Nghiên cứu xây dựng mô hình in silico dự đoán tác dụng ức chế bace 1 và ache trong sàng lọc tìm kiếm ứng viên thành thuốc chữa bệnh alzheimer

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT Amyloid precursor protein protein tiền chất amyloid Acid aspartic Amyloid- β β-site amyloid cleavage enzyme 1 hay β -secretase Cơ sở dữ liệu Genetic Algor

CHỮA BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới

người thầy của tôi - TS Phạm Thế Hải, giảng viên Bộ môn Hóa Dược, Đại học Dược Hà

Nội – người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo tôi từ những bước đi chập chững đầu tiên trên con đường nghiên cứu khoa học và trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận Thầy không những là người truyền cảm hứng khoa học cho tôi, mà thấy còn dạy cho tôi những kiến thức sâu rộng và phương pháp làm việc đầy hiệu quả, đưa ra những lời khuyên rất hữu ích với tôi trong định hướng phát triển bản thân khi làm nghiên cứu khoa học

Tôi cũng vô cùng biết ơn và xin được chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa dược đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được nghiên cứu, học tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn ủng hộ tôi trên mọi con đường tôi đã chọn, cũng là những người đã luôn sát cánh và cho tôi những góp ý chân thành trong quá trình hoàn thiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành quá trình học tập cũng như hoàn thiện quá trình bảo vệ khóa luận này

Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer 3

1.1.1 Bệnh Alzheimer 3

1.1.2 Thuốc điều trị Alzheimer hiện nay 6

1.1.3 Tổng quan về Enzym acetylcholinsterase 7

1.1.4 Tổng quan về Enzym beta-secretase 9

1.2 Mô hình in silico 11

1.2.1 Thuật ngữ in silico 11

1.2.2 Mô hình QSAR 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng mô hình QSAR 17

2.3.2 Ứng dụng mô hình đã xây dựng sàng lọc các phân tử có khả năng ức chế trên cả 2 đích AChE và BACE-1 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 22

3.1 Xây dựng mô hình QSAR dự đoán tác dụng ức chế AChE 22

3.1.1 Quá trình tối ưu hóa mô hình 22

3.2 Xây dựng mô hình QSAR dự đoán tác dụng ức chế BACE-1 26

3.2.1 Quá trình tối ưu hóa mô hình 26

3.2.2 Đánh giá mô hình 28

3.3 Kết quả sàng lọc 31

3.3.1 Sàng lọc các chất có tác dụng ức chế AChE 32

3.3.2 Sàng lọc các chất có tác dụng ức chế BACE-1 33

3.3.3 Sàng lọc các hợp chất có khả năng ức chế đồng thời cả 2 đích 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 38

4.1 Về kết quả xây dựng mô hình QSAR 38

4.2 Về kết quả sàng lọc 38

4.3 Ưu điểm của phương pháp nghiên cứu 39

4.4 Hạn chế của phương pháp nghiên cứu 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Amyloid precursor protein (protein tiền chất amyloid) Acid aspartic

Amyloid- β

β-site amyloid cleavage enzyme 1 hay β -secretase

Cơ sở dữ liệu Genetic Algorithm (Thuật giải di truyền) Glutamic acid

Glycin Histidin The half inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%, thường dùng đối với các chất ức chế enzym, chất đối vận receptor, …)

Linear discriminant analysis (Phân tích sự khác biệt tuyến tính) Monoamine oxidase B

Multiple Linear Regression (Hồi quy tuyến tính đa biến) N-methyl-D-aspartate

Platelet-activating factor (Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu) Vùng ngoại biên của enzyme acetylcholine esterase Phenylalanin

Prediction set (Tập dự đoán) Quantitative structure-activity relationships (Quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học)

Serine

Tyrosin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các phần mềm tính tham số phân tử thông dụng

Bảng 3.1 Các mô hình tốt nhất thu được sau quá trình tối ưu hóa sử dụng thuật giải di

truyền (AChE)

Bảng 3.2 Các TSPT trong mô hình (M1) và ý nghĩa

Bảng 3.3 Các mô hình tốt nhất thu được sau quá trình tối ưu hóa sử dụng thuật giải di

truyền (BACE-1)

Bảng 3.4 Các TSPT trong mô hình (N1) và ý nghĩa

Bảng 3.5: Danh sách 15 hợp chất tốt nhất được dự đoán

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase

Hình 3.5 Kiểm tra các chất nằm ngoài vùng xác định của AChE

Hình 3.6 Sắp xếp các hoạt chất theo thứ tự giảm dần hoạt tính ức chế AChE

Hình 3.7 Kiểm tra các chất nằm ngoài vùng xác định của BACE-1

Hình 3.8 Sắp xếp các hoạt chất theo thứ tự giảm dần hoạt tính ức chế BACE-1

Hình 3.9 Xếp hạng các hợp chất sàng lọc theo hệ số Y tăng dần

Hình 3.10 Cấu trúc 2D của 15 hợp chất tốt nhất được sàng lọc

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển và không hồi phục, là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ ở người cao tuổi Theo tổ chức quốc tế về bệnh Azheimer, hiện nay ước tính có khoảng 50 triệu người trên toàn thế giới mắc bệnh, con số này sẽ tăng gấp đôi sau mỗi 20 năm, đạt 75 triệu vào năm 2030 và 131,5 triệu vào năm 2050 Cũng theo đó, tổng chi phí y tế cho AD ước tính trên toàn thế giới trong năm 2018 là 1 nghìn tỷ đô la Mỹ Con số này sẽ tăng lên 2 nghìn

tỷ đô la vào năm 2030 [25] Vì thế việc tìm ra hoạt chất điều trị là rất quan trọng

Cho đến nay các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) đã trở thành loại thuốc phổ biến để điều trị triệu chứng của AD từ nhẹ đến trung bình Các thuốc này mặc dù có lợi trong việc cải thiện nhận thức và hành vi, song chúng không trì hoãn hoặc ngăn ngừa

sự thoái hóa thần kinh Do vậy, hiện nay mô hình thuốc điều trị Alzheimer đơn mục tiêu truyền thống đang dần chuyển hướng sang các thuốc hướng đa đích Trong đề tài này chúng tôi lựa chọn hai đích phân tử là enzym beta-secretase (BACE1) và enzym acetylcholinesterase (AchE) Chất ức chế BACE-1 giúp ngăn ngừa sản xuất và tích lũy

amyloid- β protein, từ đó ngăn ngừa tiến triển của bệnh [2] Bên cạnh đó, AChEI làm

giảm thoái giáng acetylcholine (ACh) giúp tăng nồng độ Ach trong não và tăng dẫn truyền thần kinh [21]

Với ưu điểm tiết kiệm thời gian, chi phí và hiệu quả, các mô hình sàng lọc in silico

(sàng lọc ảo) được ứng dụng vào các khâu khác nhau của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc hiện đại Trong số đó, mô hình định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học (QSAR - quantitive structure activity relationship) được sử dụng phổ biến [20],[35] trong sàng lọc và định hướng phát triển các hợp chất có tiềm năng thành thuốc Vì vậy chúng

tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng mô hình in silico dự đoán tác dụng ức chế BACE-1 và AChE trong sàng lọc và tìm kiếm ứng viên thành thuốc chữa bệnh Alzheimer” với các mục tiêu chính như sau:

- Xây dựng mô hình liên quan cấu trúc – tác dụng dự đoán khả năng ức chế BACE-1

và AChE

- Ứng dụng mô hình xây dựng được trong sàng lọc hoạt chất mới có tác dụng đa đích chống Alzheimer

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh Alzheimer

1.1.1 Bệnh Alzheimer

Bệnh Alzheimer (AD) là một bệnh não thoái hóa mãn tính và không thể hồi phục,

là nguyên nhân hàng đầu của bệnh lý sa sút trí tuệ Nó gây ra tình trạng suy giảm trí nhớ, rối loạn định hướng, rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tính cách và suy giảm các chức năng nhận thức khác Bệnh thường bắt đầu với các triệu chứng nhẹ và kết thúc bằng tổn thương não nghiêm trọng, tỷ lệ mắc bệnh tăng theo tuổi Theo thống kê của Hiệp hội Alzheimer thế giới 2015, tỉ lệ mắc AD từ khoảng 5% của người dưới 75 tuổi đến 40-50% của người trên 85 tuổi [25]

Bệnh Alzheimer lần đầu tiên được mô tả bởi bác sĩ Alois Alzheimer vào ngày 3 tháng 11 năm 1906 tại cuộc họp lần thứ 37 của Hội tâm thần học Tây Nam Đức ở Tubingen Ông mô tả một phụ nữ 50 tuổi ở Tây Nam Đức mắc chứng hoang tưởng, rối loạn trí nhớ, thường xuyên gây hấn và bối rối cho đến khi bà tử vong Báo cáo của ông ghi nhận các mảng đặc biệt và đám xơ rối trong mô não bệnh nhân Năm 1910, tái bản lần

8 quyển “Tâm thần học” của Kraepelin được phát hành và trong đó tác giả đề nghị đặt tên căn bệnh mới được tìm ra là Alzheimer Tới năm 1909, Alois Alzheimer công bố thêm 3 trường hợp khác tương tự với tình trạng của Auguste D, và một bệnh nhân mới (Josef F) chỉ có các mảng bám trong não mà không có rối loạn sợi thần kinh Từ trường hợp của Auguste D và Josef F, Alzheimer đã chỉ ra mảng bám và đám xơ rối là các giai đoạn khác nhau của một bệnh lý [14]

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu sâu rộng được tiến hành, tuy nhiên cơ chế gây bệnh của AD vẫn chưa được làm sáng tỏ Điều này gây khó khăn trong việc phòng ngừa

và điều trị bệnh Trong số các giả thuyết về cơ chế bệnh sinh, phải kể đến giả thuyết

Amyloid (Amyloid cascade hypothesis) đề xuất rằng sự lắng đọng của amyloid- β protein

(Aβ) trong não của bệnh nhân Alzheimer tạo thành các mảng bám là một trong những nguyên nhân quan trọng của tiến triển bệnh [15]

Sự hình thành mảng bám amyloid do β-secretase (BACE-1)

Mảng bám Aβ hình thành do phân giải protein tiền chất amyloid (APP) – một glycoprotein xuyên màng gồm 770 acid amin Protein này xuất hiện trong nhiều mô nhưng nhiều nhất trong các khớp thần kinh của các neuron APP bị phân cắt bởi 3 enzym:

α, β và γ-secretase [6]

Trước hết, APP bị phân cắt đồng thời bởi β-secretase và α-secretase tương ứng với hai con đường amyloidogenic và non – amyloidogenic Quá trình phân cắt APP bởi α-secretase xảy ra chủ yếu, chiếm hơn 90%, tạo ra sAPPα và C83 Các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap Còn phân cắt bởi β-secretase tạo ra sAPPβ và C99

Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ γ-secretase Riêng C99 dưới tác dụng của γ-secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan là Aβ40 và Aβ42 Aβ42 có tính độc hơn, được sản xuất nhiều hơn Aβ40 [6] Các monomer này sau đó kết

tụ lại thành các oligomer (dimer hoặc trimer) là các chất độc thần kinh Các oligomer này không tan và bám xung quanh tế bào thần kinh, dần dần hình thành nên các mảng amyloid beta

Hình 1.1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào

Sự lắng đọng của Aβ là sự kiện khởi phát bệnh lý AD dẫn đến sự hình thành các mảng bám và sau đó đến các đám rối thần kinh, gây chết tế bào thần kinh và cuối cùng là mất trí nhớ [26]

Bên cạnh đó, sự tích tụ các mảng Aβ cũng khiến cho nồng độ ACh ở người mắc

AD bị suy giảm đáng kể Mặt khác, ACh là chất dẫn truyền thần kinh tại khe synapse, có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thần kinh Vì thế, enzym AChE (thoái giáng ACh thành acetat và cholin) đóng vai trò quan trọng trong duy trì ổn định nồng độ Ach trong não của bệnh nhân

Do vậy, thiết kế các thuốc ức chế AChE và BACE-1 đóng vai trò quan trọng trong việc làm chậm tiến triển của bệnh Alzheimer

1.1.2 Thuốc điều trị Alzheimer hiện nay

Cho đến nay vẫn chưa có phương pháp nào thực sự điều trị cho bệnh Alzheimer Điều trị hỗ trợ và chăm sóc bệnh nhân là những biện pháp chủ yếu Đối với các bệnh nhân mắc AD triệu chứng từ nhẹ đến trung bình, các chất ức chế acetylcholinsterase (AChEI) được kê đơn nhiều nhất Tuy nhiên, chiến lược sử dụng chất ức chế đơn đích truyền thống

là không đủ và không phù hợp để mang lại hiệu quả điều trị mong muốn vì nhiều yếu tố như sự lắng đọng Aβ, viêm thần kinh, stress oxy hóa và giảm nồng độ ACh đã được cho

là đóng vai trò quan trọng trong bệnh học AD [36]

Mô hình phát triển thuốc AD theo hướng mới giải quyết vấn đề này bằng cách tập trung vào các chất ức chế đa đích dựa trên AChEI Có thể kể đến một số ví dụ điển hình như: Các chất ức chế kép AChEI, các AChEI ức chế NMDA, các AChEI đối kháng thụ thể PAF, các AChEI ức chế MAO-B [36]

1.1.2.1 Các chất ức chế kép AChE

Các chất này có khả năng ức chế đồng thời vị trí xúc tác lẫn ngoại vi, vì vậy không chỉ làm giảm triệu chứng suy giảm nhận thức của bệnh nhân AD bằng cách tăng số lượng ACh trong khe synap mà còn đóng vai trò là tác nhân làm chậm tiến trình của bệnh, làm trì hoãn sự hình thành mảng bám amyloid Một trong các thuốc điển hình của hướng nghiên cứu này thiết kế dẫn xuất của galanthamin - hợp chất đã được FDA công nhận sử dụng là thuốc điều trị Azheimer [31] I Doytchinova và các cộng sự đã thiết kế và tổng hợp 15 hợp chất dựa trên khung galanthamin, kết quả nghiên cứu chỉ ra các hợp chất này đều có IC50 lớn hơn galanthamin từ 10 đến 100 lần và đều có khả năng khóa khu vực xúc tác lẫn ngoại biên của AChE [10]

1.1.2.2 Các AChEI ức chế NMDA

Bệnh lý AD biểu hiện tổn thương tế bào thần kinh trên các hệ thống truyền đa thần kinh, bao gồm cholinergic, glutamatergic, dopaminergic, serotoninergic, v.v Các hợp chất nhắm mục tiêu vào các thụ thể tương ứng sẽ làm giảm độc tính synap và có lợi cho điều trị AD Trong số các thụ thể này, thụ thể NMDA, liên quan đến tính linh hoạt synap,

đã được chứng minh là có liên quan đến rối loạn chức năng glutamatergic trong bệnh lý

AD [8] và 4 trở thành mục tiêu điều trị AD đầy hứa hẹn Trong 1 báo cáo năm 2010, Yvonne Rook và cộng sự đã chỉ ra rằng một số β-carbolines hóa trị 2 được phát hiện có khả năng ức chế thụ thể NMDA cùng hoạt tính ức chế AChE/BuChE [27]

1.1.2.3 Các AChEI ức chế MAO-B

Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng hoạt động MAO-B được tăng lên ở vỏ não của bệnh nhân AD [5], [30] và do đó tạo ra sự gia tăng nồng độ các gốc hydroxyl trong não có liên quan đến sự lắng đọng của các mảng Aβ [5] Do đó, các chất ức chế MAO-B

đã được đề xuất để điều trị AD Một trong những AChEIs ức chế MAO-B tiêu biểu phải

kể tới MBA236, chất này được tổng hợp dựa trên ASS234 - chất chống oxy hóa và chất

ức chế tổng hợp AChE và Aβ MBA236 đã được Bautista-Aguilera và cộng sự xác định là một chất ức chế kép cholinesterase và MAO mới đầy hứa hẹn [2]

1.1.2.4 Các AChEI đối kháng thụ thể PAF

Viêm dây thần kinh có mối tương quan với lắng đọng Aβ và rối loạn sợi thần kinh Phản ứng viêm thần kinh nghiêm trọng thúc đẩy thêm quá trình thoái hóa thần kinh [22]

Là một chất trung gian gây viêm mạnh, PAF cho thấy mức độ tăng cao trong não AD Do

đó, các thuốc ức chế cả PAF và AChE được mong chờ sẽ có hiệu lực điều trị AD tốt hơn

1.1.3 Tổng quan về Enzym acetylcholinsterase

Acetylcholinsterase là một trong hai loại enzym cholinesterase, nó tập trung tại các khớp thần kinh cholinergic trên khắp hệ thống thần kinh trung ương và tại các khớp thần kinh cơ Tại đây, AChE nhanh chóng thủy phân acetylcholin thành cholin và acetat [9] Việc thủy phân acetycholine giúp tái lập kích thích thần kinh và cho phép dẫn truyền xung động thần kinh mới

Trung tâm hoạt động

Cấu trúc của AChE được mô tả lần đầu tiên vào năm 1991 bởi J Sussman, người

đã kết tinh thành công enzym từ cơ quan điện của loài cá đuối điện, Torpedo californiaica

(TcAChE) TcAChE bao gồm 537 acid amin và được bao quanh bởi 14 chuỗi xoắn ốc [32]

Trong cấu trúc AChE, hai vùng gắn kết quan trọng cần được quan tâm là vùng xúc tác và vùng ngoại biên

Phản ứng thủy phân AChE diễn ra ở vị trí xúc tác là đáy của một khoang tác động sâu 20 Å, rộng 5 Å Vị trí này có bộ ba xúc tác là các residue Ser200, His440 và Glu327 Hoạt tính xúc tác có liên quan đến việc chuyển nhóm acetyl từ acetylcholin sang Ser200

Ngoài ra, vùng xúc tác còn có các thành phần khác như: Túi “oxyanion” với các amino acid Gly118, Gly119 và Ala201, đóng vai trò đây là nơi ổn định phức hợp trung gian được tạo thành trong phản ứng xúc tác của enzym Túi acyl với các amino acid Phe288 và Phe290, có vai trò ổn định nhóm methyl của phần acetate trong quá trình xúc tác và trong việc chọn lọc cơ chất cho enzym Một thành phần khác của vùng xúc tác là vị trí anion AChE, bao gồm Trp84, Tyr130, Phe330 và Phe331, chịu trách nhiệm liên kết nhóm amoni bậc bốn cơ chất với các tương tác cation-π [2]

Vùng ngoại biên (PAS) nằm ở lối vào của khoang tác động bao gồm các amino acid Tyr70, Asp72, Tyr121, Trp279 và Tyr334 trong đó Trp279 là thành phần quan trọng nhất Vùng này liên quan đến vai trò thúc đẩy sự kết tập các mảng β amyloid đồng thời biến đổi chức năng synap của các tế bào thần kinh hải mã [2]

Nghiên cứu từ Inestrosa và cộng sự cho thấy sự tương tác của peptide Aβ với PAS góp phần hình thành các mảng amyloid bằng cách đẩy nhanh quá trình Oligome hóa Aβ [16] Các chất ức chế PAS có thể ngăn chặn ACh đi vào vào lõi xúc tác bằng hoạt tính ức chế không cạnh tranh cũng như ức chế sự oligome hóa do PAS gây ra Do đó, PAS đã nổi lên như một hướng đi mới đầy triển vọng cho điều trị AD [2]

Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của acetylcholinesterase [2]

Sự thay đổi sinh hóa đáng chú ý nhất ở bệnh nhân AD là giảm nồng độ ACh ở vùng đồi thị và vỏ não [17] Do vậy, các thuốc ức chế AChE nhằm duy trì nồng độ ACh đóng vai trò tăng cường sự dẫn truyền thần kinh, giúp cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ trong việc ngăn chặn sự tiến triển của bệnh Alzheimer

1.1.4 Tổng quan về Enzym beta-secretase

Beta – secretase hay β-site amyloid cleavage enzyme 1 (BACE-1) là một mục tiêu

quan trọng cho sự hình thành AD Ức chế enzym này sẽ ngăn chặn sự hình thành của Aβ ngay từ khi bắt đầu quá trình xử lý APP Do đó làm chậm tiến triển của AD bằng cách ức chế sự hình thành Aβ ở giai sớm là lý tưởng

Cấu trúc tinh thể của BACE-1

BACE-1 là một protein màng loại I bao gồm 501 loại acid amin, chủ yếu có ở bộ máy Golgi và được phát hiện vào những năm 1999 BACE-1 có hai tâm aspartate xúc tác

là Asp32 và Asp238, khu trú giữa đầu N và đầu C Trung tâm hoạt động của BACE-1 được bao phủ bởi một vòng kẹp gọi là nắp, bao gồm 11 acid amin Nắp (flap) là khu vực linh hoạt nhất và cấu tạo thành một phần lớn của túi liên kết [13] Nắp tồn tại ở hai cấu dạng Một cấu dạng của enzym được gọi là dạng đóng khi nhóm hydroxyl của Tyr71 và

NH (NH của nhân indole) Trp 76 tồn tại liên kết hydro

Cấu dạng nắp đóng được tìm thấy ở BACE-1 khi liên kết với các cơ chất Cấu dạng nắp mở được tìm thấy trong BACE-1 ở trạng thái tự do, không liên kết với cơ chất Trong cấu dạng mở, nắp di chuyển ra xa các trung tâm Asp xúc tác và không có liên kết hydro [1], [20]

Vòng 10s là một đặc tính quan trọng khác của BACE-1 Nó bao gồm chuỗi liên tục Lys9-Tyr14, và định vị trong túi S3 của BACE-1 Một trạng thái liên kết tốt hơn giữa cơ chất và túi S3 khi vòng 10s thông qua một cấu hình mở

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 3 của dạng nắp mở và nắp đóng

1.2 Mô hình in silico

1.2.1 Thuật ngữ in silico

Thuật ngữ in silico bắt nguồn từ tiếng Latin, được sử dụng từ năm 1989 nghĩa là

thực hiện các thí nghiệm trên máy tính bằng công nghệ mô phỏng Ban đầu, phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong các mô hình sinh học với mục đích giải thích và dự đoán

động học giải phẫu Một số lĩnh vực đầu tiên sử dụng mô hình in silico bao gồm hóa sinh,

di truyền học và sinh lý học

Các nhà khoa học sớm nhận ra ưu điểm vượt trội của phương pháp này và mở rộng ứng dụng của nó, đặc biệt trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc Phương pháp này được ứng dụng vào nhiều khâu của quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc, từ tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, đến tối ưu hóa cấu trúc các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các tính chất dược động học của thuốc, đến các khâu nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng Chúng được gọi chung là các phương

pháp “in silico” nhằm phân biệt với các phương pháp in vivo, in situ và in vitro [29].

So với các phương pháp thực nghiệm truyền thống các phương pháp in silico có ưu

thế giúp thiết kế những phân tử thuốc mới với những ưu thế vượt trội, giải thích bản chất phân tử của các tương tác thuốc, điều mà không một thí nghiệm nào có khả năng làm được Ngoài ra chúng cho phép dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng các mô hình toán học, nghiên cứu dự đoán cơ chế tác dụng, cơ chế gây độc của các hợp chất Các phương pháp này giúp tiết kiệm đáng kể cả thời gian và chi phí trong việc phát triển một thuốc mới

Trong đó, mô hình tương quan định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học

(QSAR – quantitive structure activity relationship) được ứng dụng phổ biến trong nghiên

cứu và phát triển thuốc hiện đại

1.2.2 Mô hình QSAR

Lịch sử phát triển của phương pháp QSAR có thể nói khởi nguồn từ những nghiên cứu của Crum-Brown và Frasher (1868) khi nhận xét rằng tác dụng sinh học là hàm số của cấu trúc hóa học [7] Đến năm 1893, Richet đã cho rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất lí hóa [27] QSAR thực sự được nghiên cứu bởi C.L Corwin Hansch từ những năm 60 của thế kỷ 20 [11],[12] Mô hình QSAR Hansch

thường sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến để biểu thị mối tương quan giữa các tham số hóa lý và hoạt tính sinh học, ví dụ một phương trình của ông như sau:

Log (1/C) = k1π+ k2π2 + k3σ Trong đó: C là nồng độ mol mà tại đó hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh học, π: hằng

số kỵ nước, σ: hằng số thế Hammett, k1, k2, k3 là các hệ số hồi quy

Kể từ đây, đã có nhiều phương trình QSAR cùng với những phương pháp xây dựng

đa dạng đã ra đời và chiếm một vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

1.2.2.1 Đại cương về QSAR

Mô hình QSAR dựa trên giả thuyết là các hợp chất có đặc điểm cấu trúc tương đồng sẽ có tính chất sinh học tương đồng Về mặt toán học, mô hình QSAR biểu diễn mối tương quan định lượng giữa cấu trúc phân tử và hoạt tính thông qua phương trình:

các tham số phân tử, mô tả một đặc điểm cấu trúc nào đó của phân tử hóa học Theo

Todeschini và Consonni [34], tham số phân tử là kết quả cuối cùng của một quy trình

toán học hoặc logic, biến đổi thông tin hóa học (vốn được đã hóa dưới dạng ký hiệu như

C, H, N ) thành một số thực Tham số phân tử cũng có thể là kết quả thực nghiệm nào

đó, như LogP, độ phân cực, v.v Hiện nay, tham số phân tử có thể được chia thành 4

nhóm, dựa trên chiều thông tin (dimension) mô tả cấu trúc: (i) Tham số 0D mô tả thành phần cấu tạo nên cấu trúc, còn được gọi là các tham số đếm nguyên tử, như số lượng C, N (ii) Tham số 1D mô tả cấu trúc dưới dạng chuỗi, như vân tay cấu trúc (fingerprint), hay số lượng các mảnh cấu trúc, như số lượng nhân thơm, nhóm carboxylic (iii) Tham

số 2D mô tả cấu trúc dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính xác thứ tự, vị trí của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử Các tham số 2D thường được tính toán dựa trên lý thuyết về graph (iii) Tham số 3D mô tả đặc điểm cấu trúc của phân tử trong

không gian Các tham số 3D có thể được tính toán dựa trên các phương pháp lý thuyết như MoRSE, GETAWAY, tính toán lượng tử, mô tả bề mặt hoặc thể tích phân tử Hiện nay, các nghiên cứu xây dựng mô hình QSAR dựa trên tham số 3D chủ yếu dựa trên cấu trúc hóa học được tối ưu hóa năng lượng trong môi trường chân không mà không quan tâm đến cấu dạng của phân tử khi nó nằm trong trung tâm hoạt động của đích, chịu tác động của các động lực của môi trường gắn kết Do đó, mô hình QSAR chưa phản ánh chính xác mối tương quan cấu trúc-tác dụng của hoạt chất với đích phân tử của chúng

Hàm f là một hàm mô tả mối tương quan giữa Y và các biến x Để xây dựng được hàm f, cần áp dụng các thuật toán thống kê (statistical) hoặc học máy (machine learning)

Một số kỹ thuật thống kê thường được sử dụng trong xây dựng mô hình QSAR có thể kể đến như bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Squares), hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear Regression), phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis) [4] Kỹ thuật học máy là một lĩnh vực của trí tuệ nhân tạo, liên quan đến việc nghiên cứu và xây dựng các kĩ thuật cho phép các hệ thống "học" tự động từ dữ liệu để giải quyết những vấn đề cụ thể Trong xây dựng mô hình QSAR, các phương pháp học máy thường được sử dụng là: Cây quyết định (Decision Tree), mạng nơron nhân tạo (Artificial Neural Network), [3]

1.2.2.2 Quy trình xây dựng mô hình QSAR

Xây dựng cơ sở dữ liệu: Cơ sở dữ liệu thường là cấu trúc của các hợp chất hoá học

đã được chứng minh hoạt tính sinh học in vitro Để hạn chế các yếu tố gây sai số cho mô

hình, cơ sở dữ liệu thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương đồng về cấu trúc, về protocol,

Tính toán tham số phân tử đặc trưng cho cấu trúc: Tiến hành xây dựng cấu trúc

2D, 3D của các hợp chất thu được, sau đó sử dụng các phần mềm để tính toán các tham số phân tử Số lượng tham số phân tử mà phần mềm tính toán càng nhiều thì càng mô tả chính xác cấu trúc của hợp chất

Bảng 1.1 Các phần mềm tính tham số phân tử thông dụng

STT Tên phần

mềm Loại tham số tính được

Số lượng tham số

Predictor

Tham số điện tử, tham số hàm lượng tử, tham số

Xử lý sơ bộ dữ liệu: Trước khi tiến hành xây dựng mô hình, cần tiến hành xử lý sơ

bộ số liệu để hạn chế bớt sai số cho chương trình xây dựng mô hình Công việc này có thể bao gồm loại bỏ các giá trị nằm ngoài phân bố của dữ liệu (outlier), chuyển đổi hàm thức của hoạt tính sinh học (logarit hóa, mũ hóa, nghịch đảo ), loại bỏ TSPT không liên quan,

Xây dựng mô hình QSAR: sử dụng các phương pháp xác suất thống kê và các kỹ

thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ giữa các tham số phân tử và giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính

Đánh giá mô hình: Đánh giá mô hình là giai đoạn quan trọng liên quan đến khả

năng ứng dụng của mô hình Đánh giá mô hình thường sử dụng 5 nguyên tắc của OECD [34]:

(1) Có đích xác định

(2) Các thuật toán được sử dụng để xây dựng mô hình rõ ràng (mô hình có thể được tái xây dựng lại những hợp chất mới)

(3) Có miền cấu trúc ứng dụng (AD - applicability domain) được xác định: Miền cấu trúc ứng dụng là khoảng không gian cấu trúc được xác định bởi các hợp chất trong tập huấn luyện để xây dựng mô hình Những hợp chất thuộc tập huấn luyện nếu có cấu trúc nằm ngoài miền cấu trúc ứng dụng sẽ ảnh hưởng đến độ chính xác của mô hình Những hợp chất thuộc tập dự đoán, nếu cấu có cấu trúc nằm ngoài miền này sẽ cho kết quả dự đoán không chính xác Các phương pháp xác định miền ứng dụng thường gặp như: phương pháp đòn bẩy, …

(4) Thỏa mãn các đánh giá nội trên tập TS để kiểm tra mức độ khớp, độ mạnh và ổn định của mô hình

• Độ khớp hay độ tuyến tính được đánh giá thông qua giá hệ số xác định R2, R2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mô hình với các giá trị thực nghiệm càng tốt

R2 > 0,6 thì mô hình mới có ý nghĩa Công thức tính hệ số xác định như sau:

Trong đó n là số các quan sát của tập huấn luyện; yi , 𝑦̂, lần lượt là giá trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; 𝑦̅ là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc

• Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2, Q2 được đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave-one-out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các biến đã lựa chọn và tính toán lại các thông số của mô hình Q2 càng gần 1, tính tổng quát hóa của mô hình càng cao, mô hình càng ổn định Thông thường, yêu cầu Q2 > 0,5 thì mô hình mới bền vững Công thức hệ số tương quan chéo tính như sau:

Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của quan sát thứ i;

𝑦̂ giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng mô hình đã loại biến i; 𝑦̅ là 𝑖/𝑖giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc

• Khả năng dự đoán ngoại

Khả năng dự đoán ngoại được đánh giá thông qua giá trị Q2

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Nguyên liệu

Cơ sở dữ liệu (CSDL) bao gồm 123 hợp chất có hoạt tính ức chế AChE và 592 hợp chất có hoạt tính ức chế BACE-1 Từng hợp chất có các trường thông tin như khối lượng phân tử (MW), nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (IC50 - inhibitor concentration 50%)

và các thông số khác Tất cả dữ liệu được tải về từ cơ sở dữ liệu ChemBL được lưu trữ

trong file excel

Thiết bị: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xây dựng các mô hình liên quan cấu trúc – tác dụng (QSAR) dự đoán khả năng ức chế BACE-1 và AChE

2 Chọn ra 2 mô hình tốt nhất và đánh giá các mô hình đó theo 5 tiêu chí của OECD

3 Ứng dụng mô hình xây dựng được để sàng lọc, tìm kiếm các hoạt chất mới có tác dụng ức chế trên cả 2 đích BACE-1 và AChE chống Alzheimer

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng mô hình QSAR

Mô hình QSAR biểu diễn mối tương quan định lượng cấu trúc và tác dụng sinh học của các hợp chất biểu diễn dưới biểu thức toán học: Y= a1x1 + a1x2 + … + anxn Trong

đó Y là biến phụ thuộc (logIC50), tương ứng với hoạt tính; x1, x2, …xn là các tham số mô

tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc; a1, a2, …an là các trọng số tương ứng với biến độc lập

Thu thập dữ liệu

Một tập hợp dữ liệu bao gồm 123 dẫn chất có hoạt tính ức chế AChE và 592 dẫn chất có hoạt tính ức chế BACE-1

Tính toán tham số phân tử (TSPT): Để thực hiện tính toán, tất cả các cấu trúc

của CSDL đầu vào được biểu diễn dưới dạng dòng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) Căn cứ vào các mã code, hơn 3763 tham số phân tử 0D, 1D và 2D thuộc 19 họ được tính toán bằng phần mềm DRAGON v.6.0

Để loại bỏ hiện tượng đa cộng tuyến, các TSPT có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p ≥ 0.05) và các TSPT có giá trị là hằng số được loại bỏ Cụ thể, kỹ thuật đưa vào dần từng bước các biến (FS - Forward stepwise) trong STATISTICA10.0 được sử dụng để lựa chọn bước đầu tập hợp các tham số phân tử Đây là thuật toán kết hợp dần dần với một biến mới dựa trên trị số p và tỷ lệ phân phối Fisher (F) để lựa chọn các tham

số phân tử có khả năng dự đoán hoạt tính tốt

Xây dựng mô hình

CSDL được chia thành tập huấn luyện (TS - training set) và tập kiểm tra (PS - prediction set), sử dụng phương pháp phân tích cụm k-MCA (k-mean cluster analysis) với phần mềm STATISTICA10.0 Tập huấn luyện (chiếm 70% CSDL) được sử dụng cho việc xây dựng (huấn luyện) mô hình Tập huấn luyện cho phép phát hiện mối quan hệ có khả năng dự đoán Còn tập kiểm tra (chiếm 30% CSDL) bao gồm các phân tử mà mô hình chưa bao giờ gặp giúp đánh giá khả năng ngoại suy của các các mô hình xây dựng được

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật phân tích sự khác biệt tuyến tính (LDA - linear discriminant analysis) để xác định mối quan hệ giữa tham số phân tử và hoạt tính ức chế

Kỹ thuật đưa vào dần từng bước các biến (FS - Forward stepwise) trong STATISTICA10.0 được sử dụng để lựa chọn bước đầu tập hợp các tham số phân tử Đây

là thuật toán kết hợp dần dần với một biến mới dựa trên trị số p và tỷ lệ phân phối Fisher (F) để lựa chọn các tham số phân tử có khả năng dự đoán hoạt tính tốt