Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chất thải mã số v2018 16

Khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn trong môi trường có chứa một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần ăn Bảng 3.34: Điều kiện thu hồi sinh khối vi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

“Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chất thải”

Mã số: V2018-16

Chủ nhiệm đề tài: Đào Thị Hồng Vân

Hà Nội - 2019

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Một số đặc điểm dinh dưỡng và tiêu hóa của lợn 9

1.2 Vi sinh vật và quá trình xử lý chất thải hữu cơ 13

1.2.1 Vi sinh vật phân hủy hợp chất hữu cơ 13

1.2.2 Quá trình xử lý chất thải hữu cơ 9

1.3 Chế phẩm vi sinh vật 19

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên liệu 22

2.1.1 Nguồn vi sinh vật 22

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 22

2.1.3 Môi trường nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Các phương pháp định tính và định lượng 23

2.2.2 Phương pháp phân lập 23

2.2.3 Phương pháp tuyển chọn 25

2.2.4 Phương pháp phân loại 25

2.2.4 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp 28

2.2.6 Thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm 28

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích 29

3.1.1 Phân lập 29

3.1.2 Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic và phân hủy hợp chất hữu cơ 30

3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, phân loại các chủng vi sinh vật được lựa chọn 29

3.2.1 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại vi sinh vật 29

3.2.2 Ảnh hưởng của muối mật đến khả năng sinh trưởng của các chủng lựa chọn 45

3.2.3 Khả năng dính bám của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa 38

3.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thu sinh khối 39

3.3.1 Đối với chủng Lactobacillus acidophilus AH4 39

3.3.2 Đối với chủng Bacillus subtilis H11 50

3.4 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật 54

3.4.1 Kiểm tra tính đối kháng của các chủng được lựa chọn 54

3.4.2 Khả năng sinh trưởng và chuyển hóa dinh dưỡng của các chủng được lựa chọn với một số thành phần có trong thức ăn 54

3.4.3 Tạo chế phẩm 55

3.5 Đánh giá mức độ an toàn và thời gian bảo quản của chế phẩm 60

3.6 Thử nghiệm trên lợn 62

KẾT LUẬN 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau

Bảng 3.2 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit

Bảng 3.3 Khả năng sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định của 10 chủng vi

khuẩn lactic (được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn - ∆D, mm)

Bảng 3.4 Số lượng chủng Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất Bảng 3.5 Khả năng phân giải cơ chất của một số chủng vi khuẩn Bacillus

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn của 15 chủng vi khuẩn Bacillus

Bảng 3.7 Số lượng chủng nấm men có hoạt tính kháng khuẩn

Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của 06 chủng nấm men Bảng 3.9 Đặc điểm hình thái của các vi khuẩn lactic

Bảng 3.10 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic

Bảng 3.11 Các đặc điểm sinh hoá của 02 chủng vi khuẩn lactic

Bảng 3.12 Kết quả giải trình tự và so sánh gen mã hoá cho rARN 16S của 2 chủng vi

khuẩn lactic

Bảng 3.13 Đặc điểm nuôi cấy của chủng H9 trên một số môi trường

Bảng 3.14 Đặc điểm nuôi cấy của chủng H11 trên một số môi trường

Bảng 3.15 Đặc điểm hình thái tế bào của 2 chủng H9 và H11

Bảng 3.16 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn H9 và H11

Bảng 3.17 Kết quả giải trình tự và so sánh gen mã hoá cho rARN 16S

của 02 chủng vi khuẩn Bacillus

Bảng 3.18 Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của chủng nấm men V1

Bảng 3.19 Kết quả giải trình tự và so sánh gen mã hoá cho rARN 5,8S của chủng nấm

men V1

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau đến khả

năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Bảng 3.21 Khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật trên biểu mô ruột

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của vi khuẩn L

acidophilus AH4

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nguồn đường khác nhau đến khả năng sinh trưởng

chủng L acidophilus AH4

Bảng 3.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD600nm)

và sản sinh axit lactic (g/l) của L acidophilus AH4

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và sinh axit của L

Bảng 3.26 Điều kiện lên men thu sinh khối chủng L acidophilus AH4

Bảng 3.27 Sinh khối của chủng vi khuẩn nghiên cứu theo thời gian

Bảng 3.28 Khả năng sinh trưởng (giá trị OD600nm) của chủng vi khuẩn B subtilis H11

với các nguồn cacbon khác nhau

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng 3.30: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD600nm) và

sinh enzym của chủng Bacillus subtilis H11

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của pH môi trưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của

chủng vi khuẩn Bacillus subtilis H11

Bảng 3.32: Điều kiện lên men thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis H11

Bảng 3.33 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn trong môi

trường có chứa một số thành phần có hoạt tính bổ sung trong khẩu phần ăn

Bảng 3.34: Điều kiện thu hồi sinh khối vi khuẩn

Bảng 3.35 Tỷ lệ phối trộn chất phụ gia với sinh khối vi khuẩn

Bảng 3.36 Điều kiện tạo chế phẩm vi sinh vật

Bảng 3.37: Tổng hợp lượng sinh khối và chất phụ gia sử dụng để tạo 10kg chế phẩm Bảng 3.38 Tỷ lệ sống sót của vi khuẩn trong chế phẩm sau thời gian bảo quản

Bảng 3.39 Kết quả kiểm định mật độ vi sinh vật trong chế phẩm của Trung tâm Công

nghệ và Môi trường (tháng 09/2018)

Bảng 3.40 Kết quả kiểm định mật độ vi sinh vật trong chế phẩm của Trung tâm Công

nghệ và Môi trường (tháng 12/2018)

Bảng 3.41 Đối tượng, thời gian và môi trường thử nghiệm

Bảng 3.42 Tổng hợp kết quả đánh giá theo cảm quan của người sử dụng chế phẩm

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả xác định số lượng vi sinh vật có trong mẫu trên một số môi trường đặc

trưng sau 48 giờ nuôi ở nhiệt độ 30C

Hình 3.2 Khả năng phân hủy CaCO3 (A) và sự phát triển trên môi trường đặc (B)

của chủng vi khuẩn lactic AH3

Hình 3.3 Hoạt tính kháng của các chủng lactic đối với chủng vi khuẩn kiểm định E coli Hình 3.4 Khả năng sinh enzym cellulase (A), amylase (B) và protease (C) của các

chủng vi khuẩn Bacillus

Hình 3.5 Khả năng sinh enzym ngoại bào có trong dịch sau lên men của các chủng vi

khuẩn Bacillus trên môi trường có chứa cơ chất (1)-casein; (2)-xenluloza, (3)- tinh bột

Hình 3.6 Hình thái của các chủng vi khuẩn (A) và khả năng đối kháng với chủng vi

khuẩn Salmonella sp (B) và E coli (C)

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc của 06 chủng nấm men

Hình 3.8: Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn lactic

Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm ADN tổng số và PCR sử dụng cặp mồi16S F1 và 16S R1 Hình 3.10 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng vi khuẩn AH3 và AH4 với một số

chủng vi khuẩn Lactobacillus có họ hàng gần gũi

Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng vi khuẩn Bacillus

Hình 3.12 Kết quả kít thử API 50CHB của hai chủng vi khuẩn H9 và H11

Hình 3.13 Điện di đồ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi16S F1 và 16S R1 từ DNA tổng

số của hai chủng H9 và H11

Hình 3.14 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng vi khuẩn H11 và H9 với một số

chủng vi khuẩn Bacillus có họ hàng gần gũi

Hình 3.15 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào chủng nấm men (B)

Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 Hình 3.17 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng nấm men V1 với một số chủng nấm

men có họ hàng gần gũi

Hình 3.18 Ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

chủng vi khuẩn

Hình 3.19 Khả năng đồng sinh trưởng hai chủng vi khuẩn lựa chọn

Hình 3.20 Qui trình tạo chế phẩm vi sinh vật

Hình 3.21: Chế phẩm vi sinh vật sau đông khô (A) và sau quá trình phối trộn tạo thành

chế phẩm (B)

Hình 3.22: Cám heo Jolie 1 của Neovia trước (A) và sau (B) khi trộn chế phẩm vi sinh

vật

MỞ ĐẦU

Theo Cục Chăn nuôi (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) [02], hiện tổng đàn lợn của cả nước là 28,8 triệu con, sản lượng thịt lợn hơi xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn, tăng 1,9% so với năm trước

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn phát triển kéo theo khối lượng chất thải tăng cao, không chỉ ảnh hưởng tới môi trường sống của người chăn nuôi và của các vùng xung quanh mà còn gây ô nhiễm nguồn nước, tài nguyên đất tại các vùng đó Do đó, ngành chăn nuôi phát triển nếu không đi kèm với các biện pháp xử lý chất thải sẽ làm môi trường sống của con người xuống cấp nhanh chóng Môi trường bị ô nhiễm lại tác động trực tiếp vào sức khoẻ vật nuôi, phát sinh dịch bệnh, gây khó khăn trong công tác quản

lý, giảm năng suất, chất lượng

Trong chất thải chăn nuôi lợn chứa nhiều hợp chất hữu cơ, vô cơ, vi sinh vật gây bệnh và có mùi hôi Đặc thù của chất thải chăn nuôi lợn là chất thải rắn, lỏng trộn lẫn nên rất khó thu gom và xử lý triệt để Do vậy, giảm bớt mức độ ô nhiễm của chất thải trước khi chúng phát tán ra môi trường là việc làm rất cẩn thiết

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã

và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ

Các sản phẩm probiotic nhập khẩu dùng trong chăn nuôi có mặt trên thị trường Việt Nam nhiều nhưng các đáp ứng tích cực cho vật nuôi chưa được rõ ràng Các nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật đó không phù hợp với hệ vi sinh vật đường

ruột của vật chủ bản địa Mặt khác, các nghiên cứu sản xuất các chế phẩm probiotic dùng

trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chất thải” với định hướng góp phần đưa ra được một số giải pháp công

nghệ để sản xuất các chế phẩm chứa các vi sinh có ích, nhằm tăng cường chuyển hóa thức ăn Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu

Mục tiêu của đề tài:

- Sản xuất chế phẩm vi sinh vật (dạng bột) có tác dụng giảm mùi hôi thối và mức

độ ô nhiễm của chất thải

- Thử nghiệm bổ sung chế phẩm vào thức ăn chăn nuôi lợn ở cơ sở chăn nuôi lợn tại xã Trọng Quan, Đông Hưng, Thái Bình

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu hiệu

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, phân loại đến loài các chủng được tuyển chọn

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thu sinh khối

- Sản xuất chế phẩm vi sinh vật (10 kg dạng bột)

- Đánh giá mức độ an toàn và thời gian bảo quản của chế phẩm

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm dinh dƣỡng và tiêu hóa của lợn

Về đặc điểm sinh lý tiêu hoá của lợn, theo Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2001) [06],

lợn là loài gia súc có loại hình dạ dày đơn Môi trường dạ dày có axit (pH = 2,0-2,5) do dịch vị tiết ra pH dịch vị thấp phù hợp điều kiện hoạt động của pepsin để phân giải protein thành các sản phẩm trung gian như albumoz, pepton và một lượng nhỏ axit amin Ruột non của lợn chứa dịch tụy, dịch ruột và dịch mật, có môi trường kiềm tính với pH trong khoảng 7,8 - 8,7 trong đó chỉ có dịch tụy và dịch ruột chứa đủ các enzyme tiêu hóa triệt để các chất dinh dưỡng trong thức ăn Nhờ vậy, ruột non là bộ phận tiêu hóa chứa đầy đủ enzyme thủy phân chất dinh dưỡng trong thức ăn thành chất dinh dưỡng đơn giản nhất mà cơ thể hấp thu trực tiếp qua vách ruột vào máu Trong tất cả các chất dinh dưỡng, protein là đại phân tử có cấu tạo phức tạp nhất nên phức hệ enzyme thủy phân protein (gọi chung protease) cũng hết sức phức tạp và được chia làm các nhóm khác nhau tùy theo khả năng và mức độ phân giải của từng enzyme, trong đó: Nhóm 1 gồm các enzyme pepsin của dịch vị, trypsin và chymotrypsin của dịch tụy, erepxin của dịch ruột, nhóm này thủy phân protein thành các peptit ngắn 6-8 axit amin Nhóm 2 là nhóm enzyme phân giải peptit Nhóm 3 là nhóm enzyme thủy phân protein của tổ chức liên kết như elastaza thủy phân elastin Nhóm 4 là nhóm enzyme thủy phân protein nhân tế bào Dịch mật không chứa enzyme tiêu hóa, nhưng nó hỗ trợ các hoạt động tiêu hóa và hấp thu, nhất là tiêu hóa mỡ

Ruột non có cấu tạo đặc biệt, thích ứng cao với tiêu hóa và hấp thu thức ăn Dọc niêm mạc ruột có các tuyến ruột phát triển tiết dịch ruột theo kiểu toàn tiết, tức là các tế bào tuyến chứa đầy enzyme từ niêm mạc ruột bong ra theo chu kỳ rơi thẳng vào xoang ruột tạo ra nguồn nitơ nội sinh Đây là một đặc điểm gây ảnh hưởng tới tính chính xác trong các kết quả thử mức tiêu hóa protein ở lợn mà ta không thể loại trừ

Ở ruột già của lợn có hệ vi sinh vật cộng sinh trong manh tràng và kết tràng có khả năng phân giải chất xơ Ruột già không tiết enzyme mà chỉ tiếp tục phân giải thức ăn nhờ enzyme ở ruột non Tỷ lệ tiêu hóa này cao hay thấp phụ thuộc vào thời gian lưu thức

ăn ở ruột già (12 - 16 giờ) Tính trung bình có 14% chất xơ, 12% protein và 9% mỡ còn lại trong dưỡng chất được tiêu hóa ở ruột già [5] Hoạt động chủ yếu của ruột già là sự

lên men chất xơ do tác động của hệ vi sinh vật ở manh tràng, kết tràng và hoạt động phân hủy protein thừa trong thức ăn bởi các vi khuẩn gây thối tạo thành các chất độc crezon, fenol, indol, scatol Các chất độc này được hấp thu vào máu và giải độc ở gan Nếu quá nhiều sẽ gây tình trạng ngộ độc đường tiêu hóa làm cho lợn bị ỉa chảy, chất thải có mùi thối khó chịu, làm ô nhiễm môi trường bởi các chất khí SO2, H2S

Như vậy, trong mọi trường hợp sự lên men bởi vi sinh vật ruột già ở manh tràng, kết tràng lợn đều tạo ra sinh khối vi sinh vật thải ra ngoài theo phân và nguồn nitơ này cùng với nitơ thừa trong thức ăn gây ra sai số đáng kể trong việc xác định tỷ lệ tiêu hóa thực của nitơ trong thức ăn ăn vào Hoạt động tiêu hóa của lợn vào ban ngày thường lớn hơn ban đêm và thời gian thức ăn lưu lại trong đường tiêu hóa ở lợn khoảng 24 giờ Tuy nhiên, có một phần nhỏ thức ăn sẽ thải trong khoảng 4-5 ngày

Nhu cầu các chất dinh dưỡng đối với sự phát triển của lợn:

Theo Vũ Duy Giảng và cs, (1999) [03] protein là hợp chất hữu cơ phức tạp có phân tử lượng lớn; bao gồm cacbon, hydro, oxy, ngoài ra có nitơ và lưu huỳnh Protein tìm thấy trong tất cả các quá trình xảy ra ở tế bào, mỗi cơ thể đều có các protein đặc hiệu của mình

Protein đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng và là nguồn nguyên liệu cấu tạo lên tế bào Quá trình sinh trưởng của lợn là quá trình tăng lên của khối lượng protein Protein

có nhiều chất trong cơ (30 - 35% tổng lượng protein trong cơ thể) Protein là thành phần cấu trúc cơ bản và quan trọng nhất của cơ thể lợn

Theo Từ Quang Hiển, Phan Đình Thắm (2001) [04]; nhu cầu về protein của cơ thể thực chất là nhu cầu về axit amin Cơ thể con vật chỉ có thể tổng hợp lên protein của nó theo mức cân đối về axit amin trong thức ăn Những axit amin nào nằm ngoài sự cân đối

sẽ bị oxi sẽ sản sinh ra năng lượng do vậy nếu cung cấp axit amin theo tỷ lệ cân đối sẽ nâng cao hiệu quả lợi dụng protein, tiết kiệm được protein thức ăn Một thí nghiệm nghiên cứu trên lợn sinh trưởng cho biết: yêu cầu tăng trọng 585g/con/ngày nếu khẩu phần cân đối axit amin thì protein thô cần 11 - 12%, nhưng nếu khẩu phần mất cân đối axit amin thì cần 20 -22% protein thô [09]

Theo Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2001) [06], cho biết: tổng trong cơ thể lợn, chất khoáng chiếm 3% trong đó có tới 75% là canxi và photpho, xấp xỉ 25% là kali và natri Trong cơ thể cũng có magie và một lượng nhỏ sắt, kẽm, đồng còn các chất khoáng khác chỉ tồn tại ở mức dấu vết

Người ta chỉ ra rằng, ngoài protein, năng lượng cơ thể con vật rất cần khoáng để tồn tại Chất khoáng ngoài việc tham gia vào cấu tạo cơ thể, nó còn tham gia nhiều vào các quá trình chuyển hóa của cơ thể Chính vì vậy, nếu thiếu khoáng con vật sẽ bị rối loạn trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển bị ngừng trệ dẫn đến sức sản xuất giảm sút Tùy theo hàm lượng trong cơ thể chất khoáng được chia làm 2 nhóm nhỏ: Nhóm những nguyên tố đa lượng: Ca, P, Na, K, Cl, Mg, S và nhóm những nguyên tố vi lượng: Fe, Cu,

Co, Zn, I, Cr

Trong các nguyên tố khoáng thì Ca và P là quan trọng và cần với lượng nhiều nhất Tuy nhiên, cũng phải đảm bảo cung cấp đủ các nguyên tố khác Vitamin còn gọi là sinh tố, đây chính là nhóm chất dinh dưỡng không thể thiếu được của đông vật Đa số các vitamin được tổng hợp từ thực vật, vi sinh vật và sự chuyển hóa của động vật mà động vật thu được trong khẩu phần ăn hàng ngày

Theo Đào trọng Đạt - Phan Thanh Phượng (1996) [01], trong đường ruột và dạ dày thường xảy ra hoạt động của vi sinh vật phức tạp liên quan đến sự phân giải các chất dinh dưỡng Các chất hydratcacbon của thức ăn dưới sự tác động của vi khuẩn lactic sẽ

bị phân giải tạo thành axit lactic, axit axetic, propionic (cùng một số axit béo khác và khí

CO2, NH4, H2S) Ngoài ra, một số vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh vitamin nhóm B

như Bacillus subtilis, Bacillus clausii, …

Các loại vitamin được tổng hợp sẽ vào môi trường xung quanh hoặc được giữ lại trong cơ thể vi khuẩn Ngoài ra vi khuẩn còn tổng hợp được vitamin B5 (a nicotinic)

Trong quá trình phát triển bình thường, ở đường ruột của gia súc có nhiều loại vi khuẩn nhất là vi khuẩn sinh ra axit lactic và một số cầu khuẩn đường ruột đối kháng

mạnh với vi khuẩn phó thương hàn, với Proteusvulgaris và các vi khuẩn sinh thối rữa

Có sự đối kháng này là nhờ hoạt tính của axit lactic đã có tác dụng ngăn sự hoạt động của nhiều loại vi khuẩn đường ruột đã sinh ra các chất kháng sinh ức chế được sự phát triển của những vi trùng gây bệnh

Hoạt động của hệ sinh vật trong đường tiêu hóa của lợn:

Khoang miệng là bộ phân đầu tiên của đường tiêu hóa, tiếp xúc trực tiếp với thức

ăn, nước uống và môi trường bên ngoài, do đó sự cảm nhiễm vi sinh vật rất lớn thức ăn trong khoang miệng và biểu bì tróc ra là môi trường rất tốt cho vi sinh vật tồn tại và phát triển

Theo Đào trọng Đạt - Phan Thanh Phượng (1996) [01], trong khoang miệng của động vật bình thường có thể xác đinh được một số nhóm vi sinh vật chủ yếu sau: Cầu

khuẩn (Micrococcus, Staphilococcus, Streptococcus), trực khuẩn gram (+) (trực khuẩn lactic); trực khuẩn gram (-) (E coli, Proteus Vugaris, Pasteurella), xoắn khuẩn (Leptospira), xạ khuẩn (Actimomyces), nấm men (Candida abucans)

Trong dạ dày lợn có một lượng axit rất lớn (0,2%) nó ức chế sự phát triển của một

số loại vi khuẩn, do vậy phần lớn vi sinh vật từ thức ăn, nước uống đưa vào bị tiêu diệt Tuy nhiên, trong dạ dày lợn vẫn có một số loại vi sinh vật có sức đề kháng với axit hoặc

một số nhóm ưa axit có thể tồn tại và phát triển như nhóm Lactobacter, trực khuẩn có nha bào, trực khuẩn cỏ khô (Bacillus subtilis), một số loài Streptococcus Đặc biệt một số

vi khuẩn gây bệnh có thể tồn tại và gây bệnh khi bị nhiễm vào dạ dày như Streptococcus suis Các trực khuẩn ở ruột và dạy dày (như trực khuẩn phó thương hàn Salmonella) có

thể qua dạ dày mà không bị tiêu diệt

Ruột non chiếm 3/5 đến 2/3 chiều dài ruột nhưng số lượng vi khuẩn lại rất ít Do dịch dạ dày vào ruột non vẫn còn tác dụng sát khuẩn, dịch mật, tụy, dịch ruột có tác dụng

khử khuẩn (nhất là dịch không tràng) Vi khuẩn ở ruột non chủ yếu là E coli, cầu khuẩn, trực khuẩn có nha bào, Aerobacter, Acrogeles Ở gia súc non có thêm Streptococcus lactic, trực khuẩn lactic, Lactobacteri um bulgaricum [07]

Số lượng vi sinh vật ở ruột già tăng lên nhiều do tác dụng khử khuần ở ruột già không còn mà điều kiện trong ruột già lại thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật Hệ

vi sinh vật chủ yếu trong ruột già gồm: trực khuẩn ruột già (E coli), cầu khuẩn ruột (Enterococcus), trực khuẩn có nha bào Gia súc trưởng thành số lượng E coli tới 75% hệ

vi sinh vật ruột già Ở ruột già còn có các vi khuẩn gây bệnh nhưng chưa thể hiện bằng

triệu chứng lâm sàng như: Phó thương hàn, uốn ván, Brucella những vi khuẩn này theo

phân ra ngoài và là yếu tố làm lây lan bệnh, cho nên phải xử lý phân để diệt vi khuẩn gây bệnh

Nhiều công trình nghiên cứu của nhiều tác giả khác đầu thế kỷ này cho rằng, quần thể vi sinh vật tiêu hóa của súc vật rất phong phú trong trạng thái cân bằng của cơ thể và những loài vi sinh vật chính trong quần thể đó được xác định như sau:

- Nhóm hệ phổ chính: > 90%, phần lớn là những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, phần

lớn là Basiclobacterium/Lactobacillus sản sinh axit lactic Bacteriodaceae, Eubacterium

sản sinh ra axit béo bay hơi

- Nhóm hệ phổ vệ tinh: < 1% vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc: E coli, Enterococcus

- Nhóm hệ phổ còn lại: (< 0,01 %): Clostridium, Proteus, Pseudomnas, Staphynococcus, nấm men thuộc chi Candida cũng thường gây bệnh tùy tiện hoặc không

gây bệnh khác

Sự cân bằng của quần thể sinh vật đóng góp nhiều cho động vật chủ, tất cả những rối loạn của sự điều tiết sinh học đó xảy ra vào những giai đoạn chăn nuôi nhất định, thường biểu hiện thành tai biến bệnh học hay là mắc bệnh Sự cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa phụ thuộc mối quan hệ thức ăn, quá trình chăm sóc, sức khỏe vật nuôi Khi cơ thể gặp những tác động tấn công khác, sự sai sót về chế độ dinh dưỡng, mọi sự mất cân bằng đột ngột về dinh dưỡng hay sai sót trong dùng thuốc điều trị nhất là kháng sinh hoặc trong trường hợp bệnh mà các đáp ứng miễn dịch bị thay đổi thì hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị mất cân đối gây ra rối loạn tiêu hóa Nếu nội tại vi sinh vật bị phá vỡ, khả năng kháng nhiễm bị yếu hoặc mất hoàn toàn thì các vi sinh vật sẽ sinh độc lực và gây bệnh

Vì vậy, sự tác động qua lại giữa hệ vi sinh vật đối kháng hay hiệp đồng thì sẽ tạo lên sự bền vững và cũng có thể loại bỏ được chủng khác hoặc ngăn cản được sự phát triển của bất kỳ chủng vi khuẩn nào xâm lấn Hiệu quả của hàng rào vi sinh vật cũng có tác dụng tới những vi khuẩn không gây bệnh khi chúng được đưa vào đường tiêu hóa với

khối lượng lớn qua thức ăn

1.2 Vi sinh vật và quá trình xử lý chất thải hữu cơ

1.2.1 Vi sinh vật phân hủy hợp chất hữu cơ

Từ thời cổ xưa, con người đã biết sử dụng vi sinh vật để phục vụ đời sống như: muối dưa, làm tương, ủ rượu vang… Tuy nhiên, cho đến khi nhà bác học người Pháp L Pausteur (1822-1895) tìm ra nguyên nhân lên men và một loạt các công trình khoa học

về vi sinh vật được nghiên cứu có kết quả thì việc ứng dụng vi sinh vật vào sản xuất mới phát triển mạnh và trở thành một ngành công nghiệp phục vụ đời sống con người Trong

tự nhiên, vi sinh vật với những đặc tính ưu việt sẵn có vẫn hàng ngày, hàng giờ đang chuyển hóa các chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất trung gian và những hợp chất đơn giản hơn Do vậy, hệ vi sinh vật tự nhiên có thể xem như là một nhà máy xử lý ô nhiễm khổng lồ Các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu để khai thác và ứng dụng những lợi thế của vi sinh vật và tạo điều kiện tốt nhất cho chúng phát triển trong những điều kiện và quy mô có kiểm soát, từng bước bắt chúng phục vụ cho hoạt động sống của con người

Nhóm vi khuẩn lactic: đây là nhóm vi sinh vật có khả năng sinh các chất kháng

khuẩn, sinh axit làm giảm độ pH, có khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn

gây bệnh trên bề mặt, cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh… đây là những tác nhân giúp cho nhóm vi khuẩn lactic có được hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi

khuẩn gây bệnh như E coli, Salmonella là nhóm vi khuẩn gây rối loạn tiêu hóa, ảnh

hưởng trực tiếp đến sự phát triển của vật nuôi có nhiều trong ruột và trong phế thải của động vật nuôi Vi khuẩn lactic định hướng quá trình trao đổi chất theo hướng không gây

thối, góp phần làm trong sạch và khử mùi xú uế của môi trường

Vi khuẩn Bacillus: Bacillus spp còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực

khuẩn cỏ, là một loại vi khuẩn Gram dương, catalase dương tính Thuộc chi Bacillus có

hình que, có khả năng tạo bào tử, chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt Ngoài

ra, Bacillus còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh

trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh như: Bacitracin, Bacilysin, Baxilomicin (A,B,C,R), Bacillopectin, Mycobacillin, Subtilin (A,B,C), Prolimicin (Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, 2007)

Tính ổn định cao của Bacillus trong điều kiện môi trường khắc nghiệt làm cho vi sinh vật

trở thành một trong những ứng cử viên hoàn hảo cho các ứng dụng chế phẩm sinh học

hoặc trong thực phẩm, đồ uống, khử trùng Cụ thể, Bacillus có khả năng sản sinh nhiều enzyme, nhưng quan trọng nhất là amylase và protease; Bacillus có khả năng sinh tổng

hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram(-), Gram(+) và nấm gây bệnh Trong ứng dụng

xử lý chất thải chăn nuôi, mùi hôi chăn nuôi, Bacillus còn được biết đến với vài trò

chuyển hóa các chất giàu đạm thành các acid amin, không phân giải các chất này theo con đường chuyển hóa thành chất độc gây mùi (NH3, H2S, NO2, NO3…) (S Ji, W Li, H Xin, S Wang, và B Cao, 2007)

Nấm men Saccharomyces cerevisiae: Tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5 - 14 µm, sinh sản

bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30 - 32oC, pH tối ưu 5,5 Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH 1,7 trong H3PO4, pH 1,8-2 trong acid hữu cơ Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn carbon, chúng sử dụng axit amin và muối amon như nguồn nitơ Nấm men thường được sử dụng làm men bánh mì, lên men rượu, bia và hiện còn được sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản nhờ có khả năng chịu được axit dạ dày và muối mật tốt, đề kháng tự nhiên với kháng sinh Ngoài ra, nấm men còn được biết đến với vai trò khử kim loại nặng nên có thể xử

4,5-lý chất thải rắn trong phân gia súc, xử 4,5-lý nước…

Trong chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi với thành phần đa chủng vi sinh vật thì nấm men cung cấp thức ăn cho các vi sinh vật khác, đồng thời kích thích hoạt động một

số enzyme, làm tăng khả năng tiêu hóa đường đa, trung hòa một số loại độc tố của vi sinh vật (A P Pereira, 2013)

Nấm men tuy không có một số đặc tính probiotic như các vi khuẩn lactic và

Bacillus, nhưng các chủng nấm men hữu ích tác động có lợi đối với vật nuôi qua một số

cơ chế sau: (i) kích hoạt một số enzym thuộc nhóm disacharridaza (surcraza, lactaza, maltaza) làm tăng khả năng tiêu hoá đường đa (Buts và ctv, 1986); (ii) trung hòa một số loại độc tố của vi khuẩn (Castagliuolo và ctv, 1998); (iii) kết dính một số vi khuẩn gây bệnh có roi bám vào biểu mô ruột nhờ các thụ quan mannose và loại chúng ra ngoài theo phân (Czerucka và ctv, 2002); (iv) kích thích hệ miễn dịch, tăng sản xuất IgA (Qamar et

al, 2001)

1.2.2 Quá trình xử lý chất thải hữu cơ

Phương pháp chuyển hóa các hợp chất ở dạng cao phân tử sang dạng thấp phân tử dựa trên hoạt động sống của các vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ hoặc

vô cơ làm nguồn năng lượng phục vụ cho chúng đồng thời cho vật chủ, các nhóm này bao gồm cả nhóm tự dưỡng và dị dưỡng, có thể tiến hành trong điều kiện hiếu khí, thiếu khí hay yếm khí

Những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng thường có cấu trúc cấu thành từ các nguyên tử cacbon, nitơ, lưu huỳnh, photpho hay kim loại nặng Quá trình phân giải hợp chất cacbon và nitơ là quá trình sinh hoá phức tạp thông qua hoạt động sống của vi sinh vật, nhờ đó mà một số lượng lớn các chất hữu cơ cao phân tử sẽ được phân giải thành các chất có khối lượng phân tử thấp, từ đó các vi sinh vật khác nhau chuyển hóa thành sinh khối tế bào, các khí (CO2, H2S, N2, NH4…) Các hợp chất hydratcacbon bao gồm (xenluloza, tinh bột, dextrin…) có nhiều trong nước thải của các cơ sở chế biến lương thực hay sản xuất rượu bia sẽ được những nhóm vi sinh vật đặc thù đảm nhận phân giải thành những tiểu phần nhỏ hơn để tế bào vi sinh vật có thể sử dụng cho các mục đích khác nhau, bao gồm: tạo sinh khối vi sinh vật, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất và các chất khí (N2, CO2)…, các axit hữu cơ như axit focmic, axit axetic, axit lactic… Để phân giải xenluloza, nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh ra các enzym hỗ trợ xúc tác quá trình phân giải xenluloza Cơ chế phân giải xenluloza như sau:

xenlulaza xenlobiaza

Xenluloza  Đường tan (xenlobioza)  Glucoza

Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, nó có mặt trong các hạt hoà thảo, củ, thân cây và lá cây Tinh bột gồm 2 cấu tử chính là amyloza (25%) và amylopectin (75%)

có nhiều trong nước thải của các cơ sở chế biến tinh bột, của các nhà máy bia, rượu Dưới tác dụng của một số loại vi sinh vật có khả năng sinh ra hệ enzym như amylaza, amylo–1,6–glucosidaza, glucoamylaza, tinh bột bị phân giải thành những chất đơn giản, chủ yếu là đường đơn và axit hữu cơ Quá trình phân huỷ đường đơn tiếp theo có thể được thực hiện theo những hướng sau:

- Phân huỷ đường đơn nhờ nhóm vi sinh vật lên men kỵ khí: Dưới tác dụng của một phức hệ enzym vi sinh vật, đặc biệt là của nấm men, các monosaccharit bị chuyển hoá thành rượu, axit lactic, glycerin… như sau:

Lên men rượu Glucoza  Ethanol + CO2Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện, khi có đủ oxy chúng hô hấp và quá trình lên men bị ức chế, dẫn tới sự tiêu thụ glucoza, hàm lượng ethanol và CO2 giảm và sinh khối tăng lên Quá trình được diễn ra theo phương trình:

C6H12O6 + 6O2 = 6CO2 + 6H2O + Q Ngược lại, khi không có đủ O2 hoặc ở điều kiện yếm khí, nấm men lên men mạnh nhưng lượng sinh khối không tăng nhiều Hoạt động của nấm men gây ra sự biến đổi cơ bản của quá trình chuyển hoá đường, chủ yếu là glucoza và fructoza thành rượu:

C6H12O6 = 2C2H5OH + 2CO2 + 33 Kcal Năng lượng sinh ra phục vụ cho các hoạt động sống của tế bào nấm men hoặc bị tổn thất dưới dạng nhiệt Khi lên men rượu, nhiệt độ của dịch lên men tăng mạnh, đôi khi tăng đến 10oC so với nhiệt độ ban đầu Chính quá trình sinh ra rượu của nấm men đã hạn chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây hại có trong nước thải, đồng thời rượu là nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi sinh vật lên men lactic và axetic tạo ra môi trường pH axit hạn chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh Các quá trình lên men rượu còn

có sự tạo thành diaxetil, axetoin, glyxerin và các chất thơm Các hợp chất chứa nhóm cacbonnyl của sản phẩm lên men như aldehyt, xeton, axit cacboxylic, các este, đó là những nhân tố tạo hương thơm giúp làm giảm bớt mùi thối sinh ra nhóm vi khuẩn phân hủy protein Do vậy, tại những nơi xử lý chất thải có mặt của những nhóm vi sinh vật này sẽ giúp cho quá trình giảm mùi khó chịu rất rõ ràng

Ngoài ra, glucoza còn được nhóm vi khuẩn lactic sử dụng, chuyển hóa theo con đường tổng quát:

Lên men lactic Glucoza  Axit lactic

Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hoá cacbonhydro Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic phân

bố rất rộng rãi, chúng có mặt trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm; trên bề mặt rau, củ, quả, thịt, cá, tôm Đặc biệt trong các sản phẩm muối chua như dưa cà muối, mắm tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi khuẩn lactic Vì vậy, vi khuẩn lactic còn tồn tại trong hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy chế biến thực phẩm và nông sản khác

Quá trình lên men hiếu khí phân giải triệt để hydratcacbon, glucoza và các monosaccharit khác tạo sản phẩm cuối cùng là sinh khối, CO2 và H2O

Sự phân huỷ các chất hữu cơ khác (nitơ, lipid, photpho, lưu huỳnh):

+ Phân huỷ nitơ:

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axit amin Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptid (gọi là chuỗi polypeptid) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein Protein có khối lượng phân

tử tương đối lớn và thay đổi trong một dải rộng từ mười nghìn đến hàng trăm nghìn dalton Các phân tử lớn này có thể có dạng cầu hoặc dạng sợi Các protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hóa học Thuộc nhóm này

có hầu hết protein có hoạt tính xúc tác như hemoglobin, albumin Protein hình sợi tương đối trơ về mặt hóa học, chủ yếu có chức năng cơ học ví dụ như colagen của da, xương, sụn; keratin của tóc lông, miozin của cơ…

Muốn phân giải protein, đầu tiên các vi sinh vật phải tiết ra các enzym phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hóa các protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn,

đó là các polypeptid và olygopeptid Sau đó các chất này tiếp tục được thủy phân thành axit amin nhờ các peptidase ngoại bào hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới được chuyển hóa thành các axit amin nhờ sự tham gia của các nhóm vi sinh

vật sinh có khả năng sinh proteaza như Bacillus, Pseudomonas Một phần các axit amin

này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác Quá trình chuyển hóa tiếp tục thành phần NH3 trong nước thải sẽ dẫn tới một phần tái cấu trúc trong phân tử protein mới (do năng lực đồng hóa muối

NH4+ và NO3- của hầu hết các loài vi sinh vật), một phần tích tụ làm tăng hàm lượng

NO2- hay NO3- (vi khuẩn Nitromonas chuyển thành nitrit (NO2-) và từ NO2- chuyển thành nitrat (NO3) nhờ vi khuẩn Nitrobacter) và một phần sẽ chuyển hóa đến sản phẩm cuối

cùng là nitơ phân tử (do các loài vi khuẩn phản nitrat hóa tạo ra)

+ Phân giải lipid:

Lipid được nhiều loại vi sinh vật sử dụng làm nguồn thức ăn cacbon và nguồn năng lượng Để sử dụng nguồn năng lượng này, lipid sẽ bị các vi sinh vật phân giải thành các glycerol và axit béo dưới tác dụng của lipase Sau khi được phosphoryl hóa, glycerol

sẽ được tiếp tục được oxy hóa thành dihydroxyacetone phosphat và bị phân giải trong con đường đường phân Trong khi đó các axit béo trừ triaxylglycerol thường bị oxy hóa trong con đường β – oxy hóa sau khi chuyển thành các este của coenzyme A Trong chu trình này, các axit béo bị phân giải thành acetyl – CoA, sau đó acetyl – CoA đi vào chu trình Krebs Kết thúc quá trình này, lipid bị phân hủy thành CO2 và H2O

+ Phân huỷ photpho:

Trong quá trình xử lý nhờ vi sinh vật, lượng photpho hao hụt do được vi sinh vật hấp thu để xây dựng tế bào Vi sinh vật và nhiều cơ thể sống sử dụng phosphat đơn (orthophotphat) để tạo ra các hợp chất hữu cơ chứa photphat trong các tế bào: trong axit nucleic, photpho lipid, adenosin triphotphat, hormon Canxi photphat là thành phần cơ bản của xương Hàm lượng phospho trong tế bào chiếm khoảng 20% (từ 1 – 2,5% khối lượng khô) Trong quá trình xử lý hiếu khí, một số loại vi sinh vật có khả năng hấp thu photphat cao hơn mức bình thường trong tế bào sinh vật (2 – 7%), lượng phospho dư được vi sinh vật dự trữ để sử dụng về sau Trong điều kiện kỵ khí, với sự có mặt của chất hữu cơ, lượng phosphat dư lại được thải ra ngoài cơ thể vi sinh dưới dạng photphat đơn Một vài loại tảo cũng có khả năng tích trữ một lượng phosphat dư so với nhu cầu của tế bào

Có rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải photpho khó tan và tích lũy

phospho Chúng chủ yếu thuộc hai chi Bacillus và Pseudomonadales Ngoài ra còn có các loài vi khuẩn: Alcaligenens, Achromobacter, Brevibacterium, Micrococcus,… cũng

có khả năng này

+ Phân huỷ lưu huỳnh:

Trong điều kiện kỵ khí hay vi hiếu khí, vi sinh vật thường phân huỷ các hợp chất chứa lưu huỳnh (có trong protein, axit amin, muối vô cơ) và giải phóng H2S Đồng thời,

H2S cũng được sinh ra do hoạt động của các vi khuẩn khử sulfat

1.3 Chế phẩm vi sinh vật

Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, người ta hướng vào việc phân lập và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đưa vào đường ruột, nâng cao sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đường ruột cho người, động vật nuôi, nhất là trẻ sơ sinh, người già và thú non

Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nước khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của người và vật nuôi như: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,

Vi sinh vật đường ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong khẩu phần như: carbonhydrate, protein, lipid thành những chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng như: amylase, protease, cellulase Nhóm này gồm những vi sinh vật: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas, Lactobacillus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, [12] Theo một số

nghiên cứu của Feng et al, 2015 [11], việc bổ sung nhóm vi khuẩn lactic vào trong khẩu phần thức ăn đã hạn chế việc sử dụng kháng sinh được bổ sung, tăng cường hệ miễn dịch Việc sử dụng các loại vi khuẩn lactic với một số nhóm nhất định, trong một thời điểm sẽ đem lại hiệu quả cao

Ngoài ra, việc bổ sung chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà

thịt làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hưởng phần nào lên sức

đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất [05] Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B như B1, B2, B6, B12 và vitamin K ở manh tràng và đại tràng Bản thân tế bào nấm men có chứa một lượng dinh dưỡng rất cao bao gồm: protein, lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B, có tác dụng cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng

Theo Pavla et al, 2015 [14], probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác dụng

trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E coli, có thể làm giảm hoạt tính urease

trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy một số chất có

độc tính như các nhóm vi khuẩn Bacillus, tạo thành những dẫn xuất không độc Nhiều

nghiên cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc được sinh ra trong quá trình tiêu hóa như: indol, skatol, phenol, Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic

không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trường

Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể Đặc tính quan trọng nhất của một đường tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột Việc bổ sung các nhóm vi sinh vật có lợi giúp duy trì hệ vi sinh vật đường ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng

Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất dinh dưỡng và khối lượng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Nhiều nghiên cứu

chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh như E coli, Salmonella typhimurium [10,13] Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây

bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng, giúp chuyển hóa thức ăn được hiệu quả hơn, chất thải sẽ bớt mùi

Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của probiotic Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do chúng tạo

ra như: bacteriocin, axit hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng Các axit axetic và lactic làm giảm pH đường ruột khiến môi trường

đường ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh như E coli, Salmonella Một số bacteriocin thường gặp như: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra), nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm Penicillium sinh ra), Lactobacillus acidophillus cũng tạo ra lactacin B và acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh

[16]

Yếu tố được xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào giúp loại bỏ các tế bào gây bệnh, các loại vi sinh vật gây nhiễm khuẩn Shengfa & Martin, 2017 [15], cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó mà thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột

Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp

vi sinh vật có lợi cho đường ruột ở nước ta không ngừng phát triển Kết quả của các nghiên cứu tìm hiểu ảnh hưởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế được ứng dụng trong chăn nuôi ngày càng rộng rãi Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia: Sữa

chua và canh trùng B subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con (Đào

Trọng Đạt và Vũ Đình Hưng, 1962); Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đường ruột trên gia súc (Lê Thị Tài và ctv, 1968 - 1978) Chế phẩm chứa

Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn con (Phan Thanh

Phượng và ctv, 1979 - 1984); Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm

chế phẩm Subcolac (Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm tỉ lệ tái

phát cho bệnh tiêu chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con) Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl

(Bacillus subtilis) đã sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên người và

gia súc

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

- Mẫu: Thu thập mẫu từ chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn giống Yorkshire và lợn Móng Cái tại huyện Gia Lâm, Hà Nội

- Vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella sp được sử dụng làm chủng vi khuẩn

kiểm định nhận từ Viện Công nghệ sinh học

2.1.3 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe), g/l: Pepton 10; Cao thịt 10; Cao men 8; Axetat Natri 5; Dipotassium hydrogen phosphate 2; D (+) Glucoza 20; Ammonium citrat 2; Sulfat Magiê 0,2; Sulfat Mangan 0,04; Tween 80 1 ml; Agar 20: Nước cất 1000ml; Thanh trùng ở 121oC trong 20 phút, pH = 6-6,5

- Môi trường MPA (Meat pepton agar) (nuôi vi sinh vật kiểm định), g/l: Cao thịt 5: Pepton 10; NaCl 5; Agar 20; Nước cất 1000 ml; Thanh trùng ở 121oC trong 20 phút;

pH = 7,0-7,2

- Môi trường hoạt hoá giống nấm men, g/l: Pepton 10; Cao men 3: Dipotassium hydrogen phosphate 3: D (+) Glucoza 30; Sulfat Magiê 3; Nước cất 1000ml: Thanh trùng

ở 121oC trong 20 phút, pH = 6-6,5

- Môi trường YPD (g/l): Cao men 20; Pepton 40; Glucose 40;

- Môi trường MT2(g/l): Dextrin 20; Cao nấm men 20; KH2PO4 01; MgSO4.7H2O 0,1; pH = 7

2.2 Phương pháp nghiên cứu

∆D = D-d (mm) D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

2.2.1.2 Định lượng axit lactic theo chuẩn độ Therner [17]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng hấp phụ màu của dịch axit lactic mà vi khuẩn sinh

ra với phenolphtalein Ta xác định được hàm lượng axit lactic của mẫu

Tiến hành: Lấy 10ml dịch lên men đã li tâm bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất

và thêm 2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o) Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại Ghi lại thể tích NaOH (ml) đã dùng Độ axit được tính như sau:

% axit lactic = VNaOHtiêu tốn × 0,009 (g/l)

2.2.1.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ Phương pháp như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã chứa vi khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 4oC trong 6 giờ, sau đó mang các đĩa thạch để 370C Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D

∆D = D-d (mm) D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

Khả năng sinh bacteriocin: dịch trong thu được sau li tâm được trung hòa bằng

NaOH 0,1N (mục đích trung hòa axit tạo thành), sau đó làm tiếp tục các bước như trên

để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn

2.2.1.4 Xác định hoạt tính enzym [7, 17]

- Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn: cấy chấm điểm trên đĩa Petri chứa môi trường khoáng có bổ sung các cơ chất khác nhau trong thời gian 48 giờ ở

oC như sau:

+ Bổ sung 1,0% cacboxyl metyl cellulose (CMC) (w/v)để xác định hoạt tính CMCase Hiện màu bằng dung dịch Lugol (KI 5% (w/v) và I2 10% (w/v)), đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch

+ Bổ sung 1,0% tinh bột tan (w/v) để xác định hoạt tính amylase Hiện màu bằng dung dịch Lugol, đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch

+ Bổ sung 1,0% casein (w/v) để xác định hoạt tính protease Hiện màu bằng dung dịch acid tricloaxetic 50% (w/v), đo đường kính vòng phân giải trên đĩa Petri thạch

- Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ trên đĩa Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ dịch enzym vào các lỗ đã đục, để ở 37o

C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol để vòng phân giải cơ chất hiện rõ Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường kính vòng ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch

2.2.1.5 Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa [18, 23]

- Vi khuẩn và nấm men được thu tại giữa pha log từ môi trường dịch thể tương ứng bằng ly tâm (6000 vòng/phút/15 phút) sau đó rửa 2 lần với đệm PBS

- Tế bào được huyền phù lại trong môi trường dịch thể (MRS cho vi khuẩn lactic,

MP cho Bacillus, YPD cho nấm men) trước khi tiến hành cho bám dính đạt mật độ 4 x

- Rửa tế bào: Rửa mẫu ruột sau khi ủ lần 1 với 2 thể tích muối sinh lý 1%

Rửa 3 lần với 2 thể tích đệm PBS, thu lấy dịch rửa 3 lần, đếm tế số lượng tế bào bám dính trên mẫu

2.2.1.6 Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với một số thành phần có hoạt tính trong khẩu phần ăn

Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch thể tương ứng (MRS

cho vi khuẩn lactic; thạch thường cho vi khuẩn Bacillus và YPD cho nấm men) nhưng có

bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn một số loại khoáng CuSO4 (250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm

axit lactic axit, axit formic, axit citric ) với liều 200mg/lít Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ ấm (37oC) Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48 giờ

2.2.2 Phương pháp phân lập

2.2.2.1.Vi khuẩn lactic

Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước vô trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện vi hiếu khí Nuôi ở 37oC trong 48 giờ Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong) Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng Mỗi mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới kính hiển vi

2.2.2.2 Vi khuẩn Bacillus

Mẫu trước khi pha loãng ở nồng độ tương tự như phân lập vi khuẩn lactic được xử

lý ở nhiệt độ 80oC/30 phút, sau khi pha loãng, dịch mẫu được gạt trên đĩa Petri chứa môi trường thạch thường Nuôi ở 37oC trong 48 giờ Tách và thuần khiết các khuẩn lạc tạo thành

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân

loại vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh

và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram

âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến

sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung chúng

sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào

Tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy dịch huyền phù tế bào vi khuẩn đặt lên

phiến kính Cố định tiêu bản bằng ngọn lửa rồi nhuộm thuốc đầu bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút Rửa bằng nước Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút Rửa bằng nước Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95% : axeton (1:1) trong khoảng 1 phút Lại rửa bằng nước Sau đó nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ (như Safranin hay Fuchsin Ziehl) trong 30 giây - Rửa qua nước, để khô, soi kính

2.2.4.2 Xác định khả năng đồng hóa các loại đường

1% các loại đường sử dụng thay cho glucoza trong môi trường MRS (vi khuẩn

lactic), MP (vi khuẩn Bacillus): L-arabinoza, riboza, Xyloza, fructoza,

D-mannoza, D-mannitol, D-sorbitol, lactoza, trehaloza, raffinoza, Na-gluconat Môi trường được chia vào các ống nhỏ Cấy vi sinh vật, để 2 -3 ngày Đối chứng dương được cấy trên môi trường chứa glucoza, đối chứng âm được cấy trên các môi trường không chứa nguồn đường nào

2.2.4.3 Thử khả năng lên men nguồn đường glucoza (chỉ với vi khuẩn lactic)

Nguyên tắc: Việc phát triển trên môi trường với các hợp chất này có thể làm dẫn

đến việc tích luỹ các axit hữu cơ, các sản phẩm trung hoà, các loại khí

Cách tiến hành: Sử dụng môi trường dịch thể (Glucoza - 2%) Cho vào mỗi ống

nghiệm 2ml môi trường cơ sở và 1 ống Durham để ngược Khử trùng ở 121oC/15 phút

Bổ sung 100l dịch vi khuẩn vào mỗi ống, nuôi cấy trong 1-2 ngày Quan sát khả năng sinh khí CO2, nếu sinh khí là lên men dị hình và ngược lại là lên men đồng hình

2.2.4.4 Phản ứng catalaza (chỉ với vi khuẩn lactic)

Phần lớn các chủng vi khuẩn lactic có phản ứng catalaza âm tính nhưng đặc biệt

có một số loài thuộc chi Pedioccocus lại có phản ứng catalaza dương tính gọi là

“Catalaza giả” như P pentosaceus do chúng không nhảy cảm với cyanide và azide và

không chứa một nhóm giả của Haem (C34H3204N2Fe)

Tiến hành: Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn, quan sát sự xuất hiện bọt khí bằng mắt thường

- Tách DNA tổng số của vi khuẩn: DNA tổng số của vi khuẩn được tách theo phương pháp được mô tả bởi Sambrook (Sambrook, 2001) [24] Tách DNA tổng số của nấm men phương pháp của Kurtman và Fell (1988) [20]

- Khuếch đại gen: Trình tự gen 16S rDNA của vi khuẩn và nấm men 5,8 S bằng

- Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt:

Nhiệt độ Thời gian

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 % Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy máy đọc trình tự tự động ABI

PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.5 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.2.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0, trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 40; 45oC

2.2.5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Tương tự như trên, các chủng vi sinh vật cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt giữ 37o

2.2.6 Thử nghiệm và đánh giá hiệu quả của chế phẩm

- Trộn vào thức ăn của lợn: 3g chế phẩm/kg thức ăn khô

- Đối tượng thử: lợn con, lợn nái, lợn thịt tại 3 hộ chăn nuôi thuộc xã Trọng Quan, huyện Đông Hưng, tỉnh Thái Bình

- Thời gian sử dụng: 15 ngày

- Đánh giá kết quả: người sử dụng điền vào phiếu đánh giá, phỏng vấn người sử dụng, có đại diện chính quyền địa phương đi cùng và xác nhận

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích

3.1.1 Phân lập

Sau khi thu thập các mẫu từ đường ruột non của lợn, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật tồn tại trong đó Với mong muốn thu nhận được các vi sinh vật có đặc tính phân hủy tốt hợp chất hữu cơ và probiotic nên chúng tôi tập trung phân lập ba

nhóm vi sinh vật: vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men

Trên các môi trường đặc trưng cho từng nhóm vi sinh vật đã phân lập được 31 chủng vi sinh vật (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau

Bacillus Nấm

men Ruột non của lợn giống

Yorkshire

Trong đó, từ chất chứa trong ruột non của lợn đã phân lập được 10 chủng vi

khuẩn lactic, 15 chủng Bacillus và 6 chủng nấm men Các chủng vi sinh vật sau khi phân

lập được giữ trong ống nghiệm môi trường (MRS, MPA và YPD) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu

ở - 80oC nhằm giữ được giống trong thời gian dài

Vi khuẩn lactic Vi khuẩn Bacillus Nấm men

Hình 3.1 Kết quả xác định số lượng vi sinh vật có trong mẫu trên một số môi trường đặc

trưng sau 48 giờ nuôi ở nhiệt độ 30C

3.1.2 Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic và phân hủy hợp chất hữu cơ

Trong môi trường đường ruột của lợn có chứa nhiều chủng loại vi sinh vật và điều kiện“ khắc nghiệt“, nên để tồn tại được thì vi sinh vật đó phải thích nghi với môi trường axit, chịu muối mật, cạnh tranh với vi sinh vật khác Ngoài ra, để giúp vật nuôi tiêu hóa tốt và giảm thiểu ô nhiễm của chất thải ra thì vi sinh vật phải có khả năng phân hủy tốt hợp chất hữu cơ trong thức ăn Do vậy, đề tài tiến hành tuyển chọn những chủng vi sinh vật mang đặc tính mong muốn theo thế mạnh của từng loài

3.1.2.1 Vi khuẩn lactic

a) Khả năng sinh axit lactic

10 chủng vi khuẩn lactic đã phân lập được nuôi cấy chấm điểm môi trường MRS

có bổ sung CaCO3 hàm lượng 5g/l Kết quả tuyển chọn và đặc điểm nuôi cấy các chủng

vi khuẩn có khả năng sinh axit được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2

A B Hình 3.2 Khả năng phân hủy CaCO3 (A) và sự phát triển trên môi trường đặc (B)

của chủng vi khuẩn lactic AH3

Bảng 3.2 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit Khả năng sinh axit Số lƣợng chủng Tỷ lệ (%)

b) Khả năng sản sinh bacteriocin

Một trong những đặc tính quan trọng nhất làm căn cứ tuyển chọn các chủng vi khuẩn là khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định Do vậy, đã tiến hành kiểm tra khả năng

kháng 2 chủng vi khuẩn E coli và Salmonella sp của 10 vi khuẩn lactic

Bảng 3.3 Khả năng sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định của 10 chủng vi

khuẩn lactic (được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn - ∆D, mm)

STT Ký hiệu chủng Vi khuẩn kiểm định (∆D, mm*)

STT Ký hiệu chủng Vi khuẩn kiểm định (∆D, mm*)

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, trong số 10 chủng, số chủng có hoạt tính kháng cả 2

chủng vi khuẩn Salmonella và E coli là 02 chủng, số chủng có khả năng kháng 1 chủng

là E coli là 5 chủng và số chủng có khả năng kháng Salmonella sp là 5 chủng. Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm định của các chủng rất khác nhau Vòng kháng khuẩn (đối với cả 2 loại vi khuẩn kiểm định) có đường kính lớn thuộc về các chủng có kí

hiệu AH3 và AH4 (D-d 10mm)

Hình 3.3 Hoạt tính kháng của các chủng lactic đối với chủng vi khuẩn kiểm định E coli

Vì vậy, 02 chủng AH3 và AH4 sinh bacteriocin kháng cả 2 loại vi khuẩn kiểm định được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2.2 Vi khuẩn Bacillus

a) Khả năng sản sinh enzyme ngoại bào phân hủy hợp chất hữu cơ

Tổng số 15 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được, đã được nuôi cấy chấm điểm

trên môi trường MPA có bổ sung thêm cơ chất khác nhau (tinh bột, xenluloza, casein), nuôi ở nhiệt độ 37o C trong 48 giờ (hình 3.4) Sau đó được nuôi trên môi trường lỏng có

bổ sung thêm cơ chất 0,5%, sau 48 giờ nuôi lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 37C, ly tâm

8000 vòng trên phút ở nhiệt độ 4C trong thời gian 5 phút Nhỏ dịch nuôi vào lỗ thạch (môi trường chứa cơ chất 1% + agar), ủ qua đêm, rồi nhuộm bằng thuốc thử Lugol và công gô đỏ 0,5%, đo vòng phân giải Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và hình 3.5

Hình 3.5 Khả năng sinh enzym ngoại bào có trong dịch sau lên men của các chủng vi

khuẩn Bacillus trên môi trường có chứa cơ chất (1)-casein; (2)-xenluloza, (3)- tinh bột

Các chủng có hoạt tính enzym mạnh và trung bình (D-d ≥8mm) với cả 3 cơ chất (15 chủng) được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo Khả năng sinh enzym của 15

chủng Bacillus được lựa chọn được trình bày trong bảng 3.5 Kết quả ở bảng 3.5 trên cho

ta thấy cả 15 chủng vi khuẩn Bacillus được lựa chọn thì hoạt tính enzym amylaza,

xenlulaza và proteaza mạnh nhất thuộc về 2 chủng, bao gồm chủng H9 và H11

Bảng 3.5 Khả năng phân giải cơ chất của một số chủng vi khuẩn Bacillus

Kí hiệu chủng Vòng phân giải cơ chất (D-d, mm)

Tinh bột Xenluloza Protein (casein)

b) Khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định

Từ 15 chủng có hoạt tính enzym ngoại bào được lựa chọn để đánh giá tiếp hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định Các kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của 15

chủng vi khuẩn Bacillus được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.6

A B C Hình 3.6 Hình thái của các chủng vi khuẩn (A) và khả năng đối kháng với chủng vi

khuẩn Salmonella sp (B) và E coli (C)