các yếu tố khác 54

3.2.6.1 Mối liên quan giữa độ NTTC và giới……… 54

3.2.6.2 Mối liên quan giữa độ NTTC và các yếu tố nguy cơ…… 54

KẾT LUẬN……… 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đau thắt ngực không ổn định (ĐTNKÔĐ) là một dạng trong hội chứng độngmạch vành cấp (HCMVC) Nguyên nhân dẫn đến ĐTNKÔĐ là do sự nứt vỡ của cácmảng xơ vữa không ổn định, hình thành nên các cục máu đông nhưng chưa gây tắchoàn toàn động mạch vành Tuy nhiên, ĐTNKÔĐ có thể diễn biến nặng thành nhồimáu cơ tim thực sự và gây nên các biến cố tim mạch [26] Tỷ lệ bệnh nhân mắcbệnh, tử vong ngày càng tăng và trở thành gánh nặng cho ngành y tế Mỗi năm tạiHoa Kì có hơn 5 triệu bệnh nhân nhập viện cấp cứu với cơn đau ngực và các triệuchứng liên quan, trong đó 1,4 triệu bệnh nhân là ĐTNKÔĐ hoặc nhồi máu cơ timkhông ST chênh [33] Do đó, để giảm tỷ lệ tử vong cùng các bi ế n cố tim mạch chobệnh nhân ĐTNKÔĐ thì một trong những điều trị cốt lõi là chống hình thành huyếtkhối thông qua ức chế hoạt động của tiểu cầu [53]

Clopidolgrel là một thuốc chống ngưng tậ p tiểu cầu (NTTC) được chỉ định đốivới bệnh nhân HCĐMVC và can thiệp mạch vành qua da Kết hợp clopidogrel vớiaspirin được khuyến cáo là lựa chọn đầu tay trong điều trị ức chế ngưng tập tiểu cầutheo nhiều cơ chế khác nhau Bản thân clopidogrel là một tiền chất thuộc nhómthienopyridine không có hoạt tính Để trở thành chất có hoạt tính ức chế không hồiphục thụ thể P2Y12 trên màng tiểu cầu gây giảm ngưng tập tiểu cầu, chúng cần đượcchuyển hóa qua hệ thống cytochrome P450 (chủ yếu là CYP2C19) ở gan [54], [68].Nghiên cứu cho thấy, clopidogrel có tác dụng làm giảm tới 50% các biến chứng timmạch chính (nhồi máu cơ tim, đột quỵ) ở những bệnh nhân HCĐMVC Tuy nhiên, hiệntượng kháng clopidogrel chiếm tỉ lệ khá lớn, dao động từ 5- 44% trong các quần thểkhác nhau, gây nên gi ảm khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu của clopidogrel [30] Do

đó, vẫn còn một tỉ lệ đáng kể bệnh nhân có nguy cơ tử vong, nhồi máu cơ tim (NMCT),đột quỵ, huyết khối trong stent lên quan đến giảm đáp ứng clopidogrel

[66] Một trong những nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau trong đáp ứng điều trị là

do ảnh hưởng của enzyme CYP2C19 lên quá trình chuyển hóa của clopidogrel [66]

Enzyme CYP2C19 có tính đa hình cao với khoảng 25 alen đã được xác định,trong đó quan trọng nhất là alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3, chiếm tần số cao trongquần thể người châu Á [66] Đa hình di truyền CYP2C19*2 và CYP2C19*3 có thể mãhóa tạo enzym giảm hoặc mất chức năng chuyển hóa thuốc, qua đó giảm khả năngchuyển clopidogrel thành dạng có hoạt tính kháng tiểu cầu dẫn đến tăng các biến cố timmạch Hơn nữa, ở những bệnh nhân mang alen CYP2C19*2, nguy cơ xảy ra các biến

cố tim mạch tăng gấp 3 lần so với những người không mang alen này [71] Tuy

nhiên, cơ chế đáp ứng điều trị kém clopidogrel chưa được làm sáng tỏ đầy đủ,không chỉ do yếu tố di truyền như đa hình gen CYP2C19 mà còn do ảnh hưởng củanhiều yếu tố khác như sự tương tác thuốc, không tuân thủ điều trị, giới tính, tu ổihay các yếu tố lâm sàng kèm theo như tăng huyết áp (THA), đái tháo đường (ĐTĐ),hút thuốc lá, rối loạn chuyển hóa lipid (RLCH lipid), béo phì…[30].

Hiện nay, năm 2015, tại Việt Nam đã có một nghiên cứu của Trần Hòa tạiĐại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh về mối tương quan giữa kiểu genCYP2C19*2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhân được can thiệp đặt stent độngmạch vành (ĐMV) có điều trị clopidogrel Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ tiến hànhtrên những đối tượng bệnh nhân đã được can thiệp ĐMV tại khu vực phía Nam -Việt Nam Do vậy, tính đến thời điểm này, vẫn chưa có nghiên cứu nào về đa hình ditruyền gen CYP2C19 ở bệnh nhân ĐTNKÔĐ tiến hành tại khu v ự c phía Bắc - ViệtNam nhằm đưa ra câu trả lời cho các vấn đề nêu ở trên Vì vậy, xuất phát từ nhu cầuthực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá mối liên quan giữa độ ngưng tậ p tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2, CYP2C19*3 và một số yếu tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định tại Viện Tim mạch Việt Nam”.

Đề tài được tiến hành với 2 mục tiêu:

đau thắt ngực không ổn định.

CYP2C19*3 và một số y ế u tố khác trên bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Đau thắt ngực không ổn định

1.1.1 Định nghĩa

ĐTNKÔĐ là một dạng trong HCĐMVC, được định nghĩa bởi sự xuấ t hiệncác triệu chứng lâm sàng của thiếu máu cơ tim (cơn đau thắt ngực mới xuất hiệnhoặc biến đổi các dạng đau ngực, hoặc sự gia tăng cơn đau thắt ngực lúc nghỉ ngơi,hoặc những biến đổi đau thắt ngực tương đương), không có sự xuất hiện các dấu ấnsinh học do tổn thương cơ tim (troponin), điện tâm đồ có thể thay đổi [29]

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của ĐTNKÔĐ

Xơ vữa động mạch (XVĐM) là quá trình tiến triển bởi sự hình thành cácmảng xơ vữa ở lớp nội mô của động mạch vừa và lớn, diễn ra liên tục và dẫn đếnthiếu máu cấp tính Các yếu tố nguy cơ như: cholesterol máu cao, THA, ĐTĐ, hútthuốc lá, đóng vai trò thiết yếu trong khởi phát XVĐM [43] Chúng làm tổn thươngđến tế bào nội mô của mạch máu và gây rối loạn chức năng nội mô bằng cách làmgiảm hoạt tính sinh học của nitric oxyde, tăng sản xuất endothelin, làm tổn thươngmạch máu, tăng biểu lộ phân tử kết dính (selectin, phân tử kết dính tế bào mạch,phân tử kết dính giữa các tế bào) và tăng cường quá trình đông máu [39]

Viêm đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của mảng xơ vữa Khi các tếbào nội mô bị tổn thương, các tế bào viêm đặc biệt là monocyte sẽ gắn với các phân

tử dính nội mô, đi vào lớp dưới nội mô và biệt hóa thành đại thực bào Các đại thựcbào ăn các phân tử LDL, chuyển thành tế bào bọt và hình thành lên dải chất béo Đểduy trì quá trình viêm, đại thực bào được hoạt hóa sẽ thu hút thêm các đại thực bàokhác bằng cách tiết ra các chất trung gian Thêm vào đó, đại thực bào cũng kíchthích sự tăng sinh và hình thành tế bào cơ trơn ở lưới ngoại bào thông qua việc tiết

ra các cytokin, góp phần hình thành các mô xơ bởi lưới ngoại bào [43]

Nguy cơ vỡ mảng xơ vữa phụ thuộc vào kiểu mảng xơ vữa hơn là kích thước.Lõi vữ a của mảng xơ vữa giàu lipid và không có collagen nâng đỡ Nghiên cứu chothấy k ích thước của lõi vữa tỉ lệ thuận với khả năng vỡ mảng xơ vữa [40] Thêm vào

đó, viêm là một nhân tố quan trọng làm mảng xơ vữa dễ bị tổn thương, liên quan đếntăng hoạt động của đại thực bào và lympho T tại vị trí mảng Sự tăng hoạt động nàylàm kích thước của lõi xơ vữa lớn lên và làm mỏng vỏ bao xơ của mảng do đại thựcbào tạo ra metalloproteinase – enzym tiêu khung ngoại bào và tế bào lympho T cũngtiết ra các enzyme tiêu khung ngoại bào mạnh như tryptase, chymase [56] Bên cạnh

đó, các phân tích bệnh học còn cho thấy, có sự thiếu các tế bào cơ trơn tại các mảng

xơ vữa dễ tổn thương Các chất trung gian trong quá trình viêm có thể làm cho các

tế bào cơ trơn chết theo chương trình hoặc ức chế sự tổng hợp các chất collagen từ

tế bào cơ trơn [56] Tóm lại, các mảng xơ vữa có nguy cơ cao hay dễ bị tổn thươngnếu chúng có các đặc điểm sau: lõi xơ vữa lớn, vỏ bao xơ mỏng, tập trung dày đặcđại thực bào và lympho T, lượng nhỏ tế bào cơ trơn, tăng biểu hiện tại chỗ củametalloproteinase sẽ làm thoái hóa collagen, tăng sinh mạch và xuất huyết tại mảng

và cục huyết khối không làm tắc hoàn toàn động mạch vành, chỉ làm giảm dòng máutới vùng cơ tim do động mạch đó nuôi dưỡng, thì biểu hiện lâm sàng là cơn đau

thắt ngực không ổn định Nội soi động mạch vành cho thấy 73,7% bệnh nhân

ĐTNKÔĐ có huyết khối trong lòng động mạch vành [27,56]

1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán đau thắt ngực không ổn định

Chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn của ACCF/AHA (2012) (American college of Cardiology Foundation/ American Heart Association) [53]:

- Lâm sàng: cơn ĐTNKÔĐ có thể hiện diện dưới các dạng thức khác nhau:

+ Cơn đau thắt ngực xuất hiện dưới đây (4-8) tuần

+ Cơn đau thắt ngực trầm trọng dần thêm (tần số hoặc cường độ hoặc thời gian các cơn đau, giảm đáp ứng với các dẫn xuất nitrat)

+ Cơn đau thắt ngực kéo dài lúc nghỉ ngơi (>15-20 phút) nhưng đáp ứng vớicác dẫn xuất nitrat (nếu không có thể đó là nhồi máu cơ tim không có sóng Q)

- Điện tâm đồ lúc nghỉ có thể thay đổi

- Men CK-MB, troponin T, Ic không tăng

1.2 Tổng quan về ngưng tập tiểu cầu

1.2.1 Sinh lý tiểu cầu

Tiểu cầu là thành phần hữu hình nhỏ nhất của máu, hình đĩa, đường kính 3-4µm,không nhân, được sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tủy xương Quan sát dưới kínhhiển vi, tiểu cầu có cấu trúc siêu phức tạp, gồm hệ thống màng, hệ thống vi quản, hệthống ống đặc, nhiều hạt và hệ thống các kênh mở Màng tiểu cầu gồm 2 lớp lipid képbao quanh tiểu cầu, có các glycoprotein (GP) tác dụng như các thụ thể (receptor) bềmặt và là nơi diễn ra các hoạt động đông máu của tiểu cầu [10] Ngoài ra, màng tiểucầu cũng có thể nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên trong [63]

Hình 1.2 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [10]

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu

Ở trạng thái sinh lý bình thường, khi mạch máu nguyên vẹn, tiểu cầu bị bấthoạt, không bám dính được do hoạt động của nitric oxide, prostacyclin và do khả năngkìm hãm kích hoạt ADP của ADPase (adenosin diphotphatase) từ các tế bào nội mô.Tuy nhiên, khi mạch máu bị tổn thương, tiểu cầu sẽ nhanh chóng bám dính vào thànhmạch, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tập thông qua một loạt phản ứng dẫn đếnhình thành nút tiểu cầu tại mô tổn thương Quá trình tạo tiểu cầu hoạt hóa có thể đượcchia thành các bước: bám dính, ngưng tập và phóng thích các chất [50]

➢ Giai đoạn bám dính

Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng ti ể u cầu nội sinh bị suy yếu, để

lộ lớp dưới nội mô có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von Willebrand(vWF), fibronectin, lamilin…[50,63] Khi tốc độ dòng máu cao, vWF đóng vai trò quantrọng trong bám dính tiểu cầu ban đầu thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V Tuynhiên, khi tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh thì bám dính tiểu cầu ban đầu chủ yếu thôngqua liên kết của collagen với phức hợp GP Ia//IIa Những tương tác này giúp tiểu cầulưu thông chậm lại, từ đó giúp các cặp thụ thể - phối tử tương tác, ràng buộc hơn nữadẫn đến sự bám dính tĩnh [50,52] Đặc biệt, sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP

VI làm hoạt hóa các thụ thể GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa vWF và collagen hình thành liênkết mạnh với GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa [50]

➢ Giai đoạn ngưng tập

Trong giai đoạn NTTC, tiểu cầu dính với nhau tạo thành từng đám (nút tiểucầu) GP IIb/IIIa là một th ụ thể có vai trò quan trọng trong giai đoạn này, có khoảng

4000 - 5000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của màng tiểu cầu bất hoạt Khi tiểu cầuhoạt hóa, các GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, chúng hoạt động như thụ thể gắn vớifibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Tuy nhiên chúng gắn với fibrinogen là chủyếu vì fibrinogen có nồng độ cao trong huyết tương và GP IIb/IIIa có ái lực vớifibrinogen là mạnh nhất Khi liên kết này xảy ra trên các tiểu cầu sẽ tạo nên một cầunối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạnngưng tậ p và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau, diễn ra liên tục cho đến khitạo thành nút tiểu cầu [10,50] Một số chất có khả năng gây NTTC như: ADP,adrenalin, thromboxan A2, collagen, ristocetin…, trong đó ADP là chất gây NTTCquan trọng nhất vì chúng không phụ thuộc vào tác nhân khác và còn giúp cho phản ứngngưng tập của các tác nhân khác diễn ra đầy đủ hơn Hơn nữa, ADP còn có nguồn

gốc từ hồng cầu Do đó, ở những thành mạch bị tổn thương, hồng cầu sẽ bài tiếtADP, làm tăng nhanh nồng độ ADP, giúp tăng NTTC, nhanh chóng tạo nút cầm máuban đầu, làm ngừng chảy máu ADP phát huy hiệu quả tối đa khi gắn kết với c ả 3thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2Y12, P2X1, trong đó P2Y1, P2Y12 là 2 thụ thể cầ nthiết cho hiện tượng NTTC xảy ra tối đa Chúng là một trong những trọng tâm củanghiên cứu về thuốc ức chế NTTC trong dự phòng và điều trị huyết khối [10].

➢ Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu

Sau khi bị ngưng tập bởi các chất gây ngưng tập, các tiểu cầu sẽ xảy ra mộtloạt các biến đổi như quá trình thay đổi hình dạng và phóng thích các yếu tố của tiểucầu Quá trình này rất phức tạp, tiểu cầu biến đổi cả về hình thái và sinh hóa [69]

Hình 1.3 Bám dính và ngưng tập tiểu cầu

(Nguồn:https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4265014_40681_20

1.2.3 Điều trị ức chế NTTC trong ĐTNKÔĐ

Chống hình thành huyết khối thông qua ức chế hoạt hóa tiểu cầu là điều trịcốt lõi trong ĐTNKÔĐ, giúp làm giảm các biến cố tim mạch và giảm tỉ lệ tử vongcho người b ệnh [53] Theo cơ chế tác dụng, các thuốc chống NTTC được phân loạinhư sau [63]:

- Thuốc ức chế Cyclooxygenase (aspirin)

- Thuốc ức chế thụ thể ADP (clopidogrel [Plavix], prasugrel [Effient],

ticlopidine [Ticlid])

- Thuốc ức chế phosphodiesterase (cilostazol [Pletal])

- Thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa (abciximab [ReoPro], eptifibatide

[Integrilin], tirofiban [Aggrastat])

- Thuốc ức chế tái hấp thu Adenosin (dipyridamole [Persantine])

A2 (TXA2) và PGI2 TXA2 khi gặp các tác nhân kích thích (collagen, thrombin, ADP)

sẽ được tổng hợp và phóng thích bởi tiểu cầu, chúng có tác dụng gây co mạch mạnh vàgây NTTC không hồi phục thông qua thụ thể TXA2 Aspirin ức chế COX-1 gây ức chếtạo TXA2, dẫn đến ức chế NTTC Vì tiểu cầu không có nhân,

không thể tổng hợp thêm COX-1 mới nên sự ức chế này rất mạnh, diễn ra trong suốtđời sống của tiểu cầu Tuy nhiên, aspirin còn ức chế men prostacyclin synthetasedẫn đến ức chế sự tổng hợp chất prostaglandin kháng đông là PGI2 (có tác dụng ứcchế NTTC và giãn mạch) của tế bào nội mạc, kết quả là kích thích NTTC Nhưng

do các tế bào nội mạc có nhân có thể tổng hợp ra men mới nên tác dụng này khôngmạnh bằng tác dụng ức chế men COX và không kéo dài [54,68]

1.2.4.2 Clopidogrel

Clopidogrel không có hoạt tính chống NTTC Sau khi được hấp thu tại ruột, cótới 85% lượng clopidogrel được chuyển hóa bởi các enzyme esterase: carboxylesterase(CES), butyrylcholinesterase (BchE) thành chất không có hoạt tính Chỉ có 15% lượngthuốc được chuyển hóa qua hai bước ở gan bởi hệ thống enzyme P-450 (chủ yếu làCYP2C19) tạo thành chất có hoạt tính Chất này có tác dụng ức chế chọn lọc và khônghồi phục quá trình gắn phân tử ADP (adenosin diphosphate) vào các thụ thể (P2Y12)của nó lên bề mặt tiể u cầu, dẫn đến các cảm thụ GPIIb/IIIa không được hoạt hóa vàdẫn đến các tiểu cầu không kết dính được với nhau [54,68]

Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa clopidogrel và công thức cấu tạo

của các chất sau mỗi bước chuyển hóa

(Ngu ồn: conversion-to-an-active-metabolite-Clopidogrel-AM-via_fig1_313838290)

https://www.researchgate.net/figure/Clopidogrel-metabolism-and-its-Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên quá trình NTTC

(Nguồn: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0808227 )

1.3 Tổng quan về đa hình di truyền gen CYP2C19

1.3.1 Đa hình đơn nucleotide

Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism – SNP – đọc là

“snip”) là biến thể di truyền phổ biến nhất trong DNA ở người Gen là một đoạnphân tử DNA mang thông tin mã hóa cho một sản phẩm nhất định Một gen chứa rấtnhiều nucleotide (gồm 4 loại A, T, G và C) Mỗi SNP đại diện cho sự khác biệt mộtnucleotide trong gen đó, tạ o nên sự khác biệt về một gen giữa các cá thể Ví dụ,một SNP có thể thay thế nucleotide cytosine (C) bằng nucleotide thymine (T) CácSNP là sự khác biệt duy nhất, là cơ sở tồn tại giữa các cá nhân [44]

(Nguồn: https://www.tubascan.eu/tubascan/snp/)

SNP được xác định khi tần sốxuất hiện của một alen phải lớn hơn hoặc bằng1% Mặc dù, theo lý thuyết, có thể xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotide, nhưng thôngthường SNP chỉ xuất hiện 2 loại alen Có thể giải thích điều này là do SNP b ắtnguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ gen, chuyển một nucleotide này sangmột nucleotide khác Nếu đột biến xảy ra trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì cácthế hệ sau sẽ mang đột biến này, và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quầnthể Tuy nhiên, chỉ có 2 alen – một alen gốc và một alen đột biến Để có alen thứ 3,cần phải có một đột biến mới xảy ra ở đúng vị trí trước đó trong hệ gen, và cá thểmang đột biến phải di truyền lại được cho các thế hệ sau Khả năng xảy ra là rấthiếm, do đó phần lớn SNP chỉ có 2 alen [78].

SNP có thể xảy ra trong vùng mã hóa nhưng không gây ra sự thay đổi trongtrình tự axit amin, có thể xảy ra ở một vùng mã hóa với sự thay đổi trình tự axitamin, có thể xảy ra trong vùng điều khiển gây ra sự thay đổi biểu hiện gen, hoặc cóthể xảy ra trong một vùng giữa các gen [75]

SNP xuất hiện một lần trong mỗi 300 nucleotide, nghĩa là có khoảng 10 triệuSNP trong hệ gen của con người Chúng có thể hoạt động như các marker sinh học,giúp các nhà khoa học xác định vị trí các gen có liên quan đến bệnh tật Khi SNPxảy ra trong một gen hoặc ở vùng điều khiển gần gen, chúng có thể liên quan trựctiếp đến bệnh tật bằng cách ảnh hưởng đến chức năng gen Hầu hết các SNPs khôngảnh hưởng đến sức khoẻ con người Tuy nhiên, một số SNP đã chứng tỏ được vaitrò rất quan trọng trong nghiên c ứ u sứ c khoẻ con người Các SNP có thể giúp dựđoán phản ứng của một cá nhân đối với một số loại thuốc nhất định, sự nhạy cảmvới các yếu tố môi trường như chất độc và nguy cơ phát triển thành bệnh lý cụ thể.SNP cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của gen bệnh trong gia đình.Các nghiên cứu tiếp theo trong tương lai sẽ được tiến hành để xác định các SNP liênquan đến các bệnh phức tạp như bệnh tim, tiểu đường và ung thư [44]

1.3.2 Gen CYP2C19 và vai trò của chúng trong chuyển hóa thuốc

1.3.2.1 Gen CYP2C19

Enzym cytochrome P450 là các protein màng có chứa hem (hem protein) nằm

ở lưới nội chất của tế bào gan Enzyme CYP bao gồm CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19,

CYP1A2 và CYP2E1, trong đó CYP2C19 là một enzyme quan trọng trong siêu họ cytochrome P450 [80]

Gen mã hóa cho CYP2C19 nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 ở người(10q23.33), có kích thước 90,637bp, từ cặp nucleotide 94,762,624 đến cặpnucleotide 94,853,260.

Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 trên nhiễm sắc thể số 10

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP2C19#location )

Gen CYP2C19 gồm 9 exon, mã hóa cho protein CYP2C19 dài 490 axit amin.Gen CYP2C19 có tính đa hình cao với 25 alen đã được xác định Bên cạnh alenCYP2C19*1 quy định enzym CYP2C19 có hoạt tính chuyển hóa thuốc bình thườngthì các alen như alen *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *17 quy định enzyme CYP2C19giảm, mất hoặc tăng hoạt tính [73] Trong đó alen *2, *3 là 2 đa hình alen quantrọng nhất, chiếm tần số cao trong quần thể người châu Á [68]

(Nguồn:

https://www.researchgate.net/figure/51745678_fig1_Figure-1-Illustration-of-the-CYP2C19-gene-highlighting-the-location-of )

Hình 1.9 Vị trí của các exon (hộp đen) và một số alen trên gen CYP2C19

Alen CYP2C19*1: quy định biểu hiện enzym CYP2C19 có chức năng hoạt động bình thường

- Alen đa hình CYP2C19*2

Alen có kí hiệu rs4244285 ở vị trí (c.681G>A) là đa hình xác định của alenCYP2C19*2, đây là dạng đột biến đồng hoán thay G bằng A ở exon 5 làm xuất hiện

kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợp tử đột biến GA và kiểu gen đồnghợp tử đột biến AA Đột biến này làm khung đọc mRNA bị cắt ngắn hơn bìnhthường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính CYP2C19 *2 là d ạ ng alen mãcho enzyme CYP2C19 mất hoạt tính phổ biến nhất với tần số xuất hi ệ n khoảng12% ở người da trắng, 15% ở người Mỹ gốc Phi và 29-35% ở người châu Á [68].

- Alen đa hình CYP2C19*3

CYP2C19*3 cũng là dạng alen mã hóa cho enzym CYP2C19 mất hoạt tính

có kí hiệu rs4986893 ở vị trí (c.636G>A), đây là dạng đột biến thay G bằng A ởexon 4 làm xuất hiện mã kết thúc sớm ở axit amin 212 Đa hình này tạo ra 3 kiểugen, trong đó, kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại GG, kiểu gen dị hợ p tử đột biến GA vàkiểu gen đồng hợp tử đột biến AA Tần số của alen CYP2C19*3 trong phần lớn cácquần thể là dưới 1%, tuy nhiên tỷ lệ này cao hơn ở người châu Á với 2-9% [68]

Ngoài ra, các alen khác mã hóa cho enzym giảm hoặc mất hoạt tính làCYP2C19*4 (rs28399504), *5 (rs56337013), *6 (rs72552267), *7 (rs72558186) và

*8 (rs41291556) Các alen này có tần số dưới 1% trong các quần thể người [68]

Một số alen khác cũng được xác định trong các quần thể khác nhau với rất ít

dữ liệu được mô tả hoặc được dùng các thuật toán phân tích để dự đoán ảnh hưởngcủa chúng lên chức năng protein [68]

1.3.2.2 Vai trò của CYP2C19 trong chuyển hóa thuốc

Siêu họ enzyme Cytochrome 450 (Cyt-P450) tham gia vào quá trình chuyểnhóa phần lớn các thu ốc khác nhau như thuốc chống ngưng tập tiểu cầu clopidogrel

(Plavix), thu ốc chống động kinh mephenytoin, thuốc ức chế bơm protonomeprazole, thuốc an thần diazepam…, trong đó enzyme CYP2C19 là enzymechính tham gia vào quá trình chuyển hóa thuốc clopidogrel [80]

Một thuốc A khi đưa vào trong cơ thể sẽ đi theo một hoặc các con đường sau [6]:

- Được hấp thu và thải trừ không biến đổi: bromid, lithi, saccharin

- Chuyển hóa thành chất B (pha I), sau đó thành chất C (pha II) và thải trừ

- Chuyển hóa thành chất D ( pha II) rồi thải trừ

Chất A có thể có hoặc không có hoạt tính sinh học, sinh ra chất B có thể cóhoặc không có hoạt tính Chất C, D luôn là chất không có hoạt tính Chất A có thểsinh ra nhiều loại chất B hoặc C [6]

Pha I Qua pha này thuốc ở dạng tan trong lipid sẽ phân cực hơn, dễ tan trongnước hơn Thuốc có thể mất, giảm, tăng hoặc trở nên có hoạt tính sinh học Pha Ixảy ra các phản ứng như phản ứng khử, phản ứng thủy phân, nhưng thường g ặ pnhất là phản ứng oxy hóa với sự tham gia của Cyt-P450 [80].

Pha II Các thuốc đi qua pha này chủ yếu trở thành phức hợp không có hoạttính, dễ tan trong nước và bị thải trừ Các phản ứng ở pha II đều là các phản ứngliên hợp: một phân tử nội sinh (acid glucuronic, glutathion, sulfat, glycin, acetyl) sẽghép với một nhóm hóa học của thuốc để tạo thành các phức hợp tan mạnh trongnước Thông thường, các phản ứng ở pha I sẽ tạo ra các nhóm chức cần thiết chocác phản ứng ở pha II như nhóm -OH, -COOH, -NH2, -SH [80]

Như đã nói ở trên, ở pha I, phản ứng chính là phả n ứng oxy hóa và là phảnứng phổ biến nhất có xúc tác của các enzym oxy hóa, đặc biệ t là cyptochromeP450 Chu trình phản ứng được thực hiện theo các bước chính sau [6]:

Bước 1 Thuốc (Drug) phản ứng với Cyt -P450 dạng oxy hóa (Fe3+) tạo phứchợp Drug - P450 (Fe3+) Cyt-P450 lúc này biến đổi đương lượng từ trạng thái spinthấp thành trạng thái spin cao Sự biến đổi thế năng oxy hóa gây ra bằng cách nàygiúp vận chuyển điện tử thứ nhất thuận lợi

Bước 2 Nhận điện tử thứ nhất từ NADPH, dưới tác dụng xúc tác của enzym

Cyt-P450-reductase tạo phức hợp Drug-P450 dạng khử (Fe2+)

Bước 3 Phức hợp dạng khử này phản ứng với một phân tử oxy để tạo thành

phức hợp oxy hoạt hóa

Bước 4 Phức hợp vừa tạo thành nhận tiếp điện tử thứ 2 từ phân tử NADPH

thứ 2 hoặc từ NADH Hai điện tử nhận được khử phân tử oxy trong phức hợp thuốc

- enzym tạo thành hợp chất trung gian

Bướ c 5 Oxy được hoạt hóa sẽ phản ứng với 2H+ (từ 2 phân tử NADPH+)

tạo thành phân t ử nước, tách ra khỏi hợp chất trung gian trên.

Bước 6 Hợp chất mới thu được, được oxy hóa bằng nguyên tử oxy còn lại

và được giả i phóng (drug-OH); enzym Cyt-P450 trở về trạng thái oxy hóa ban đầu

(Fe3+), hoàn thành một chu kì phản ứng

Kết quả của quá trình chuyển hóa làm thuốc từ không có hoạt tính thànhdạng có hoạt tính

Hình 1.10 Vai trò của enzyme Cytochrome P450 trong chuyển hóa thuốc

(Nguồn: https://doctorlib.info/medical/biochemistry/32.html)

1.3.2.3 Mối liên quan giữa kiểu gen và hoạt tính enzym chuyển hóa thuốc

Hoạt tính enzyme chuyển hóa thuốc dự a vào kiểu gen theo các alen

được phân loại trong bảng như sau [67]:

tự của DNA làm khuôn với tiền chất là các dNTP Chuỗi phản ứng gồm các bước: khởi

đầ u, biến tính, gắn mồi, kéo dài chuỗi và kết thúc Cụ thể, người ta tổng hợp và sửdụng hai đoạn oligonucleotide có vị trí liên kết chặn ở 2 đầu của đoạn DNA cần nhândòng Đoạn thứ nhất có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch mã hóa là mồi xuôi, đoạnthứ hai có trình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch đối mã là mồi ngược DNA khuôn đượcbiến tính bởi nhiệt, tạo điều kiện cho mồi xuôi, mồi ngược đính vào các vị trí ở 2 đầuđoạn DNA cần nhân dòng Với sự có mặt của các tiền chất là dNTP, DNA polymerase

sẽ nhân dòng đoạn trình tự DNA được giới hạn bởi 2 đoạn mồi Trong PCR, DNA đượcgây biến tính và sự tổng hợp DNA diễn ra lặp lại qua

nhiều chu kì nhờ khả năng điều nhiệt của máy Kết quả là, sau mỗi chu kì, số phân

tử DNA lại tăng gấp đôi Đây là phản ứng có độ nhạy cao Vậy nên, chỉ một vài bảnsao DNA, ta có thể thu được hàng tỉ bản sao sau khoảng 30 chu kì (số bản saoDNA= 2n với n là số chu kì phản ứng) [11]

sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau [51]

Mỗi enzym giới hạn nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệuvới nó và được gọi là trình tự nhận biết Các trình tự này có cấu tạo từ 4 đến 6 bp vàphải có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), tức là hai mạch của trình tựhoàn toàn giống nhau khi được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn Ví dụ nhưđoạn DNA được đóng khung dưới đây [51]:

Có 2 loại kiểu cắt RE: cắt đầu bằng và cắt đầu dính.

Hình 1.12 Các kiểu cắt RE

(Nguồn: https://schoolworkhelper.net/restriction-endonucleases-or-restriction-enzymes/)

Cắt đầu bằng: Phân tử DNA được cắt ngay chính giữa palindromic, tạo ra hai

DNA đầu bằng Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng tự kết hợp trở lại

Cắt đầu dính: Cắt bên này và bên kia c ủa tâm đối xứng để tạo hai đầu lệch

nhau một vài bazơ Hai đầu phân tử DNA sau khi cắt có trình tự bổ sung với nhau,

do đó chúng có thể bắt cặp trở lại, hoặc có thể bắt cặp với các phân tử DNA khácđược cắt bởi cùng enzym giới hạn tạo ra những phân tử lai Tính chất này được ứngdụng trong nhân dòng phân tử và tạo DNA tái tổ hợp, góp phần thúc đẩy sự pháttriển của công nghệ di truyền [11,51]

Phân tích PCR - RFLP dựa trên nguyên tắc đa hình vị trí giới hạn trong cácphân đoạn DNA đã được nhân bản bởi PCR Tức là đoạn DNA đích sẽ được khuếchđại bằng kĩ thuật PCR, sau đó chúng được cắt bằng các RE Các phân đoạn tạothành có thể được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhờ nhuộm màu gel, tínhđặc thù của các đoạn này có thể được quan sát trực tiếp hoặc chụp ảnh qua máy soiDNA Sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử DNA sẽ được phản ánh thôngqua số lượng và kích thước của các phân đoạn Sự hiện diện của các đoạn cắt nàyđặc trưng cho từng tổ hợp DNA/ enzym giới hạn Do đó, người ta có thể sử dụngPCR – RFLP để đánh giá trự c tiếp tính biến dị di truyền của sinh vật Ưu điểm củaphương pháp là kỹ thuật đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí và độ tin cậy cao [51]

1.3.3.2 PCR - Giải trình tự

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trật tự chính xáccủa các nucleotide trong phân tử DNA Hầu hết các phương pháp giải trình tự (GTT)DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger Nguyên tắc của phương pháp này làdựa vào việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’dideoxynucleotide

(ddNTP - mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 trên phân tử đường pentose) vào thànhphần phản ứng tổng hợp DNA Khi ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’-OHnên sự tổng hợp sẽ dừng lại, tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau [11].

Phản ứng GTT được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt, mỗi ống bổ sung mộthỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại dNTP này được đánh dấuphóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp Ngoài ra, từng loại trong 4 loạiddNTP sẽ được thêm lần lượt vào mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại dNTP tươngứng Phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào mạch DNA đang tổng hợp, nhưngddNTP cũng sẽ liên kết vào một số mạch DNA đang tổng hợp và làm kết thúc quátrình sao chép Kết quả là hình thành hỗn hợp nhiều phân tử DNA được sao chépkhông hoàn chỉnh, đầu 5’ giống nhau nhưng khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loạinucleotide kết thúc chuỗi Sản phẩm được phân tách trên gel polyacrylamide và đọctrình tự theo thứ tự băng xuất hiện với chiều từ cực dương sang âm [11]

Kỹ thuật Sanger cần nhiều thao tác kỹ thuật, đồng thời việc đọc kết quả điện

di bằng mắt có thể xảy ra sai sót Vậy nên hiện nay, để GTT DNA các hệ gen lớnđều dựa vào phương pháp GTT tự động Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTPđược gắn chất phát quang khác nhau cho mỗi loại Các ddNTP khi được kích thíchbởi nguồn sáng của máy giải trình tự sẽ phát ra tín hiệu khác nhau Thông tin nàyđược một cảm biến tín hiệu kết hợp với máy tính sẽ xử lý và tự động chuyển thànhtrình tự DNA Ưu điểm của phương pháp là khả năng tự động hóa phần lớn cácbước của quá trình phân tích và có độ nhạ y, tốc độ đọc, mức độ chính xác cao (đặcbiệt là đoạn DNA dài từ 30 đến 1000 bp) [11]

Nguyên lý: RT- PCR cũng là một phản ứng tái bản các trình tự đặc hiệu nhưng

có sử dụng thêm chất phát huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang được phát hiện ngaytrong bước bắt cặp mồi và kéo dài chuỗi DNA Do đó Real-time PCR còn có thể sửdụng để định lượng hoặc bán định lượng DNA như định lượng số bản copy của virusviêm gan B,C Bên cạnh đó, phương pháp cũng có thể giúp xác định tỷ lệ biến đổi gen

có trong mẫu, phát hiện các khác biệt SNP và xác định kiểu di truyền [77]

1.4 Tình hình nghiên cứu mối liên quan giữa độ NTTC với kiểu gen CYP2C19

và các yếu tố khác trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ trên thế giới và trong nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối tương quan giữa độNTTC với kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân bệnh mạch vành

Nghiên cứu của Sibbing và các cộng sự (2009) trên 2485 bệnh nhân can thiệpđộng mạch vành qua da cho thấy: tỉ lệ các biến cố huyết khối đặt stent ở những bệnhnhân mang alen đột biến CYP2C19*2 tăng gấp 3 lần so với những bệnh nhân mangđồng hợp tử kiểu dại với p=0,007 [71]

Nghiên cứu đa trung tâm, ngẫu nhiên, mù đôi ELEVATE-TIMI (2011) tiến hànhtrên 333 bệnh nhân bị bệnh tim tại 32 điểm từ tháng 10/2010 đến tháng 9/2011 Cácbệnh nhân mang kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2 liều clopidogrel 225 mg có tác dụngdược lý tương đương với liều chuẩn 75 mg, còn với bệnh nhân mang kiểu gen đồnghợp tử CYP2C19*2 thì liều 300mg cũng không có tác dụng chống NTTC [49]

Yang J và cộng sự (2013) cho thấy rằng ở những người mang 1 alen đột biến(*1/*2, *1/*3) và 2 alen đột biến (*2/*3, 2 /*2, *3/*3) có độ NTTC tối đa với ADP caohơn so với những người mang kiểu dại (*1/*1) với p lần lượt là 0,002 và 0,0039 [81]

Yu Chen và các cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu trên 336 bệnh nhânHCĐMVC có can thiệp mạch vành qua da, theo dõi sau 1 tháng và 6 tháng Với nhómbệnh nhân mang alen CYP2C19*2, có độ NTTC cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhómmang kiểu gen dại ở cả thời điểm nhập viện và sau 1 tháng (p lần lượt là 0,005 và 0,003).Đồng thời, nguy cơ các biến cố tim mạch chính ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 cũngcao hơn so với nhóm bệnh nhân mang alen kiểu dại CYP2C19*1 với p=0,003 [37]

Các nghiên cứu trên đều cho thấy, alen CYP2C19*2 chiếm tỉ lệ khá cao trongquần thể nghiên cứu Những bệnh nhân mang alen này cũng cho thấy có biến cố timmạch nặng hơn so với những người không mang gen Điều này phần nào khẳngđịnh vai trò c ủa CYP2C19*2 trong kháng thuốc clopidogrel

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tính tới thời điểm này, chưa có nghiên cứu nào về mối liên quan giữa độ NTTCvới kiểu gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ ở Việt Nam, mới chỉ có các nghiêncứu về mối liên quan độ NTTC với một số yếu tố trên bệnh lý khác nhau

Nguyễn Thị Nữ, Cung Thị Tý và Đỗ Trung Phấn (1997) nghiên cứu “Chỉ sốNTTC ở người trưởng thành Việt Nam bình thường” với chất kích tập tiểu cầu collagennồng độ 1mg/ml là 65,5±6,7%; với chất kích tập ADP nồng độ 10µM là 67±6,5%.Không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê về độ NTTC giữa nam và nữ [17].

Trương Thị Minh Nguyệt (2003) nghiên cứu độ NTTC trên bệnh nhân thiếumáu cục bộ cơ tim với chất kích tập ADP nồng độ 5µM là 71,6±8,83%, trong đó độNTTC ở nhóm NMCT cấp là 74,46±9,95%, tăng có ý nghĩa so với nhóm chứng ởtất cả các bệnh nhân thiếu máu cục bộ cơ tim có các yếu tố nguy cơ như THA,ĐTĐ, béo phì, hút thuốc lá, tiền sử gia đình bị tim mạch Mức tăng độ NTTC cómối liên quan đồng biến mức độ vừa với hàm lượng fibrinogen huyết tương và có

xu hướng tăng theo số lượng nhóm nguy cơ [15]

Nghiêm Hoàng Lan Phương (2007) cũng nghiên cứu về độ NTTC ở bệnhnhân NMCT cấp trước và ĐMV cho thấy: độ NTTC ở người bị NMCT cấp là74,3±10,2%, cao hơn so với người bình thường là 67±6,5% Bệnh nhân NMCT cấp

có nhiều yếu tố nguy cơ thì độ NTTC sẽ cao hơn người có ít yếu tố nguy cơ ĐộNTTC giảm rõ rệt sau liều điều trị tấn công của thuốc chống NTTC (Plavix+Aspirin+ Lovenox) so với trước can thiệp [18]

Trần Hòa và Trương Quang Bình (2015) nghiên cứu mối tương quan giữakiểu gen giảm chức năng CYP2C19 *2, CYP2C19*3 và tiên lượng ở bệnh nhânđược can thiệp đặt stent động mạch vành có điều trị clopidogrel Hiện tại nghiêncứu vẫn đang thực hiện và chưa công bố kế t quả cuối cùng

Như vậy, cho tới nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về mối liên quangiữa độ NTTC với đa hình di truyền gen CYP2C19 trên bệnh nhân ĐTNKÔĐ Do

đó, việc tiếp tục nghiên cứu theo hướng này điều rất cần thiết, giúp công tác điều trị

và phòng bệnh ĐTNKÔĐ được tốt hơn

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán ĐTNKÔĐ theo tiêu chuẩn ACCF/AHA(American College of Cardiology Foundation/ American Heart Association) (2012)

Bệnh nhân sau khi nhập viện, điều trị với liệu pháp kháng tiểu cầu kép vào ngày thứ 3 với liều duy trì aspirin (100mg/ngày) kết hợp clopidogrel (75mg/ngày)

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân phải dùng thêm bất cứ một loại thuốc chống ngưng tập tiểu cầu nào khác ngoài aspirin và clopidogrel

- Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu t ạng

- Tai biến mạch não dưới 3 tháng

- Mới phẫu thuật dưới 1 tuần

- Nguy cơ cao chảy máu

- Suy thận, suy gan giai đoạn cuối

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

➢ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 1/2018

➢ Địa điểm thu mẫu: Viện Tim mạch Việt Nam

➢ Địa điểm nghiên c ứ u:

- Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Viện Tim mạch Việt Nam

- Viện nghiên cứu hệ gen

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang

Cỡ mẫu nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện Đốitượng nghiên cứu thỏa mãn các tiêu chuẩn, đồng ý tham gia nghiên cứu, được lựa chọnliên tục cho đến khi đủ cỡ mẫu (54 bệnh nhân) tại Viện Tim mạch Việt Nam

2.4 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.4.1 Hóa chất

- Cặp mồi tự thiết kế,

được đặt tổng hợp từ hãng IDT- Mỹ 21

- Lambda DNA/HindIII Marker, code SM0103, hãng Fermentas.

- GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, code SM0321, hãng Thermo

Scientific

- Q5 High – Fidelity DNA polymerase, hãng Neb (New England Biolabs)

- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code D3392, hãng Omega-Biotek

- GeneJET PCR Kit, hãng Thermo Fisher Scientific

- Chất kích tập là ADP 5 µM của hãng Nippon Corporation (Nhật Bản)

2.4.2 Thiết bị

-Máy PCR Prime Thermal Cycler (Code: 5PRIME/02, Anh)

-Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)

-Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ

-Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu Chrono – LOG của Mỹ

2.5 Các bước nghiên cứu

2.5.1 Quy trình nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:

2.5.2 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu

➢ Cách lấy mẫu: 4ml máu lấy từ tĩnh mạch người bệnh, được chuyển vào ống

chuyên dụng có sẵn chất chống đông EDTA, đảm bảo không bị nhiễm bẩn Ghi đầy đủthông tin của bệnh nhân và mã code để tránh nhầm các mẫu với nhau Lượng máu

ở mỗi ống đủ cho hơn một lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu để có thểlặp lại việc tách DNA tổng số cho đến khi kiểu gen của bệnh nhân được xác định

➢ Bảo quản mẫu: Mẫu được bảo quản trong điều kiện ngăn đá tủ lạnh dân dụng

không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển đảm bảo nguyên tắc an toàn sinh học đếnphòng thí nghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia HàNội Mẫu tiếp tục được bảo quản trong điều kiện lạ nh -30˚C đến khi sử dụng

➢ Kí hiệu mẫu: Ống mẫu phải có đầy đủ các thông tin bao gồm: mã bệnh nhân,

tên, tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin của mỗi mẫu phải được lưu lại trong sổ gồm: mãbệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu sau khi bàn giao và khi sử dụng

2.5.3 Tách chiết và kiểm tra chất lượng DNA tổng số

2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Chúng tôi sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số

Nguyên lý kit: Dưạ trên sự hấp thụ chọn lọc của các axit nucleic vào màng

silica-gel trong điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính bao gồm:

- Phá vỡ tế bào để giải phóng DNA

- DNA liên kết với màng silica-gel

- Loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer

- Thu nhận DNA tổ ng số

2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số

Sau khi tách chiết, DNA tổng số được kiểm tra theo hai phương pháp sau:

Thực nghiệm được tiến hành tại bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược,Đại học Quốc gia Hà Nội Chúng tôi sử dụng máy Eppendorf Bio Photometer Plus.Các bước của quy trình thao tác chung:

- Đo Blank: Đo với môi trường được sử dụng để bảo quản/ pha loãng mẫu DNA

- Đo mẫu DNA

Các mẫu được đo ở 2 bước sóng: 260nm và 280nm, mỗi mẫu đo ít nhất 2 lần

và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu

➢ Kiểm tra DNA bằng phương pháp điện di

- Điều kiện điện di: Điện di trên gel agarose 0,7% pha trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 90V, thời gian chạy 60 phút

- Thể tích mẫu điện di: 5 µl mẫu + 1µl DNA 6X loading dye, 5µl Ruler 100

2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR

và kiểm tra chất lượng sản phẩm

2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 bằng PCR

Nguyên lý: Nguyên lý của kĩ thuật PCR để khuếch đại đoạn trình tự DNA

mong muốn là: DNA mới được tổng hợp từ 1 DNA khuôn ban đầu bằng enzympolymerase Thành phần chính của phản ứng bao gồm: DNA khuôn, mồi, dung dịchđệm, 4 loại deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP) và DNA polymerase Quy trìnhgồm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95˚C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép

- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống thích hợp để mồi tự bắt cặp vàosợi DNA khuôn Nhiệt độ này phụ thuộc vào mồi sử dụng như trình tự và số lượngnucleotide của mồi

- Giai đoạn kéo dài: Enzyme DNA polymerase sẽ tổng hợp mạch

polynucleotide mới dựa vào mạch khuôn và 4 loại dNTP tại nhiệt độ 72˚C [24].Trình tự mồi nhân dòng các alen *2 và *3 được trình bày dưới đây:

Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng các alen CYP2C19*2 và CYP2C19*3

Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 Thành phần

2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng s ản phẩm PCR

Phương pháp điện di được sử dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR.Quy trình được tiến hành tương tự như điện di kiểm tra chất lượng tách chiết DNA

2.5.5 Tinh sạch sản ph ẩ m PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:

1 Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1:1 Mix đều

2 Nếu DNA <500 bp, thêm isopropanol 100% với tỉ lệ 1:2 Mix đều

3 Chuyể n 800µl hỗn hợp từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, sau

đó ly tâm trong 30 - 60 giây, loại bỏ phần dịch lọc

6 Chuyển cột lọc sang ống ly tâm vô trùng 1,5ml Thêm 50µl Elution Buffer Ủtrong 1 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm, thu dịch lọc.

7 Bảo quản sản phẩm tinh sạch ở -20˚C

25

2.5.6 Xác định kiểu gen của SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp cắt bằng enzym giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp giải trình tự

Sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR sẽ được pha loãng hoặc cô đặc đế n nồng

độ 40 - 50ng/µl và tiến hành cắt bằng enzym giới hạn (RFLP) Mỗi mẫu sẽ được cắt(quá trình ủ) ở 2 thời gian trong vùng thời gian cắt hoàn toàn tối ưu để đảm bảophản ứng cắt xảy ra hoàn toàn, cũng như để kiểm tra tính lặp lại của phản ứng

Quy trình RFLP phân tích kiểu gen của alen *2, *3 được thể hiện dưới đây:

Bảng 2.4 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *2

Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất có kích thước: 719 bp

Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 526 bp và 193 bp.Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 719bp, 526bp và 193 bp

Bảng 2.5 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen của alen *3

Kiểu gen AA điện di cho 1 băng duy nhất kích thước: 898 bp

Kiểu gen GG (kiểu gen dại) điện di cho 2 băng có kích thước: 523 bp và 375 bp.Kiểu gen GA điện di cho 3 băng có kích thước: 898 bp, 523 bp và 375 bp.Sau khi có kết quả kiểu gen của SNP CYP2C19*2 và CYP2C19*3 sử dụng

26