Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên thực nghiệm

Feng Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ 18 Sâm vũ diệp Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ 19 Tam thất hoang Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dị ch thể hi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA

VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax

stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA

VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP

(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax

stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa YDược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điếu ki ện giúp

em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Em xin chân thành cảm ơn các thầy

cô đã giảng dạy và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5năm qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Dương Thị Ly Hương

và PGS TS Bùi Thanh Tùng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạođiều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này Em cũng xin gửi lời cảm ơn đếncác thầy cô bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã giúp đỡ em trong quá trìnhhoàn thành khóa luận

Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm

từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) vùng Tây Bắc”, mã

số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung

nghiên cứu này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và ngườithân đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏinhững thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô

để khóa lu ận được thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Lưu Thị Huyền Trang

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid

AChE Acetylcholinesterase

ATCI Acetylthiocholine iodid

DMSO Dimethyl sulfoxide

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem. 5

Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T. 6

Tsai et K M Feng)

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết cao giàu saponin từ 18

Sâm vũ diệp

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao giàu saponin từ 19

Tam thất hoang

Hình 2.3 Sự đổi màu của dung dị ch thể hiện tác dụng 21

chống oxy hóa trong phương pháp DPPH

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử 22

Ellman

Đồ thị bi ểu diễn khả năng chống oxy hóa in

Hình 3.1 vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cao 27

giàu saponin

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa in 28

vitro của vitamin C

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym 29

AChE in vitro của berberin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chất hoạt động chứa oxy và nito chính 8Bảng 3.1 Kết quả chống oxy hóa in vitro của vitamin C 26

Bảng 3.2 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ 26

diệp cao giàu saponin

Bảng 3.3 Kết quả chống oxy hóa in vitro của Tam thất 27

hoang cao giàu saponin

Giá trị IC 50 chống oxy hóa in vitro của Sâm

Bảng 3.4 vũ diệp, Tam thất hoang và vitamin C trong 28

phương pháp DPPH

Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in 29

vitro của berberin

Bảng 3.6 Kết quả về khả năng ức chế enzym AChE in 30

vitro của Sâm vũ diệp cao giàu saponin

Bảng 3.7 Kết quả v ề khả năng ức chế enzym AChE in 30

vitro c ủa Tam thất hoang cao giàu saponin

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Panax L 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L 3

1.1.3 Phân bố 3

1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L 4

1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L 4

1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) 5

1.2 Tổng quan về gốc tự do 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Các ROS và RNS 8

1.2.3 Stress oxy hóa 9

1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa 10

1.3 Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan 11

1.3.1 Acetylcholin 11

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase 12

1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13

1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Dung môi, hóa chất 20

2.3 Máy móc, dụng cụ 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 20

2.4.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 22

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả thực nghiệm 26

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang……… 26

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 29

3.2 Bàn luận 31

3.2.1 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ diệp và Tam thất hoang 31

3.2.2 Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và Tam th ất hoang 34

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gốc tự do là một thuật ngữ đã trở lên quen thuộc với giới y khoa vàngày càng được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn Bởi gốc tự do có nhiềutác hại với sức khỏe của con người Nó là nguồn gốc của sự lão hóa và hơn

100 bệnh tật nguy hiểm, bao gồm các bệnh về não, mắt, da, hệ miễn dịch, tim,mạch máu, phổi, thận, đa cơ quan và khớp Đồng thời, gốc tự do còn là nguyênnhân gây ung thư [22] Sau khi lấy đi điện tử, gốc tự do làm tổn thương màng tếbào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các acid béo, dẫn đến nhữngbiến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào Số lượng gốc tự do tích lũy theotuổi và tác hại ngày càng nghiêm trọng [1]

Gốc tự do tác động tới tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể, trong đó

có các tế bào thần kinh Gốc tự do là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa

tế bào thần kinh và bệnh lý mạch máu não [1, 20] Một trong những bệnhthoái hóa tế bào thần kinh được quan tâm là bệnh Alzheimer

Thống kê ở châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnhAlzheimer, con số này được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ màdạng bệnh điển hình là Alzheimer [3] Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ làm giảmkhả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duynhận thức, hành động… ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượngcuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cộng đồng xãhội Các nhà khoa học đã đưa ra các nguyên nhân để giải thích cho bệnhAlzheimer Trong đó, giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyềnđạt thần kinh bằng Acetylcholin (cholinergic) [21] Bệnh Alzheimer là dogiảm t ổng hợp của Acetylcholine (ACh) (một chất dẫn truyền thần kinh).Trong thực hành lâm sàng, các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chếenzym Acetylcholinesterase duy trì được nồng độ của ACh bằng cách giảmtốc độ phân hủy ACh

Chi Panax L gồm nhiều loài cây thuốc quý như Nhâm sâm (Panaxginseng), tam thất (Panax notoginseng) đã được sử dụng từ lâu đời Các loàithuộc chi Panax L có thành phần hóa học chính là saponin Đây là hợp chất

cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau Trong đó, tác dụng bảo vệ tế bào thầnkinh của dịch chiết saponin từ các loài thuộc chi Panax ngày càng được quantâm nghiên cứu nhiều Theo nghiên cứu của Cheng et al (2005), cácginsenosid Rg1, Rb1 giúp tăng độ bền các tế bào thần kinh [45] Nghiên cứucủa Cheng et al (2016) cho thấy Nhân sâm và Ginsenosid Rg1, Rg3 và Regiảm Aβ trong não động vật [45] Ngoài ra, trong nghiên cứu của Zhong, Z et

al (2005), Saponin trong Tam thất giúp tăng nồng độ và hoạt tính của Cholinacetyltransferase, do đó giúp bảo vệ và cải thiện hệ thần kinh cholinergic [52].Saponin cho tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh theo nhiều cơ chế khác nhau,một trong số các cơ chế liên quan đến khả năng chống oxy hóa của hợp chấtsaponin [45]

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus H Tsai et K M Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhân

sâm (Araliaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc Trong dân gian, 2 loài

được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau… Tuy nhiên,các nghiên cứu về tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế Qua cácnghiên cứu của Liang, Chun, et al (2010) và Nguyễn Hữu Tùng, et al (2011)

về thành phần hóa học của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cho thấysaponin khung drammaran và oleanan chiếm tỷ lệ cao trong rễ và lá Với tỷ lệhàm lượng saponin cao trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, liệu 2 loài này

có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh

Alzheimer không? Tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên thực nghiệm” với mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất

hoang trên in vitro.

2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ

diệp và Tam thất hoang trên in vitro.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Panax L.

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L.

có vị trí phân loại như sau:

Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật

của các loài thuộc chi Panax L

1.1.2 Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L.

Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ Thân rễ ngắn hoặc thon dài,

phân nhánh Các loài khác nhau của chi Panax L có sự khác nhau về độ bền của rễ (rễ các loài P japonicus C A Mayer, P vietnamensis Ha & Grushv.,

và P wangianus S C Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ Lá kép

chân vịt, mọc vòng t ừ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim.Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới Hoa có 5 lá đài hàn liền

ở dưới, tràng 5, nhị 5 B ầu 2-3 có khi đến 5 ô Quả mọng, hình cầu có khi hơidẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41]

Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L (Burkill

1902; Hara 1970; Hu 1976; Wen and Zimmer 1996) [32]

1.1.4 Thành phần hóa học chính của chi Panax L.

Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành

phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L Ngoài ra,

nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, cácpolysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben… cũng đã

được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L.

1.1.4.1 Hợp chất saponin

Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoidkhung dammaran hoặc oleanan Các nhà khoa học đã phân lập và xác địnhcấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau D ựa vào cấu trúc của cácsapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khácnhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất củaprotopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acidoleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác Trong đó,sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol,saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổbiến nhất [49]

1.1.4.2 Hợp chất polyacetylen

Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon

1.1.5 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L

1.1.5.1 Nhâm sâm (Panax ginseng C.A Mey)

Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần và mệt mỏi Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác

dụ ng khác nhau Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của h ệ tim mạch,

hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu [29] 1.1.5.2 Tam thất

(Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen) (Sanchi ginseng)

Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau Dịch chiếtsaponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ timmạch Thành phần saponin trong dược liệu cũng cho thấy tác dụng hạ đường

huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chốngoxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp

và tăng hoạt động của tinh trùng [40]

1.1.5.3 Sâm Mỹ ( Panax quinquefolius)

Các nghiên cứu cho thấy Sâm Mỹ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch,nhờ sự kích thích sản sinh tế bào lympho B, tăng (interleukin) IL-2, IL-10,interferon- γ và làm tăng tế bào diệt tự nhiên (NK) Sâm Mỹ cũng có tác dụngchống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơtim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim Tương tựnhư Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tậptiểu cầu Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39]

1.1.6 Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm

(Araliaceae) Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc

Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng Các nghiên cứu nhiều

cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế

Hình 1.1 Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem.

Hình 1.2 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)

và Rb3 [50] Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập

và xác định được cấu trúc củ a 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũdiệp trong dịch chiết methanol Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là cácbifinoside A—C và 7 h ợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester,chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1,pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2methyl ester [46]

Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà, Nguyễ n Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũdiệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl)

heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ của Sâm vũ diệp Ngoài ra, trong Sâm vũ diệp cũng có các hợp chất

triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic vànhững nguyên tố vi lượng [5, 6] Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen đượcnhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6].

b Tam thất hoang

Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiềusaponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) vớihàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàmlượng thấp [34]

Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khungoleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48].Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đạihọc Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khungdammaran bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từdich chiết ethanol của Tam thất hoang đượ c thu hái ở Trung Quốc [53] Năm

2010, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định được 15 hợpchất saponin khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin Amethyl ester, 3 hợp chất polyme, một sesquitecpen và một acid béo [34]Ngoài ra, Tam thất hoang cũng chứa các thành phần như triterpenoid, tinhdầu, đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, các nguyên tố vilƣợng, và polyuronic [5, 6]

Về tác dụng dược lý:

Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầmmáu, giảm đau… Các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định có trongSâm vũ diệ p có thể giải thích một phần cho các tác dụng chống oxy hóa,chống ung thư, chống mệt mỏi, chống bệnh tiểu đường, cải thiện chức năngsinh s ản… của cây theo y học cổ truyền đã sử dụng [29, 39, 40]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Liang, Chun, et al tiến hành đánh giá khả năng

ức chế khối u của các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang Kết quả cho thấy các hợp chất trong dịch chiết cho tác dụng chống khối u trên các dòng tế bào ung thư của người HL-60 (bệnh bạch cầu ác tính) và HCT-116 (ung thư ruột kết) với các giá trị IC 50 là khác nhau của từng hợp chất [34] Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả

7

năng ức chế NF – κB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợpB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợpchất có tác dụng ức chế phụ thuộc liều đến khả năng phiên mã của TNF – α cóảnh bởi NF – kB [35]

1.2.2 Các ROS và RNS

Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy(Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (ReactiveNitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử.Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất khôngphải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do) [18] (Bảng 1.6)

Bảng 1.1 Các ch ấ t hoạt động chứa oxy và nito chính [18]

ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương

mô Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thốngchống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxyhóa ở mức độ thấp Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiềuROS sẽ gây ra stress oxy hóa ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch,tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47]

Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa cóthể gây hại cho hệ thống sống Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vaitrò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các

bộ phận của cơ thể Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do pháhủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit [18]

Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổichất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể [1,18]

Ở nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tím hiệu làm nhiệm vụ: [1]

• Điều hòa phân ly tế bào

• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) chocác gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm

• Điều hòa biểu hi ệ n các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa

Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gâynên: [1]

1.2.3 Stress oxy hóa

1.2.3.1 Khái niệm

Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa sự sản xuất các gốc tự do và khảnăng của cơ thể sống trong việc khử các chất trung gian hoạt tính cao hay sửachữa các hư hại do những chất này gây ra Sự nhiễu loạn của trạng thái oxyhóa khử của các mô có thể gây ra các ảnh hưởng độc hại thông qua sự sản

sinh của các peroxid và gốc tự do làm hư hại tất cả các thành phần của tế bào,trong đó bao gồm protein, chất béo và DNA [13].

1.2.3.2 Ảnh hưởng của stress oxy hóa

Stress oxy hóa là nguyên nhân quan trọng trong các bệnh gây thoáitriển thần kinh, bao gồm bệnh xơ cứng teo cơ một bên (Amyotrophic LateralSclerosis - ALS) hay bệnh Lou Gehrig, bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer[30] Sự sản xuất ROS, RNS liên quan đến con đường bệnh sinh của các bệnhnày Sự tích lũy quá trình stress oxy hóa cùng với sự rối loạn quá trình hô hấp của

ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson và cácbệnh lý thần kinh khác [44]

Stress oxy hóa cũng được cho là có liên quan đến một số bệnh timmạch, do sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein -LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, giaiđoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và nhiều bệnh tim mạch khác [1] Đồngthời, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân gây đột quỵ, nhồi máu cơ tim, bệnhtiểu đường

Ngoài ra, stress oxy hóa cũng tham gia vào quá trình phát triển bệnhung thư liên quan đến tuổi Các chất hoạt động ROS và RNS gây stress oxyhóa có thể phá hủy trực tiếp DNA, gây ra đột biến và có thể gây ngăn chặnquá trình phân ly tế bào; từ đó thúc đẩy quá trình phát triển, xâm lấn và di căn

của tế bào khối u [20] Nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sự sản xuất của

ROS và RNS trong dạ dày của người, là nguyên nhân của sự phát triển ungthư dạ dày [23]

1.2.4 Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa

1.2.4.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH

Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl; DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa Khi cho các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ

có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất So với các phươngpháp khác, phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp nhanh, đơngiản và ít tốn kém hơn.

1.2.4.2 Phương pháp đánh giá sự khử màu của

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)

Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánhgiá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu

Phương pháp sử dụng quang phổ diod-array để đo sự mất màu khi thêmmột chất chống oxy hóa gốc có màu xanh lam ABTS· + (2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) ABTS· + là một gốc tự do ổn địnhkhông tìm thấy trong cơ thể của người Chất chống oxy hóa sẽ làm chuyểnABTS· + thành ABTS và do đó làm mất màu [11]

1.2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl

Hydroxyl là một chất hoạt động chứa oxy phản ứng mạnh trong hệthống sống Nó phản ứng với các acid béo không bão hòa trên màngphospholipid và do đó gây tổn thương tế bào Khả năng quét gốc tự dohydroxyl được đo bằng phương pháp của Kunchandy và Rao (1990) Hỗn hợpphản ứng gồm 100 µl 2-deoxy-Dribose (28 mM trong 20 mM đệm KH2PO4-KOH, pH 7.4), 500 µl dịch chiết 200 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeCll EDTA (1.04 mM) và 200 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeClM FeCl3

(1:1 v/v), 100 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeCll H2O2 (1.0 mM) và 100 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeClL ascorbic acid (1.0 mM), sau đó ủtrong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Thêm vào hỗn hợp 1 ml acid thiobarbituric và 1

ml acid trichloroacetic (2,8%) sau đó ủ ở 100ºC trong 20 phút Đo độ hấp thụquang của hỗn hợp cuối ở 532 nm [11]

1.3 Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan

1.3.1 Acetylcholin

Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh có ở tất cả các hạchthần kinh tự chủ và các cơ quan nội tạng được kiểm soát bởi hệ thần kinh tựchủ, ở các khớp nối thần kinh cơ và có ở nhiều các synap ở hệ thần kinh trungương ACh là chất dẫn truyền thần kinh ở sợi tiền hạch của các tế bào thầnkinh giao cảm và phó giao cảm, đồng thời chất dẫn truyền thần kinh ở

tuyến thượng thận và ở các cơ quan được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ.Tại hệ thần kinh trung ương, ACh được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào thầnkinh liên lạc.

ACh đươc ̣ tổng hơp ̣ từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym Cholin acetyltransferase, rồi bi đọ́ng gói vào các túi màng bi ṛàng buôc ̣ Sau sư ̣xuất hiêṇ của môṭtín hiêụ thần kinh ởđầu tận cùng của môṭsơị truc,̣ các túi màng hơp ̣ nhất với màng tếbào se ̃giải phóng ra ACh vào khe synap Đối với các tín hiêụ thần kinh đểđươc ̣ dâñ truyền đi tiếp tuc ̣ thìACh phải khuyếch tán sang môṭtếbào thần kinh hoăc ̣ tếbào cơ bắp ởgần ngay đó, nơi nóse ̃ràng buôc ̣ vàkích hoaṭmôṭprotein thu ̣thể Sau khi ACh được giải phóng, nó sẽ gắn vào các thụ thể của ACh (thụ thể Nicotinic vàMuscarinic) [15]

Trong hê ̣thống thần kinh trung ương, ACh đóng vai trò quan trong ̣ trong viêc ̣ dâñ truyền các xung đông ̣ thần kinh, đảm bảo cho các hoaṭđông ̣ caocấp của vỏnaõ như các quátrình nhâ ṇ thức, quátrình trínhớ, chúý… Khi mức nồng độ ACh giảm xuống thấp, không đủ để gây khử cực, tín hiệu thần kinh

sẽ không được truyền đi Vìvâỵ ACh cóliên quan chăṭche ̃với bênḥ

Alzheimer

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase

Enzym Acetylcholinesterase (AChE) hay acetylhydrolase, làcholinesterase chính trong cơ thể Nó là enzym xúc tác cho sự phân hủy củaacetylcholin và của một vài ester cholin khác có chức năng là các chất dẫntruyền thần kinh AChE được tìm thấy chủ yếu ở các khớp nối thần kinh cơ vàcác khớp nối thần kinh của hệ cholinergic [15]

Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, mặc dù sự kết hợpban đầu của enzym AChE diễn ra ở rìa ngoài, ở vùng ngoại biên Ở vị trí trêncùng của hẻm, nơi mà quá trình thủy phân xảy ra, có 4 vị trí hoạt động chínhcủa enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl Các

vị trí hoạt động được minh họa như trên hình 1.3 [24]

Hình 1.3 Các vị trí gắn của enzym AChE [24]

1.3.3 Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến BệnhAlzheimer liên quan đến việc mất các tế bào thần kinh cholinergic ở não và sựgiảm nồng độ của ACh [1] Bệnh này thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi[3], tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy rasớm hơn rất nhiều Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trêntoàn thế giới Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1 trên 85 vàonăm 2050 [3]

Các nhà khoa học đã đưa ra một số nguyên nhân để giải thích cơ chếbệnh Alzheimer Giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạtthần kinh bằng ACh (cholinergic) Trong đó, bệnh Alzheimer được cho là dogiảm tổng hợp ACh Các chất ức chế Cholinesterase sẽ làm tăng chức năngcủa hệ cholinergic bởi nó ức chế enzym phân hủy ACh, do đó làm tăng nồng

độ của ACh, kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não

Trong thực hành lâm sàng, các chất ức chế ChE vẫn là được sử dụngchính để điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer [20] Các thuốc đượcdùng cho bệnh Alzheimer ức chế AChE, giúp duy trì được nồng độ ACh bằngcách giảm tốc độ phân hủy ACh.

Các loại thuốc hiện đang được các cơ quan quản lý: Cục Quản lý Thựcphẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu(EMA) chấp thuận để điều trị các biểu hiện về nhận thức của bệnh Alzheimer

và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân gồm: donepezil, rivastigmine

và galantamine là thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là một chấtđối kháng thụ thể NMDA Tacrine là chất ức chế AChE đầu tiên được chấpthuận cho điều trị AD năm 1993, nhưng việc sử dụng nó đã bị bỏ vì có nhiềutác dụng phụ bao gồm gan nhiễm độc gan [15]

1.3.4 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.3.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây

dựng và ứng dụng sớm nhất Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụngkhá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng Trong đó, phương pháp đoquang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương phápnày sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’-dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB)

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzymcholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm

1961 [19] Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúctác của cholinesterase tạo thiocholin Thiocholin phản ứng với thuốc thử

DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng Hợp chấtnày được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412

nm Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế enzym AChE in

vitro khác tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được

công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau

đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sửdụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp củachúng vào hỗn hợp phản ứng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phươngpháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khibản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơchất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym.Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nềnvàng [10]

Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là có thểgặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trênbản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục hạn chế này,bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác(bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bảnthử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợpdung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mớiphun dung dịch AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB đượcphun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChEđược phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vếtmàu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả[9]

1.3.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử

dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn

chế Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công

bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K vào năm 1962 Nguyên tắc củaphương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giảiphóng chất α-naphthol Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối FastBlue B tạo thành sản phẩm màu diazo Hợp chất này được xác định bằng cách

đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm Tuy nhiên, sau đó không cónhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng

ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di

Giovanni S [17] Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giảnày có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về:nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độdung dịch cơ chất

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phươngpháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym

AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002 Ở phương pháp này,

sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng.Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốcthử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng Những chất gây ức chế AChE

sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [17]

Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thửEllman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối FastBlue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả Để loại trừ các vếtdương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử đượctriển khai Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phunlên bản mỏng mà không có dung dịch enzym Nếu xuất hiện vết màu trắng thìvết đó là vết dương tính giả

Ngoài việc sử dụng 2 phương pháp trên, để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z M và cộng sự

đã sử dụng phương pháp điện di mao quản Tuy nhiên, mới chỉ có rất ítnghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố Lý do là phương phápnày đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đốiphức tạp Ngoài ra, những hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗilần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện dimao quản trong nghiên cứu sàng lọc