Tối ưu quy trình phân tích đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng002

Thời điểm hiện tại cá thể hóa điều trị đang là một xu hướng tất yếu và ngàycàng ảnh hưởng sâu rộng đến quá trình điều trị ung thư đại trực tràng của các bác sĩ.Một trong các công cụ rất

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN HUY HOÀNG

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG

PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN

UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH BÁC SĨ ĐA KHOA

KHÓA 2012-2018

Hà Nội - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

NGUYỄN HUY HOÀNG

TỐI ƢU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÙNG

PROMOTER CỦA GEN UGT1A1 Ở BỆNH NHÂN

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin đặc biệt gửi lời cám ơn đến ThS Phạm Thị Hồng Nhung đã trực

tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và

hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Tôi xin gửi lời cảm tạ sâu sắc nhất tới TS BS.

Trần Quốc Hùng, Khoa ung bướu Bệnh viện 198 Bộ Công an đã tạo điều kiện giúp

tôi thu thập số liệu nghiên cứu và cho tôi những góp ý chuyên ôn vô cùng giá trị

Để thực hiện tốt khóa luận này, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Khoa Y

Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã số CS.15.09 Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô và cán bộ nghiên cứu Bộ môn

Y dược học cơ sở, Khoa Y dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội đã luôn ủng hộ và

nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu khoahọc tại đây

Tôi xin cảm ơn các bạn sinh viên

Kiều Hồng Nhung đã hỗ trợ tôi thự hiệ

chân thành khi viết khóa luận

Bùi Xuân Nhật, Nguyễn Thùy Linh và

các nghiên cứu và cho tôi những góp ý

Để có được sự thành công của khóa luận này, tôi xin cảm ơn gia đình đã

quan tâm động viên, khuyến khích giúp tôi vững vàng vượt qua những khó khăntrong quá trình học tập và nghiên cứu

Axit ethylene diamine tetraacetic (Ethylene Diamine Tetra AceticAcid)

Kĩ thuật phân tích phân giải cao nhiệt độ nóng chảy (High resolutionmelt)

Kilobazơ (=1000 bp)Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc Gia – Mỹ (NationalCenter for Biotechnology I formation)

Mật độ quang học (Opti al de sity)Phản ứng tổng hợp chuỗ (Polymerase chain reaction)Uridine 5’ diphosphat

Enzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferaseEnzym Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1Gen mã hóa cho Uridine 5’ diphosphat glucoronosyltransferase A1

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment lengthpolym rphism)

Đa hình di truyền đơn nucleotit (Single nucleotide polymorphism)Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (Single strand conformationpolymorphism)

Đệm Tris base/ axit acetic/ EDTA

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tran g

Bảng 1 Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến 4

Bảng 2 Nồng độ ADN tổng số tách từ mẫu mô đúc paraffin bằng phương pháp đo mật độ quang OD 22

Bảng 3 Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR 25

Bảng 4 Đa hình vùng promoter của UGT1A1 ở 38 bệnh nhân nghiên cứu 27

Bảng 5 Chỉ định xét nghiệm UGT1A1*28 khi sử dụng một số loại thuốc 30

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Tran g

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT 2

Hình 1.2 Phản ứng chuyển nhóm glycosyl nhờ UGT 3

Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người 3

Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong của 10 ung thư phổ biến nhất năm 2012 9

Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan 10

Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến kiểu gen UGT1A1 11 Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 15

Hình 1.8 Kết quả điện di của kiểu gen (TA)6/(TA)7 và (TA)6/(TA)8 sử dụng gel agarose 3% 15 Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica đơn giản 17

Hình 2.2 Quy trình PCR 19

Hình 3.1 Điện di trên gel agarose 0.7% sả phẩm tinh sạch ADN từ mẫu máu 21

Hình 3.2 Điện di trên gel agarose 1.5% ủa thí nghiệm tối ưu nhiệt độ gắn mồi PCR nhân vùng promoter của UGT1A123 Hình 3.3 Điện di trên gel agarose 1.5% của thí nghiệm tối ưu nồng độ ADN PCR nhân vùng promoter của UGT1A1 24 Hình 3.4 Điện di trên gel agarose 1.5% sử dụng quy trình PCR tối ưu nhân vùng promoter của UGT1A1 chạy với 10 mẫu bệnh nhân 24 Hình 3.5 Kết quả giải trình tự kiểu gen đồng hợp (TA)6/(TA)6 25

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự kiểu gen (TA)5/(TA)6 26

Hình 3.8 Tần số ác alen UGT1A1*28, UGT1A1*36 và UGT1A1*6 ở một số quần

thể 28

MỤC LỤC MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1 2

1.2 Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A 5

1.2.1 Hội chứng Gilbert 5

1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar 6

1.3 Đa hình di truyền UGT1A1*28 7

1.4 Ung thư đại trực tràng và mối liên quan giữa irinotecan với đa hình di truyền UGT1A1*28 8

1.5 Các phương pháp phân tích đa hình di truyề n UGT1A1*28 11

1.5.1 Giải trình tự ADN 11

1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand conformation polymorphism - SSCP): 12

1.5.3 Phân tích dị sợi kép (heteroduplex analysis): 13

1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạ (R striction fragment length polymorphism – RFLP) 13

1.5.5 Real – time PCR 14

1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Hóa chất 16

2.3 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Tách chiết ADN t ổng số 17

2.4.2 Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số 18

2.4.3 Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1 18

2.4.4 Xác định kiểu gen UGT1A1*28 bằng phương pháp giải trình tự 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Kết qu ả tách chiết ADN tổng số 21

3.3 Kế t qu ả giải trình tự kiểu gen UGT1A1*28 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Ung thư hiện đang ảnh hưởng rất nhiều tới sức khỏe và chất lượng cuộcsống Theo tổ chức Y tế thế giới, ung thư đứng hàng thứ 2 trong các nguyên nhân tửvong, với khoảng 14 triệu người mắc mới vào năm 2012 và tiếp tục có xu hướngtăng lên Ung thư đại trực tràng là một trong những ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệmắc mới đứng hàng thứ tư và tỉ lệ tử vong cao thứ năm ở cả hai giới [33] Mặc dù

đã có các tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị, tuy nhiên tỉ lệ bệnh nhân ung thưđại trực tràng tiến triển đến giai đoạn muộn (giai đoạn IV) vẫn còn cao Một trongcác thuốc điều trị chính ở giai đoạn muộn là Irinotecan, nhưng việc điều trị còn gặpnhiều khó khăn, đặc biệt là các tác dụng không mong muốn của thuốc

Thời điểm hiện tại cá thể hóa điều trị đang là một xu hướng tất yếu và ngàycàng ảnh hưởng sâu rộng đến quá trình điều trị ung thư đại trực tràng của các bác sĩ.Một trong các công cụ rất hữu ích với các bác sĩ lâm sàng trong việc đối đầu vớiung thư đại trực tràng chính là sinh học phân tử

Các nghiên cứu đã chỉ ra đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1

có ảnh hưởng lớn đến quá trình chuyển hóa của irinotecan, liên quan chặt chẽ đếnhiệu quả điều trị và mức độ trầm trọng do các tác dụng không mong muốn củathuốc Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and DrugAdministration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng

kiểu gen[23] Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về gen UGT1A1 cũng như đa hình di truyền UGT1A1*28 ở Việt Nam Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài

“Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1 ở

bệnh nhân ung thư đại tr ực tràng” Kết quả của đề tài sẽ cung cấp một công cụ hỗ

trợ đắc lực cho các bác sĩ không chỉ trong việc điều trị ung thư đại trực tràng mà còntrong việc ẩn đoán một số bệnh lý di truyền như hội chứng Gilbert hay hội chứngCrigler – Najar

Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng

promoter củ a gen UGT1A1.

Nội dung nghiên cứu:

1 Tối ưu quy trình phân tích đa hình di truyền vùng promoter của gen UGT1A1

trên mẫu mô bệnh phẩm đúc trong paraffin và mẫu máu

2 Áp dụng quy trình phân tích gen trên các mẫu bệnh phẩm thu từ Bệnh viện

198 Bước đầu xác minh tần số alen và tần số kiểu gen của đa hình di truyền vùng

promoter thuộc gen UGT1A1 trong nhóm mẫu nghiên cứu.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferases A1

Uridine 5’ diphosphat glucurosyltransferases A1 (viết tắt là UGT1A1) là mộtthành viên trong họ enzym Uridine 5’ diphosphat glucuronosyltransferase (viết tắt làUGT), đóng vai trò xúc tác cho các hoạt động chuyển hóa cũng như giải độc củagan UGT là một họ lớn bao gồm 22 loại protein, được chia làm 5 họ và 6 phân

đoạn căn cứ vào cơ sở giải trình tự gen cấu trúc (Hình 1.1) [25].

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các protein UGT [25]

Các protein UGT chủ yếu xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl củaaxit uridine 5’ dip osphat glucuronic đến một cơ chất phù hợp hình thành các chấthòa tan trong nước Các cơ chất được gắn nhóm glucosyl bao gồm các chất khôngphân cực kích thước phân tử nhỏ như các steroit, bilirubin, các hormon và các

thuốc Phả n ứng chuyển hóa xúc tác bởi UGT được mô tả trong Hình 1.2 [25].

Trong các UGT, các protein thuộc phân họ UGT1A được quan tâm hơn cả, đóng vaitrò t en chốt trong việc chấm dứt các hoạt động sinh học và tăng cường việc đào thảicác chất không phân cực của thận Chính vì vậy, chúng giúp duy trì nồng độ cácchất và đảm bảo cân bằng nội môi [25] UGT1A tập trung chủ yếu ở gan và đườngống tiêu hóa (dạ dày, ruột non, đại tràng) Bên cạnh đó còn ghi nhận sự biểu hiệncủa UGT1A ở phổi, buồng trứng, tinh hoàn, tuyến vú và tuyến tiền liệt [17]

Uridine 5’ diphosphat glucuronic

Nucleophin Enzym UGT

Gốc glucuronyl

Uridine 5’ diphosphat

UGT1A1 được mã hóa bởi gen UGT1A1 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2q37),

gồm có 13 exon chia làm 2 nhóm Nhóm 1 bao gồm 9 exon được kí hiệu là A1, A3,A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10) Nhóm 2 gồm bốn exon, được kí hiệu từ 2 đến 5

(Hình 1.3) 9 exon nhóm 1 mã hóa cho vị trí liên kết với cơ chất với enzym và đều

có một promoter riêng Sau phiên mã tổng hợp mARN, mỗi exon nhóm 1 nối với 4exon nhóm 2, tạo ra các chuỗi mARN khác nhau, từ đó tạo thành các polypeptitkhác nhau [2]

Hình 1.3 Sơ đồ locus UGT1A1 ở người Mỗi gen UGT1A bao gồm một exon nhóm

1 (A) và 4 exon nhóm 2 phía sau (exone 2-5) Các exon nhóm 1 luân phiên nối với 4 exon nhóm 2 phía sau tạo thành 9 loại protein khác nhau [25]

Trong số các exon này, gen UGT1A1 mã hóa cho enzym UGT1A1 được

quan tâm nhiều hơn cả vì những ảnh hưởng của nó với thực tiễn lâm sàng Hơn 100

đa hình di truyền của UGT1A1 đã được mô tả, một vài trong số chúng làm tăng,

giảm hoạt động hoặc bất hoạt enzym UGT1A1 (Bảng 1) [25].

Bảng 1 Các đa hình di truyền UGT1A1 phổ biến [25].

thay đổi thay đổi

Ghi chú : CN1: Hội chứng Crigler – Najar type 1

CN2: Hội chứng Crigler – Najar type 2Gilbert: Hội chứng Gilbert

4

Như Bảng 1 thống kê, đa số các alen mới được phát sinh chủ yếu là các dạng

biến đổi do thay thế nucleotit (đa hình di truyền đơn nucleotit), thêm và mất mộtđoạn trình tự ADN Trong số các đa hình trên, phần lớn gây ảnh hưởng đến hoạtđộng của enzym UGT1A, dẫn đến các rối loạn bệnh lý như hội chứng Crigler –Najar type 1,2 hay hội chứng Gilbert

1.2 Một số bệnh lý liên quan đến enzym UGT1A

1.2.1 Hội chứng Gilbert

Hội chứng Gilbert là một tình trạng di truyền thường gặp, đặc trưng chủ yếubởi tăng bilirubin không liên hợp trong máu, không có bệnh lý về tế bào gan hoặchuyết tán Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1901 bởi AugustinGilbert và Pierre Lereboullet [10] Nguyên nhân của b ệnh được xác định là do sựsuy giảm hoạt động của enzym UGT1A, có liên quan mật thiết đến đa hình di truyền

UGT1A1*28.

Những triệu chứng điển hình của hội ch ứng Gilbert có thể kể đến như vàng

da nhẹ liên tục ở thanh thiếu niên, billirubin gián tiếp tăng sau mất nước, tiêu chảy,kinh nguyệt Các triệu chứng không điển hình khác đau bụng, đau dạ dày, mệt mỏi,sụt cân [10]

Về vàng da, trong hội chứng Gilbert cơ thể sản xuất một lượng bilirubin tự

do cao hơn bình thường trong máu và không gây ra hậu quả nghiêm trọng Vàng da

có thể xuất hiện sau khi bệnh nhân bị stress, nhiễm trùng, gắng sức,…, nhưngthường là không có triệ u ch ứ ng [26] Cũng đã có các báo cáo cho thấy hội chứngGilbert góp phần thúc đẩ y sự khởi đầu của bàng da sơ sinh, đặc biệt là trong trườnghợp tăng tan máu như tr ng bệnh thiếu enzym G6PD Tình trạng này có thể trở nênđặc biệt nghiêm trọng nếu không nhanh chóng điều trị nồng độ bilirunbin tăng caotrong máu, gây ra ảnh hưởng về thần kinh không thể phục hồi trong bệnh vàng danhân não [13]

Về khả năng chuyển hóa thuốc, những bất thường liên quan đến enzymUGT1A1 trong hội chứng Gilbert cũng ảnh hưởng đến vài khả năng của gan tronggiải độc thuốc của gan Hội chứng Gilbert có liên quan đến tình trạng tiêu chảy nặng

và sự giảm bạch cầu trung tính ở những bệnh nhân được điều trị với Irinotecan (mộtthuốc điều trị ung thư), là cơ chất của UGT1A1 Paracetamol không được chuyểnhóa bởi UGT1A1 nhưng enzym chuyển hóa nó cũng có bất thường trong hội chứngGilbert Nên các BN có hội chứng Gilbert có nguy cơ ngộ độc paracetamol cao hơn

Hội chứng Gilbert có ảnh hưởng đến hệ Tim mạch Bilirubin có đặc tínhchống oxi hóa mạnh trong ống nghiệm, làm giảm quá trình oxy hóa huyết tương [8].Một vài phân tích cho thấy những người bị hội chứng Gilbert và đái tháo đường cónguy cơ bị các bệnh mạch vành thấp hơn người bình thường [16].

Hội chứng Gilbert là một tình trạng lành tính, do vậy không cần m ột chế độquản lý, điều trị đặc biệt và không cần bất kỳ một chế độ ăn kiêng nào

1.2.2 Hội chứng Crigler – Najar

Hội chứng Crigler-Najjar (CNS) là một rối loạn di truyền hiếm gặp gây rốiloạn chuyển hóa bilirubin Hội chứng Crigler-Najjar được p ân thành 2 loại Type 1được mô tả bởi Crigler và Najjar vào năm 1952 có liên quan đến tăng bilirubin giántiếp ở trẻ sơ sinh sơ sinh và vàng da nhân Type 2 (còn gọi là hội chứng Arias) đượcArias phát hiện vào năm 1962, với mức bilirubin trong máu thấp hơn và đáp ứngvới điều trị phenobarbital [32]

Hội chứng CNS liên quan đến sự thiế u hụt enzym UGT do đột biến trongtrình tự mã hóa enzym UGT Trong hội chứ g Crigler-Najjar type 1, cơ thể gần nhưthiếu hụt hoàn toàn enzym UGT, dẫn đế ống độ bilirubin trong máu sau sinh rất cao(có thể lên đến 50 mg/dl) Trong khi đó, Crigler-Najjar type 2 có nồng độ bilirubinthấp hơn (khoảng 20 mg/ l) Đối với các trường hợp này, điều trị phenobarbital cóthể thúc đẩ y sự hoạt động của enzym UGT, làm giảm nồng độ bilirubin trong máukhoảng 25% [32]

Trong hội chứng Crigler-Najjar type 1, bệnh nhân sẽ có biểu hiện vàng dakéo dài sau sinh Đối với type 2, vàng da có thể không biểu hiện cho đến khi bệnhnhân đến độ tuổi thiếu niên Hậu quả nghiêm trọng nhất của tăng bilirubin máu làvàng da nhân và tình trạng này xảy ra ở hầu hết bệnh nhân type 1 không được điềutrị, đặc biệt trong những ngày đầu sau sinh Biến chứng vàng da nhân não do tăngbilirubin hiế m gặp ở type 2, nhưng có thể bị thúc đẩy bởi các yếu tố nhiễm trùng,thuốc mê, hay sử dụng thuốc Biểu hiện lâm sàng của vàng da nhân gồm giảmtrương lực cơ, điếc, liệt vận nhãn, hôn mê và tử vong

Với các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler-Najjar type 2 có thể không cầnđiều tr ị hay được điều trị bằng phenobarbital Ngược lại, khi xuất hiện biến chứngvàng da nhân trên bệnh nhân type 1, cần được nhanh chóng điều trị nhằm hạn chếcác di chứng thần kinh Các thuốc phenobarbital (luminal, barbita) được sử dụng đểhạn chế các di chứng thần kinh trong bệnh nhân type 1và điều trị các triệu chứngthần kinh đối với type 2 [19]

Điều trị khẩn biến chứng não do tăng bilirubin bao gồm truyền huyết tương,nhằm loại bỏ albumin đã bão hòa bilirubun trong máu, đồng thởi cung cấp protein

tự do để gắn kết với bilirubin trong mô, giảm nồng độ bilirubun [15]

Truyền huyết tương cần điều trị kèm chiếu đèn trong thời gian dài, giúpchuyển đổi bilirubin gián tiếp sang bilirubin trực tiếp để có thể thải ra theo nướctiểu Sử dụng canxi photphat cũng có thể hỗ trợ cho liệu pháp chiếu đèn [15]

1.3 Đa hình di truyền UGT1A1*28

Trong số các đa hình di truyền của UGT1A1, đa hình di t uyền UGT1A1*28 phổ biến và được quan tâm nhiều nhất UGT1A1*28 gây suy giảm hoạt tính của

enzym UGT1A1, dẫn đến các rối loạn về chuyển hóa cũng như chức năng giải độc

của gan với các thuốc UGT1A1*28 được ghi nhận có liên quan đến nhiều bệnh lý

chuyển hóa và sự gia tăng những tác dụng khô g mong muốn của các thuốc, đặc biệt

là irinotecan trong điều trị ung thư đại trực trà g

UGT1A1*28 là đa hình di truyền với s ự lặp lại 7 lần của trình tự

thymine-adenine (TA) ở vùng promoter của UGT1A1[17] Ở dạng kiểu dại trình tự (TA) chỉ lặp lại 6 lần và được kí hiệu là alen UGT1A1*1 Độ dài của trình tự TA ở vùng promoter của exon UGT1A1 liên quan hặt chẽ đến hoạt tính của enzym UGT1A1 Chính vì vậy đa hình UGT1A1*28 đã được ghi nhận gây giảm hoạt tính của enzym UGT1A1 Người mang 1 alen UGT1A1*28 có hoạt tính enzym UGT1A1 giảm 25%

và giảm đến 70% ở người có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 (mang 2 alen

UGT1A1*28) [5],[6] Tầ n số xuất hiện của alen UGT1A1*28 dao động nhiều ở các

quần thể khác nhau: 26% đến 31% ở quần thể người da trắng, 42% đến 56% ở quầnthể người Châu Phi và 9% đến 16% ở các quần thể người Châu Á

Ảnh hưởng lớn nhất của alen UGT1A1*28 liên quan đến quá trình chuyển

hóa của một số t uốc và tình trạng tăng nồng độ bilirubin không liên hợp (bilirubingián tiếp) Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của nhân hem trong hemoglobin củahồng cầu, ch ủ yếu được tạo ra ở hệ thống tổ chức liên võng, ngoài hệ thống tuầnhoàn Đây là một chất không tan trong nước có ái lực cao với lipid và albumin củahuyế hanh Do có ái lực cao với lipid của màng tế bào nên sự kết hợp với lipid màngcủa bilirubin gây hư hại chức năng màng tế bào đặc biệt của hệ thống thần

k nh Bilirubin được vận chuyển vào máu và kết hợp với albumin của huyết thanh,sau đó được vận chuyển đến gan và được giải phóng nhanh chóng khỏi albumin Ở tế bàogan, bilirubin được glucuronic hóa nhờ các UGT tạo thành bilirubin liên hợp, là chất tantrong nước, dễ dàng đào thải qua phân và nước tiểu [2]

Hoạt tính của enym UGT, đặc biệt là UGT1A1 suy giảm sẽ làm tăng nồng độbilirubin không liên hợp trong máu, gây ra tình trạng vàng da Đột biến

UGT1A1*28 đã được quan sát thấy ở các bệnh nhân mắc hội chứng Crigler – ajar

type I và được ghi nhận là dấu hiệu của hội chứng Gilbert [12]

Nhiều thuốc khác đã được xác định là chất ức chế hoạt động c ủ a enzymUGT1A1 như Indinavir (kháng retrovirus, sử dụng trong điều trị HIV), Atazanavir(điều trị HIV), Sorafenib (điều trị ung thư gan và thận)…[17] Nhiều nghiên cứu

cho thấy xác định sự có mặt của alen UGT1A1*28 ở những bệnh nhân điều trị với

Atazanavir, Indinavir có thể giúp họ tránh bị tăng bilirubin không liên hợp [4], [24].Một số thuốc khác đã được xác định là cơ chất của UGT1A1 như raloxifene (điều trịloãng xương), raltegravir (ức chế virus, sử dụng trong điều trị HIV)… đặc biệt làirinotecan (thuốc điều trị ung thư đại trực tràng) được quan tâm nhất Ảnh hưởng

của alen UGT1A1*28 đến bệnh nhân điều trị bằ g irnotecan sẽ được trình bày cụ thể hơn ở bên dưới Đến nay, mối tương quan giữ đa hình UGT1A1*28 và đáp ứng của

cơ thể với các thuốc khác nhau vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu

1.4 Ung thƣ đại trực tràng và mố liên quan giữa irinotecan với đa hình

di truyền UGT1A1*28

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất trên thếgiới cũng như ở Việt Nam Trong điều trị bệnh, irinotecan được sử dụng thườngxuyên cho những bệnh nhân ở giai đoạn IV Tuy nhiên thuốc có nhiều tác dụng

không mong muốn như tiêu chảy nặng, suy tủy, xuất huyết… UGT1A1*28 được ghi

nhận có liên quan chặt ch ẽ đến các tác dụng không mong muốn này Do vậy trong

thực hành lâm sàng, các bác sĩ cần cân nhắc xét nghiệm UGT1A1*28 trước khi

quyết định điều trị bằng irinotecan và điều chỉnh liều lượng thuốc phù hợp cho bệnhnhân để tránh ác tác dụng không mong muốn nặng

Theo t ổ hức Y tế thế giới, ung thư là nguyên nhân tử vong đứng hàng thứhai, với kho ả ng 14 triệu trường hợp mắc mới vào năm 2012 và sẽ tăng khoảng70% trong vòng 2 thập kỷ tới Khoảng 70% số ca tử vong do ung thư xảy ra ở cácnước có thu nhập thấp và trung bình [16] Việt Nam cũng không phải ngoại lệ Theothông in được đưa ra tại hội thảo khoa học Ung bướu quốc gia lần thứ VII năm

2013, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150.000 người mới mắc ung thư và 75.000người tử vong vì căn bệnh này, tức 205 người/ngày và con số này dự báo sẽ ngàycàng tăng cao Tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong của các ung thư phổ biến được thể hiện

trong Hình 1.4.

Trong số các ung thư phổ biến, ung thư đại trực tràng là một trong nhữngdạng ung thư có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao nhất ở cả 2 giới Trên thế giới, ung thưđại trực tràng có tỉ lệ mắc cao thứ 4 (17,2%) và tỉ lệ tử vong cao thứ 5 (8,3%) TạiViệt Nam, ung thư đại trực tràng nằm trong số 5 bệnh ung thư thường g ặp với tỉ lệmắc là 10,1% và tỉ lệ tử vong là 7,0% So với các ung thư đường tiêu hóa khác, ungthư đại trực tràng có tiên lượng tốt hơn Tỉ lệ sống 5 năm phụ thuộc vào giai đoạnbệnh: giai đoạn I >90%, giai đoạn II>60%, giai đoạn III > 30% và giai đoạn IV<5%[17] Tuy nhiên các chương trình sàng lọc ung thư đại trực tràng mới được triểnkhai trong những năm gần đây, hơn nữa sự tiếp cận của người dân với các phươngpháp chẩn đoán sớm còn hạn chế nên tình trạng bệnh nhân phát hiện ra bệnh ở giaiđoạn muộn vẫn còn cao.

Hình 1.4 Tỉ lệ mắc và tử vong ở cả hai giới của 10 ung thư phổ biến nhất năm

2012 [33]

Irinotecan (CPT-11,7-ethyl-10-[4-(1-(piperidino)-1-piperidino] carbonylcamptothecin, Camptosar®) là thuốc điều trị chính để điều trị ung thư đại trực trànggiai đoạ n muộn, khi ung thư di căn, tái phát hoặc tiến triển sau điều trị ban đầu

T uốc thường được sử dụng kết hợp với các thuốc khác trong các phác đồ Pháp đồđiều trị phối hợp irinotecan thông thường là FOLFIRI (FOLONIC acid, Fluoroucacilhoặc leucovorin, IRInotecan) [17]

Irinotecan là một dẫn xuất tổng hợp của thuốc chống ung thư camptothecin(lần đầu tiên được phân lập từ cây Camptotheca) Giống như camptothecin,

irinotecan ức chế enzym topoisomerase I (là một enzym trong nhân tế bào) Enzymnày xúc tác cho một số quá trình trong nhân tế bào như điều hòa cấu trúc cuộn xoắn,quá trình sao chép và sửa chữa của ADN.

Irinotecan là tiền chất của SN38 Dạng hoạt hóa SN38 có hoạt tính m ạnh gấp

100 -1000 lần so với Irinotecan [18] SN-38 có tác dụng gây độc tế bào bằng cáchliên kết với phức hợp topoisomerase-ADN, làm gián đoạn quá trình cắt sợi đơn, ngừngquá trình sao chép Việc quá trình sao chép bị ngừng đột ngột và sự tương tác của cácenzym sao chép với phức hợp SN38-topoisome ase-ADN phá vỡ cấu trúc sợi kép củaADN, gây ra những tổn thương ADN không hồi phục, đưa các tế bào vào quá trìnhapotosis (chết theo chu trình) Chính vì tác dụng như vậy mà irinotecan ngăn cản sự pháttriển và tiêu diệt các tế bào ung thư Nhưng cũng vì thế thuốc ảnh hưởng đến các mô, cơquan có các tế bào có khả năng phân chia mạnh như đường tiêu hóa, tủy xương Hậu quả

là thuốc thường gây nên các tác dụng không mong muốn có thể dẫn đến tử vong như tiêuchảy nặng, suy tủy, dễ chảy máu… do tích tụ sản phẩm chuyển hóa Tuy nhiên, nhờ cóenzym UGT1A trong gan, SN-38 được glucuronyl hóa tạo thà h sản phẩm không độc và

đào thải được (Hình 5).

Hình 1.5 Đa hình di truyền UGT1A1 và sự chuyển hóa irinotecan a) Sự chuyển

hóa của irinotecan nhờ enzym UGT1A1 ở gan b) Đa hình di truyền vùng promoter của alen UGT1A1*28 ảnh hưởng tới hoạt tính glucuronul hóa của enzym UGT1A1

Dưới sự xúc tác của enzym UGT1A1, SN-38 liên hợp với axit glucuronic hìnhthành SN-38 glucuronit không còn hoạt tính gây độc, được đào thải chủ yếuqua mật, khoảng 30% qua thận[14] Chính vì vậy, những bệnh nhân mang alen

UGT1A1*28 làm giảm biểu hiện của UGT1A1 sẽ gây tích tụ SN-38 trong cơ thể,

gây nguy cơ xuất hiện các tác dụng phụ ở mức độ nặng khi điều trị bằng irinotecan

[11] Năm 2005, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and DrugAdministration, viết tắt là FDA) đã đưa ra khuyến cáo nên xét nghiệm gen

UGT1A1*28 khi dùng irinotecan và có hướng dẫn về điều trị tương ứng với từng

kiểu gen (Hình 1.6) [23].

Chưa có một liều lượng irinotecan cụ thể được thiết lập cho alen

UGT1A1*28 Tuy nhiên Innocenti và cộng sự năm 2006 đã đưa ra khuyến cáo giảm

20% liều cho bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp UGT1A1*28 Liều lượng thuốc có

thể điều chỉnh tăng hoặc giảm trong lần điều trị thứ 2 dựa trên các đáp ứng của khối

u với thuốc và quá trình theo dõi các tác dụng không mong muốn

Hình 1.6 Irinotecan và phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng liên quan đến

kiểu gen UGT1A1[16]

1.5 Các phương pháp phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28

Hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau để phân tích các đa hình ditruyền Các phương pháp này dựa trên những nguyên lý khác nhau như trình bàybên dưới Tuy nhiên phương pháp giải trình tự theo nguyên lý của Sanger và PCR-

RFLP được ứ ng dụng trong phân tích đa hình di truyền UGT1A1*28 nhiều hơn cả.

Với nhiều ưu điểm so với các phương pháp khác, phương pháp giải trình tự theonguyên lý của Sanger được lựa chọn cho nghiên cứu này

1.5.1 Giải trình tự ADN

Phần lớn các phương pháp được nói phía dưới ứng dụng cho việc để sàng lọcbước đầu đột biến điểm/ các SNP Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giảitrình tự hiện nay đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm

1977, được gọi là phương pháp dideoxyribonuleotit (gọi tắt là phương phápdideoxy) [35] Nguyên lý cơ bản của phương pháp này dựa trên sự bổ sung các dẫnxuất tương ứng của các deoxynucleotit (dNTP) là 2’,3’-dideoxynucleotit (dd TP).Các ddNTP thiếu nhóm 3’- OH, nên một khi được gắn vào mạch ADN đang tổnghợp thì quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại Theo phản ứng tổng hợp ADN, mộttrình tự Sanger giới hạn được bắt đầu tại một vị trí cụ thể trên chuỗi ADN bằng cách

sử dụng một đoạn oligonucleotit ngắn là đoạn ADN có trình tự xác định trước,thường được tổng hợp hóa học, có trình tự bổ sung với trình tự của mẫu tại vị trí đó.Các mồi oligonucleotit được kéo dài nhờ tác dụng của enzym ADN polymerase.Trong hỗn hợp phản ứng có sẵn các loại dNTP và ddNTP để ngắt phản ứng kéo dàichuỗi Các đoạn ngắn ADN mới được tổng hợp sau đó được điện di trên gelpolyacrylamide, hình ảnh thu được sẽ được dùng để phân tích trình tự ADN [1],[27]

Ngày nay, phương pháp giải trình tự tự độ g được áp dụng rộng rãi ở cácphòng thí nghiệm trên thế giới nhưng cơ bản v ẫn áp dụng nguyên lý như trên Với

sự phát triển của các enzym ADN polym rase và các hợp chất hóa học, phương phápnày cho phép sàng lọc các SNP hiệu quả rất cao khi so sánh với các kỹ thuật đãmiêu tả trên Cho đến nay, giải trình tự thế hệ mới và sử dụng chất huỳnh quang chophép xác định chính xác các điểm đột biến trên cả một hệ gen với độ nhạy rất cao

Ưu điểm của giải trình tự là cung cấp đầy đủ thông tin về điểm đột biến như: loạiđột biến, vị trí và có thể tiến hành phân tích với nhiều đột biến điểm cùng lúc [2]

Tuy vậy hạn chế c ủa phương pháp này là đòi hỏi sản phẩm khuếch đại ADNphải có độ tinh sạch rất cao và các hóa chất, thiết bị đắt tiền Thời gian cần thiết đểtiến hành giải trình tự cũng kéo dài hơn so với các phương pháp như Real – timePCR và PCR - RFLP Tuy nhiên, giải trình tự vẫn là phương pháp tốt nhất để xácđịnh chính xác ùng lúc tất cả các đa hình trên phân đoạn cần phân tích, phù hợp chocác nghiên cứu chưa xác định được đa hình liên quan đến bệnh lý quan tâm Bêncạnh đó, giải trình tự xác định được sự xuất hiện của đột biến, cung cấp dữ liệu kiểugen đầy đủ của đối tượng tham gia nghiên cứu [1]

1.5.2 Phân tích đa hình cấu hình sợi đơn ( Single-strand

conformation polymorphism - SSCP):

Đây là một phương pháp đơn giản được sử dụng trong nghiên cứu đột biến điểm là phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) của phân tử ADN Cấu trúc

không gian 3 chiều của phân tử ADN sợi đơn được xác định bởi trình tự và môitrường chứa chúng Do đó, trong trường hợp điều kiện môi trường không thay đổi,cấu trúc của chúng chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotit và bất cứ thay đổi nào trong

đó cũng làm thay đổi cấu hình sợi đơn Phương pháp này sử dụng PCR để khuếchđại đoạn gen mong muốn Sau đó sản phẩm PCR được điện di trên gelpolyacrylamit không biến tính, các nucleotit trên phân tử ADN sợi đơn sẽ bắt cặp bổsung lại với nhau, dẫn đến hình thành cấu hình không gian khác nhau do sự khácbiệt về trình tự nucleotit Các phân tử ADN sợi đơn này sẽ di chuyển với tốc độkhông giống nhau và phân tách ra Những yếu tố khác ảnh hưởng đến cấu hình sợiđơn như nhiệt độ, pH, đệm chạy có thể được sử dụng để tăng khả năng phân tách.Nhìn chung, nhiệt độ và pH thấp giúp duy trì cấu hình và dễ dàng phân biệt đượccác phân tử ADN có trình tự khác nhau [22], [29]

Cũng giống như phương pháp SSCP, nguyên lý của phương pháp phân tích

dị sợi kép dựa trên sự hình thành của ADN dị sợi kép Các ADN của một mẫu cókiểu dại đã được xác định trước đượ trộ lẫn với mẫu ADN cần phân tích Các phân

tử ADN sợi kép được biến tính ở nhiệt độ cao để phân tách 2 mạch đơn Nếu mẫucần phân tích có kiểu gen dị hợp thì trong mẫu trộn lẫn sau biến tính sẽ bao gồm cácsợi bổ sung và các sợi có chứa một cặp basơ không bổ sung (tương ứng với vị trícủa SNP) Sau đó hạ nhiệt độ xuống chúng sẽ liên kết lại với nhau hình thành ADN

dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Chính sự xuất hiện của cặp basơghép đôi không chính xác này làm giảm tốc độ di chuyển khi điện di của các phân

tử ADN dị sợi kép so với các phân tử ADN đồng sợi kép Hiện nay phương phápnày đã được cải tiến bằng cách khuếch đại các đoạn ADN của mẫu kiểu gen hoangdại và kiểu gen cần phân tích [22], [29]

1.5.4 Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction fragment

length polymorphism – RFLP)

Nguyên lí cơ bản của phương pháp này là dựa vào tính chất của enzym giớihạn, có hể nhận biết một trình tự ADN đặc hiệu để cắt đoạn ADN thành các mảnhnhỏ có chiều dài khác nhau Các mảnh giới hạn này sau đó được phân tách theochiều dài của chúng bằng phương pháp điện di trên gel agarose/polyacrylamitvà/hoặc được chuyển qua màng bằng phương pháp lai Southern blot Trên màng lai

có những đầu dò ADN để xác định những đoạn ADN giới hạn có thể bắt cặp bổ

sung với chúng Phân tích RFLP thường được hỗ trợ bằng kĩ thuật PCR để khuếchđại đoạn gen cần phân tích Chính vì thế, kĩ thuật này thường được gọi là PCR-RFLP Tùy theo mục đích và dựa vào đặc điểm của gen cần nghiên cứu, người ta cóthể thực hiện phương pháp PCR-RFLP theo các cách khác nhau, có thể đơn giảnhóa hoặc tiến hành cùng một số phương pháp khác [27], [29].

1.5.5 Real – time PCR

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuyếch đại đoạn ADN đích, ngườilàm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả ví dụ như điện di sảnphẩm PCR trên gel agarose, acrylamide hay thí nghiệm lai với các đoạn dò đặc hiệu(trên màng, trên giếng hay phiến nhựa…) để xem sả n phẩm khuếch đại có trình tựmong muốn hay không Kỹ thuật PCR cần phải có giai đoạn đọc kết quả sau khihoàn tất phản ứng khuếch đại được gọi là PCR cổ điển

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà số lượ g khuếch đại ADN đích hiển thịđược ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Quá trình khuếch đại ADN của cácống được hiển thị dưới dạng một biểu đồ khuếch đại Các dNTP (nguyên liệu đểtổng hợp ADN) được đánh dấu huỳnh quang Cường độ huỳnh quang trong ốngphản ứng sẽ tăng sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của ADN đích tăng gấpđôi sau mỗi chu kỳ và được máy ghi lại để dựng thành biểu đồ Tuy nhiên cường độhuỳnh quang trong ống sẽ tăng trưởng đến một mức độ thì sẽ chậm dần và thànhđường ngang do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzym Taq polymerase không hoạtđộng hiệu quả nữa, nên số lượng bản sao không còn gia tăng số lượng theo cấp số 2nữa [27], [29]

1.5.6 Phân giải cao nhiệt độ chảy

V.Thomas và cộng sự năm 2013 đã phát triển quy trình phân tích đa hình di

truyền vùng promoter của gen UGT1A1 dựa trên kĩ thuật HRM (phân giải cao nhiệt

độ chảy) Phương pháp này có ưu điểm dễ ứng dụng, tiết kiệm chi phí và thời gianhơn so với phương pháp giải trình tự Tuy nhiên phương pháp này không phân tíchđược s ự khác nhau giữa các kiểu gen dị hợp TA6/TA7 và TA6/TA8 và cần sử dụng

p ương pháp điện di tiếp sau để phân biệt 2 loại kiểu gen dị hợp này (thể hiện trong

Hình 1.7 và Hình 1.8) [30] Chính vì vậy, V.Thomas vẫn đưa ra khuyến cáo nên sử

dụng phương pháp giải trình tự để có được kết quả khách quan khi phân tích đa hình TA6/TA7 [30]

TA 7 /TA 7

TA 6 /TA 7 và TA5/TA8

TA 6 /TA 8 TA5/TA5

TA 6 /TA 6

TA5/TA6 TA5 /TA7

Hình 1.7 Biên độ nhiệt của các đa hình vùng promoter của gen UGT1A1 Tất cả

8 kiểu gen TA n đều được phân biệt rõ ràng với các kiểu gen khác, ngoại trừ kiểu gen TA 6 /TA 7 và TA 6 /TA 8 [30].

được 1 băng ADN Ttrong khi đó, bệnh nhân có kiểu gen TA 6 /TA 8 sẽ thu được 2 băng ADN.

15

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

38 mẫu sinh phẩm thu được sau phẫu thuật tại Bệnh viện 198 B ộ Công an được cố định trong formalin và đúc trong paraffin, được bảo quản ở 4 oC

8/38 bệnh nhân trên cung cấp thêm mẫu máu (1 ml) bảo quản trong EDTAlưu ở -20 oC đến khi sử dụng

2.2 Hóa chất

Nhóm hóa chất tách ADN tổng số: Kit ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep

System (Promega) dùng cho mẫu mô đúc trong paraffin; Kit E.Z.N.A blood DNAMini kit (Omega-Biotek) dùng cho mẫu máu; Ethanol 100%; Isopropanol 100%

Nhóm hóa chất điện di: EDTA(Affymetrix); Tris base (Bio basic); agarose

(Lonza); GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (Thermo Scientific) dùng cho điện disản phẩm PCR; Lamdba DNA/HindIII Ladd r (Thermo Scientific) dùng cho điện disản phẩm ADN tổng số; 6X ADN loading dye (Thermo Scientific)

Nhóm hóa chất phản ứng PCR: dNTPMix 2mM (Thermo Scientific); Q5

High-Fidelity ADN polymerase (NEB); Nước khử ion (Omega-Biotek); Cặp mồiđặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ) với trình tự như sau:

F1: 5’ GCTCCACCTTCTTTATCTCTG 3’

R1: 5’ ATC AAC AGT ATC TTC CCA GCA 3’

Nhóm hóa chất giải trình tự: BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing (Applied

Biosystems); Dung dịch SAM (Applied Biosystems)

2.3 T iết bị và địa điểm nghiên cứu

Bể ổn nhiệt; Tủ ấm; Máy lắc VELP Scientifica (Đức); Máy li tâm EBA 21Hettich Zentrifugen (Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel Cole-Parmer (M ỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh sâu -20 ˚C (NhậtBản); Máy phân tích phân đoạn ADN tự động (Applied Biosystems); Máy quangphổ NP80 Nanophotometer (Đức)

Nghiên cứu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Y Dượchọc cơ sở - Khoa Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số cần được thu hồi từ mẫu sinh phẩm để thực hiện cho các phản

ứng tiếp theo Với phản ứng PCR để nhân dòng một đoạn ADN xác định rất cần

ADN được tinh sạch Các tạp chất còn lẫn trong mẫu ADN cần nhân dòng có thể ức

chế hoặc làm giảm hiệu suất của quá trình PCR Để giải quyết vấn đề này, mẫu cần

được xử lý qua một loạt quá trình ly giải để khử tạp chất Một trong số các phương

pháp phổ biến nhất hiện nay và cũng được áp dụng trong nghiên cứu này là phương

pháp tinh sạch ADN bằng cột ly tâm chứa chất bám silica (mô tả trong Hình 2.1)

[9]

mẫu

Hình 2.1 Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica [35]

Để tiến hành tinh sạ ch ADN theo phương pháp này, người ta sử dụng đệm ly

giải chứa nồng độ cao các muối hoạt động bề mặt cao Các chấp hoạt động bề mặt

này sẽ làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van der Walls và tương tác kị nước [9]

Protein cũng bị mất ổn định và liên kết của chúng với axit nucleic bị phá vỡ tạo điều

kiện chuyển ADN lên màng silica ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và sau đó

được gi ải phóng ở lực ion thấp Để tăng cường khả năng gắn cả acid nucleic lên

màng, các alcohol cũng được thêm (ở nghiên cứu này sử dụng ethanol) Dung dịch

ly giả i c ần được ly tâm tiếp để có thể đi qua màng silica, sau ly tâm chỉ ADN hoặc

ARN được giữ lại trên màng, còn các thành phần khác như protein, poysaccarit,

sẽ bị rửa trôi Sau đó cột silica được ly tâm để làm khô cột, loại bỏ ethanol Cuối

cùng, đệm Tris 10mM hoặc nước được thêm vào màng để các acid nucleic sẽ bị

hydrat hóa và được giải phóng nhanh chóng ra khỏi màng [9]

2.4.2 Đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng số

Hai phương pháp để đánh giá chất lượng của sản phẩm tách ADN tổng sốđược sử dụng trong nghiên cứu này là điện di ADN và đo mật độ quang

Với phương pháp điện di ADN, nguyên tắc là dưới tác động của điện trường,các phân tử axit nucleic khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ uộn xoắn vàdạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực

âm sang cực dương với tốc độ di chuyển khác nhau Vì vậy chúng dần tách nhau ratrên trường điện di; qua đó ta có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạnADN hoặc gen riêng rẽ Trên trường điện di, các phân đoạn ADN có kích thướccàng nhỏ càng di chuyển nhanh Sau khi điện di kết thúc, các phân tử ADN có thểquan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, như ethidium bromide.Mỗi băng điện di thường phản ánh một tập hợp các phân tử ADN có cùng kíchthước [1]

Có 2 loại gel được dùng phổ biến là gel agarose và polyacrylamide Gelpolyacrylamid có độ phân giải cao, như g vùng kích thước ADN có thể phân tíchhẹp, thường chỉ dùng để phân tích các đoạn ADN kích thước nhỏ (5 – 1000 bp).Trong khi đó gel agarose có độ phân giả thấp đối với các đoạn ADN có kích thướcnhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân tách các đoạn ADN kích thước lớn (khoảng từ 200

bp đến 20 kb) Trường hợp ki ểm tra độ tinh sạch ADN tổng số, tôi sử dụng gelagarose để kiểm tra độ tinh s ạch của sản phẩm ADN tương ứng với kích thướckhoảng 23 kb [1]

Với phương pháp đo mật độ quang, nguyên lý dựa trên cường độ hấp thụ tia

tử ngoại của các cấu trúc vòng thơm trong các nucleotit cấu tạo nên phân tử ADN.Khi tia UV được c iếu qua dung dịch axit nucleic, mức độ hấp thụ tia UV (OD260)phụ thuộc vào nồng độ các axit nucleic Dựa trên nồng độ ADN hoặc ARN của cácdung dịch chuẩn biết trước, các giá trị OD 260 tương ứng được dùng để vẽ đườngtuyến tính chuẩn tương quan giữa nồng độ axit nucleic với chỉ số OD 260 Khác vớiaxit nucleic, protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (chủ yếu là docấu rúc vòng thơm của axit amin tryptophan) Do vậy độ tinh sạch của dịch chiếtADN có thể xác định qua tỉ số OD 260/280 [1]

2.4.3 Phản ứng PCR nhân dòng vùng promoter của UGT1A1

Kỹ thuật PCR dùng ADN polymerase để tổng hợp phân tử ADN mới từ trình

tự của phân tử ADN làm khuôn với tiền chất là các dNTP Các ADN polymerase

tổng hợp ADN theo chiều 5’ đến 3’ và có thể xúc tác gắn nucleotit vào đầu 3’ của

một đoạn oligonucleotit có sẵn làm mồi (mô tả ở Hình 2.2) [1].

để những đoạn ADN polymerase

lặp lại Mỗi chu kì lƣợng mồi gắn vào trình tổng hợp đoạn ADN

ADN tăng gấp đôi

tự bổ sung trên mới bổ sung với mạch ADN gốc mạch ADN gốc

Mạch ADN Mồi mới

Mạch ADN cũ

Hình 2.2 Quy trình PCR [35]

Tuy nhiên do chỉ nhân được một chiều nên phản ứng PCR cần hai đoạn mồi

có vị trí liên kết chặn ở hai đầu đoạn ADN cần nhân dòng Đoạn oligonucleotit cótrình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch mã hóa được gọi là mồi xuôi Đoạn thứ hai cótrình tự bổ sung với đầu 5’ của mạch đối mã được gọi là mồi ngược Phân tử ADNlàm khuôn được gây biến tính bởi nhiệt, tạo điều kiện cho các mồi xuôi và mồingược đính kết vào các vị trí ở hai đầu đoạn ADN cần nhân dòng Với sự có mặtcủa các nguyên liệu là các dNTP, ADN polymerase sẽ nhân dòng đoạn trình tựADN được giới ạn bởi hai đoạn mồi [1]

Sau khi đoạn ADN mới được tổng hợp, phân tử ADN được hồi tính để mạchADN mới v ới mạch ADN gốc liên kết bổ sung với nhau Kết quả hình thành haiphân tử ADN có trình tự giống hệt phân tử ADN ban đầu Sự biến tính và hồi tínhđược l ặp đi lặp lại qua nhiều chu kỳ để tăng số lượng ADN lên theo cấp số nhânnhờ khả năng điều nhiệt của máy Mỗi chu kỳ điều nhiệt, số phân tử ADN tăng gấpđôi Nhờ vậy phản ứng PCR có độ nhạy cao Chỉ cần vài bản sao ADN có trong