Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam.

Trang 1

Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 2: 94-104 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104

www.vnua.edu.vn

ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH GAN THẬN MỦ

TRÊN CÁ NHEO MỸ ( Ictalurus punctatus )

Trương Đình Hoài 1* , Kim Văn Vạn 1 , Đào Lê Anh 2 , Nguyễn Thị Huyên 2 , Nguyễn Văn Tuyến 1 ,

Vũ Đức Mạnh 1 , Nguyễn Thị Hương Giang 2 , Trương Quang Lâm 2 , Nguyễn Thị Lan 2

1 Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2

Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

* Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh

gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam

Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu thập và phân tích mẫu cá nheo Mỹ bệnh, xác định các triệu chứng, các đặc điểm bệnh lý đại thể và vi thể thông qua phương pháp quan sát lâm sàng và phương pháp mô bệnh học và ứng dụng PCR trong chẩn đoán khẳng định mầm bệnh Kết quả nghiên cứu cho thấy cá bệnh có triệu chứng bơi lờ đờ, mang nhiều nhớt, xuất huyết nắp mang, các gốc vây và hậu môn Các đặc điểm bệnh lý đại thể của cá bị bệnh gồm gan, thận có các đốm mủ màu trắng, thành ruột và biểu mô xuất huyết nặng Kết quả giám định bằng PCR

cho thấy cá bị bệnh do nhiễm E ictaruli Kết quả nghiên cứu mô bệnh học chỉ ra rằng mô mang, gan, thận và ruột bị

tổn thương nghiêm trọng nhất Mang cá tăng sinh và xuất huyết, trong khi gan và thận cá bị hoại tử, cấu trúc lỏng

lẻo, giảm số lượng tế bào và xuất huyết

Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, bệnh lý, PCR, cá nheo Mỹ

Pathological characterization and PCR application

for diagnosis Edwardsiella ictaluri infecting Channel catfish (Ictalurus punctatus)

ABSTRACT

This study was conducted to determine the pathological characteristics and to apply PCR method to diagnose

the disease caused by Edwardsiella ictaluri for Channel catfish (Ictalurus punctatus) in Northern provinces of

Vietnam The infected Channel catfish was collected and determined the clinical symptoms, gross features and microscopic lesions using through clinical observation and histopathological methods Subsequently, PCR method was applied to confirmed the pathogen The results revealed that the diseased fish exhibited the symptoms of lethargy swimming, mucus in the gills, haemorrhage of gill operculum, fins, anus The liver and kidneys contained white spots, intestinal walls and epithelial cells were severe haemorrhage The evaluation by PCR showed that all

affected fish was infected with E.ictaluri Histopathological examination revealed that the gill tissue, liver, kidney, and

intestines were the most severely damaged organs Gills exhibited the hyperplasia and hemorrhage, while liver and kidneys are necrosis and loose structure, decreasing cells and severed haemorrhage

Keywords: Ewardsiella ictaluri, pathoglogy, PCR, Channel catfish

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus,

Rafinesque, 1818) có tên tiếng anh là Channel

catfish, đây là loài cá bản địa của Châu Mỹ, phân

bố ở phía nam Canada và phía đông bắc Mỹ cũng

như phía bắc của Mexico Cá nheo Mỹ gồm 7 họ

và hơn 45 loài, chúng sống trong môi trường nước ngọt ở sông, hồ và ao Chúng chịu được ngưỡng biến đổi môi trường khá rộng, nhiệt độ thích hợp

là 24-30C nhưng có thể chịu rét tốt (Gatlin & Stickney, 1982) Ngày nay, cá nheo Mỹ đã có ở trên 35 quốc gia trên thế giới di nhập và phát triển Loài cá này trở thành một đối tượng thủy

Trang 2

Trương Đình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến,

Vũ Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan

sản quan trọng của thế giới Cá nheo Mỹ được

nuôi nhiều nhất ở Trung Quốc với sản lượng

trung bình 255.000 tấn/năm (FAO, 2014)

Loài cá này được du nhập vào miền Bắc

Việt Nam từ năm 2010 Đây là loài cá có giá trị

dinh dưỡng cao, thịt cá thơm ngon, bổ dưỡng,

nhiều khoáng chất canxi, phốt pho, sắt, vitamin

Từ năm 2013, loài cá này được nuôi thử nghiệm

ở nhiều tỉnh miền Bắc cho kết quả tốt, cá có thể

sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện tự

nhiên ở Việt Nam (Kim Văn Vạn, 2017) Hiện

nay, nhiều cơ sở sản xuất giống cá nước ngọt đã

có thể chủ động sản xuất giống cá nheo Mỹ và

nuôi dưới nhiều hình thức như nuôi ghép, nuôi

thâm canh, nuôi lồng hay nuôi ở hệ thống nước

chảy Do vậy, sản lượng loài cá này càng ngày

càng tăng nhanh và cung cấp một lượng lớn

thực phẩm cho người tiêu dùng, mang lại thu

nhập cao cho người nuôi

Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá nheo Mỹ diễn

biến khá phức tạp, gây khó khăn và thiệt hại

lớn cho người nuôi, các bệnh thường gặp gồm

xuất huyết, lỡ loét, bệnh nội và ngoại ký sinh

(De la Cruz & cs., 2017; Hoai & cs., 2019;

Wagner & cs., 2002) Những năm gần đây bệnh

gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

gây ra trên cá nheo Mỹ nuôi ở Việt Nam đã được

ghi nhận và bệnh gây thiệt hại rất lớn cho người

nuôi Tuy nhiên đặc điểm về bệnh gan thận mủ

trên cá nheo Mỹ đặc biệt là các đặc điểm lâm

sàng, đặc điểm mô bệnh học, phương pháp chẩn

đoán bệnh gan thận mủ cho đối tượng nuôi này

vẫn chưa được nghiên cứu sâu Các nghiên cứu

trước đây về bệnh mủ gan tập trung trên cá tra

và basa ở miền Nam, bệnh do vi khuẩn

E ictaluri gây ra hao hụt có thể lên đến 90%

(Crumlish & cs., 2002; Dung & cs., 2008) Với sự

phát triển ngày càng mạnh mẽ của cá nheo Mỹ

ở các tỉnh Miền Bắc và Bắc Trung bộ, cùng với

tình trạng ô nhiễm môi trường nước, bệnh gan

thận mủ có thể diễn biến phức tạp trong thời

gian tới và có thể gây thiệt hại cho người nuôi

Do vậy, cần có các nghiên cứu liên quan đến tác

nhân, đặc điểm bệnh lý và phương pháp chẩn

đoán bệnh để góp phần giúp người nuôi sớm

nhận dạng, đề ra các biện pháp phòng trị bệnh

hiệu quả và giảm thiểu thiệt hại trong tương lai

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu cá nheo Mỹ thương phẩm bị bệnh (kích

cỡ 0,5-1,7kg) được thu từ các hộ nuôi cá ao, cá lồng khu vực phía bắc Việt Nam Môi trường

Tryptic soya broth và Tryptic soya Agar- (TSB

và TSA; Merck) Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn Gram (Merck); Kit chiết tách DNA thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), GoTaq PCR green (Promega) và các hóa chất, máy móc, thiết

bị trong phòng thí nghiệm phục vụ chạy PCR, làm tiêu bản mô học, phân tích kết quả và một

số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm và phương pháp thu mẫu

Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu thập 70 mẫu cá bị bệnh từ các hộ nuôicá nheo Mỹ ở Lý Nhân - Hà Nam (32 mẫu), Lương Tài - Bắc Ninh (22 mẫu), Ân Thi - Hưng Yên (16 mẫu) Thời gian thu thập từ tháng 3 - tháng 11 năm 2019 Mẫu được vận chuyển về và phân tích tại phòng thí nghiệm Bệnh thủy sản, Khoa Thủy sản - Học viện Nông nghiệp Việt Nam bằng phương pháp vận chuyển kín

2.2.2 Quan sát lâm sàng

Cá được phân tích ngay sau khi chuyển tới phòng thí nghiệm Các triệu chứng lâm sàng được quan sát và ghi chép cẩn thận Sau đó, tiến hành giải phẫu cá bằng dao kéo tiệt trùng để thu thập bệnh tích đại thể, nuôi cấy và phân lập

vi khuẩn theo mô tả của Hoai & cs (2019), thu mẫu mô để làm tiêu bản mô bệnh học theo mô

tả của Hoai & cs (2014)

2.2.3 Phân lập vi khuẩn gây bệnh

Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn từ tiền thận cá bị bệnh, nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường TSA và TSA bổ sung 5% máu cừu Vi khuẩn được nuôi cấy ở nhiệt độ 28C Các mẫu bệnh có nhiễm khuẩn được quan sát hình dạng, màu sắc, kích thước khuẩn lạc Trong trường hợp có sự hiện diện của nhiều hơn 1 loại khuẩn lạc, xác định loại khuẩn lạc chiếm ưu thế và loại thiểu số để sơ bộ xác định loại khuẩn lạc nào là

Trang 3

Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

tác nhân chính, nhuộm Gram theo hướng dẫn

của nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck) để

xác định đặc tính Các chủng vi khuẩn phân lập

được sử dụng để thử đặc tính sinh hóa bằng kit

API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất

(BioMerieux, Pháp) và bảo quản trong môi

trường TSB bổ sung 20% glycerol (v/v) và giữ ở

tủ âm sâu (-80C)

2.2.4 Giám định vi khuẩn gây bệnh bằng

phương pháp PCR

DNA từ vi khuẩn (n = 70) được tách chiết

theo phương pháp sử dụng kit chiết tách DNA

thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)

Quy trình chiết tách DNA được thực hiện theo

hướng dẫn của nhà sản xuất Phản ứng PCR

dùng để giám định các chủng phân lập sử dụng

cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene 16S

rRNA của vi khuẩn Edwardsiella ictaluries

EiFd-1 (Forward) 5’- GTAGCAGGGAGAAAGCT

TGC - 3’ và EiRs-1 (Reverse) 5’- GAACGCTATT

AACGCTCACACC - 3’ (Panangala & cs., 2007)

Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5

nuclease-free water; 12,5µL 2X Go Taq green

master mix (Promega); 1µL Mồi ngược (10

pmole 1-F); 1µL mồi xuôi (10 pmole

EiFd-1-R) và 5µL khuôn mẫu DNA Đối chứng dương

sử dụng trong phản ứng PCR là chủng

Edwardsiella ictaluri LMG 7860, đây là chủng

đối chứng dương chuẩn quốc tế phân lập từ cá

nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được cung cấp từ

Viện Nuôi trồng thủy sản II

Chu trình nhiệt được thực hiện gồm 3 bước bao gồm: Tiền biến tính ở nhiệt độ 94°C trong 2 phút; Chu kỳ lặp lại 30 lần: Biến tính ở nhiệt độ 95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 45 giây, tổng hợp kéo dài ở 72°C trong 30 giây; Hoàn thành ở 72°C trong 7 phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1,2% (TBE 1X) với thang DNA chuẩn 100bp (marker) Sử dụng nguồn điện di ở hiệu điện thế 100V, cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút Sản phẩm PCR nếu dương tính sẽ cho vạch sáng 407bp

2.2.5 Thu mẫu mô, làm tiêu bản và phân tích biến đổi mô bệnh học

Các cơ quan và bộ phận của 14 cá bị bệnh gan thận mủ được chọn ngẫu nhiên từ số bị bệnh gan thận mủ (đã được khẳng định bằng PCR) và 1 cá khỏe mạnh (mẫu đối chứng) được tiến hành làm tiêu bản mô học Mang, gan, thận, ruột của cá bị bệnh được thu và cố định trong dung dịch buffer formalin 10%, sau đó được đúc parafin, cắt mô và nhuộm Hematoxyline và Eosin (HE) theo quy trình và

phương pháp của Mumford & cs (2007) Các

mẫu mô được phân tích đặc điểm bệnh lý vi thể

ở độ phóng đại 40, 100 và 400 lần để phát hiện

và so sánh các biến đổi mô học

2.3.6 Xử lý số liệu

Tỷ lệ xuất hiện các triệu chứng, bệnh tích của cá bệnh được thu thập và tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

Bảng 1 Triệu chứng và bệnh tích của cá nheo Mỹ bị bệnh gan thận mủ (n = 70)

Triệu chứng và bệnh tích cá bị bệnh Số cá có triệu chứng/bệnh tích Tỷ lệ (%) Triệu chứng

Bệnh tích

Trang 4

3 KẾT QU

3.1 Đặc đi

bệnh gan th

Kiểm tra 70

dấu hiệu

Mỹ mắc b

ăn, bơi l

xương nắ

tượng xuấ

xuất hiện

bụng trướ

sưng và xu

Ghi chú: A

nhiều nhớt, xương n

Ghi chú: A

huyết; D- Th

T QUẢ VÀ TH

c điểm bệnh lý c

nh gan thận mủ

m tra 70 mẫu cá

bị bệnh gan th

c bệnh có biểu hi

ăn, bơi lờ đờ, mang nhi

ắp mang và các g

ất huyết và l

n Trong đó, cá b

ớc khi chết, cá b

sưng và xuất huyết l

Ghi chú: A - Cá bơi lờ đ

t, xương nắp mang xu

Hình

Ghi chú: A - Bụng tích nư

Thận sưng, nhi

Trương Đ V

VÀ THẢO LUẬN

nh lý của c

u cá thu từ gan thận mủ cho th

u hiện triệu ch , mang nhiều nh

p mang và các gốc vây,

t và lở loét trên da Trong đó, cá bỏ ăn, bơi l

t, cá bị xuất huy

t lỗ hậu môn, mang nhi

đờ, ngửa bụng trong l

p mang xuất huy

Hình 1 Tri

ng tích nước vàng, gan có

n sưng, nhiều đốm mủ tr

Hình 2 Bệ

Trương Đình Hoài, Kim V

Vũ Đức Mạnh, Nguy

a cá nheo Mỹ

ừ các hộ nuôi có cho thấy cá nheo

u chứng như b

u nhớt, xuất huy

c vây, ngoài ra hi loét trên da cũng thư

ăn, bơi lờ đờ, ng

t huyết gốc vây,

u môn, mang nhi

ng trong lồng nuôi; B

t huyết; D - Xuất huy

Triệu chứng cá nheo M

c vàng, gan có nhiều đốm m

trắng, xuất huy

ệnh tích cá

ình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguy

nh, Nguyễn Thị

ỹ bị

nuôi có

y cá nheo

ng như bỏ

t huyết ngoài ra hiện cũng thường , ngửa

c vây,

u môn, mang nhiều

nhớ

là các tri Giả đốm ho

bề nhũn, m tác đ kính hi nhi 1)

nheo M hiện t trình

ng nuôi; B - Mang nhi

ất huyết lỗ hậu môn.

ng cá nheo Mỹ

ốm mủ trắng; B, C

t huyết và tụ huy

nh tích cá nheo Mỹ b

n, Đào Lê Anh, Nguy Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguy

ớt và xuất huy

là các triệu ch

ải phẫu cá b

m hoại tử màu tr mặt gan và th nhũn, một số đ tác động nhẹ và đ kính hiển vi Ru nhiều dịch vàng cũng chi 1) Các triệu ch

nheo Mỹ bị bệnh gan th

n từng triệ trình ở bảng 1,

Mang nhiều nhớ

u môn

ỹ bị bệnh gan th

ng; B, C - Gan xu huyết; E, G - Ru

bị bệnh gan th

n, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguy Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguy

t huyết nắp mang chi

u chứng thường th

u cá bị bệnh cho th màu trắng có th

t gan và thận Các đ

đốm mủ dễ

và đồng nh Ruột xuất huy

ch vàng cũng chiếm t

u chứng, bệnh tích đ

nh gan thận m

ệu chứng, bệ hình 1 và hình

ớt, xuất huyết trên g

Gan xuất hiện nhiềm đ Ruột xuất huyết, niêm m

Huyên, Nguyễn Văn Tuy Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguy

p mang chiếm tỷ

ng thấy ở cá b

nh cho thấy gan th

ng có thể quan sát rõ trên Các đốm mủ này m

vỡ ra nhiều d

ng nhất khi quan sát trên huyết và xoang b

m tỷ lệ khá cao (B

nh tích đại th

n mủ và tỷ ệnh tích cụ

và hình 2

ết trên gốc vây; C

ủ

m đốm mủ, xu

ết, niêm mạc xu

n Văn Tuyến, Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan

ỷ lệ cao và

cá bị bệnh

y gan thận có các quan sát rõ trên này mềm,

u dịch khi

t khi quan sát trên

t và xoang bụng có khá cao (Bảng

i thể của cá

lệ % xuất

ụ thể được

c vây; C - Mang

ất huyết, tụ

c xuất huyết

Trang 5

Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Theo người nuôi cá nheo Mỹ, cá bị bệnh gan

thận mủ rất khó phát hiện sớm, vì các triệu

chứng bệnh bên ngoài không đặc trưng, người

dân chỉ phát hiện được bệnh khi cá bắt đầu có

hiện tượng chết rải rác, mổ khám mới nhận diện

được bệnh Trong quá trình thu mẫu ở 3 tỉnh

cho thấy bệnh gan thận mủ ở cá nheo Mỹ

thường xuất hiện rải rác quanh năm, bệnh xuất

hiện từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm, tập

trung nhiều ở các tháng mùa hè nắng nóng từ

tháng 6-9 Theo Francis-Floyd & cs (1987), vi

khuẩn phát triển và gây bệnh ở nhiệt độ từ 17

đến 32C, nhưng cá có triệu chứng bệnh rõ khi

nhiệt độ nước >22C và có thể gây bùng phát

dịch bệnh khi nhiệt độ nước nuôi dao động xung

quanh 28C Điều nay cũng hoàn toàn phù hợp

với đặc điểm phát triển của bệnh gan thận mủ ở

cá nheo Mỹ ở miền Bắc Việt Nam, từ tháng 11

năm trước đến tháng 3 năm sau, nhiệt độ nước

thấp, do vậy bệnh ít xuất hiện Trong khi tháng

6-9 là thời điểm nắng, nhiệt độ cao và là điều

kiện cho vi khuẩn phát triển và gây bùng phát

dịch bệnh

Hiện nay, một số tác nhân gây bệnh có thể

gây ra hiện tượng đốm mủ trắng trên nội tạng

cá da trơn, do vậy cần phân biệt để chẩn đoán

đúng tác nhân gây bệnh Bệnh gan thận mủ

trên cá tra chủ yếu do E ictaluri (Crumlish &

cs., 2002; Dung & cs., 2008), trong khi đó theo

Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng nghĩa

(2016) tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá

lóc (Channa striata) nuôi ở đồng bằng sông cửu

long là Aeromonas schubertii Ngoài ra một số

đốm trắng trên gan, thận cá da trơn có thể do

bào tử sợi Myxobolus sp gây ra (Đồng Thanh

Hà, 2009) Theo Đồng Thanh Hà (2009) bệnh

gan thận mủ trên cá tra do E ictaluri thường

gây ra các đốm mủ nhỏ, kích thước 1-2mm,

trong khi cá bị bệnh, các đốm trắng lớn thường

do bào nang bào tử sợi gây ra Tuy nhiên, theo

quan sát của chúng tôi, cá nheo Mỹ bị bệnh gan

thận mủ, các đốm mủ này có kích thước dao

động lớn, từ 1-8mm và hoàn toàn không có sự

xuất hiện của bào tử sợi Đặc điểm khác biệt về

kích thước đốm mủ này có thể do sự khác biệt về

loài cá nheo Mỹ và cá tra, ngoài ra có thể có sự

khác biệt về chủng vi khuẩn gây bệnh và giữa

điều kiện môi trường giữa 2 miền Nam và Bắc

mà biểu hiện bệnh ở 2 loài cá là khác nhau

3.3 Kết quả phân lập, kiểm tra đặc điểm sinh hóa và giám định vi khuẩn bằng phương pháp PCR

Vi khuẩn nuôi cấy từ cá bị bệnh trên môi trường nuôi cấy phần lớn đều có hình dạng là các khuẩn lạc nhỏ, không nhân, phát triển sau 48h ở môi trường TSA và phát triển nhanh hơn (24h) ở môi trường TSA có bổ sung 5% máu cừu Các khuẩn lạc có màu trắng hơi đục, rìa bằng, hơi lồi (Hình 3A) Kết quả nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn hình que, thon mảnh, tròn hai đầu và bắt màu Gram âm (Hình 3B) Khoảng 3% khuẩn lạc còn lại có kích thước khá lớn, khi nhuộm gram bắt màu Gram âm, dạng trực

khuẩn Các vi khuẩn này có thể là Aeromonas

spp và đây là vi khuẩn cơ hội trong môi trường nước và thường có trong cơ thể cá nên rất dễ bắt gặp khi phân lập vi khuẩn từ cơ thể cá (Wang & Silva, 1999) Với tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch cho thấy vi khuẩn có khuẩn lạc nhỏ là tác nhân chính gây bệnh Các chủng

vi khuẩn này đã được nuôi cấy thuần, thử đặc tính sinh hóa và tăng sinh để phục vụ giám định bằng PCR

Các chủng vi khuẩn (n = 70) được đánh giá

là tác nhân gây bệnh gan thận mủ cho cá nheo

Mỹ đã được nuôi cấy thuần để xác định sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo Kết quả phản ứng sinh hóa sử dụng API 20E cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng thủy phân lysine (dương tính LDC) và ornithine (dương tính ODC), có khả năng lên men và oxy hóa đường (dương tính D-glucose), 17/20 phản ứng còn lại cho kết quả âm tính Kết quả này hoàn toàn

phù hợp với đặc tính sinh hóa của E ictaluri

theo mô tả của Hawke (1979) ở cá nheo mỹ và của Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trúc Phương (2010) (Bảng 2)

Kết quả giám định các chủng vi khuẩn bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu EiFd-1F/EiFd-1R để phát hiện DNA của vi khuẩn

E ictaluri cho thấy 100% chủng đều cho kết quả

PCR dương tính với DNA của vi khuẩn

E ictaluri và cho sản phẩm PCR có độ dài

407bp (Hình 4)

Trang 6

Bảng 2.

Các ch

Nhuộm gram

Hình dạng

Tính di động

ONPG

ADH

LDC

ODC

Citrate utilization

H 2 S Production

Urease

TDA

Indole production

Voges-Proskauer

Gelatin

Tạo axit từ

D-glucose

D-mannitol

Inositol

D-sorbitol

L-rhamnose

D-sucrose

D-melibiose

Amygdalin

L-arabinose

Ghi chú: *

Hình 3 Hình d

ng 2 Kết qu

Các chỉ tiêu sinh hóa

m gram

ng

Citrate utilization

S Production

Indole production

Proskauer

ừ

glucose

mannitol

Inositol

sorbitol

rhamnose

sucrose

melibiose

Amygdalin

arabinose

Ghi chú: * - Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguy

Hình 3 Hình dạ

Trương Đ V

t quả thử sinh hóa các ch

Hoàng Oanh và Nguy

ạng khuẩn l

thu t

sinh hóa các ch

Các chủng vi khu

Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc Phương (2010); ND

n lạc và nhu thu từ cá nheo M

nh, Nguyễn Thị

sinh hóa các chủng Edwardsiella ictaluri

ng vi khuẩn phân lập cá b

- Trực khuẩn +

-

- + +

-

+

-

n Trúc Phương (2010); ND

c và nhuộm gram ch

cá nheo Mỹ bị bệnh gan th

Edwardsiella ictaluri

p cá bệnh (n = 70)

n Trúc Phương (2010); ND - Không xác đ

m gram chủng vi khu

nh gan thận m

Edwardsiella ictaluri phân l

) Edwardsiella ictaluri

Không xác định

ng vi khuẩn E ictaluri

n mủ

phân lập từ cá b

Edwardsiella ictaluri

- Trực khuẩn +

-

- + +

-

ND

-

+

-

nh

E ictaluri Ei-VN19

cá bệnh

Edwardsiella ictaluri CAF255*

n

VN19-6

Trang 7

Đặc điểm b

Ghi chú: M: Marker; Gi

Giếng 9: Đ

Hình

Từ các đ

nhuộm Gram và k

thể nói rằ

E ictaluri

các chủng

khác nhau nhưng có đ

trúc gen C

phát hiện DNA c

sử dụng đ

tra, cá rô phi và cá nheo M

này Mặc dù v

E ictaluri

thể có sự

có các nghiên c

tự bộ gen c

khác nhau đ

3.4 Một s

nheo Mỹ

Để nghiên c

cá bị bệnh, 14 m

bị bệnh gan th

01 cá khỏ

mô học Nh

thận, ruộ

mủ được so sán

trình bày

Kết qu

mắc bệnh gan th

sinh, mô mang xu

m bệnh lý và ứng d

Ghi chú: M: Marker; Gi

ng 9: Đối chứng dương ch

Hình 4 Kết qu

các đặc tính hình thái khu

m Gram và kết qu

ằng cá nheo M

E ictaluri gây ra Theo

ng E ictaluri

khác nhau nhưng có đ

trúc gen Cặp mồi đặ

n DNA của vi khu

ng để chẩn đoán b

tra, cá rô phi và cá nheo M

c dù vậy, gi

E ictaluri gây bệnh cho các loài cá khác nhau có

khác nhau v

có các nghiên cứu tiếp theo, đ

gen của các ch

khác nhau để làm rõ v

t số đặc điể

ỹ mắc bệnh gan th

nghiên cứu đ

nh, 14 mẫu mô đư

nh gan thận mủ

ỏe mạnh đượ

c Những biến đ

ột của cá nheo M

c so sánh vớ

trình bày ở các hình 5 đ

t quả kiểm tra bi

nh gan thận m

sinh, mô mang xuất huy

ng dụng phương pháp PCR ch

Ghi chú: M: Marker; Giếng 1-7: 7 chủ

ng dương chủng vi khu

t quả chạy PCR

c tính hình thái khu

t quả giám định b

ng cá nheo Mỹ bị bệnh gan th

gây ra Theo Waltman

phân lập từ khác nhau nhưng có độ tương đồng cao trong c

ặc hiệu EiFd

a vi khuẩn E ictaluri

n đoán bệnh gan th tra, cá rô phi và cá nheo Mỹ trong nghiên c

y, giữa các ch

nh cho các loài cá khác nhau có nhau về đặc tính di truy

p theo, đặc bi

a các chủng gây bệnh

làm rõ vấn đề này

ểm mô bệnh h

nh gan thận m

u đặc điểm bệnh lý vi th

u mô được thu t

đã giám định b

ợc sử dụng đ

n đổi mô họ

a cá nheo Mỹ mắc b

ới cá khỏe m các hình 5 đến hình 20

m tra biến đổi mô b

n mủ cho thấy mang

t huyết và phù n

ng pháp PCR ch

ủng vi khuẩn đ

ng vi khuẩn E ictaluri LMG 7860.

y PCR 7 chủng vi khu

bị bệ

c tính hình thái khuẩn lạc, kết qu

nh bằng PCR, có

nh gan thận mủ Waltman & cs (1986)

ừ một số loài cá

ng cao trong c

u EiFd-1F/EiFd-1R đ

E ictaluri đã đư

nh gan thận mủ trên cá trong nghiên c

a các chủng vi khu

nh cho các loài cá khác nhau có

c tính di truyền và c

c biệt là giải trình

nh ở các loài cá

nh học của cá

n mủ

nh lý vi thể

c thu từ cá nheo M

nh bằng PCR và

ng để làm tiêu b

ọc ở mang, gan,

c bệnh gan th

e mạnh và đư

n hình 20

i mô bệnh họ

y mang cá tăng

t và phù nề trong khi

ng pháp PCR chẩn đoán bệnh gan th

n đại diện thu t

n E ictaluri LMG 7860.

ng vi khuẩn đ ệnh gan thậ

t quả

ng PCR, có

ủ do (1986), loài cá

ng cao trong cấu

1R để

đã được trên cá trong nghiên cứu

ng vi khuẩn

nh cho các loài cá khác nhau có

n và cần

i trình các loài cá

a cá

của

cá nheo Mỹ

ng PCR và làm tiêu bản mang, gan,

nh gan thận

nh và được

ọc cá

cá tăng trong khi

mang cá kh lượng các t giữa các tơ mang th trống giúp cho quá trình hô h

5, 6 7 và 8) Mang tăng sinh, phù n nhớ

nguyên nhân làm cho cá ch xuấ

xuấ thoái hóa kèm theo ho

10 và 12) Th thoái hóa, xu hoạ

và 16) Thành ru cấu trúc l

đứt nát, thoái hóa, lan tràn vi khu hồng c

đại th đến nay, ch của cá nheo M Plumb (1985) nghiên c

cơ, th

và ho

mô t

cá có hi khá th bệnh h Miyazaki & Plumb (1985) là với k

nh gan thận mủ

n thu từ cá nheo bị

n E ictaluri LMG 7860

n đại diện phân l

ận mủ

mang cá khỏe các tơ mang sơ c

ng các tế bào

a các tơ mang th

ng giúp cho quá trình hô h

5, 6 7 và 8) Mang tăng sinh, phù n

ớt làm cho cá thi nguyên nhân làm cho cá ch

ất hiện nhiều t

ất huyết, tụ thoái hóa kèm theo ho

10 và 12) Thận cá cũng xu thoái hóa, xuất huy

ại tử ống thậ

và 16) Thành ru

u trúc lỏng lẻ

t nát, thoái hóa, lan tràn vi khu

ng cầu đã ph

i thể ở ruột cá b

n nay, chỉ có m

a cá nheo Mỹ Plumb (1985) nghiên cứu chỉ

cơ, thận và mô máu cá Hi

và hoại tử da đã đư

mô tả kỹ, tuy nhiên trong nghiên c

cá có hiện tượng l khá thấp (17,1%) Các đ

nh học ở thậ Miyazaki & Plumb (1985) là

i kết quả nghiên c

ủ trên cá nheo M

ị bệnh; Giếng 8:

n phân lập từ

e các tơ mang sơ c bào mang phân b

a các tơ mang thứ cấp rõ và nhi

ng giúp cho quá trình hô h

5, 6 7 và 8) Mang tăng sinh, phù n

t làm cho cá thiếu oxy, s nguyên nhân làm cho cá ch

u tế bào đại th máu, giảm s thoái hóa kèm theo hoại tử

n cá cũng xu

t huyết và t

ận bị tổn thương n

và 16) Thành ruột xuất huy

ẻo, biểu mô lông nhung c

t nát, thoái hóa, lan tràn vi khu

u đã phản ảnh đúng đ

t cá bị bệnh (Hìn

có một nghiên c

ỹ nhiễm E ictaluri

thực hiện, tuy nhiên k nêu được đặ

n và mô máu cá Hiệ

da đã được Miyazaki & Plumb (1985) , tuy nhiên trong nghiên c

ng lở loét và ho

p (17,1%) Các đặc đi

ận cá bệnh trong nghiên c Miyazaki & Plumb (1985) là

nghiên cứu này

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus

ng 8: Đối chứng âm;

ừ cá nheo M

e các tơ mang sơ cấp, thứ mang phân bố đều, không gian

p rõ và nhiề

ng giúp cho quá trình hô hấp thuận l

5, 6 7 và 8) Mang tăng sinh, phù nề

u oxy, sức khỏe kém cũng là nguyên nhân làm cho cá chết nhiều Gan cá

i thực bào, nhi

m số lượng tế

ử nghiêm tr

n cá cũng xuất hiện nhiề

t và tụ huyết, các vùng b

n thương nặng nề

t huyết, cơ trơn c

u mô lông nhung c

t nát, thoái hóa, lan tràn vi khuẩn gây b

nh đúng đặc điểm b

nh (Hình 19 và 20) Cho

t nghiên cứu về mô b

E ictaluri do Miyazaki &

n, tuy nhiên k

ặc điểm mô b

ện tượng cơ cá b Miyazaki & Plumb (1985) , tuy nhiên trong nghiên cứu này, t

loét và hoại tử cơ chi

c điểm về bi

nh trong nghiên c Miyazaki & Plumb (1985) là khá tương đ

u này

Ictalurus punctatus)

ng âm;

cá nheo Mỹ

ứ cấp và số

u, không gian

ều khoảng

n lợi (Hình

ề và nhiều

e kém cũng là

u Gan cá bệnh

c bào, nhiều vùng

ế bào gan, nghiêm trọng (Hình

ều vùng bị

t, các vùng bị

ề (Hình 14

t, cơ trơn của ruột

u mô lông nhung của ruột bị

n gây bệnh và

m bệnh tích

h 19 và 20) Cho

mô bệnh học Miyazaki &

n, tuy nhiên kết quả

m mô bệnh học ở

ng cơ cá bị lở loét Miyazaki & Plumb (1985)

u này, tỷ lệ

cơ chiếm tỷ lệ biến đổi mô

nh trong nghiên cứu của khá tương đồng so

Trang 8

Hình 5 Mang cá

sơ cấp và th

Hình 7 Mang cá nheo M

tăng sinh, mang xu

Hình 9

độ và phân b

Mang cá nheo M

p và thứ cấp r

7 Mang cá nheo M

tăng sinh, mang xu

Gan cá bình thư

và phân bố tế bào gan đ

gan

Trương Đ V

nheo Mỹ khỏ

p rộng và thoáng

7 Mang cá nheo Mỹ bị b

tăng sinh, mang xuất huyết n

Gan cá bình thường, c

bào gan đều (HE × 100)

ỏe, các tơ mang

ng và thoáng (HE ×

bệnh, tơ mang

t nặng (HE ×

ng, cấu trúc, m

u trên nhu mô

nh, Nguyễn Thị

e, các tơ mang

× 40)

Hình mang có c bình thư

nh, tơ mang

100)

Hình

u trúc, mật trên nhu mô

Hình 10

xu l

E ictaluri

Hình 6 Mang cá mang có cấu trúc, s bình thường

th

Hình 8 Mang cá

xuất huy

Hình 10 Gan cá b xuất huyết, t lỏng lẻo (mũi tên đen), s

E ictaluri trong mô (mũi tên vàng)

Mang cá nheo M

u trúc, số lư

ng và phân bố thứ cấp (HE

8 Mang cá bệnh, tơ

t huyết lan tràn

Gan cá bệnh, nhu mô gan ho

t, tế bào gan thưa th

o (mũi tên đen), s trong mô (mũi tên vàng)

nheo Mỹ khỏe, các t lượng và kích thư

ố đều trên tơ (HE ×100)

, tơ mang tăng sinh và

t lan tràn (HE × 400)

nh, nhu mô gan ho bào gan thưa thớt, c

o (mũi tên đen), sự hiện diệ trong mô (mũi tên vàng) (HE

các tế bào

ng và kích thước

u trên tơ mang

mang tăng sinh và

400)

nh, nhu mô gan hoại tử,

t, cấu trúc

ện của (HE × 100)

Trang 9

Đặc điểm b

Hình 11

giác, nhân rõ và phân b

Hình 13

cấ

5 KẾT LU

Cá nheo M

bơi lờ đờ

mang, gốc vây và h

gan, thận có nhi

ruột xuất huy

có biểu hi

tràn Ruộ

nát Gan, th

lẻo kèm theo hi

m bệnh lý và ứng d

11 Gan cá bình thư

giác, nhân rõ và phân b

gan

3 Thận cá bình thư

ấu trúc ống th

T LUẬN

Cá nheo Mỹ bị b

ờ, mang nhi

ốc vây và hậ

n có nhiều đ

t huyết Về mô b

u hiện tăng sinh

ột bị xuất huy

nát Gan, thận bị hoạ

o kèm theo hiện tượ

ng dụng phương pháp PCR ch

Gan cá bình thường, t

giác, nhân rõ và phân bố đều trong nhu mô

(HE × 400)

n cá bình thường, s

ng thận rõ (HE

bệnh gan th , mang nhiều nhớt, xu

ậu môn Các n

u đốm mủ trắ

mô bệnh học, mang cá b

n tăng sinh mạnh và xu

t huyết và thành ru

ại tử, cấu trúc nhu mô l ợng xuất huy

ng pháp PCR ch

ng, tế bào hình đa

u trong nhu mô

ng, số lượng và

HE × 40 )

nh gan thận mủ thư

t, xuất huyết n

u môn Các nội quan như

ắng do hoại t

c, mang cá b

nh và xuất huyết lan

t và thành ruột bị

u trúc nhu mô l

t huyết và tụ huy

ng pháp PCR chẩn đoán bệnh gan th

o hình đa

u trong nhu mô

Hình 12 Gan cá b giảm, c

lan tràn

E ictaluri

ng và Hình

lượ bi đen), s

thường

t nắp

i quan như

i tử,

c, mang cá bệnh

t lan đứt

u trúc nhu mô lỏng

huyết

nhỏ

vi khu Các ch sinh hóa và giám đ dương tính v kết qu phát hi đoán và phòng và tr thiệ

nh gan thận mủ

Hình 12 Gan cá b

m, cấu trúc l lan tràn (mũi tên đen), s

E ictaluri trong mô (mũi tên vàng)

Hình 14 Thận cá b ợng ống thậ biến dạng, xu đen), sự hiện di

(mũi tên vàng)

Các chủng vi khu

ỏ, không nhân, tr

vi khuẩn dạng tr Các chủng vi khu sinh hóa và giám đ dương tính với

t quả nghiên c phát hiện sớm b đoán và phòng và tr

ệt hại do dịch b

ủ trên cá nheo M

Hình 12 Gan cá bệnh, s

u trúc lỏng lẻo, ho (mũi tên đen), s trong mô (mũi tên vàng)

n cá bệnh, th

ận giảm, cấ

ng, xuất huyết lan tràn

n diện của E ictaluri

(mũi tên vàng)

ng vi khuẩn từ , không nhân, trắng hơi đ

ng trực khuẩn b

ng vi khuẩn này đã đư sinh hóa và giám định bằng PCR v

i E ictaluri

nghiên cứu này là cơ s

m bệnh, đề ra ph đoán và phòng và trị bệnh phù h

ch bệnh này gây ra trong tương lai

trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus

ố lượng tế bào gan

o, hoại tử và xu (mũi tên đen), sự hiện diệ trong mô (mũi tên vàng) (

nh, thận bị ho

ấu trúc ống th

t lan tràn (mũi tên

E ictaluri trong mô

(mũi tên vàng) (HE × 40)

ừ cá bệnh có khu

ng hơi đục, rìa bằ

n bắt màu Gram âm

n này đã được thử

ng PCR với 100% m Những thông tin t

u này là cơ sở để ngư

ra phương pháp ch

nh phù hợp, gi

nh này gây ra trong tương lai

Ictalurus punctatus)

bào gan

và xuất huyết

ện của (HE × 400)

hoại tử, số

ng thận bị (mũi tên trong mô

nh có khuẩn lạc

ng, hơi lồi,

t màu Gram âm

ử đặc tính

i 100% mẫu

ng thông tin từ người nuôi ương pháp chẩn

p, giảm thiểu

nh này gây ra trong tương lai

Trang 10

Hình 15 Th

thận rõ, các t

Hình 17

cấu trung r

Hình 19

lẻo lông nhung rách nát, xu

thành ru

Hình 15 Thận cá bình thư

n rõ, các tế bào

(HE

17 Ruột cá bình thư

u trung rắn chắc, bi

rõ cấu trúc

19 Ruột cá b

lông nhung rách nát, xu

thành ruột và bi

Trương Đ V

n cá bình thường, c

bào ống thận phân b

HE × 100)

t cá bình thường, thành ru

c, biểu mô và lông nhung

u trúc (HE ×

t cá bị bệnh, thành ru lông nhung rách nát, xuất huy

t và biểu mô ruộ

ng, cấu trúc

n phân bố đ

ng, thành ru

u mô và lông nhung

40)

nh, thành ruột lỏ

t huyết trên c

ột (HE × 40)

nh, Nguyễn Thị

u trúc ống đều

Hình 16 Th ống th nhu mô th

ng, thành ruột

Hình cấu trung r

ỏng

t trên cả

)

Hình ra rách nát, xu

Hình 16 Thận cá b

ng thận bị m nhu mô thận xu

Hình 18 Ruộ

u trung rắn ch

rõ c

Hình 20 Ruộ

ra, cấu trúc cơ vòng l rách nát, xuấ

biểu mô ru

n cá bệnh, nhu mô b mất cấu trúc, nhân thoái hóa,

n xuất huyết lan tràn

ột cá bình thư

n chắc, biểu mô và lông nhung

rõ cấu trúc (HE

ột cá bị bệnh, thành ru

u trúc cơ vòng lỏng l

ất huyết trên c

u mô ruột (

nh, nhu mô bị ho

u trúc, nhân thoái hóa,

t lan tràn (HE

t cá bình thường, thành ru

HE × 100)

nh, thành ru

ng lẻo, lông

t trên cả thành ru (HE × 100)

hoại tử, các

u trúc, nhân thoái hóa,

HE × 100)

ng, thành ruột

nh, thành ruột giãn

o, lông nhung thành ruột và

Định dạng
Số trang	11
Dung lượng	27,04 MB