Xây dựng quy trình phân tích đa hình gen cyp2c93 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIKHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGA XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở NGƯỜI BỆNH SAU THAY VA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ NGA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN

CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ

THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở

NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH Y ĐA KHOA

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ NGA

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN

CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ

THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở

NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn: ThS Phạm Thị Hồng Nhung

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Bác sĩ đa khoa của tôi không chỉ là kếtquả cho sự cố gắng của bản thân mà còn do nhận được sự giúp đỡ, động viên của côthầy, bạn bè và người thân Qua trang viết này tôi xin gửi lời cảm ơn tới nhữngngười đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – nghiên cứu vừa qua

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn tới ThS Phạm ThịHồng Nhung – người đã tận tình chỉ bảo, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trìnhthực hiện đề tài khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đỗ Thị LệHằng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thínghiệm Các cô không chỉ trang bị cho tôi kiến thức khoa học, các kỹ năng phòngthí nghiệm mà còn truyền cho tôi niềm cảm hứng, lòng đam mê với nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Y Dược và Bộ môn Y Dược học

cơ sở đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu vàhoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí cho đềtài mã số QG.17.29 do PGS.TS Phạm Trung Kiên chủ trì và nghiên cứu của của tôi

là một phần trong đó

Tôi xin cảm ơn tập thể nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã tạo điều kiện đểtôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất Tôi cũng xin gửi lời tri ân tới các ngườibệnh đã tham gia vào nhóm nghiên cứu của đề tài

Xin gửi lời cảm ơn tốt đẹp tới nhóm sinh viên nghiên cứu thuộc bộ môn YDược học cơ sở đã luôn hỗ trợ kịp thời và giúp đỡ tôi khi tôi gặp khó khăn trongquá trình thực hành nghiên cứu

Bên cạnh đó, xin cảm ơn Quỹ học bổng PDG Trust đã luôn tin tưởng và đồnghành cùng tôi trong thời gian làm khóa luận nghiên cứu bậc đại học

Cu ối cùng, tôi xin được bày tỏ sự yêu thương đến gia đình, bạn bè, nhữngngười đã luôn là điểm tựa để tôi yên tâm hoàn thành tốt nhất khóa luận này

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm

2019

Tác giả

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BMI Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể)

Bp Base pair (Cặp bazơ nitơ)

tỷ lệ chuẩn hóa quốc tế)

OD Optical density (Mật độ quang học)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PCR-CTPP Polymerase Chain Reaction with confronting two-pair primers

( Phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi kép)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ

dài đoạn cắt giới hạn)SNP Single nucleotit polymorphism (Đa hình đơn nucleotit)

VKORC1 Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 (Phức hợp

reductase vitamin K epoxide, tiểu đơn vị 1)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị 5Bảng 3.1 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số 20Bảng 3.2 Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen 22

Bảng 4.2 Các biến trong thuật toán tính liều acenocoumarol ở nhóm 27

nghiên cứu người Tây Ban NhaBảng 4.3 So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật 28

toán của các nhóm nghiên cứu khác nhau

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan 6

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm 20

nghiên cứu

Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21

ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dòng alen CYP2C9*3

Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối 21

ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA nhân dòng alen CYP2C9*3

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel 22

agarose 1,5 %

Hình 3.5 Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thông qua giải trình tự 23Hình 4.1 Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người Tần 24

số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim 3

1.1.1 Quá trình đông máu 3

1.1.2 Bệnh lý van tim 4

1.2.Thuốc chống đông kháng vitamin K 4

1.3.Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol 7

1.3.1 Dược động học Acenocoumarol 7

1.3.2 Dược di truyền của Acenocoumarol 8

1.4.Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 9

1.4.1 Enzym CYP2C9 9

1.4.2 Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 10

1.4.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên c ứu 14

2.1.1 Tiêu chuẩn l ựa chọn người bệnh 14

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ 14

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.2 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 14

2.2.1 Hóa chất 14

2 2.2 Thiết bị 14

2 3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm 15

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit 16

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 17

2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA 17

2.3.5 Giải trình tự DNA 18

2.3.6 Phân tích kết quả và xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20

3.1 Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA 20

3.2 Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 20

3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase 21

3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA 21

3.3 Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 23

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 24

4.1 So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau 24

4.2 Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay 25

4.3 Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lý van tim là một trong các bệnh phổ biến trên thế giới cũng như tạiViệt Nam, là nguyên nhân hàng đầu gây suy tim và đe dọa tính mạng của ngườibệnh Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do di chứng của tổn thương vantim trong bệnh thấp tim [10] Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống củangười bệnh mắc bệnh van tim đã được cải thiện đáng kể, mang lại cho họ cuộc sốnggần như bình thường Tuy nhiên, trong quá trình hoạt động các van tim nhân tạothường sinh ra các cục máu đông dễ gây tắc mạch, huyết khối Do vậy, ngay sau khithay van tim người bệnh phải sử dụng thuốc chống đông Tại Việt Nam, thuốcchống đông kháng vitamin K đã được đưa vào sử dụng hơn 25 năm nay với biệtdược chính là Sintrom (Acenoucomarol) có hiệu quả trong phòng và điều trị huyếtkhối đã được chứng minh Tuy nhiên trong quá trình sử dụng thuốc chống đôngkháng vitamin K tỷ lệ gặp biến chứng khá cao, khoảng điều trị hẹp, tác dụng củathuốc chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiều yếu tố (chế độ ăn, các thuốc khác như aspirin,kháng sinh cephalosporin…) nên việc xác định liều lượng điều trị phù hợp gặpnhiều khó khăn Nếu liều dùng thuốc sử dụng thấp thì không đạt hiệu quả điều trịnhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu thậm chí gây tử vong

Hiện nay các thầy thuốc lâm sàng điều chỉnh liều thuốc chống đông khángvitamin K chủ yếu dựa vào xét nghiệm INR (Thời gian Prothrombin đo với tỉ lệchuẩn hóa quốc tế- International Normalized Ratio) của người bệnh INR yêu cầuphải theo dõi hàng ngày để điều chỉnh liều, điều đó gây khó khăn việc này đòi hỏiphải theo dõi INR hàng ngày để điều chỉnh liều, gây nên những khó khăn về thờigian và kinh tế cho người bệnh tiến hành xét nghiệm Qua quá trình theo dõi điềutrị, có sự khác nhau về kết quả điều trị người bệnh trong cùng một nhóm tuân thủđiều trị như nhau Vậy điều gì ảnh hưởng tới kết quả INR ở những người bệnh cùng

độ tuổi, cùng giới tính, cùng phác đồ là câu hỏi vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ

Kiểu gen thu được từ dự án giải trình tự bộ gen người năm 2000 đã mở ramột kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe Y học cá nhân hóa dựa vào kiểugen đang trở thành một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng Hơn 30gen đã được tìm thấy tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chốngđông máu họ Coumarin dạng uống, trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng

đa hình di truyền CYP2C9*3 (c.1075 A > C) là một trong các yếu tố di truyền quan

trọng ảnh hưởng đến sự đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K Một số nghiên

giảm liều chống đông so với người bệnh đồng hợp kiểu dại AA [25, 42] Do đó,việc xác định được kiểu gen này đóng một vai trò quan trọng trong tiên lượng đápứng thuốc điều trị ở từng người bệnh.

Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt ditruyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh.Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phân tích đa hình di

truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông

Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim” với mục tiêu và nội dung nghiêncứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3

trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim

- Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền

CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3.

- Giải trình tự và xác định kiểu gen của các đa hình CYP2C9*3.

- Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen trên 100 người bệnh sau thay van tim ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát quá trình đông máu và bệnh lý van tim

1.1.1 Quá trình đông máu

Bình thường máu lưu thông trong lòng mạch ở trạng thái lỏng, không đôngnhờ có sự cân bằng giữa hệ thống đông cầm máu và ức chế đông máu Khi xảy ratổn thương mạch máu, hệ thống đông cầm máu được khởi động nhằm tạo cục máuđông khu trú tại chỗ tổn thương, làm ngừng chảy máu Sau khi hoàn thành chứcnăng cầm máu, cục máu đông sẽ được tiêu đi, trả lại sự lưu thông bình thường cholòng mạch Toàn bộ quá trình cần có sự tham gia của các thành phần: thành mạch,tiểu cầu, các yếu tố đông máu, các chất ức chế đông máu, hệ thống tiêu sợi huyết

Quá trình đông cầm máu gồm các giai đoạn: cầm máu nguyên phát (tạo nútcầm máu tạm thời), đông máu huyết tương (tạo nút cầm máu vĩnh viễn), tiêu cụcmáu đông [6] Cầm máu nguyên phát diễn ra ngay tức khắc, có hai yếu tố quantrọng là tiểu cầu (kết hợp thành nút chặn tiểu cầu) và thành mạch (hiện tượng comạch) Tiểu cầu kết dính vào nơi thành mạch bị tổn thương trực tiếp hay thông quayếu tố Von-Willebrand Cầm máu thứ phát (đông máu huyết tương) diễn ra chậm,vài phút tới vài giờ Sau khi ra khỏi lòng mạch 2-4 phút, máu bắt đầu đông lại Máuđông lại là do sự chuyển fibrinogen thành fibrin không hòa tan dưới xúc tác củathrombin Các fibrin trùng ngưng với nhau tạo thành mạng lưới giam giữ các tế bào

máu và huyết tương tạo thành cục máu đông Sơ đồ thể hiện ở Hình 1.1.

Các yếu tố đông máu được hoạt hóa kết hợp với Ca2+

1.1.2 Bệnh lý van tim

Bệnh lý van tim là tình trạng van tim bị bệnh lý hoặc bị tổn thương và có thểảnh hưởng đến dòng máu chảy qua tim Có hai loại bệnh van tim chính Hẹp van:nghĩa là việc mở van bị giới hạn và van không mở ra hoàn toàn Vì vậy, làm hạn chếlưu lượng máu chảy qua van Hở van: nghĩa là van không đóng đúng cách và códòng máu phụt ngược qua van bị hở Đôi khi còn được gọi là thiểu năng van, hoặc

rò van Bất kỳ van tim nào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi những vấn đề này Tuynhiên, van hai lá và van động mạch chủ thường gặp hơn [4]

Hầu hết các vấn đề về van tim có thể được điều trị bằng thuốc, can thiệp hayphẫu thuật sửa chữa, thay thế Tùy vào nguyên nhân gây hở van, mức độ nặng củabệnh mà bác sĩ đưa ra khuyến cáo phù hợp cho người bệnh Các thuốc điều trị hẹp,

hở van tim đã chứng minh có thể kiểm soát hoặc làm giảm các triệu chứng, giảmgánh nặng cho tim và làm chậm tiến triển của bệnh Các thuốc thường dùng gồmthuốc lợi tiểu: giúp giảm gánh nặng cho tim; thuốc ức chế men chuyển hạ huyết áp

và giảm gánh nặng cho tim; chẹn beta giao cảm: giảm nhịp tim, kiểm soát nhịp tim

và hạ huyết áp; các thuốc trợ tim giúp ổn định nhịp tim và giúp tăng sức bóp cơ tim;thuốc chống đông: ngăn ngừa nguy cơ hình thành cục máu đông, đặc biệt sau phẫuthuật van tim hoặc thay van bằng vật liệu tổng hợp

Phẫu thuật tim hở hay can thiệp tim qua da, sẽ được bác sỹ quyết định dựatrên mức độ tổn thương van Can thiệp qua da được áp dụng với các trường hợp van

bị lỗi hoặc khuyết tật van tim bẩm sinh Sửa chữa van tim đơn giản hơn thay vantim vì tổn thương ít hơn, chi phí điều trị thấp hơn và hạn chế được nguy cơ bị nhiễmtrùng sau phẫu thuật Thay thế van tim: khi không còn khả năng sửa chữa, tiến hànhthay van tim bằng van tim cơ học hoặc van tim sinh học

Van sinh học được làm từ mô tim động vật, mô tim của người hiến tặng hoặc

sử dụng mô của chính người bệnh Van sinh học không cần sử dụng thuốc chốngđông suốt đời Van cơ học được làm bằng vật liệu tổng hợp, thiết kế để hoạt độngđược nhiều năm tuy nhiên van cơ học đã được nghiên cứu và chứng minh tăng nguy

cơ tạo cục máu đông do đó cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời

1.2 Thuốc chống đông kháng vitamin K

Sau thay phẫu thuật thay van tim biến chứng hay gặp nhất là do sử dụng các

thuốc chống đông máu Có thể nói thay van tim là thay một “bệnh van tim” bằng một “bệnh van tim nhân tạo”, do van tim nhân tạo khi hoạt động sẽ hình thành nên

các cục máu đông có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối Do vậy, tất cả ngườibệnh sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hìnhthành các cục máu đông, tránh nguy cơ gây tắc mạch và/hoặc huyết khối.

Thuốc kháng vitamin K đường uống đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm1940), có một số nhóm thuốc kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol Cácthuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị tại Việt Nam được trình bày ởBảng 1.1

Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị

Hoạt chất Biệt dược Dạng bào chế Liều dùng

DẪN XUẤT COUMARIN

Sintrom Viên nén 4mg, Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày

vạch chia ¼ Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngàyAcenocoumarol

Mini-Viên nén 1mg Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngàysintrom Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày

Coumadine Viên nén 2mg có Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày

vạch chia Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngàyWarfarin

Coumadine Viên nén 5mg có Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày

vạch chia Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày

DẪN XUẤT INDANEDION

Fluindion Previscan Viên nén 20mg, Người lớn: Liều khởi đầu 20mg/ngày

vạch chia ¼ Trẻ em: 0,37 đến 1,4mg/kg/ngày

Thuốc chống đông kháng vitamin K có khoảng an toàn rất hẹp, nếu dùng liềuthấp thì không đạt hiệu quả kháng đông, nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảymáu đe dọa tính mạng người bệnh Do vậy, khi dùng thuốc chống đông khángvitamin K cần phải nêu rõ các thông tin sau (1) thuốc cụ thể được dùng (warfarin,

acenocoumarol, phenprocoumon), (2) khoảng INR đích đối với từng van, (3) INR

trung bình đạt được, (4) phương pháp kiểm soát kháng đông (bác sĩ hoặc điều

dưỡng kiểm soát, hoặc người bệnh tự điều chỉnh ở nhà), và (5) thời gian điều trị

Nếu người bệnh bị huyết khối van, thuyên tắc hoặc biến cố chảy máu thì phải nêu rõ

INR vào thời điểm xảy ra biến cố

Có nhiều loại thuốc chống đông, nhưng tại Việt Nam hiện nay được dùng nhiều

nhất là thuốc kháng vitamin K do giá thành hợp lý và nằm trong danh mục được bảo

hiểm y tế chi trả Cơ chế chống đông được miêu tả như Hình 1.2

Vitamin K oxide Reductase

Thuốc kháng vitamin K

Vitamin K bị khử Vitamin K bị oxy hóa

Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) hoạt hóa

Carboxylase

Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan

Chống đông kháng vitamin K tác động bằng làm giảm chức năng carboxyl

hóa của vitamin K nhằm biến đổi các tiền chất thành các yếu tố đông máu gồm: yếu

tố prothrombin (yếu tố II), proconvertin (yếu tố VII), yếu tố anti hemophilia B (yếu

tố IX), và yếu tố Stuart-Prower (yếu tố X), sau cùng thành yếu tố đông máu bất

hoạt Trong quá trình chuyển đổi, vitamin K bị oxy hóa thành expoxid vitamin K

Như vậy các kháng vitamin K có tác dụng chống đông máu gián tiếp bằng cách

ngăn cản tổng hợp các dạng hoạt động của nhiều yếu tố đông máu kể trên

Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau

thay van tim Bourguigon T và cộng sự theo dõi 505 người bệnh thay van tim cơ

học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất là tắc mạch và chảy máu

có liên quan đến hoạt động của van [14] Abhijit Trailokya và cộng sự khuyến cáo

liều acenocoumarol 4-8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 đến 4 là

an toàn và hiệu quả [9] Nghiên cứu của Alec Vahanian và cộng sự đã đưa ra đượcnhững chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuấtmức INR cho người bệnh thay van tim cơ học từ 2,5 đến 4 [10] Nghiên cứu củaNashimura và cộng sự trên 650 người bệnh thay van tim thấy 0,62 % có tắc mạch và0,95 % chảy máu, dùng thuốc chống đông kháng vitamin K liều 1 -2,5 mg/ngày cóthể hạn chế được tắc mạch [16] Isthyak Ashmed Mir nghiên cứu trên 127 ngườibệnh sử dụng acenocoumarol sau thay van tim cho thấy nếu người bệnh duy trìđược mức INR từ 2,5-3,5 sẽ giảm tối đa nguy cơ tắc mạch và chảy máu [27].Elbardissi và cộng sự nghiên cứu 861 người bệnh thay van động mạch chủ thấy rằngnếu sử dụng sớm thuốc chống đông thì hầu hết không thấy tai biến huyết khối tắcmạch sau thay van [22].

1.3 Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol

1.3.1 Dược động học Acenocoumarol

Việc hoàn thành dự án bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mớicho ngành khoa học sức khỏe Y học cá nhân hóa dựa vào bằng chứng đang nổi lênnhư một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng trong thời gian gầnđây Thuốc chống đông kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol vàphenprocoumon là thuốc thường được kê đơn nhất cho việc quản lý các vấn đề liênquan đến đông máu ở người bệnh rung nhĩ, thay van tim, vùng sâu, huyết khối tĩnhmạch, phổi thuyên tắc và với những người bệnh đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình[17, 40, 25, 18] Nếu như tại Mỹ, hơn 2 triệu người bệnh được cho warfarin đơn liều

để ngăn ngừa huyết khối tắc mạch [31], thì ở Việt Nam, acenocoumarol (Sintrom)được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin

Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trípara của vòng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R (+) và S (-), trong đó R (+)acenocoumarol có tác dụng chống đông mạnh hơn so với S (-) acenocoumarol Cơchế chống đông acenocoumarol cũng giống như nhóm thuốc chống đông kháng

Vitamin K khác đã trình bày ở Hình 1.2

Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa và đạt nồng

độ tối đa (Cmax) 0,3 (± 0,05) mcg/mL trong 2-3 giờ Acenocoumarol trong huyếttương đa phần ở dạng liên kết với protein, chỉ 1,52 % tồn tại ở trạng thái tự do Saukhi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thảicủa Acenocoumarol lần lượt là 3,9 (± 0,7) mcg mL/giờ và 10,9 (± 1,5) giờ Thời

gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian prothrombin là từ

24-30 giờ [27] Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được đàothải ra ngoài một cách nhanh chóng

Năm 1982 Tổ chức Y tế Thế giới đưa ra khái niệm INR (International

Normalized Ratio) Định nghĩa INR như sau: INR = (PT người bệnh / trung bình PT

bình thường)ISI, trong đó ISI (International Sensitivity Index) là độ nhạy của lô

thromboplastin được dùng so với thromboplastin chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới

có ISI = 1 (ISI của mỗi lô thromboplastin do nhà sản xuất cung cấp) Hiện nay INRđược xem là xét nghiệm chuẩn để đánh giá mức độ chống đông bằng thuốc khángvitamin K Vì không thể có được một giá trị INR cố định trong suốt quá trình điềutrị dài hạn, các hướng dẫn điều trị đưa ra một khoảng INR cần đạt đối với từng bệnh

lý (ví dụ đối với người có van 2 lá cơ học khoảng INR cần đạt là 2,5-3,5) Liềuthuốc kháng vitamin K được điều chỉnh để đạt INR trong khoảng này Duy trì INRtrong một khoảng là một công việc khó khăn INR có thể dao động (dù liều thuốckháng vitamin K không thay đổi) do những thay đổi của lượng vitamin K trongkhẩu phần ăn (các loại thức ăn chứa nhiều vitamin K gồm bắp cải, bông cải, cảixoăn, rau diếp, gan bò, gan lợn), do thay đổi của chức năng gan, do tương tác thuốchoặc do người bệnh không tuân thủ điều trị Trên thực tế, để duy trì INR ổn địnhtrong một khoảng đích cần thực hiện xét nghiệm này một cách định kỳ, ít nhất 1lần/tháng và mỗi khi có phối hợp thêm một thuốc có tương tác với thuốc khángvitamin K

1.3.2 Dược di truyền của Acenocoumarol

Nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây, di truyền học là một trong các yếu tốquan trọng đóng vai trò tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng INRmong muốn [12, 44] Hơn 30 gen đã được tìm thấy có tham gia vào các hoạt động

và sự trao đổi chất của thuốc chống đông đường uống, trong đó CYP2C9 (một trong những gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và VKORC1 (gen mã hóa cho tiểu phần 1 của enzym khử vitamin K 2,3 epoxide thành dạng hoạt

động) là hai gen quan trọng nhất ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc chống đôngAcenocoumarol [36, 28, 43]

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều

phụ thuộc vào đa hình đơn nucleotit (SNP) trên gen VKORC1 và khoảng 12% phụ thuộc vào SNP trên gen CYP2C9 [19, 38] Một nghiên cứu của hiệp hội genome mở rộng cũng chỉ ra rằng VKORC1, CYP2C9 và CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ

yếu chịu trách nhiệm cho sự biến thiên liều của chống đông đường uống ở người

bệnh da trắng và trong đó các SNPs của gen VKORC1 và gen CYP2C9 có vai trò

quan trọng nhất [38]

Xét về phương sai liều, VKORC1 được chứng minh có ảnh hưởng lớn hơn

CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [28, 17] Tuy nhiên, liều lượng thuốc

điều trị cho một cá thể được xác định bằng sự tương tác của các yếu tố di truyền vàmôi trường Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực để pháttriển các thuật toán hướng dẫn liều điều trị dựa trên các yếu tố di truyền cũng nhưlâm sàng [13] Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trò quan trọng trong việchướng dẫn liều điều trị cho các thuốc thuộc họ coumarin

Đa số các công bố hiện nay nghiên cứu nhiều về dược di truyền của warfarin,trong khi đó những hiểu biết về dược di truyền với thuốc acenocoumarol còn rất hạnchế Năm 2016, Kalpana S.R và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di truyền

gen của VKORC1, CYP2C9 với liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh [28].

Tác giả Van Schie và cộng sự công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sửdụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể so với thuậttoán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [43] Đây là một nghiên cứu trong chuỗinghiên cứu về gen mã hóa cho enzym ảnh hưởng đến xác định liều thuốc chốngđông

1.4 Tổng quan về đa hình CYP2C9*3

1.4.1 Enzym CYP2C9

Cytochrom P450 ( CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóaphần lớn các thuốc được sử dụng trên lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưngtập tiểu cầu (clopidogrel), chống động kinh (phenytoin)… trong đó CYP2C9 làenzym đóng vai trò quan trọng trong oxy hóa các hợp chất nội và ngoại sinh, đồngthời là enzym tham gia chuyển hóa thuốc acenocoumarol

Hàng trăm loại thuốc điều trị được chuyển hóa bởi CYP2C9 tại gan, bao gồm

cả các loại thuốc có chỉ định điều trị hẹp như acenocoumarol, warfarin và phenytoin

và các loại thuốc khác như tolbutamide, losartan, glipizide, cũng như một số loạithuốc chống viêm không steroid Ngoài ra CYP2C9 tham gia chuyển hóa các hợpchất nội sinh quan trọng như 5 -hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động,các axit béo không bão hòa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học

Gen CYP2C9 là một trong nhiều gen CYP2C nằm trong một khu vực có kích

thước khoảng 500 kb ở vị trí số 23 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 10 (10q23.33)

CYP2C9 có tính đa hình cao Hơn 50 nucleotit polymorphisms (SNPs) đã được tìm

thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [21] Một số SNP đã được chứng minh là

có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng kiểu dại

1.4.2 Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3

Đa hình đơn nucleotit (Single nucleotit polymorphism – SNP) là những vị trínằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loạinucleotit khác nhau (A, T, G hoặc C) Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số

ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1 % Mặc dù về lý thuyết, có thểxuất hiện 1 trong 4 loại nucleotit, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loạialen [45] Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệgen, chuyển một nucleotit này sang một nucleotit khác Nếu đột biến được xảy ratrong tế bào sinh sản của cơ thể, thì sẽ có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này,

và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể Nhiều SNP có thể giúp dựđoán đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với cácyếu tố môi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo dõi các bệnh lý ditruyền theo gia đình [43]

Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 (c.1075 A > C) hay rs1057910 là đột

biến đồng hoán A thay thế bằng C Đột biến này làm khung đọc mARN bị ngắn hơn

bình thường và tạo ra dạng enzym không có hoạt tính Alen CYP2C9*3 là dạng alen đột biến CYP2C9 phổ biến nhất Tại vị trí đa hình này tạo ra 3 trường hợp kiểu gen:

đồng hợp tử kiểu dại AA, dị hợp tử AC và đồng hợp tử kiểu đột biến CC

1.4.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu

Tách DNA tổng số

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số Nguyên lý củakit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trongđiều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNAliên kết với màng silica-gel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer;

và thu DNA

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

Nguyên lý của kỹ thuật PCR là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên haiphân tử DNA mới từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu sau mỗi chu kỳ Thành phầnchính của phản ứng gồm có DNA khuôn, cặp mồi, dung dịch đệm, 4 loạideoxyrinucleotit triphosphate (dA, dT, dG, dC), DNA polymerase Chu trình nhiệt

gồm 3 giai đoạn chính Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95 °C) để tách hai mạch của chuỗi DNA xoắn kép Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tới

nhiệt độ gắn mồi, tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn Nhiệt

độ này phụ thuộc vào thành phần và số lượng nucleotit của cặp mồi Giai đoạn kéo

dài: Tại 72 oC, DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotit mới

dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxynucleo tit triphosphate [21, 43] Sau nchu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp được 2n phân tử DNA mới

Đánh giá chất lượng DNA bằng đo hấp thụ quang và điện di

Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp đohấp thụ quang Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánhsáng của một chất ở một bước sóng xác định Để tính nồng độ DNA cần xác địnhgiá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260 nm (OD260) Trong đó, 1 đơn vị OD260tương ứng dung dịch có nồng độ 50 ng/ml DNA sợi đôi [1] Trong khi đó, proteinhấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (OD280) do có cấu trúc vòng thơmcủa axit amin tryptophan Độ tinh sạch của dịch chiết DNA được xác định thôngqua tỉ số OD260 /OD280 hay còn kí hiệu là OD260/280 Nếu tỉ số này trong khoảng 1,8 -2,2, dung dịch DNA được coi là có độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm Nếu OD260/280 >2,2 thì dung dịch DNA đã bị biến tính hoặc phân hủy Nếu OD260/280 < 1,8 thì dungdịch DNA có lẫn nhiều tạp chất [3]

Chất lượng DNA còn có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di Nguyên lýcủa điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo của điện trường tác độngvào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của giá thể Dung dịch đệm là môi trườngdẫn điện và tạo điện trường Dưới tác động của điện trường, các phân tử khác nhau

về kích thước, điện tích, mức độ xoắn và hình dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng)

sẽ di chuyển qua giá thể (gel agarose hay gel polyacrylamide) với tốc độ khác nhau.Sau khi điện di kết thúc, các phân tử có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộmphát huỳnh quang (như ethidium bromide) Độ sáng, số lượng băng, hình dạng băng(thẳng gọn hay không) là các yếu tố giúp đánh giá chất lượng DNA Cuối cùng,

kích thước băng điện di của mẫu có thể ước lượng thông qua so sánh vị trí của băngDNA với các băng đã biết kích thước trên thang chuẩn DNA [1].

Xác định kiểu gen của từng SNP bằng phương pháp giải trình tự

Giải trình tự của gen là phương pháp giúp phát hiện trình tự sắp xếp của bốnloại nucleotit trên phân tử DNA Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình

tự DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger: bổ sung các dideoxynucleotit(ddNTP) lần lượt tương ứng với mỗi loại nucleotit A – T – G – C, tức là cácnucleotit đã mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 của phân tử đường pentose KhiddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp mạch đơn sẽ

dừng lại tại đó và tạo ra các đoạn DNA khác nhau (mô tả trong Hình 1.3) [1].

Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động

Trong phương pháp Sanger, phản ứng được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt,trong mỗi ống gồm một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loạidNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp Ngoài ra,mỗi loại ddNTP sẽ được thêm vào lần lượt mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loạitương ứng Khi tổng hợp mạch mới, dNTP sẽ tham gia, cùng với đó là ddNTP mỗiloại, nhưng với nồng độ thấp, làm kết thúc quá trình sao chép Do đó hình thành hỗnhợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’

nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’ Sản phẩm này sẽ đượcphân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự băng xuất hiện.

Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phươngpháp Sanger có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ màđược đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loạ i Máy baogồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lýtín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ đi qua một chùm tia sáng laser Hệthống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotit A, T, C, G

Ưu điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn cácbước, tốc độ đọc và mức độ chính xác rất cao Tuy nhiên hạn chế là không đọc đượccác trình tự quá ngắn, sai số tăng lên khi đoạn DNA dài hơn 1000 bp, hoặc các đoạnDNA mang nhiều trình tự lặp có xu hướng bị nén lại khi chạy qua cột chứa gel nên

có các pic ở các vùng lặp đó lồng vào nhau, khó xác định trình tự chính xác [21,43]

Hiện nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về dược di truyền liên quantới các gen chuyển hóa acenocoumarol Từ những dữ liệu ở trên, trong khuôn khổ

đề tài này, tôi chọn CYP2C9*3 (1075 A > C) là đối tượng nghiên cứu chính đồng

thời chọn phương pháp giải trình tự bằng máy tự động để xác định đa hình di truyền

CYP2C9*3 trên người bệnh thay van tim sử dụng acenocoumarol.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh

100 Người bệnh mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim cơ học tại Bệnhviện Tim Hà Nội tham gia cung cấp mẫu Tiêu chuẩn chọn người bệnh theo Khuyến cáocủa Hội Tim mạch học Việt Nam [2]

2.1.2 Các tiêu chuẩn loại trừ

Đang chảy máu ngoài hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;Tai biến mạch não dưới 3 tháng; Mới phẫu thuật dưới 1 tuần; Chống chỉ định dùngthuốc chống ngưng tập tiểu cầu; Nguy cơ cao chả y máu; Suy thận, suy gan giaiđoạn cuối; Không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018

Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại họcQuốc gia Hà Nội

2.2 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose(hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nướckhử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồiđược đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại(hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng ThermoScientific)

2.2.2 Thiết bị

Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica(Châu Âu); Tủ lạnh sâu Panasonic (Nhật Bản); Máy quang phổ NP 80Nanophotometer (Implen, Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gelCole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1.

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Về lượng mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên

dụng chứa sẵn EDTA chống đông (tối thiểu 300 µL máu/ống) Mỗi ống máu đủ cho

1 lần tách DNA tổng số, luôn đảm bảo còn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNAtổng số đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh

Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -20 đến -300C cho đến khi được sửdụng Nếu không có tủ lạnh -200C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụnghoặc trong đá không quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặcchuyển đến nơi có tủ -200C để bảo quản

Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin: mã người bệnh, tên,

tuổi, ngày lấy mẫu Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ

với các thông tin: tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit

Các bước thao tác được tiến hành như sau:

Bước 1 Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phòng

Bước 2 Lắc đều ống máu Chuyển 250µL mẫu vào ống ly tâm vô trùng

Bước 3 Thêm 25 µL OB Protease Solutionvà 250 µL BL Buffer, vortex 10 giây

Bước 4 Ủ 65 oC trong 10 phút Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây

Bước 5 Thêm 260 µL Ethanol 100% Vortex trong 20 giây

Bước 6 Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu không dính trên

thành và nắp ống

Bước 7 Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 mL

Bước 8 Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µL)

Bước 9 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 10 Bỏ dịch lọc và Collection Tube

Bước 11 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới

Bước 12 Thêm 500 µL HBC Buffer

Bước 13 Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 14 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

Bước 15 Thêm 700 µL DNA Wash Buffer

Bước 16 Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 vòng/phút

Bước 17 Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

Bước 18 Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash BufferBước 19 Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/p trong 2 phút để làm

khô cột

Bước 20 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới

Bước 21 Thêm 100 µL Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 oC) Ủ ở 65 oC trong 5

phút

Bước 22 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 23 Thêm 50 µL Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 24 Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 25 Thu và bảo quản DNA ở -20 oC

2.3.3 Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3

Để có quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định, tôi tiến hành xác định nhiệt

độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sửdụng Phusion polymerase (Thermo Scientific) Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổnghợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xuôi 5’ GCATCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC AGTTCT TTC C 3’ Dựa trên trình tự DNA tham chiếu trên Trung tâm Thông tin Côngnghệ Sinh học Quốc gia- Mỹ (National Center for Biotechnology Information

- NCBI), đoạn DNA nhân dòng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp

2.3.4 Kiểm tra chất lượng DNA

DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá chất lượng thông qua haiphương pháp được mô tả bên dưới

Đánh giá chất lượng DNA thông qua phương pháp đo quang

Bước 1 Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA

Bước 2 Đo mẫu trắng: lấy 2 µL Elution buffer dùng để pha loãng DNA làm dung

dịch đo mẫu trắng

Bước 3 Đo mẫu DNA: lấy 2 µL mỗi mẫu DNA để đo, máy sẽ tự động tính toán

nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa vào giá trị OD260 và OD280 thu được

Đánh giá chất lượng DNA thông qua điện di trên gel agarose

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm

TAE 1X Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn, sau đó đểnguội đến 50 – 60 oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạocác giếng tra mẫu Sau khoảng 30 phút, gel đã đông lại, gỡ lược ra và đặtbản gel vào bể điện di, phần giếng nằm gần phía cực âm của máy Đổđệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1 – 2 mm

Bước 2: Tra mẫu DNA: 5 µL mẫu DNA được trộn với 1 µL 6X DNA loading dye

DNA được tra vào mỗi giếng: Lamda/HindIII DNa Ladder với DNA tổng số và DNA marker 100bp-4kb (Lonza) với sản phẩm PCR.

Bước 3: Chạy điện di với hiệu điện thế 100 V trong 40 phút

Bước 4: Quan sát kết quả: Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra khỏi khuôn, soi

dưới ánh sáng tử ngoại trong hệ thống phân tích kết quả Gel -DocIt Cácmẫu có chất lượng tốt là các mẫu cho băng điện di sáng, rõ

2.3.5 Giải trình tự DNA

Do trình tự điểm đột biến của CYP2C9*3 không có trình tự nhận biết cho

enzym cắt giới hạn Vì vậy tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen để xác định

kiểu gen CYP2C9*3 25 µL sản phẩm PCR được tinh sạch bằng E.Z.N.A.®

Cycle-Pure Kit (Omega-biotek) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm sau khi tinhsạch được gửi đi hãng First Base (Malaysia) để giải trình tự Sanger Kết quả giảitrình tự gen được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9, qua đó xác địnhkiểu gen của từng người bệnh

Kết quả giải trình tự gen tốt cần đảm bảo những yêu cầu: bốn loại nucleotitđược phân biệt bởi các màu khác nhau (ví dụ: màu đen là Guanine (G), màu xanhnước biển là Cytosine (C), màu xanh lá cây là Adenine (A) và màu đỏ là Thymine(T) Tín hiệu huỳnh quang của các nucleotit là các đỉnh màu đơn, rõ ràng, không cótín hiệu nhiễu (hoặc có tín hiệu nhiễu nhưng nền nhiễu thấp)

2.3.6 Phân tích kết quả và xử lý số liệu

Dựa trên kiểu gen của từng người bệnh được xác định thông qua giải trình tự,

đa hình của CYP2C9*3 được phân tích và xác định tính dựa trên hai thông số: tần số

kiểu gen và tần số alen Trong nghiên cứu này, locut có 2 alen A và C có tần sốtương ứng là pA và qC x, y, z là tần số từng kiểu gen Ta có:

xAA + yAC + zCC = 1Vậy tần số alen A, C được tính như sau:

p A = x + 2 ; q C = z + 2Quần thể được coi là đạt trạng thái cân bằng theo định luật Hardy-Weinbergkhi thỏa mãn:

p2AA + 2pqAC + q2CC = 1

Để kiểm tra quần thể trong nghiên cứu có đạt trạng thái cân bằng Weinberg hay không, tôi sử dụng phép thử χ2 Tần số kiểu gen thu được từ thựcnghiệm được coi là không có sự ý nghĩa khác biệt có ý nghĩa thống kê với tần sốkiểu gen lý thuyết (đạt cân bằng Hardy-Weinberg) nếu giá trị p > 0,05.

Hardy-2.4 Đạo đức nghiên cứu

Người bệnh trước khi tham gia nghiên cứu được thông báo đầy đủ về mụcđích và mục tiêu nghiên cứu, cũng như lợi ích của nghiên cứu và những ảnh hưởngbất lợi của nghiên cứu tới người bệnh Các thông tin của người bệnh được đảm bảo

bí mật tuyệt đối và chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu