Ứng dụng phương pháp thiết kế và phân tích dữ liệu insilico (isida) trong thiết kế hợp chất acid hydroxamic mới ức chế HDAC2

Nhờ những tiến bộ trong di truyền học và sinh học phân tử, Histondeacetylase HDAC được chỉ ra là một trong những đích tác dụng phân tử cho điềutrị ung thư, trong đó HDAC2 thuộc nhóm I đư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ACID HYDROXAMIC MỚI ỨC CHẾ HDAC2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ACID HYDROXAMIC MỚI ỨC CHẾ HDAC2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: 1 TS LÊ THỊ THU HƯỜNG

2 TS PHẠM THẾ HẢI

Hà Nội – 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Lê Thị Thu Hường, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền

-khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tình trực tiếp chỉbảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại học

Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y Dược,Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm khóa luận, đượchọc tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và bạn

bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập, nghiêncứu hoàn thành luận văn

Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện còn hạnhẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiến đónggóp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, Ngày 25 tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Đoàn Việt Nga

Sai số tuyệt đốiPhương pháp hồi quy tuyến tính đa biếnTập kiểm tra

Hệ số tương quan chéo

Hệ số xác định cho tập kiểm tra

Tương quan định lượng giữa cấu trúc – tácdụng

Sai số toàn phươngSuberoylanilide hydroxamic acidTập huấn luyện

Tham số phân tử

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình1.1: Quá trình acetyl hóa histone / deacetyl hóa được điều chỉnh bởi các

enzyme HAT và HDAC 5

Hình 1.2 : Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 5

Hình 1.3 : Mối liên quan của các dạng HDAC khác nhau tới quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào 9

Hình 1.4: Cấu trúc một số dãy acid hydroxamic được tổng hợp 13

ở Việt Nam 13

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid hydroxamic 20

thu thập được 20

Hình 2.2: Các bước xây dựng mô hình QSAR và ứng dụng mô hình trong thiết kế và dự đoán 22

Hình 2.3: Cơ chế đếm mảnh cấu trúc trong mô tả phân tử ISIDA 23

Hình 2.4: Biểu di n công thức N- 5-hydroxypyridin-2-yl acetamide theo chương trình tô màu và gắn nhãn 24

Hình 2.5: Hai loại mảnh cấu trúc theo chuỗi và nhánh với các phân loại: nguyên tử và liên kết, chỉ nguyên tử, chỉ liên kết 25

Hình 3.1: Các mảnh cấu trúc sử dụng trong mô hình QSAR 29

Hình 3.2: Các mảnh cấu trúc quan trọng được lựa chọn trong mô hình M1, M2 và M3 phản ánh mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học ức chế enzyme HDAC2 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng 11

Bảng 2.1: Giá trị IC50 thực nghiệm của 45 hợp chất trong CSDL 21

Bảng 3.1: Các thông số đánh giá chéo và độ thích hợp của các mô hình tuyến tính trên tập TS 31

Bảng 3.2: Tính toán khả năng dự đoán của mô hình tuyến tính trên tập PS 32

Bảng 3.3: Cấu trúc và giá trị dự đoán IC50 của các hợp chất mới thiết kế 36

Bảng 3.4: Dẫn xuất của khung 4a 37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư 3

1.1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới 3

1.1.2 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam 3

1.2 Tổng quan HDAC 4

1.2.1 Khái niệm histon deacetylase 4

1.2.2 Phân loại các histon deacetylase 6

1.2.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC2 7

1.3 Các chất ức chế histon deacetylase 10

1.3.1 Trên thế giới 10

1.3.2 Tại Việt Nam 11

1.3.3 Cấu trúc các chất ức chế HDAC 13

1.3.4 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 14

1.4 Mô hình tương quan định lượng tính chất – tác dụng (QSAR) 15

1.4.1 Lịch sử QSAR 15

1.4.2 Đại cương về QSAR 15

1.4.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Cơ sở dữ liệu (CSDL) 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp thiết kế và dự đoán hợp chất thiết kế mới bằng mô hình QSAR từ mảnh cấu trúc 21

2.2.2 Tính toán tham số phân tử 23

2.2.3 Thiết k ế tập huấn luyện và tập kiểm tra 25

2.2.4 Xây dựng mô hình 26

2.2.5 Đánh giá mô hình 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả 27

3.1.1 Các mô hình QSAR thu được 27

3.1.2 Đánh giá mô hình 30

3.1.3 Ứng dụng trong thiết kế hợp chất mới và dự đoán hoạt tính 34

3.2 Bàn luận 37

3.2.1 Về phương pháp tính toán tham số phân tử 37

3.2.2 Về mô hình QSAR 37

3.2.3 Về thiết kế hợp chất mới 38

3.2.4 Kết quả dự đoán khả năng ức chế HDAC2 của các hợp chất acid hydroxamic mới 38

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Theo báo cáo thống kê của tổ chức Y tế giới WHO , ung thư là căn bệnh giếtngười hàng đầu thế giới mỗi năm với khoảng 14 triệu ca mới phát hiện và 8,2 triệutrường hợp tử vong số liệu tính đến hết năm 2012, theo báo cáo số 297, cập nhậttháng 6 năm 2014 Dự báo, số lượng bệnh nhân mắc mới sẽ tăng lên hơn 70% trong

2 thập kỷ tới So với thế giới, Việt Nam thuộc nhóm các nước đứng thứ 2 vì tỉ lệmắc ung thư [27]

Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới chống lạiung thư luôn là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học, trong đó có ViệtNam Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc nói chung và các thuốc điềutrị ung thư nói riêng hiện nay vẫn chủ yếu dựa trên các phương pháp thực nghiệmthử-lỗi với nhược điểm là tốn thời gian, tiền bạc và cho hiệu quả thấp [30] Ngoài ra,các thuốc điều trị ung thư hiện đang còn nhiều hạn chế Do đó yêu cầu cấp bách đặt

ra là phải nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọctrên đích phân tử nhằm phát huy tối đa hiệu quả, ít độc hơn

Nhờ những tiến bộ trong di truyền học và sinh học phân tử, Histondeacetylase (HDAC) được chỉ ra là một trong những đích tác dụng phân tử cho điềutrị ung thư, trong đó HDAC2 thuộc nhóm I được đánh giá là một đích phân tử quantrọng do có biểu hiện quá mức trong quá trình deacetyl hoá các histon xảy ra ở hầuhết các dòng tế bào ung thư người [14, 66] Vì vậy, các chất ức chế HDAC2 đangtrở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng [6, 8, 43]

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu xác định, pháthiện và thử hoạt tính của hợp chất ức chế HDAC2 có nguồn gốc tự nhiên và tổnghợp hóa học [3-5] Trong các nhóm chất ức chế HDAC2, các acid hydroxamic lànhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất vì có cấu trúcđơn giản, có khả năng tổng hợp với điều kiện của Việt Nam Acid hydroxamic cónhóm –NHOH tạo được phức bền với Zn2+ ở trung tâm hoạt động của HDAC2mang lại hoạt tính ức chế enzyme mạnh Để vừa tiết kiệm thời gian công sức cũngnhư tính đặc hiệu, nghiên cứu đã lựa chọn thực hiện theo phương pháp thiết kếthuốc hợp lý dựa trên khung cấu trúc acid hydroxamic

Trong những năm gần đây, nghiên cứu sàng lọc hợp chất ức chế HDAC2 dựa

trên các phương pháp trợ giúp bởi máy tính, hay còn gọi là phương pháp in silico đã trở thành một hướng đi mới, đầy tiềm năng [48] Các mô hình in silico là các mô

hình toán học thể hiện mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính

(QSAR – Quantitive Structure Activity relationships), được ứng dụng chủ yếu trong

dự đoán hoạt tính và cơ chế tác dụng, sàng lọc virtual screening các hợp chất có

hoạt tính từ các cơ sở dữ liệu hợp chất Tuy nhiên ngày nay, thay vì phải sàng lọchàng triệu hợp chất từ các thư viện để tìm ra hợp chất dẫn đường-điểm khởi đầu cho

thiết kế thuốc, phương pháp dựa trên mảnh cấu trúc FBDD-Fragment based drug

discovery bắt đầu với tập hợp các phân tử cấu trúc nhỏ dựa trên cấu tạo của đích và

đồng thời các mảnh cấu trúc này sẽ được ứng dụng trong thiết kế hợp chất mới Mộttrong số các FBDD sử dụng phổ biến hiện nay là mô tả phân tử thiết kế và phân tích

dữ liệu in silico (ISIDA-In Silico design and Data Analysis Với mô tả phân tử ISIDA, quá trình thiết kế thuốc mới trong điều trị ung thư sẽ được tối ưu hóa do ứng

dụng linh hoạt mô tả trong sàng lọc, dự đoán và thiết kế hợp chất mới

Từ các vấn đề nêu trên, mục tiêu chung của nghiên cứu này là “Ứng dụng

mô tả phân tử ISIDA trong thiết kế các hợp chất ức chế enzyme histone deacetylase 2 trong điều trị ung thư” Với mục tiêu cụ thể:

- Xây dựng được các mô hình toán học QSAR sử dụng mô tả phân tử ISIDA định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính ức chế HDAC2

- Đánh giá mô hình QSAR theo các thông số thống kê

- Ứng dụng mô hình xây dựng được trong sàng lọc, dự đoán và thiết kế hợp chất mới

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư

1.1.1 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới

Ung thư đang là một trong những căn bệnh dẫn đến tử vong hàng đầu trêntoàn thế giới Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới-WHO, trong năm 2012, cókhoảng 14 triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tửvong liên quan đến ung thư Trong số đó, các ca tử vong do các ung thư chủ yếu là:ung thư phổi 1,59 triệu ca , ung thư gan 745000 ca , ung thư dạ dày 723000 ca , ungthư đại trực tràng 694000 ca , ung thư vú 521000 ca , ung thư thực quản (400000 ca)[33]

Dự kiến, số lượng các ca ung thư mới sẽ có khả năng tăng khoảng 70% trongvòng hai thập kỉ tới, số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14 triệu trong 2012lên 22 triệu trong vòng hai thập kỉ tới Hơn 60% số các ca ung thư mới hàng nămtrên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và Nam Mỹ, chiếm 70% số các ca tửvong ung thư thế giới [33]

5 yếu tố nguy cơ hàng đầu về hành vi và chế độ ăn uống có liên quan đến30% trường hợp tử vong do ung thư đó là: chỉ số khối cơ thể cao béo phì , ăn ít rauquả tươi, ít tập thể dục, nghiện thuốc lá hoặc rượu Ngoài ra, các bệnh nhi m virusHBV, HCV và một số type Human Papilloma Virus HPV là nguyên nhân của trên20% số các ca tử vong ung thư ở các nước thu nhập thấp và thu nhập trung bình[38]

1.1.2 Thực trạng mắc bệnh ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam

Vào năm 2012, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở Việt Nam trên nam giới

là gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dạ dày 9.406 ca, đại trực tràng 4.561 ca và mũihọng 3.301 ca; các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: vú 11.067 ca, phổi 5.783 ca,gan 5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca và dạ dày 4.797 ca [64] Tổng số ca tử vong doung thư là 91.600 ca, trong đó: số nam giới tử vong do ung thư là 58.200 ca: ung thưgan chiếm 26,9%, phổi 24,4%, dạ dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trựctràng 5,2% và do ung thư khác là 23,2%; số nữ giới tử vong do ung thư là 33.400ca: ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, vú 12,5%, dạ dày 12,1%, đại trực tràng8% và do ung thư khác là 39,3% [64]

1.2 Tổng quan HDAC

1.2.1 Khái niệm histon deacetylase

Nhi m sắc thể được cấu thành bởi: ADN, protein histon và protein khôngphải histon [29] Đơn vị cơ bản của nhi m sắc thể là nucleosom Mỗi nucleosomgồm 146 cặp base ADN được gói trong một protein histon octame [34] tạo bởi 4thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [15]

Vào năm 1964, Allfrey VG, Faulkner R, Mirsky AE [7] đã khám phá ra quátrình acetyl hóa thuận nghịch của protein histone và ý nghĩa của biến đổi sau phiên

mã này với điều hòa biểu hiện gen Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng các đầu aminocủa protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình methyl hóa, phosphoryl hóahoặc acetyl hóa sau dịch mã Quá trình acetyl hoá là một trong những cơ chế điềuhoà chính của biểu thị gen, là chìa khóa làm thay đổi cấu trúc nhi m sắc thể và biếnđổi sau phiên mã Deacetyl hóa histone là quá trình ngược lại của acetyl hóa, làmtăng tương tác ion giữa histon tích điện dương và ADN tích điện âm, giúp đóngxoắn bằng cách cho cấu trúc chromatin nhỏ gọn hơn và ngăn chặn sự sao chép gen

vì đã làm hạn chế khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã Ngoài ra, acetyl hóahistone còn liên kết với các chức năng bộ gen khác như lắp ráp chromatin, sửa chữaDNA và tái tổ hợp Kiểm soát quá trình biểu thị gen này phụ thuộc vào sự cân bằnggiữa hoạt động của enzym histon acetylase và enzym histon deacetylase, nhờ vào sựđiều hoà quá trình acetyl hoá lysin ở phần đuôi histon [10] Ngoài ra, quá trìnhacetyl hóa cũng liên quan đến rất nhiều protein không histone non-histone proteins)với bản chất có vai trò như một chất nền đóng vai trò quan trọng trong việc quy định

sự biểu hiện gen cũng như các protein khác trong các con đường điều tiết sự tăngsinh tế bào, di chuyển tế bào, chu trình chết của tế bào và tạo mạch Histonacetyltransferase (HAT) là enzym acetyl hóa nhóm ε-NH2 trong gốc lysin đầu N tậncủa histon, làm trung hòa điện tích dương trên lysin, do đó giảm khả năng tương táccủa histon với ADN tích điện âm tạo cấu trúc mở chromatin Vì vậy, sự acetyl hóahiston tạo điều kiện cho quá trình phiên mã, dịch mã xảy ra hình 1.1b [10, 28]

Histon deacetylase HDAC là enzym có tác dụng đối lập với HAT HDAC loại

bỏ nhóm acetyl từ acetyl lysin Ac-Lys ở đầu N tận của histon, làm đóng xoắnchromatin, do đó ức chế quá trình phiên mã Hình 1.1

Hình1.1: Quá trình acetyl hóa histone / deacetyl hóa đƣợc điều chỉnh bởi các

enzyme HAT và HDAC (Nguồn: www.quora.com)

Trung tâm hoạt động HDAC gồm 2 phần chính Hình 1.2 : ion Zn 2+ làcoenzyme của HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống Cấu trúc rất linh động, cóthể biến đổi phù hợp với chiều dài cơ chất khác nhau Trên miệng túi có một vànhnhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein, phần vành này sẽ tương tác vớinhóm nhận diện bề mặt HDAC [40, 61]

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC

(Nguồn: PNAS (2004) 101, 15064-15069)

1.2.2 Phân loại các histon deacetylase

Tính đến nay, các nhà khoa học đã chỉ ra 18 loại HDAC khác nhau, đượcchia thành 4 nhóm (I-IV trong đó các HDAC phụ thuộc vào Zn2+ thuộc nhóm I, II

và IV được gọi là các HDAC “kinh điển” và thường được sử dụng để sàng lọc vàthiết kế các chất ức chế HDAC mới [36, 40, 46, 67]

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8 Các enzym này có ở phầnnhân của nhiều loại tế bào Các HDACs nhóm I có kích thước nhỏ, thường biểuhiện ở khắp mọi nơi trong các mô khác nhau của trên người và thường đóng một vaitrò chính trong sự tồn tại của tế bào, sự sinh trưởng phát triển và sự khác biệt

Nhóm II gồm nhóm IIa và nhóm IIb Trong đó nhóm IIa có HDAC4,HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10 Các enzym này biểuthị mô đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân

Nhóm III: Các protein điều hoà chuỗi thông tin 2 SIRT : SIRT 1 – 7, chúng

có ở bào tương, ty thể và nhân

Nhóm IV: HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào

Các enzym nhóm I, II và IV phụ thuộc vào Zn2+ Nhóm III là các enzym cócấu trúc phụ thuộc NAD [54, 67] Nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8) có cấu trúc tương đồng

với Rdp3 ở tế bào nấm men S.cerevisiae, có chức năng ức chế phiên mã, chỉ hoạt

động khi nằm trong phức hợp protein HDAC nhóm I có ở nấm men, động vật có vú

và thực vật Ở động vật có vú, các HDAC này được chia thành 2 phân nhóm làHDAC1/2 và HDAC3

-HDAC1 và 2 có cấu trúc khá tương đồng 82% Vùng xúc tác nằm ở đầu Ntạo nên phần chính của protein Các cofactor là cần thiết cho hoạt động của HDAC.HDAC1, 2 hoạt động khi nằm trong phức hợp như phức hợp SIN 3,NuRD/NRD/Mi2 và CoREST Phosphoryl hóa serin trên HDAC1, 2 điều hòa hoạtđộng của chúng và tạo nên phức hợp với các cofactor khác [24, 53]

-HDAC3 được tìm thấy trong phức hợp với N-coR (nuclear receptor

copressor và phức hợp với SMRT Khoảng 68% vùng các acid amin của HDAC3

cần thiết cho cả hoạt tính deacetyl hóa và ức chế phiên mã [53]

-HDAC8 không được xếp vào phân nhóm nào vì nó chủ yếu có ở động vật

có xương sống Hoạt động của HDAC8 giảm khi phosphoryl hóa bởi protein kinase

A [53, 57]

Nhóm II gồm HDAC 4,5,7,9 nhóm IIa và HDAC6,10 nhóm IIb tương đồngvới HDAC1 trong tế bào nấm men HDAC nhóm II có kích thước phân tử lớn vàkhác biệt so với HDAC nhóm I do có đầu N tham gia váo quá trình ức chế

phiên mã Nhóm này chứa tín hiệu định vị ngoài nhân NES nên có thể di chuyển từ nhân ra bào tương và ngược lại [31].

Nhóm III gồm SIRT1-7 tương tự Sir2 ở tế bào nấm men HDAC nhóm III nàykhông liên quan đến các nhóm khác, chúng có ở trong nhân SIRT 1,6,7 , bào tươngSIRT2 hoặc ty thể SIRT 3,4,5 Nhóm HDAC III ít được nghiên cứu ở người,

nhưng được xác định có cơ chế hoạt động phụ thuộc cofactor NAD+ [53].` Nhóm

IV gồm HDAC11 chỉ có ở người Nghiên cứu hệ thống loài thấy rằng HDAC11

liên quan gần hơn với HDAC3,8 nên có thể giả định HDAC11liên quan mật thiết với HDAC nhóm I hơn là nhóm II HDAC11 có vùng xúc tác ởđầu N và có thể bị ức chế bởi trapoxin dẫn chất của TSA HDAC11 chưa được tìmthấy trong các phức hợp HDAC đã biết để có thể xác định chức năng sinh học [31,53]

HDAC không chỉ điều hòa các protein histon mà rất nhiều protein khônghiston cũng bị ảnh hưởng bởi hoạt tính của các HDAC Thuật ngữ các chất ức chếHDAC để chỉ các chất có khả năng ức chế HDAC nhóm I, II và IV [50, 65]

1.2.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC2

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự biểu hiện gen, kiểm soát bởithay đổi biểu sinh là rất quan trọng đối với sự khởi đầu và tiến triển của rất nhiềubệnh trong đó có ung thư Thay đổi biểu sinh làm thay đổi biểu hiện gen mà cấu trúcDNA không thay đổi, do đó, dẫn đến bệnh tật - trái ngược với đột biến DNA

– vì thế có tiềm năng đảo ngược bởi các enzyme nhắm mục tiêu chịu trách nhiệmdược lý trong sửa đổi di truyền ngoại sinh HDACs có mặt trong hầu hết các mô vàcho thấy biểu hiện quá mức hoạt động của enzyme, tăng mạnh phản ứng deacetylhóa đuôi histon và cấu trúc sợi nhi m sắc Sự có mặt quá nhiều, chức năng và tăngsinh các HDAC nhóm I và II có liên quan tới khối u ác tính bao gồm ung thư biểu

mô tế bào T [11] cũng như sự tăng biểu hiện của nhóm I HDAC1, HDAC2 vàHDAC3 được xác định là yếu tố cần thiết cho sự gia tăng và phát triển của tế bàoung thư thông qua các bằng chứng thực nghiệm, tiền lâm sàng và lâm sàng về cácảnh hưởng sinh học liên quan đến sự thay đổi trong hoạt động của HDAC Ngoài ra,HDAC nhóm I có mặt trong các khối u ác tính và huyết học có xu hướng tươngquan với tiên lượng xấu hơn, với biểu hiện tăng cao HDAC2 [63] Ngược lại, sựbiểu hiện các HDAC nhóm II 4,5, 6, 7 và 10 có xu hướng liên quan đến tiên lượngtốt hơn như tế bào ung thư phổi Đó là lý do mà mối tương quan giữa HDAC và ungthư chưa thật rõ ràng, tuy nhiên lựa chọn ức chế HDAC nhóm I là chiến lược điềutrị ung thư hiệu quả hơn cả Hình 1.3 cho thấy các nhóm

HDAC khác nhau có các tác động khác nhau: chu trình tự chết, biệt hóa, điều hòa vòng đời tế bào, di chuyển, tính cảm ứng với điều trị hóa học và sinh mạc h.

Histone deacetyleasa 2 HDAC2 thuộc HDAC nhóm I HDAC2 hoạt độngnhư một chất ức chế phiên mã thông qua loại bỏ nhóm lysine ở đầu N của proteinhiston H2A, H2B, H3 và H4 Tuy nhiên HDAC2 không liên kết với ADN nênchúng sẽ được chọn lọc bởi các yếu tố phiên mã như YY1, SP1/SP3, gen ức chếkhối u p53 và BRCA1 HDAC2 cũng có thể được gắn vào ADN như là một phầncủa phức hợp CoREST, mSin3 và NuRD Những phức hợp là mục tiêu với các trình

tự gen đặc hiệu bằng các tương tác với các yếu tố phiên mã trình tự đặc hiệu [19]

Phức hợp chứa HDAC2 cũng liên quan đến gen điều chỉnh phiên mã qua thụthể trung gian Những phức hợp chứa gen biến đổi biểu sinh khác, chẳng hạn nhưMeCp2 – là một protein có nhóm liên kết methyl Các enzyme vận chuyển nhómmethyl DNA DNMT1, DNMT3A và DNMT3B, sự methyl transferases histoneSUVAR39H1 và G9a và histon bị bỏ đi nhóm methyl LSD1 , cho thấy một cáchkhác mà HDAC2 quy định biểu hiện gen và sửa chữa nhi m sắc [39]

HDAC2 cũng quy định biểu hiện gen thông qua sự deacetyl của yếu tố phiên

mã cụ thể bao gồm STAT3 và SMAD7 HDAC2 là một chìa khóa quan trọng củagen điều hòa chu kỳ tế bào, quá trình tế bào tự tiêu diệt, kết dính tế bào và di cư.Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã của các gen liên quan đến quátrình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mô, phát triển tim và tế bào thần kinh [55]

Các đột biến có thể có ở HDAC2 xuất hiện ở tế bào soma HDAC2 bị độtbiến trong các khối u lẻ tẻ và trong các khối u phát sinh ở người có ung thư biểu môđại trực tràng không polyp di truyền Đột biến này do sự cắt bỏ 9 adenin ở exon tạothành protein không hoạt động Sự biểu hiện các dạng đột biến của HDAC2 gây ra

sự kháng với tác dụng của các chất ức chế HDAC Việc thiếu các biểu hiện và chứcnăng HDAC2 tạo nên sự tăng điều chỉnh gen thúc đẩy tăng trưởng khối u [25, 42].HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau:

Hình 1.3: Mối liên quan của các dạng HDAC khác nhau tới quá trình sinh

trưởng phát triển của tế bào (Nguồn: Future medicinal chemistry (2012) 4,

1439-1460).

Việc điều hòa về biểu hiện hoạt động HDAC2 có liên quan đến sự phát triểnung thư HDAC2 biểu hiện quá mức trong các loại ung thư khác nhau bao gồm cảđại tràng, dạ dày, cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi không tế bào nhỏ

và ung thư biểu mô tế bào gan HDAC2 biểu hiên quá mức liên quan đến ung thưmột phần thông qua việc chọn lọc sai lầm của nó và sự im lặng của các gen ức chếkhối u Sự ức chế của gen p21WAF1 ức chế khối u ở vùng khởi động và có thể đượcđảo ngược bởi việc điều trị bằng thuốc ức chế HDAC [52] Biểu hiện HDAC2 tươngquan với tiên lượng xấu khi bệnh ở giai đoạn tiên triển trong ung thư đại trực tràng,tuyến tiền liệt, dạ dày và biểu mô tế bào gan

Ung thư đại tràng: Các nghiên cứu cho thấy trong loại khối u này sự phiên

mã HDAC2 được điều chỉnh bởi tín hiệu beta-catenin-TCF-myc đã bị xóa bỏ trongbệnh ung thư đại tràng HDAC2 biểu hiện quá mức tương quan với tiên lượng xấu

và bệnh ở giai đoạn tiến triển trong ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, Ropero và cáccộng sự tìm thấy một sự đột biến bất hoạt của HDAC2 trong ung thư đại tràng vớibất ổn microsatellite [47]

Ung thư vú: HDAC2 gây lão hóa trong tế bào ung thư vú Hơn nữa sự mấthoạt tính của HDAC2 kéo theo quá trình chết tế bào apoptosis của tamoxifen trongestrogen / progesterone tế bào ung thư vú dương tính [41].

Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu của Weichert và các cộng sựthấy rằng HDAC2 được biểu hiện mạnh mẽ trong hơn 70% các trường hợp phântích ung thư tuyến tiền liệt Sự gia tăng trong biểu hiện HDAC2 có liên quan vớităng cường tăng sinh tế bào khối u

Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào và sự phân chiacủa HDAC2 gây ra ngừng chuyển pha G1/S trong chu kỳ tế bào Trong quá trìnhchuyển đổi G1/S,sự phân chia đích của HDAC2 có tính chọn lọc gây ra các biểuhiện của p16 INK4a và p21 WAF1/Cip1 , và đồng thời ức chế sự biểu hiện củacyclin D1, CDK4 và CDK2 Do đó, sự ức chế HDAC2 dẫn đến sự giảm điều chỉnhcủa gen đích E2F/DP1 thông qua việc giảm sự phosphoryl hóa protein PRB [9]

Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính COPD : giảm hoạt động và biểu hiện HDAC2được tìm thấy trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính COPD Việc giảm hoạt động củaHDAC2 làm tăng điều hòa các gen liên quan đến phản ứng viêm và khángcorticosteroid trong COPD [9]

Trong các nhóm chất ức chế HDAC, các acid hydroxamic là nhóm chất đượcquan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất bởi cấu trúc đơn giản, d tổnghợp và có nhóm -NHOH tạo được phức bền với Zn+2 ở trung tâm hoạt động củaHDAC, đáp ứng được chức năng gắn kết với nhóm kẽm và giúp tăng hoạt tính ứcchế enzym Hiện nay, FDA đã phê duyệt một acid hydroxamic UHDAC điển hình làvorinostat suberoylanilide hydroxamic acid, Zolinza vào năm 2006 sử dụng trongđiều trị u lympho da tế bào Một hợp chất UHDA khác là depsipeptide

romidepsin, Istodax cũng được FDA cấp phép lưu hành vào năm 2009 để điều trịCTCL và điều trị ung thư hạch tế bào T ngoại vi Nhiều chất ức chế enzym HDACkhác cũng đang được thử nghiệm lâm sàng nhằm phát triển liệu pháp điều trị ungthư dựa trên đích này Bảng 1.1 [8, 49].

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng

1.3.2 Tại Việt Nam

Một số nghiên cứu tìm kiếm hợp chất ức chế HDAC2 đã được thực hiện vàcông bố trên các tạp chí trong nước và quốc tế Tất cả các nghiên cứu trên đều đượcthực hiện bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Nguy n Hải Nam thuộc Đại học Dược

Hà Nội Hiện nhóm chủ yếu tập trung thiết kế và tổng hợp hóa dược các hợp chất dịvòng là dẫn xuất của acid hydroxamic, gần 50 hợp chất mới được tổng hợp và thửhoạt tính [3-5, 17, 44].

Hình 1.4: Cấu trúc một số dãy acid hydroxamic đƣợc tổng hợp

ở Việt Nam

1.3.3 Cấu trúc các chất ức chế HDAC

Cấu trúc các chất ức chế HDAC thường gồm 3 phần chính hình 1.5):

- Nhóm khóa hoạt động cap group hay nhóm nhận diện bề mặt SRG : là cácvòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề mặtamino acid Đã có nhiều nghiên cứu thay đổi vùng nhóm khóa hoạt động này trướcđây như thêm nhóm thế halogen, vòng diazol, thiazol dựa trên sườn cấu trúcSAHA, Như đã được chứng minh thì vùng nhóm khóa hoạt động cần phải có sựxuất hiện các hydrocacbon thơm, có thể thêm các nhóm thế halogen, cacbonyl,methyl, triflourmethyl ceton hoặc liên kết không no để tăng mức độ ức chế

- Vùng cầu nối linker : thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocacbonthân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Vander Waals với kênh enzym

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm Zinc binding group - ZBG): nhóm tạo chelatvới kẽm trong vùng trung tâm hoạt động của HDAC2 do đó tăng mức độ tương tác

và khả năng ức chế enzyme Trong khung cấu trúc hydroxamic, –NHOH chịu tráchnhiệm chính cho vai trò này

Hình 1.5: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC (a) và khung cấu trúc

acid hydroxamic đảm nhiệm vai trò nhóm kết thúc (b)

Như vậy, các phần trong cấu trúc của các chất ức chế HDAC đều tham giavào quá trình hình thành liên kết với enzym và phát huy tác dụng Chúng tôi sẽ thiết

kế các hợp chất mới bằng cách thay đổi nhóm khóa hoạt động và vùng cầu nối, giữ

cố định nhóm kết thúc mang cấu trúc acid hydroxamic

1.3.4 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC đối với ung thư là do khả năngtác động lên nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào, từ đó làm mất sự điềuhòa trong tế bào ác tính Một trong những yếu tố được coi là then chốt, quyết địnhhoạt tính chống ung thư của các hợp chất này là thúc đẩy sự biệt hóa, ức chế chutrình tế bào và thúc đẩy sự chết tế bào Ngoài ra, hoạt hóa đáp ứng mi n dịch và ứcchế sự tạo mạch cũng là vai trò rất quan trọng của các UHDAC, gián tiếp ức chế sựphát triển của các khối u Ngoài ra các chất ức chế HDAC ngăn cản các đuôi histon

có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác

Với vai trò sinh học của HDAC và các nghiên cứu về các chất UHDAC chothấy đấy là mục tiêu quan trọng cần hướng tới trong điều trị ung thư Do đó, việctìm kiếm các hợp chất mới có khung cấu trúc acid hydroxamic có tiềm năng ức chếHDAC2 là một hướng đi đúng đắn nhằm tìm kiếm các hợp chất mới với khả năng

ức chế cao hơn, ít độc tinh, cải thiện được sinh khả dụng của các nhà khoa học [2]

1.4 Mô hình tương quan định lượng tính chất – tác dụng (QSAR)

1.4.1 Lịch sử QSAR

Vào năm 1868, Crum-Brown và Frasher đã nhận xét rằng tác dụng sinh học

là hàm số của cấu trúc hóa học và đây cũng chính là khởi nguồn của phương phápxây dựng mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học

(QSAR- Quantitative Structure-Activity Relationships) Đến năm 1893, Richet đã

cho rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất lí hóa.Đến năm 1935, phương trình Hammett được coi là mô hình đầu tiên biểu di n mốiquan hệ hoạt tính và cấu trúc:

Log =ρσ

Với K, Ko là hằng số acid, σ là hằng số Hammett, thông số hóa lý đặc trưngcho khả năng hút hoặc đấy điện tử của nhóm thế

Tuy nhiên, mô hình QSAR thực sự được nghiên cứu bởi C.L Corwin Hansch

từ những năm 60 của thế kỉ 20 Mô hình QSAR Hansch thường sử dụng phươngpháp hồi quy tuyến tính đa biến để biểu thị mối tương quan giữa các tham số hóa lí

và hoạt tính sinh học, ví dụ:

Log (1/C) = k1π+ k2π2+ k3σ

Trong đó: C là nộng độ mol mà tại đó hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh học,

π: hằng số kỵ nước, σ: hằng số thế Hammett; k1, k2, k3 là các hệ số hồi quy

Kể từ đây, phương trình QSAR đã được xây dựng bằng những phương pháp,

kĩ thuật xây dựng đa dạng đã ra đời và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu vàphát triển dược phẩm

1.4.2 Đại cương về QSAR

Về mặt toán học, mô hình QSAR biểu di n mối tương quan định lượng giữacấu trúc phân tử và hoạt tính thông qua phương trình:

Y cũng có thể nhận giá trị rời rạc, ví dụ như có hay không có hoạt tính, hoạt tính

mạnh hay yếu Các biến x trong mô hình QSAR được gọi là các tham số phân

tử (TSPT), mô tả một đặc điểm cấu trúc nào đó của phân tử hóa học Hàm f là một hàm mô tả mối tương quan giữa Y và các biến x Để xây dựng được hàm f, cần áp

dụng các thuật toán thống kê (statistical) hoặc học máy (machine learning) Một số

kỹ thuật thống kê thường được sử dụng trong xây dựng mô hình QSAR có thể kểđến như mạng neuron nhân tạo (Artificial Neural Network); hồi quy đa biến tuyếntính (Multiple Linear Regression), phân tích thành phần chính (PrincipalComponent Analysis)

1.4.3 Quy trình xây dựng mô hình QSAR

Các bước để xây dựng mô hình QSAR [59] gồm:1) Xây dựng cơ sở dữ liệu(CSDL ; 2 Tính toán tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc bằng sử dụng cácphần mềm giúp biểu di n và tính toán; 3) Xây dựng mô hình QSAR: Sử dụng cácphương pháp xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mốiliên hệ giữa các tham số phân tử (TSPT) và các giá trị đại lượng biểu di n hoạt tính;4) Đánh giá mô hình; 5 Giải thích các kết quả và sử dụng mô hình trong quá trìnhsàng lọc ảo nếu có thể

Xây dựng cơ sở dữ liệu: CSDL thường là cấu trúc của các hợp chất hoá học

đã được chứng minh hoạt tính sinh học in vitro Để hạn chế các yếu tố gây sai số

cho mô hình, CSDL thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương đồng về cấu trúc,

về protocol, Các giá trị sinh học được hiệu chỉnh, mang tính đại diện và có ý nghĩathống kê

Tính toán tham số mô t ả phân tử đặc trưng cho cấu trúc: Đây là quá trìnhchuyển đổi toán học và lôgic chuyển đổi thông tin cấu trúc hóa học mã hóa thànhdạng số giúp máy tính có thể “hiểu” được

Thiết kế tập huấn luyện và tập kiểm tra: CSDL được chia thành tập huấn

luyện TS-Training set chiếm 75%, được sử dụng để xây dựng mô hình và tập kiểm tra PS-Prediction set để đánh giá khả năng dự đoán của các mô hình đã xây dựng

được

Xây dựng mô hình QSAR: sử dụng các phương pháp xác suất thống kê vàcác kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các TSPT và giá trịđại lượng biểu di n hoạt tính

Đánh giá mô hình: Đánh giá mô hình là giai đoạn quan trọng liên quan đếnkhả năng ứng dụng của mô hình Mô hình cần có độ khớp, độ ổn định thông quađánh giá nội trên tập TS và khả năng dự đoán tốt thông qua đánh giá ngoại trên tập

PS dựa trên các thông số thống kê Để đánh giá mô hình QSAR, các kĩ thuật hayđược sử dụng đó là: đánh giá nội hay đánh giá chéo; đánh giá ngẫu nhiên Y; đánh

giá bằng cách chia tệp dữ liệu thành các hợp chất để huấn luyện hay kiểm tra vàđánh giá ngoại bằng cách áp dụng mô hình trên tập dữ liệu ngoại [18].

Đánh giá nội: Độ khớp hay độ tuyến tính được đánh giá thông qua giá hệ số

xác định R2, R2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mô hình với các giá trịthực nghiệm càng tốt; r2> 0,8 thì mô hình mới có ý nghĩa Công thức tính h ệ số xácđịnh như sau:

R 2

^Trong đó n là số các quan sát của tập huấn luyện; yi, yi , lần lượt là giá trị thực

tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; y là giá trị thực tế trung bìnhcủa biến phụ thuộc

Khả năng Fit của mô hình được xác định thông qua sai số toàn phương trung

bình (RMSE- root mean square errors) Giá trị RMSE cho biết độ sai lệch giữa giá

trị thực nghiệm và giá trị dự đoán của mô hình:

√ ∑

Trong đó y và lần lượt là giá trị hoạt tính sinh học thực nghiệm và dự đoáncủa các hợp chất trên tập TS, ym làu trung bình hoạt tính thực nghiệm, n là số lượngphân tử hợp chất của tập TS đang kiểm tra

Một mô hình dự đoán tốt thì giá trị RMSE nên thấp hơn 0.5 [56]

MAE: sai số tuyệt đối MAE-root mean square errors được định nghĩa là sự

khác biệt lớn nhất của giá trị y thực tế so với y dự đoán [13]

Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2 LOO, Q2 LOOđược đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave one out)bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các biến đãlựa chọn và tính toán lại các thông số của mô hình Q2 càng gần 1, tính tổng quáthóa của mô hình càng cao, mô hình càng ổn định Thông thường, yêu cầu Q2 > 0,7thì mô hình mới bền vững Công thức hệ số tương quan chéo tính như sau:

Q 2

Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của quan sát

^

thứ i; yi/i giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng mô hình đã loại biến i; y là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc

Đánh giá ngoại: Để đánh giá ngoại mô hình đã xây dựng được tức là đánh

giá khả năng dự đoán chính xác của mô hình, do đó đầu tiên cần phải so sánh đó saikhác của giá trị hoạt tính quan sát thực tế và giá trị dự đoán trên tập PS thông quagiá trị sai số toàn phương trung bình RMSE

Tuy nhiên, khi dự đoán của các mô hình được tính toán trên nhiều đặc tínhkhác nhau biến đáp ứng cần phải được so sánh, RMSE bị một nhược điểm đó là giátrị của nó phụ thuộc vào số lượng các đặc tính được xem xét, do đó sự so sánh nàykhông có ý nghĩa Chính vì lý do này, khả năng dự đoán ngoại được đánh giá

thông qua giá trị Q2

kiểm tra và do vậy chứng tỏ khả năng dự đoán của mô hình cao

yi, y , lần lượt là giá trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; y

EXT và y TR là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc trên tập PS và TS [62]

Ngoài ra, đánh giá mô hình cũng dựa trên một số các thông số thống kê có ýnghĩa khác như hệ số phân phối Fisher, tính phù hợp của hệ số tương quan CCC-

concordance correlation coefficient),

Cuối cùng, mô hình MLR được đánh giá tương quan ngẫu nhiên tương phảnbằng kiểm tra ngẫu nhiên Y với 2 hệ số r2scr và q2scr Nếu đỉnh trục Y không vượtquá 0.3–0.4 đối với r2 và 0.05 đối với q2 thì mô hình tự do trong tương quan,

18

Giải thích đƣợc cơ chế (nếu có thể)

Mô hình cần được giải thích về vai trò của các biến trong mô hình, qua đógiúp định hướng thiết kế các hợp chất mới từ các mô tả phân tử đóng góp hoạt tính

có mặt trong mô hình

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Cơ sở dữ liệu (CSDL)

Cơ sở dữ liệu (CSDL): gồm 45 hợp chất ức chế HDAC2 lựa chọn t ừ dữ liệuxây dựng bởi 6 bài báo khoa học đã công bố trước đó cùng với giá trị IC50 được xácđịnh bằng phương pháp giống nhau (sử dụng Kit định lượng Bioscence®) [17, 31,

32, 45, 58] Các giá trị IC50 thu thập được đều đã được hiệu chỉnh, lấy giá trị trungbình đại diện có ý nghĩa thống kê và độ tin cậy cao thông qua nhiều bước lọc bằngcách loại bỏ các giá trị nằm ngoài khoảng giới hạn [giá trị trung bình ± độ lệchchuẩn (SD)] Công thức hóa học mô tả như hình 2.1 và giá trị IC50 tương ứng đượcnêu trong bảng 2.1

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid hydroxamic

thu thập được