Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h tsai et k m feng) trên in vitro

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIKHOA Y DƯỢC Người thực hiện: LÊ THỊ TÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP Panax bipinnatifidus Seem.. Để làm sá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

LÊ THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƢNG TẬP TIỂU CẦU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT SÂM

VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) TRÊN

IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: LÊ THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN

DỊCH CHIẾT SÂM VŨ DIỆP (Panax

bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng)

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược,ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở đã tạođiều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cácthầy cô giáo trong khoa đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tậptrong suốt 5 năm qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG.TS Dương Thị Ly Hương, TS

Vũ Thị Thơm những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ emhoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô ở Bộ môn Dược lí – Dược lâm sàng

và Bộ môn Y Dược học cơ sở đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giảipháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai

loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã

tài trợ kinh phí để em thực hiện nội dung nghiên cứu này Em cũng xin cảm ơnKhoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ em thực hiện thínghiệm

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi những thiếusót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêmhoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 06 năm 2017

Sinh viên

Lê Thị Tâm

Kí hiệu

AAADPAMPATPCADPCEPICOX-1CTEtOAcGP

IC 50

LC 50MDAMPANTTCPBBtPBEAPBEtPBTPPPPRPPSBt

PS DCMPSnHPSTSVDTTHTXA2

vWF

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Bảng 1.1

Bảng 1.2

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Hình 3.3 Ảnh hưởng của phân đoạn ethylacetat Sâm vũ diệp đến độ

NTTC

đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp

Hình 3.6 Ảnh hưởng của phân đoạn tổng Tam thất hoang đến độ NTTC

NTTCHình 3.8 Ảnh hưởng của phân đoạn n-hexan Tam thất hoang đến độ

NTTC

NTTC

đoạn dịch chiết Tam thất hoang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Sinh lý học tiểu cầu 2

1.1.1 Đời sống tiểu cầu 2

1.1.2 Cấu trúc tiểu cầu 2

1.1.3 Chức năng tiểu cầu 4

1.2 Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu 10

1.3 Các thuốc kháng tiểu cầu 13

1.4 Vài nét sơ lược về hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 16

1.4.1 Đặc điểm thực vật 16

1.4.2 Thực trạng và phân bố 17

1.4.3 Thành phần hóa học 17

1.4.4 Công dụng 21

1.4.5 Các nghiên cứu trong nước về hoá học và dược lý 21

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả 27

3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp 27

3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang 29

3.2 Bàn luận 33

Kết luận: 37

Đề xuất: 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) là hai loài thuộc chi Panax, họ Nhân sâm

(Araliacea), cũng là 2 loài sâm đặc hữu vùng Tây Bắc, phân bố chủ yếu ở vùng núiHoàng Liên Sơn [15] Theo kinh nghiệm dân gian, Sâm vũ diệp và Tam thất hoangcũng được dùng làm thuốc bổ giống như các loài sâm khác, có tác dụng giảm đau,

bổ huyết, cầm máu,…[12].Tuy nhiên, nếu như các nghiên cứu dược lý và độc tính

đã được tiến hành tương đối đầy đủ ở một số loài thuộc chi Panax (như Nhân sâm,

Tam thất và gần đây là Sâm Việt Nam [24]) thì nghiên cứu về hai loài Sâm vũdiệp và Tam thất hoang nhìn chung còn rất hạn chế Các nghiên cứu ban đầu vềthành phần hóa học của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cho thấy trong rễ và lá hailoài cây này có chứa saponin khung dammaran và oleanan với hàm lượng cao[10,34,37,46] Saponin cũng là thành phần hóa học chính được tìm thấy trong các

loài khác thuộc chi Panax [51] Đặc biệt, saponin trong một số loài thuộc chi Panax

đã được chứng minh là có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu [35] Liệu với thànhphần giàu saponin trong rễ và lá của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, hai loài câynày có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng chống ngƣng tập tiểu cầu của các phân đoạn

dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro”, với mục tiêu:

1 Đánh giá được tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp

2 Đánh giá được tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của các phân đoạn dịch chiết Tam thất hoang

1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu

Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, đường kính 3-4µm, được

sản xuất từ nguyên mẫu tiểu cầu ở tuỷ xương Số lượng tiểu cầu lưu hành ở máu

ngoại vi khoảng 150 - 450 × 109/L Nguyên mẫu tiểu cầu bắt nguồn từ tế bào nguồn

dòng tủy, do tế bào gốc sinh máu tạo nên Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000

tiểu cầu [23]

1.1.1 Đời sống tiểu cầu

Tiểu cầu có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày Với điều kiện lắc liên tục

ngoài cơ thể ở nhiệt độ phòng có thể lưu giữ tiểu cầu khoảng 5 ngày [23]

1.1.2 Cấu trúc tiểu cầu

Tiểu cầu có kích thước 2-4mm, thể tích 7-8mm3 Bình thường có 150-450×

109 tiểu cầu trong 1 lít máu ngoại vi [23]

Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tiểu cầu có một siêu cấu trúc

phức tạp gồm lớp màng, các hạt, hệ thống vi ống, hệ thống các kênh mở [23]

 Màng tiểu cầu

Gồm 2 lớp lipid kép bao quanh tiểu cầu, là các glycoprotein quan trọng, đóng

vai trò như các receptor bề mặt, là nơi diễn ra một số hoạt động đông máu của tiểu

cầu [23] Các receptor chính của tiểu cầu được trình bày tóm tắt ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các receptor chính của bề mặt tiểu cầu [42]

Các loại receptor Glycoprotein (GP)

bề mặt tiểu cầu

Các thành phần quan trọng của màng tiểu cầu: Glycoprotein Ib (GPIb): làprotein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố vWF giúp cho tiểu cầu dínhbám vào collagen Glycoprotein IIb/IIIa (GP IIb/IIIa): là protein màng, hoạt độngphụ thuộc vào ion Ca, có nhiệm vụ liên kết với fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưngtập với nhau tạo thành đinh cầm máu Chức năng của chúng được thể hiện tronghình 1.1 [23].

Hình 1.1 Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [23].

Ngoài ra, các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserin (PS) cóvai trò quan trọng trong quá trình đông máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứngenzym tiểu cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong quátrình hoạt hóa tiểu cầu và là chất chủ vận mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểucầu Màng tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệuhóa học bên trong [42]

Các hạt α: chứa nhiều loại protein khác nhau là: yếu tố phát triển tiểu cầu(platelet derived growth factor - PDGF), fibrinogen, yếu tố V, vWF và nhiều proteinquan trọng giúp cho hiện tượng dính của tiểu cầu như thrombospondin, fibronectin[23].

 Hệ thống các kênh mở

Gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích

bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ thống kênh này [23]

Hình 1.2 Cấu trúc của tiểu cầu [23].

1.1.3 Chức năng tiểu cầu

Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [23]

4

a Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu

Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạchmáu còn nguyên vẹn Khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu nhanhchóng trải qua các quá trình bám dính, thay đổi hình dạng, bài tiết và ngưng tậpthông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh xảo, mà đỉnh điểm là hình thành mộtnút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương Quá trình chuyển đổi tiểu cầu bất hoạt thànhtiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều dọc liên tục nhưng có thể được chia thànhcác bước: bám dính, ngưng tập, phóng thích các chất [6]

 Giai đoạn bám dính

Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạtđộng bởi nitric oxid và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu Tế bào nội môcòn chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kíchhoạt ADP Khi mạch máu bị tổn thương, các yếu tố kháng tiểu cầu nội sinh bị suyyếu để lộ lớp dưới nội mô lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu

tố von Willebrand, fibronectin, lamilin… [6,30,42] Yếu tố vWF tạo điều kiện cho

sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GP Ib/IX/V đóng vai trò thụthể trên màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầukhi tốc độ dòng máu cao Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dínhban đầu của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GP Ia/IIa Nhữngtương tác này cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộchơn nữa của các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [6,31]

Đặc biệt sự tương tác ban đầu giữa collagen và GP VI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GP Ia/IIa vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với

GP IIb/IIIa và GP Ia/IIa, fibrinogen liên kết với GP IIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [6]

 Giai đoạn ngưng tập

Đây là hiện tượng tiểu cầu dính với nhau thành từng đám (nút tiểu cầu) Hiệntượng dính hoạt hoá tiểu cầu, tạo điều kiện cho hiện tượng ngưng tập (aggregation)xảy ra [23]

Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầmmáu Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GP IIb/IIIa, liên kết cáctiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng4.000-5.000 phức hợp GP IIb/IIIa trên bề mặt của nó Trong trạng thái không hoạtđộng, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Chỉ

khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GP IIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động nhưmột thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu kháctạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạthóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn raliên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [6,23,31].

Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin,adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin , trong

đó ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cáchđộc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do cáctác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu.Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làmtăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trìnhngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu.Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy ADP phát huy hiệu quả đầy đủ khi có sự thamgia của cả 3 thụ thể trên tiểu cầu: P2Y1, P2TAC, P2X1, trong đó hai thụ thể P2Y1

và P2TAC cần thiết để hiện tượng ngưng tập xảy ra tối đa Hai thụ thể này là mộttrong những trọng tâm của nghiên cứu về thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu trong dựphòng và điều trị huyết khối [13,23]

- Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu khôngngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thoái hóa ATP thành ADP Trongtrường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứng này bị ức chế dẫn đến tiểu cầu bị ngưngtập [19] Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP được tóm tắt ở hình 1.3

Hình 1.3 Cơ chế gây ngƣng tập tiểu cầu của ADP [19].

(Chú thích: (-) Ức chế).

6

- Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi acid arachidonic (AA): Cơ chế gây NTTC của acid arachidonic được tóm tắt ở hình 1.4.

Hình 1.4 Cơ chế ngƣng tập tiểu cầu của acid arachidonic [19].

Hiện nay, vai trò của phospholipid màng mà cụ thể là acid arachidonic (AA)tham gia vào sự ngưng tập tiểu cầu đã được chứng minh Trong cơ chế này, ngưngtập tiểu cầu là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố kích tập với phospholipidmàng và các men như cyclooxygenase và thromboxan synthetase [19]

- Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi 1 số yếu tố khác:

Adrenalin và noradrenalin gây ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế gián tiếp thôngqua việc phóng thích ADP và trực tiếp kích thích sự ngưng tập qua vai trò của acidarachidonic [19]

Sự ngưng tập do ristocetin xảy ra do sự kích thích yếu tố von-Willebrand gắnvới tiểu cầu tại vị trí của receptor GP Ib [19]

Thrombin gây ngưng tập tiểu cầu qua cơ chế tác động lên yếu tố V có trên bềmặt tiểu cầu Bởi vậy khi dùng men trypsin để thủy phân yếu tố V thì tiểu cầu khôngcòn ngưng tập được nữa [19]

Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A khuếch đại cùng với ADP cho phảnứng của tiểu cầu, ngoài ra serotonin có thể đóng vai trò gây đông máu, làm tăng việclưu giữ protein đông máu như fibrinogen, thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [ 6].

 Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [19]

Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bịngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là quá trình thay đổi hìnhdạng và phóng thích của tiểu cầu Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sựbiến đổi về hình thái và sinh hóa của tiểu cầu Cụ thể như sau:

- Những thay đổi về hình thái: tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt, co lại,

- Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP,serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố 3 tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid vàmột số men khác

- Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu đường,thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa thrombosterin.Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có tiêu tốn nănglượng của tiểu cầu Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo vệ mạch máukhi mạch máu bị tổn thương

Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có

sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chứcnăng của tiểu cầu

Hình 1.5 Quá trình ngƣng tập tiểu cầu [31].

8

b Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương

Tiểu cầu cũng đóng một vai trò quan trọng trong quá trình đông máu thông qua một số hiện tượng sau: [23]

- Ngay sau khi có hiện tượng bám dính, ngưng tập để khởi động quá trìnhcầm máu thì đã có một quá trình hoạt hoá ngay tại màng tiểu cầu để chuyển yếu tố

XI thành XIa

- Tiểu cầu mang điện tích âm trên bề mặt tạo thuận lợi cho việc hoạt hoá yếu

tố XI nhờ kallikrein và HMWK (Hight-Molecular-Weigth-Kininogen), là bước đầutiên trong dòng thác đông máu

- Sau khi có hiện tượng thay hình đổi dạng, tiểu cầu phóng thích các chấttrong đó có yếu tố 3 tiểu cầu, đó là yếu tố có vai trò quan trọng trong hình thànhphức hợp prothrombinase gồm Xa, Va, ion Ca và phospholipid (yếu tố 3 tiểu cầu)

- Tiểu cầu gắn với yếu tố Xa làm tăng đáng kể tốc độ hoạt hoá prothrombin

1.2 Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu

- Số lượng tiểu cầu giảm trong: Xuất huyết giảm tiểu cầu, suy tuỷ xương, lơ

xê mi cấp, sốt xuất huyết, sau tia xạ hoặc sau hoá trị liệu, do 1 số thuốc có độc tínhvới tiểu cầu, một số trường hợp trong hội chứng rối loạn sinh tuỷ, đông máu nộimạch lan toả

- Số lượng tiểu cầu tăng chủ yếu gặp trong hội chứng tăng sinh tuỷ

1.2.2 Đo thời gian máu chảy

Nguyên lý:

- Khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời hệ thốngcầm máu bắt đầu hoạt động Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành mạch và củatiểu cầu Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian để cầm đượcmáu dài hơn Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương mạch máu và đothời gian từ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [7]

10

1.2.3 Nghiệm pháp co cục máu đông

- Nguyên lý: Máu ra khỏi thành mạch sẽ bị đông, máu đông là máu chuyểnthành dạng rắn nhờ hình thành các sợi fibrin Mạng lưới sợi fibrin ôm lấy các thànhphần hữu hình rồi co rút lại tạo nên cục máu đông tách rời khỏi phần huyết thanh.Cục máu đông co được là nhờ vai trò của tiểu cầu và của fibrin [7]

- Nguyên tắc: Định tính hay định lượng mức độ co của cục đông fibrin sau khi máu đã đông trong ống nghiệm được để ở bình điều nhiệt nước 37 0C [9]

- Bình thường cục máu sẽ co hoàn toàn, tách khỏi thành ống nghiệm sau 3

giờ [2]

- Co cục máu không bình thường (không co hoặc co không hoàn toàn) gặptrong những trường hợp giảm số lượng hoặc bất thường về chức năng của tiểu cầu,tăng fibrinogen máu, đa hồng cầu [2]

1.2.4 Dấu hiệu dây thắt

- Nguyên lý: Để kiểm tra sức bền của mạch máu, đặc biệt các mạch máu nhỏ,dưới da, người ta tạo ra một áp lực của máu tác động lên mạch bằng cách ngăn cảnmáu trở về để tăng khối lượng máu cục bộ trong lòng mạch [7]

- Nguyên tắc: dùng huyết áp kế duy trì một áp lực 90-100 mmHg ở cánh tay trong 5 phút, sau đó đếm số nốt xuất huyết ở phía dưới phần garo [2]

- Dấu hiệu dây thắt dương tính khi xuất hiện trên 5 nốt xuất huyết [2]

- Nghiệm pháp dương tính trong những trường hợp giảm số lượng tiểu cầu, bất thường về chức năng tiểu cầu, bất thường cấu trúc mạch máu [2]

1.2.5 Phân tích chức năng tiểu cầu – PFA (platelet function analysis)

- Nguyên lí: PFA-100 là hệ thống xét nghiệm được kiểm soát bằng vi xử lý,dùng để đánh giá chức năng tiểu cầu trong máu toàn phần chống đông với citrate

Hệ thống này mô phỏng quá trình cầm máu ban đầu xảy ra sau một tổn thươngmạch máu Về cơ bản, hệ thống PFA-100 bao gồm hộp chứa mẫu máu, ống mao dẫn(đường kính trong: 200µm), và một màng chắn (cellulose ester) với lỗ trung tâm cóđường kính 150µm Màng chắn có chứa các chất kích thích kết tụ tiểu cầu gồm 2 µgcollagen + 10µg epinephrine (gọi tắt là CEPI), hoặc 2 µg collagen + 50 µgadenosine diphosphate (gọi tắt là CADP) Ống mao dẫn tạo thuận lợi cho sự dịchchuyển của dòng máu đi từ ngăn chứa mẫu đến màng chắn với một tốc độ có kiểmsoát Mẫu máu được chống đông với citrate 3,8%, cho vào ngăn chứa mẫu và ủ

11

trong thiết bị ở 37 oC Dưới lực hút chân không cố định, dòng máu dịch chuyển vớilực xé cao đi qua lỗ trung tâm Với sự hiện diện của các chất kích thích kết tụ tiểucầu trên màng chắn và lực xé cao của dòng máu tại lỗ trung tâm, tiểu cầu sẽ hoạthóa và kết tụ ở vùng xung quanh lỗ, tạo thành nút chặn tiểu cầu và cuối cùng lấp kín

lỗ trung tâm Thiết bị sẽ theo dõi dòng máu đi qua lỗ trung tâm và ghi nhận thờigian cần thiết để hình thành nút tiểu cầu lấp kín hoàn toàn lỗ trung tâm Chức năngtiểu cầu thể hiện qua thời gian lấp kín (closure time = CT), là thời gian hình thànhnút tiểu cầu để lấp kín hoàn toàn lỗ trung tâm Thời gian lấp kín khi dùng CEPIđược gọi tắt là CEPI CT, thời gian khi sử dụng CADP gọi là CADP CT [33]

Hình 1.7 Nguyên lí hệ thống PFA-100 [33].

-Giá trị bình thường: [33]

+ CEPI CT: 97-188s

+ CADP CT: 62-123s

1.2.6 Đánh giá độ ngƣng tập tiểu cầu

- Nguyên lí: Khả năng ngưng tập của tiểu cầu xảy ra khi cho thêm chất kíchtập từ ngoài vào như ADP, collagen phản ánh một trong những chức năng quantrọng của tế bào này Kỹ thuật đo độ ngưng tập tiểu cầu qua sự thay đổi mật độquang học (phương pháp đo quang) hoặc độ trở kháng được sử dụng rộng rãi đểđánh giá chức năng tiểu cầu [3]

- Nguyên lý của phương pháp đo quang: thiết bị đo độ ngưng tập tiểu cầubằng phương pháp quang học là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định.Một chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giầu tiểu cầu và mộtchùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu Khi đo, sử dụngmột mẫu huyết tương giầu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở

đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 0% Đồng thời sử dụng

huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánhsáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100% Khi cho chất kích tập nhưADP, collagen, thrombin, epinephrine, arachidonic acid, ristocetin vào huyết tươnggiầu tiểu cầu sẽ xẩy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám vìvậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độngưng tập tiểu cầu Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyếttương giầu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [20].

Hình 1.8 Nguyên lí của xét nghiệm ngƣng tập tiểu cầu [40].

1.3 Các thuốc kháng tiểu cầu

Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế các quá trình kết dính, hoạt hóa, ngưngtập và liên kết với viêm của tiểu cầu [19]

Điều trị chống ngưng tập tiểu cầu có thể tấn công lên các mục tiêu trên conđường của quá trình ngưng tập tiểu cầu và đó là các đích tác dụng của các thuốckháng tiểu cầu như: Cyclooxygenase (COX): COX-1 tiểu cầu; thụ thể ADP;glycoprotein kết dính tiểu cầu như: GP Ib, GP Ia/IIa, GP VI, ; thrombin; sản phẩmAMP vòng; thụ thể Gp IIb/IIIa trên bề mặt tiểu cầu, (hình 1.9) [21]

13

Hình 1.9 Các đích tác dụng của các thuốc ức chế ngƣng tập tiểu cầu [21] Một số thuốc kháng tiểu cầu

a Aspirin

Aspirin là thuốc chống ngưng tập tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãitrên lâm sàng hiện nay Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: Aspirin ở liều thấp có tácdụng ức chế chọn lọc enzym cyclooxygenase 1 (COX-1) là enzym xúc tác bước đầutrong quá trình biến đổi acid arachidonic thành PGH2 PGH2 là chất trung giankhông bền và là cơ chất của nhiều isomerase tạo ra ít nhất 5 prostanoid có hoạt tínhsinh học khác nhau trong đó có Thromboxan A2 (TXA2) TXA2 được tổng hợp vàphóng thích bởi tiểu cầu để đáp ứng lại một số tác nhân kích thích (collagen,thrombin, ADP) và nó gây ra NTTC bất hồi phục thông qua thụ thể TXA2 Aspirin

ức chế COX-1 dẫn đến ức chế sự sinh tổng hợp TXA2, do đó có tác dụng ức chếNTTC gây ra bởi một số tác nhân kích thích (ADP, collagen, thrombin) Sự ức chếnày rất mạnh, diễn ra trong suốt đời sống của tiểu cầu vì tiểu cầu không thể tổnghợp thêm COX-1 mới [19] Cơ chế tác dụng ức chế NTTC của aspirin được tóm tắt

ở hình 1.10

Bên cạnh tác dụng ức chế NTTC, aspirin còn ức chế sự tổng hợp chấtprostaglandin kháng đông là PGI2 của tế bào nội mạc thông qua việc ức chế menprostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC Tuy nhiên tác dụng này

không mạnh bằng tác dụng ức chế men cyclooxygenase và tác dụng này cũngkhông kéo dài vì tế bào nội mạc có thể tổng hợp ra men mới [19].

Hình 1.10 Cơ chế ức chế ngƣng tập tiểu cầu của aspirin

d Clopidogrel

Cơ chế tác dụng ức chế NTTC: ức chế chọn lọc thụ thể ADP của tiểu cầu,ngăn cản sự hoạt hóa glycoprotein IIb/IIIa của fibrinogen trên tiểu cầu, làm giảmgắn fibrinogen vào tiểu cầu [18]

e Các chất ức chế glycoprotein IIb/IIIa receptor: Abcimab, Eptifibatid,

Tirofiban, … [18]

15

1.4 Vài nét sơ lƣợc về hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

1.4.1 Đặc điểm thực vật

Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ,

Hoàng liên thất Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem [15].

Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Bình biên tam

thất, Thổ tam thất Tên khoa học: Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng, họ ngũ

gia bì (Araliaceae) [15]

Đặc điểm hình thái: cả hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình tháitương đối giống nhau: Cây thân thảo, sống nhiều năm; cao 0,25 – 0,7 m; đường kínhthân từ 0,3 – 0,6 cm Thân rễ mập, phân nhánh, nằm ngang và thường nổi trên mặtđất; đường kính 1,5 – 3,5 cm Phần thân mang 3 – 5 lá, mọc vòng ở đỉnh thân; Lákép chân vịt, thường gồm 3 – 5 lá chét, mép khía răng cưa Cụm hoa tán đơn, mọc ởngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1– 1,5 cm Hoa mẫu 5, bầu 2 ô Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2cm; khi chín màu đỏ Hạt 2, hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốnhạt [15,50,52] Đặc biệt, khác biệt rõ nhất của hai loài là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy,còn Tam thất hoang thì không

Hình 1.11 Sâm vũ diệp [15] Hình 1.12 Tam thất hoang [15].

1.4.2 Thực trạng và phân bố

Loài Panax bipinnatifidus Seem được Seemann phát hiện đầu tiên tại vùng

núi Hymalaya của Ấn Độ, và được công bố trên tạp chí J Botany năm 1868 Đếnnay được ghi nhận phân bố tự nhiên ở Trung Quốc, Bhutan, Ấn Độ, Nepal,Myanmar và Việt Nam [50,52]

Loài Panax stipuleanatus được hai nhà khoa học người Trung Quốc (Tao Hse

Tsai và Kuo Mei Feng) công bố năm 1975 trên tạp chí Acta PhytotaxonomicaSinica Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Maguan, Trung Quốc (gần ViệtNam) ở độ cao 1100-1700m so với mặt nước biển Cho đến nay, trên toàn thế giới,loài này mới chỉ tìm thấy ở Đông-Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vàiđiểm ở Vườn Quốc Gia Hoàng Liên thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [15,50]

Việt Nam: Các kết quả điều tra đến nay cho thấy hai loài Sâm vũ diệp vàTam thất hoang mới chỉ thấy có phân bố tự nhiên ở sườn đông bắc dãy Hoàng LiênSơn và một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và

Sa Pa của tỉnh Lào Cai [15,16]

Đến nay phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các quẩn thể củachúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ

1.4.3 Thành phần hóa học

a Sâm vũ diệp

Thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp được phát hiện có nhiềusaponin khung dammaran và oleanan Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốccông bố phân lập 13 saponins khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốctrong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3,Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [49] Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-HànQuốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan, trong đó có 3 chất mới làbifinosid A-C (1-3) và các chất narcissiflorine methyl ester (4), chikusetsusaponinIVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7),pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8), momordinIIe (9), and stipuleanoside R2methyl ester (10) (1-10, Hình 1.13) là thành phần chính của thân rễ cây Sâm vũ diệpđược thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [46]

Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu thành phầnhóa học của Sâm vũ diệp kết quả đã phân lập được một hỗn hợp saponin (11) baogồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11A) và β-sitosterol-3-O-β-D-

17

glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: trihydroxytridec-8-en-2-yl)heptacosanamid (12), dichaccarid: saccharose (13),saponin: 28-desglucosylchikusetsusaponin IV (14) từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễSâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trênđược công bố phân lập từ cây này [8].

1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N-(1,3,4-Hình 1.13 Hợp chất saponin khung oleanane từ thân rễ Sâm vũ diệp [46]

b Tam thất hoang

Các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học trước đâycủa Tam thất hoang chỉ ra rằng phần thân rễ của cây chứa nhiều saponin khungolean với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàmlượng thấp

Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin dẫnchất acid oleanolic là stipuleanosid R1 và R2 (16-17), từ dịch chiết methanol củathân rễ Tam thất hoang [45]

Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đạihọc Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồmcác ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của câyTam thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [34]

Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây Tam thất hoang ở Việt Nam, nhómnghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc công bố xác định 15 hợp chất saponin (1-15, Hình1.14) khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester

(1), 3 hợp chất polyyn (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20) [28, 29].Trong đó, hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyn 16 và polyyen 17 thể hiện tác dụnggây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) với giá trị IC50 từ 0.13đến 41.45 μM theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào (apoptosis) qua phân tíchhình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trìnhapoptosis Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, một số hợp chất saponin6-11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF-κB với giá trị IC50 từ 3.1 đến 18.9 μMtrên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thư và kháng viêm[27,36]

Hình 1.14 Thành phần hoá học của cây Tam thất hoang.

19

Bảng 1.2 Các hợp chất saponin đã phân lập đƣợc từ Tam thất hoang.