Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm cổ cò ganoderma flexipes pat , họ ganodermataceae thu hái tại tây nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIKHOA Y DƯỢC ĐẶNG THỊ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN

DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ

- GANODERMA FLEXIPES PAT.,

HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI

TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

ĐẶNG THỊ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN

CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ

GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn: 1 TS Nguyễn Thị Duyên

2. TS Nguyễn Hữu Tùng

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen

từ phân đoạn diclomethan của Nấm cổ cò - Ganoderma flexipes Pat., họ

Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” là kết quả cho qúa trình học tập,rèn luyện của em tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trìnhnghiên cứu, thực tập tại Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu Trong thời gianthực hiện khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình củaquý thầy cô, gia đình và bạn bè

Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

TS Nguyễn Thị Duyên - Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu, TS.Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp chỉbảo, hướng dẫn em hoàn thành đề tài khóa luận này

Lãnh đạo, thầy cô công tác tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia HàNội đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu tạiKhoa trong suốt 5 năm học qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt là cáccán bộ, nhân viên tại khoa Hóa Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình thựchiện đề tài

Gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, tạođiều kiện cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua

Dù đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ từ nhiều nguồn nhưng vìkiến thức cũng như thời gian còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránhkhỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiếnđóng góp của quý thầy cô, bạn bè để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019

Sinh viênĐặng Thị Quỳnh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG

BảngBảng 1.1.Bảng 1.2.Bảng 1.3

Bảng 1.4.Bảng 1.5.Bảng 3

DANH MỤC CÁC HÌNH

HìnhHình 1.1.Hình 1.2.Hình 1.3.Hình 1.4

Hình 2.Hình 3.1.Hình 3.2.Hình 3.3.Hình 3.4.Hình 3.5.Hình 3.6

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chi Ganoderma 3

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Ganoderma 3

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.2.1.Triterpen/ Triterpenoid 4

1.1.2.2.Sterol 9

1.1.2.3.Polysaccharit 9

1.1.3 Tác dụng sinh học 10

1.1.3.1.Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư 10

1.1.3.2.Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan 12

1.1.3.3.Tác dụng kháng virut 13

1.1.3.4.Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm 13

1.1.3.5.Tác dụng trên hệ thần kinh 14

1.1.3.6.Tác dụng khác 15

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò. 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu. 19

2.2 Hóa chất, thiết bị. 19

2.2.1 Hóa chất, dung môi 19

2.2.2 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh

khiết. 20

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 20

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn diclomethan. 24

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò. 24

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cò. 26

3.1.3 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết 27

3.2 Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06 28

3.2.1 Hợp chất NCC03 28

3.2.2 Hợp chất NCC06 30

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Về chiết xuất 32

3.3.2 Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất. 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

1 Kết luận 35

2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự tiến bộ của khoa học – kỹ thuật, xu hướng quay về vớithiên nhiên, tìm về những phương thuốc truyền thống dân gian ngày càngđược quan tâm, phát triển Dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quantrọng trong phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ Trong đó, việc tìm ra loạidược liệu có nguồn gốc thiên nhiên để chữa các bệnh hiểm nghèo trên cơ sởkhoa học có ý nghĩa vô cùng to lớn [10]

Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền Với thànhphần hóa học có chứa polysaccharit (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid,saponin…, nấm Linh chi được ghi nhận có tác dụng phòng chống ung thư, tăngcường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesteroltrong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa vàđiều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giớinhư Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9]

Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhàxuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 loài nấm Linh chi,chiếm khoảng 1/3 số loài trên thế giới với không ít loài mới, đặc hữu [7] Riêng

ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Nguyên, chi Ganoderma có ít nhất là 25 loài, trong đó 10 loài có tác dụng dược liệu như Ganoderma tornatum,

Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum,

Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các loài còn

lại chưa biết rõ ý nghĩa [6] Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở ViệtNam sẽ là một công trình có ý nghĩa và mang lại hiệu quả to lớn cho người trồngnấm Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu (cả trong và ngoài nước) về chi

Ganoderma mới chỉ dừng lại trên đối tượng Ganoderma lucidum Trong khi

cũng được công bố là một trong số 10 loài có tác dụng dược liệu tại Vườn

Quốc gia Kon Ka Kinh, nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes lại chưa được

nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng

Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của Ganoderma

flexipes, em thực hiện đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm Cổ cò -

1

Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” với 2 mục tiêu cần đạt được:

1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dicloromethan

2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Ganoderma

1.1.1 Vài nét về thực vật của chi Ganoderma.

Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219

loài trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đớichâu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5] Ở Việt Nam, theo GS.TSKH TrịnhTam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3] Riêngtrong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đãđịnh danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6] Các loài nấm thuộc chi

Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá

rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lárộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa Đa

số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6]

Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst.

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) chi Garnoderma Karst.

Chi Ganoderma Karst [3]

Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

Quả thể có cuống hoặc không cuống, mọc trên gỗ Mũ nấm bóng lángthường dạng thận hay quạt có khi tròn Thịt nấm màu nâu chất gỗ đến chất bìdai Ống nấm đa số một tầng, một số ít hai tầng Bào tử có dạng hình trứngnhụt một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp, lớp ngoài nhẵn lớp trong có gai nhẹ cómàu vàng gỉ sắt [6] Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái có thể thay đổi do, ví

dụ, sự khác biệt trong canh tác ở các vị trí địa lý khác nhau trong các điềukiện khí hậu khác nhau và sự phát triển di truyền tự nhiên (đột biến, tái tổhợp) của từng loài [13]

3

1.1.2 Thành phần hóa học

Ngoài gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10%

khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%),

carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin vàkhoáng chất Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứatất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine Tuynhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau

của chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35].

1.1.2.1 Triterpen/ Triterpenoid

Terpen là một nhóm các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, có bộ xươngcarbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren Terpen bao gồm bốn nhóm:(a) mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (tinh dầu) (C10 và C15), (b) diterpen ítbay hơi (C20), (c) triterpen và sterol (C30) và (d) ) các sắc tố caroten (C40).Hầu hết các nghiên cứu về nấm Linh chi liên quan đến các dạng triterpene vàsterol ít bay hơi hơn [13]

Triterpen là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren [13].Hàng trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol,ethanol, acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các

loại nấm Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36].

Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B

từ Ganoderma lucidum (FR.) KARST năm 1982 Kể từ đó, hơn 316 triterpen

đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm

Linh chi trong chi Ganoderma [46].

Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyểnhóa của lanosterol, thông thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định làganoderic (C30) và axit lucidenic (C27) Theo nghiên cứu của Cole R J vàSchweikert M A đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acidganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic, ) được phânlập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi Các triterpen tồntại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một sốnhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C Cấu trúc hóa họccủa nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan

4

tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước

ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2]

Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm

khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây

5

-4 Ganorbiformin G

Hình 1.2 Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1]

Bảng 1.2 Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma

4 Acid ganoderic W

1.1.2.2 Sterol

Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từdầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol,Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19]

Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi

Ganoderma.

Bảng 1.4 Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma

STT12345

1.1.2.3 Polysaccharit

Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng

và phức tạp [10] Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào

tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004) Nhưng

polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại nhưsau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, còn GL – B có thànhphần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35] Theo các báo cáo trước đây, các

polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc các

heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose, galactose,mannose và fucose [50] Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharit,

có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn nàytựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000

- 1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM) Một phần

9

polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nướcnóng [2].

1.1.3 Tác dụng sinh học

Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụngbảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể Ngày nay, khi nền khoa họchiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lýdược lâm sàng, hàng trăm những công trình nghiên cứu đã công bố, một lầnnữa khẳng định tính năng, công dụng của loài thảo dược quý này Kết quả của

các nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma

chủ yếu do triterpen và polysaccharit đem lại

1.1.3.1 Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

Tác dụng chống ung thư của các loài nấm Linh chi đã và đang đượcquan tâm, nghiên cứu và ứng dụng nhiều Nhiều cơ sở khoa học về tác dụngnày của nó đã được công bố

Axit ganoderic T (GA-T) gây ra sự giảm sự tăng sinh của một số tế bàoung thư Nó có độc tính tế bào cao hơn đối với dòng tế bào ung thư phổi 95-D

so với các dòng tế bào bình thường Khả năng tồn tại của các tế bào 95-D đã

bị ức chế 70% ở liều 50 μg/mL trong 24 giờ bởi GA-T GA-T ở nồng độ thấpcũng có thể ức chế mạnh sự hình thành các khuẩn lạc tế bào 95-D Chen vàcộng sự chứng minh rằng GA-T ức chế thành công sự xâm lấn tế bào ung thư

trong ống nghiệm và di căn trong thí nghiệm in vivo, do đó GA-T có thể hoạt

động như một loại thuốc tiềm năng để điều trị ung thư [45]

Gao và cộng sự đã nghiên cứu các tác dụng chống độc in vivo của

ganoderiol F, cho thấy hoạt động mạnh nhất trong xét nghiệm độc tế bào Nóđược dùng cho chuột mang tế bào ung thư biểu mô tế bào phổi (LLC) củaLewis với ba liều 5, 10 và 20 mg/kg/ngày Ganoderiol F ức chế đáng kể sựphát triển khối u Trong khi đó, không có tác dụng phụ hoặc độc hại rõ ràngnào được nhận thấy [15]

Su và cộng sự (2000) đã kiểm tra hoạt động gây độc tế bào của lanostan

từ G tsugae và tìm thấy hoạt động chống lại ba dòng tế bào ung thư Lanostan

và một steroid từ G tsugae đã gây chết tế bào do apoptosis và cho rằng đó là

10

sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a).Gonzalez và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào

ung thư bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna Ngược lại, ba triterpen từ G concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và

chuột có liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA(Mizushina và cộng sự, 1999) [38]

Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt độngchống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tếbào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38]

Polysacharit phân lập từ chi Ganoderma làm tăng phản ứng miễn dịch

chống khối u bằng cách thúc đẩy hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và tế bàolympho T gây độc tế bào [37] Ngoài ra, các nó cũng được công nhận để cảithiện sự biểu hiện của phức hợp tương hợp mô, chủ yếu trong dòng tế bào u áctính, giúp cải thiện quá trình trình diện kháng nguyên và do đó kích thích khángvirut và ung thư [44] Polysaccharit thường không tác động trực tiếp gây đến độc

tế bào trong các tế bào khối u, nhưng tác động đến các hoạt động chống khối uthông qua việc tăng cường miễn dịch qua trung gian của vật chủ [15]

Theo các nghiên cứu mới nhất của Wiater và cộng sự, các α- D -glucan

được phân lập từ G lucidum thể hiện hành động gây độc tế bào liên quan đến

các tế bào ung thư HeLa biểu mô ở người [42]

Một số nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng polysaccharit (β D glucan, heteropolysaccharit và glycoprotein) được phân lập từ Ganoderma có

-hoạt tính chống khối u sarcoma 180 ở chuột Sự kích thích của hệ thống miễndịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích chokhả năng chống khối u của nấm Linh chi Trong số rất nhiều polysaccharit, β- D-glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48]

Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọngtrong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnhung thư Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềmnăng ức chế IDH1 Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh rằng

hợp chất sterol từ Ganoderma sinense có thể có tiềm năng lâm sàng trong các

liệu pháp khối u như một chất ức chế hiệu quả của IDH1 đột biến [51]

11

Hexokinase 2 (HK2), một enzyme giới hạn tốc độ trong bước đầu tiên củacon đường glycolysis HK2 cung cấp một mục tiêu mới cho điều trị ung thư dovai trò then chốt của nó trong quá trình khối u và di căn khối u Việc sàng lọcphối tử ảo dựa trên cấu trúc trong một cơ sở dữ liệu nhỏ các sản phẩm tự nhiên

đã dự đoán rằng một steroid mới, (22E, 24R) -6β-methoxyergosta-7,9 (11),

22-triene-3β, 5α-diol từ Ganoderma sinense có ái lực liên kết cao với HK2 Kết quả nghiên cứu in vitro của Bao F và cộng sự đã khẳng định rằng sterol này là chất

ức chế HK2 tự nhiên đầu tiên, nó có thể được coi là một ứng cử viên thuốc tiềmnăng nhắm mục tiêu tại HK2 để điều trị ung thư [12]

Ngai và cộng sự đã phân lập được một lectin từ G capense thể hiện

hoạt động giảm thiểu mạnh đối với tế bào lách chuột và hoạt động chống tăngsinh đối với các tế bào ung thư bạch cầu và tế bào gan trong ống nghiệm [36]

1.1.3.2 Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan

Trong số các thành phần hóa đã được phân lập và xác định của chi

Ganoderma thì terpen được chứng minh là phần có hoạt tính chống oxy hóa

cao nhất [15] Sự gia tăng các enzym chống oxy hóa chủ yếu được đóng gópbởi axit ganoderic Nó có thể kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quanđến yếu tố 2 (Nrf2), từ đó khởi đầu sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa(SOD, CAT và GPx) và do đó tăng cường nồng độ enzyme chống oxy hóa(Ko và cộng sự 2008) [29]

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Chu cùng cộng sự (2012)suy ra rằng do sự hiện diện của lanostan triterpen có thể góp phần vào việc hạlipid máu Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen

có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxyhóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bìnhthường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyptúi mật [14]

Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa

và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệuquả

Ngoài ra, tác dụng chống oxi hóa của các loài nấm Linh chi còn đượcchứng minh qua hoạt tính sinh học của polysaccharit Một nghiên cứu chéo

12

ngẫu nhiên, mù đôi đã được thực hiện giữa viên nang là dịch chiết nấm L inh chiđược làm giàu polysaccharit (GL) và viên nang giả dược với 90% là tinh bộtđược thực hiện bởi Hui Fang Chiu và cộng sự Kết quả nghiên cứu thu được

ở các đối tượng được điều trị GL cho thấy sự giảm đáng kể mức độ của cácdấu hiệu stress oxy hóa khác nhau Hơn nữa, các tổn thương gan đã được bìnhthường hóa khi điều trị bằng GL Do đó, nhóm tác giả đã kết luận rằng GLđược làm giàu với polysaccharit có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxyhóa, chống lão hóa và bảo vệ gan thông qua việc làm giảm quá mức các gốc

tự do và do đó bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại [14]

Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một

glucan trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G lucidum có thể tăng

đáng kể (40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạchcầu đơn nhân chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H 2O2 gây ra, và giảm

sự hình thành các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27]

1.1.3.3 Tác dụng kháng virut

HIV là virut gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS).Phương pháp điều trị hiện tại cho HIV là hoãn sự phát triển của AIDS Một sốtriterpen của các loài nấm Linh chi (ganoderic acid beta, lucidumol B,ganodermanondiol, ganodermanontriol và ganolucidic acid A) đã được chứngminh là có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở người, với giá trị IC50 là 20-

90 microM [32] Hai terpen: axit lucidenic O và lucidenic lactone, đã ức chếmen sao chép ngược loại 1 của HIV [36] Nhiều nghiên cứu vẫn cần đượcthực hiện để tạo cơ sở cho việc khẳng định các loài nấm Linh chi là tác nhânchống HIV, tuy nhiên triterpen dường như vẫn là nhóm hợp chất chính có tácdụng chống HIV [15]

Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng polysacharit của

Ganoderma lucidum hòa tan trong nước đã ức chế đáng kể virut herpes simplex HSV-1 và HSV-2 [28].

1.1.3.4 Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm

Heleno và cộng sự báo cáo rằng chiết xuất methanol của nấm Linh chi chothấy hoạt động chống lại Staphylococcus aureus và Bacillus cereus cao hơn

13

so với kháng sinh ampicillin và streptomycin, trong khi Staphylococcusaureus và Bacillus cereus là những vi khuẩn nhạy cảm nhất Nồng độ ức chếtối thiểu nằm trong khoảng 0,0125-0,75 mg/mL và nồng độ diệt khuẩn là0,035-1,5 mg/mL [22] Như vây, polysaccharit cho thấy hoạt động khángkhuẩn, ức chế sự phát triển của vi khuẩn hoặc gây ra cái chết của vi khuẩn gâybệnh Tuy nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫnchưa được xác định rõ ràng [15].

Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ

kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15] Ganomycins A và B từ

G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương

[34]

Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15

kDa, được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45].

1.1.3.5 Tác dụng trên hệ thần kinh

Stress oxy hóa là một lý do cho sự tiến triển của nhiều bệnh thoái hóathần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh xơ cứng teo cơ và bệnhAlzheimer (AD) Một trong những cách tiếp cận để điều trị AD là kiểm soátchức năng của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não thông quaviệc ức chế acetylcholinesterase (AChE) Zhang và cộng sự đã báo cáo rằng

hỗn hợp các hợp chất triterpen trong G.lucidum thúc đẩy sự tồn tại của tế bào

thần kinh và giảm mệt mỏi Và người ta đã chứng minh rằng việc tiếp tục

uống G.lucidum có thể cắt giảm sự tiến triển của bệnh Alzheimer [49].

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Huang và cộng sự cho thấy rằngpolysaccharit của nấm Linh chi cũng đại diện cho một sản phẩm tự nhiên có tiềmnăng lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị sớm AD Phát hiện của nhóm tác giảcho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo để điều trịsuy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thoái hóa thần kinh [23]

Ngoài ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm

đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằngchiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảmhành vi lo lắng ở chuột [33]

14

1.1.3.6 Tác dụng khác

Sterol phân lập từ nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng ứcchế tổng hợp cholesterol trong ống nghiệm [28]

Nucleoside, uridine và uracil từ sợi nấm của một loài nấm Linh chi

-G.capense đã được tìm thấy có khả năng làm giảm mức độ aldolase trong huyết thanh của những con chuột bị chứng thiếu máu thực nghiệm Adenosine

cũng đã được chứng minh là ức chế kết tập tiểu cầu [23, 39]

Như vậy, từ những bằng chứng nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm sửdụng trong y học cổ truyền từ xa xưa, các loại nấm Linh chi đã được báo cáo là

có một số tác dụng dược lý bao gồm: điều hòa miễn dịch, chống xơ vữa độngmạch, chống viêm, giảm đau, giảm một số tác dụng phụ do hóa trị liệu gây ra,chống ung thư, thúc đẩy giấc ngủ, kháng khuẩn, kháng virut (HBV, HSV, cho tới HIV), bảo vệ gan, hạ lipid máu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống dị ứng,chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do triệt để, chống lão hóa, hạ đường

huyết, hoạt động estrogen và đặc tính chống loét Điển hình là Ganoderma lucidum hiện đã được công nhận là một chất bổ trợ thay thế trong điều trị

bệnh bạch cầu, ung thư biểu mô, viêm gan và tiểu đường [13]

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò.

Nấm Cổ cò có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có

nguồn gốc từ Việt Nam Bằng chứng đã được trình bày trong các nghiên cứuphát sinh gen trước đây rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012;Wang và cộng sự, 2012), được tìm thấy rộng rãi trên khắp châu Á cận nhiệt

đới và nhiệt đới Cao và cộng sự (2012) đề xuất rằng Ganoderma atrum, Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense (J.D Zhao và cộng sự, 1979)

và Ganoderma parviungulatum (J.D Zhao & X.Q Zhang, 1986) tất cả được

mô tả từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc của Giáo sư Ji-Ding Zhao và các đồng

nghiệp của ông là từ đồng nghĩa của G.flexipes [52].

Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat.

Giới : Mycota hay Fungi

Ngành : Eumycota

Ngành phu ̣ : Basidiomycotina

15

Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat.

Hình 1.4 Nấm Cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên

a. Quả thể b Bào tử c Bào tầng

Ghi chú: Thước đo tự nhiên = 2cm, thước đo hiển vi 2µm,

thước đo bào tầng = 0.5 mmQuả thể có màu nâu đỏ Mũ nấm khi non có dạng vòi, sau phát triểnthành dạng quạt hay móng nhỏ Mặt trên mũ nấm có cấu trúc vòng đồng tâm

và vân thớ phóng xạ Mép mũ tà, ít lượn sóng và không chia thùy Bề mặt mũnấm gồ ghề, có màu nâu đỏ Kích thước quả thể khoảng 1,5-10 x 1,0-7,0 cm;dày 0,5-1,0 cm

Thịt nấm chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu Hệsợi dimitric gồm sợi không vách ngăn ngang và sợi bện; kích thước từ 1,5-7,0

µm Hệ sợi trong nuôi cấy trên môi trường thạch (môi trường thuầnkhiết) lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt

Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4-7 ống, miệng ống nấm trònđều Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt

16

Bào tử hình trứng nhụt một đầu, kích thước 6,5-7,5 x 7,5-9,0(x10) µm;

màng hai lớp (màng ngoài nhẵn, màng trong có gai nhẹ) và có màu rỉ sắt

Đảm đơn bào, hình chùy ngắn kích thước 7-12 µm, màng là một lớp

mỏng, nội chất không màu trong suốt; trong mỗi đảm có 3-4 cuống mang bào

tử

Nấm có cuống dài mọc rời gốc, đính bên, nấm mọc ký sinh hay hoại

sinh trên cây gỗ mục gỗ màu trắng

Nấm phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy nhân tạo

Nấm mọc trên gốc cây sống hoặc đã chết của nhiều loài cây gỗ, đây là

loài phân bố rộng ở các tỉnh Tây Nguyên [3, 52]

Tình hình nghiên cứu về nấm Cổ cò

Khi tiến hành tra cứu trên ba trang Website: Sciencedirect,

ncbi.nlm.nih.gov và Scifinder với các từ khóa là Ganoderma, Ganoderma

lucidum và Ganoderma flexipes cho kết quả như bảng 1.5.

Bảng 1.5 Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính đến tháng 7/2018

Từ khóa

Ganoderma Ganoderma lucidum Ganoderma flexipes

Kết quả bảng cho thấy trên chi Ganoderma có nhiều công bố và chủ

yếu tập trung ở loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), các nghiên cứu về

đối tượng nấm Cổ cò còn rất hạn chế Hai công bố trên các website trên là:

Theo nghiên cứu của Da Yu Cheng (2012) [16] về đa dạng các loài nấm

lỗ polypore ở Trung Quốc có chú thích địa lý đã xác định loài nấm Cổ cò

phân bố vùng nhiệt đới trên xác thực vật hạt kín

Một nghiên cứu khác về đa dạng của các loài thuộc nấm gỗ họ nấm lỗ

polypore dựa trên phân tích hình thái và phát sinh loài của nhóm tác giả Li

Wei Zho và cộng sự (2015) [52] đã xác định các loài Ganoderma curtisii,

Ganoderma flexipes, Ganoderma lingzhi, Ganoderma multipileum,

17

Ganoderma resinaceum, Ganoderma sessile, Ganoderma sichuanense và Ganoderma tropicum thuộc cùng một nhánh phát sinh (Clade A).

Các nghiên cứu trong nước của tác giả Nguyễn Phương Đại Nguyên [6]

và Trịnh Tam Kiệt [3], hai tác giả cũng chỉ có những mô tả về thực vật vàphân bố của loài nấm Cổ cò tại Việt Nam Như vậy, theo tìm hiểu của nhómthực hiện đề tài, các nghiên cứu trong và ngoài nước về loài nấm Cổ cò cònrất hạn chế và chỉ dừng lại ở công bố về thực vật và sinh thái của loài

18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu.

Đối tượng của nghiên cứu là cơ thể đậu quả của nấm Cổ cò được thu hái

ở Tây Nguyên vào tháng 12 năm 2017 Mẫu được xác định tên khoa học là

Ganoderma flexipes Pat bởi TS.Nguyễn Phương Đại Nguyên – Bộ môn Sinh

học – Trường Đại học Tây Nguyên Mã số mẫu DL 001 Tiêu bản mẫu mã sốGF1217 được lưu giữ tại khoa hóa học, Viện Dược liệu

Hình 2 Nguyên liệu nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes Pat.

2.2 Hóa chất, thiết bị.

2.2.1 Hóa chất, dung môi

Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điểnViệt Nam IV: nước cất hai lần (H2O), dung môi ethyl acetat (EtOAc),

dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), n – hexan.

Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), bột silica gel pha

đảo YMC C18 (30-35 mm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm).

Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol để phát hiện vết chất

2.2.2 Thiết bị

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: cột sắc ký,bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm…

19

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi).

Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

Bếp điện, bếp đun cách thủy

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR.Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

Máy siêu âm Power sonic 405

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization MassSpectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap củaViện Hoá học Các hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN

FT-2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất

tinh khiết.

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

Toàn bộ nấm Cổ cò bao gồm: tán nấm và thân nấm được phơi khô, xaynhỏ (5,7 kg) chiết nóng tại 65ºC với methanol (3 lần, mỗi lần 3h) Tiến hànhlọc loại bã dược liệu, gộp dịch chiết lại và cất thu hồi dung môi dưới áp suấtgiảm thu được cao tổng Cao này được hòa lại trong nước, đem chiết lỏng –

lỏng lần lượt với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, DCM và

EtOAc, sau đó tiếp tục đem cô riêng rẽ từng phân đoạn, thu được cao phân

đoạn n-hexan, phân đoạn DCM, phân đoạn EtOAc, và phân đoạn nước.

Các hợp chất trong các phân đoạn của nấm Cổ cò được phân lập bằng

phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường

(0,040-0,063 mm, Merck), và pha đảo RP – 18

Theo dõi, kiểm tra các phân đoạn của sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng,thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18(Merck) Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366

nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

Thu gom, tinh chế các chất phân lập được bằng dung môi thích hợp.Kiểm tra độ sạch của các chất phân lập được bằng TLC, HPLC với các hệdung môi phù hợp

20

Các bước tiến hành:

+ Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để rửa giải: khảo sát cao tổng bằngsắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau, chọn hệ dung môi có khảnăng tách tốt để làm dung môi rửa giải

+ Chuẩn bị cột: chọn cột sắc ký có kích thước phù hợp, rửa sạch, sấykhô, lắp thẳng đứng trên giá cố định Lót một lớp bông xung quanh vị trí vít.Cân một lượng thích hợp chất nhồi cột vào cốc có mỏ, thêm dung môi thíchhợp vào khuấy đều cho hết bọt khí thu được hỗn dịch Mở khóa cột, từ từ róthỗn dịch đã chuẩn bị lên cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, đều và đối xứng quanh thâncột bằng quả bóp cao su Sau khi đưa hết pha tĩnh lên cột, tiếp tục cho dungmôi chảy liên tục qua cột để luyện đến khi cột hoàn toàn ổn định (có thể từ 5-

10 giờ) Chú ý không được để cột bị khô dung môi làm nứt cột

+ Nạp mẫu lên cột:

Nạp mẫu khô: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làmbay hơi dung môi đến khi thu được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thànhmột lớp đều đặn bên trên chất nhồi cột

Nạp mẫu ướt: dùng pipet hút dung dịch mẫu cần phân tích, rót từ từ,nhẹ nhàng dọc quanh thành cột

Sau khi đưa mẫu lên cột, đặt một miếng bông lên để bảo vệ mặt tiếp xúc

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải Dịch rửa giảiđược hứng vào bình nón hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp Kiểm tra cácphân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau,các phân đoạn chứa chất cần được tinh chế

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc

Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ cộng hưởng từhạt nhân một chiều và hai chiều (1H và 13C, DEPT, HSQC, HMBC, NOESY),phổ khối (MS),…; và một số đặc trưng lý hóa như điểm chảy, cảm quan,

a Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ionsinh ra từ phân tử Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối lượng củaion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng (m) và điện tích (z) của ion (m/z) Khi

đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion

21

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học củaproton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịchchuyển hóa học khác nhau Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùngmôi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh Đỉnh này có thể là đỉnhđơn, đôi, ba… tới 7 đỉnh thành phần Diện tích mỗi đỉnh tỉ lệ với số lượng protoncủa đỉnh Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon -13 (13C-NMR) cung cấp các thôngtin về môi trường hóa học của carbon Carbon lai hóa sp3 không liên kết với

dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm Carbon liên kết đơn với oxy (alcol,ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm Carbon lai hóa sp2 chuyển dịchtrong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết (đôi) với oxy có thể dịch chuyểntới 240 ppm Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là nhữngvạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon (hơn 1 carbon nếu cũng có chung môitrường hóa học) của phân tử

Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượngproton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử Kỹthuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement byPolarization Transfer)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và Hgắn trực tiếp trên nó, giữa các proton của carbon kế cận nhau (phổ COSY)hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) giữa proton và các carbon kế cận(thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn (long-rangeHETCOR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhautrong không gian (NOESY, ROESY)

22

Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữacác proton và carbon trong phân tử Kết hợp với phổ khối và các thông tinkhác ta có thể xây dựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [8].

23