Nghiên cứu tác dụng sinh học và bước đầu tìm hiểu cơ chế hóa sinh của ngũ gia bì hương ( acanthopanax gracilistylus w w smith) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh tự kỷ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ---***--- PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HÓA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG Acanthopanax gracilistylus W.

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-*** -

PHẠM THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC

VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ HÓA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG

(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG

BỆNH TỰ KỶ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC

VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU CƠ CHẾ

HÓA SINH CỦA NGŨ GIA BÌ HƯƠNG

(Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG

1 Viện Dược liệu

2 Bộ môn Hoá sinh

HÀ NỘI – 2020

LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô là người đã trực tiếp

hướng dẫn em trong quá trình nghiên cứu khoa học tại khoa, luôn bên cạnh động viên

cổ vũ, dìu dắt em thực hiện tốt khoá luận này

Tiếp đến, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Lập,

bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội Cô đã cho em cơ hội được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị tại khoa Dược lý Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn em về kỹ thuật cũng như tạo điều kiện để em có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

-Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn

bè đã luôn bên em, ủng hộ và động viên em, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn

bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Phạm Thị Bích Phượng

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Ngũ gia bì hương 3

1.1.1 Tên gọi - vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố 3

1.1.3 Giá trị sử dụng 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý đã được thực hiện của cây Ngũ gia bì hương 5

1.1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới 5

1.1.5.2 Các nghiên cứu trong nước 6

1.2 Tổng quan về bệnh tự kỷ 6

1.2.1 Sơ lược về bệnh tự kỷ 6

1.2.2 Dịch tễ 7

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ 8

1.2.3.1 Yếu tố di truyền học 8

1.2.3.2 Yếu tố rủi ro môi trường 9

1.2.4 Dấu hiệu, triệu chứng và các vấn đề chẩn đoán chung 10

1.2.5 Điều trị 11

1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ 12

1.3 Tổng quan về ruồi giấm 13

1.3.1 Chu kỳ vòng đời 13

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm 14

1.3.3 Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm 14

1.3.3 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose gây bệnh tự kỷ 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Động vật nghiên cứu 17

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn NGBH trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 20

2.2.1.1 Đánh giá tương tác cộng đồng (Social space assay) 20

2.2.1.2 Đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm 21

2.2.1.3 Đánh giá khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm 22

2.2.1.4 Đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm (Odor- taste learning) 23

2.2.2 Đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction - NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 25

2.2.3 Phân tích kết quả 27

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn NGBH trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 28

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng tương tác cộng đồng (Social space assay) 28

3.1.2 Kết quả đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm 29

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm 31

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm (Odor - taste learning) 33

3.2 Kết quả đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction-NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 34

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Về mô hình nghiên cứu 37

4.1.1 Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ 37

4.1.2 Về căn cứ để lựa chọn mức liều 2mg/ml và 4mg/ml 38

4.2 Về kết quả nghiên cứu 38

4.2.1 Về cải thiện mức độ tương tác cộng đồng 38

4.2.2 Về sự thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm 39

4.2.3 Về khả năng di chuyển (bò) của ấu trùng ruồi giấm 40 4.2.4 Về khả năng học tập của ấu trùng ruồi giấm 40 4.2.5 Về sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction-NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt

1 ABA Applied Behavior Analysis Phân tích hành vi ứng dụng

3 ASD Autism Spectrum Disorder Hội chứng rối loạn phổ tự kỷ

4 BSA Biotin-streptavidine Biotin-streptavidin

8 HL3 Hemolymph-like 3 saline Dung dịch muối HL3

11 NMJ Neuromuscular junction Ngã ba thần kinh cơ

12 PBS Phosphat buffer saline Đệm Phosphat

15 SSR Subsynap reticulum region Vùng mạng lưới sau synap

16 TSC Tuberous Sclerosis Complex Hội chứng xơ cứng củ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1: Hóa chất 17 Bảng 2 2: Dụng cụ, thiết bị 18

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐỒ THỊ

Hình 1 1:Một số hình ảnh cây NGBH (Acanthropanaxgracilistylus W.W.Smith) 3 Hình 1 2:Cấu trúc hóa học của syringin 5 Hình 1 3: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các chức năng sinh học khác nhau 9 Hình 1 4:Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 14 Hình 1 5:Cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction) ở ấu trùng ruồi giấm 15

Hình 2 1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng của ruồi giấm 20 Hình 2 2: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 22 Hình 2 3: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng bò của ấu trùng ruồi giấm 23 Hình 2 4: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm 24 Hình 2 5: Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm bậc 3 26

Hình 3 1: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen tự kỷ 29 Hình 3 2: Kết quả phân tích tổng số lần hoạt động trong 5 ngày của ruồi giấm trưởng thành 30 Hình 3 3: Kết quả phân tích mức độ vận động thời tại điểm sáng sớm của ruồi giấm trong 5 ngày 31 Hình 3 4: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ 32 Hình 3 5: Chỉ số học tập LI được biểu diễn bằng biểu đồ box-and-whisker plot 33 Hình 3 6: Kết quả phân tích cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction- NMJ) tại nhóm cơ số 4 của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 35

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) là một bệnh lý thần kinh phức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu tiên của cuộc đời, được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng hòa nhập xã hội, suy giảm khả năng giao tiếp kết hợp với những hành vi cứng nhắc, lặp đi lặp lại Trong những thập

kỷ gần đây, do thay đổi về nhận thức và tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp các yếu tố sinh học và môi trường, tỷ lệ tự kỷ gia tăng một cách nhanh chóng ở tất cả các quốc gia, gây suy giảm chất lượng sống đồng thời khiến người mắc tự kỷ trở thành gánh nặng của gia đình và xã hội Cho đến nay bệnh vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ nguyên nhân cũng như chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu, các thuốc tân dược đang

sử dụng hiện mới chỉ giúp cải thiện triệu chứng của bệnh, tuy nhiên lại gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm Vì thế nhu cầu nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu không có tác dụng phụ để hỗ trợ và điều trị hội chứng tự kỷ là rất cần thiết và đang được thế giới quan tâm

Ngũ gia bì hương có tên khoa học là Acanthopanax gracilistylus W.W Smith

họ Nhân sâm (Araliaceae) là cây thuốc quí hiếm được đưa vào sách đỏ quốc gia từ năm 1996 Cây có thể mọc hoang dã hoặc được trồng ở một số nơi ở Việt Nam đặc biệt là các tỉnh miền Bắc như Hà Giang và Lào Cai Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ rễ

và vỏ thân của cây Ngũ gia bì hương được sử dụng làm thuốc bổ, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chữa đau lưng, tê chân, trẻ em chậm biết đi và bồi bổ cho phụ nữ sau khi sinh Nghiên cứu trong vỏ rễ và vỏ thân của Ngũ gia bì hương có các thành phần hóa học như các saponin triterpenoid, syringin, các acid triterpenoid có khung lapan, tinh dầu

Kết quả nghiên cứu của dự án “Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/ hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ và cơ chế tác dụng” do PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ để sàng lọc dược liệu tại khoa Dược lý- Sinh hóa, Viện Dược liệu cho thấy, Ngũ gia bì hương có tiềm năng trong điều trị hội chứng tự kỷ Hơn nữa việc nghiên cứu thuốc làm từ dược liệu nhằm hỗ trợ điều trị tự kỷ là hoàn toàn mới ở Việt Nam Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng sinh học

2

và bước đầu tìm hiểu cơ chế hóa sinh của Ngũ gia bì hương (Acanthopanax

gracilistylus W.W.Smith) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ” với

hai mục tiêu cụ thể sau:

1 Đánh giá được tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ của cao chiết cồn Ngũ gia

bì hương trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ

2 Bước đầu tìm hiểu được cơ chế hóa sinh của cao chiết cồn Ngũ gia bì hương thông qua sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm bậc 3

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: cây Ngũ gia bì hương

1.1.1 Tên gọi - vị trí phân loại

Ngũ gia bì hương (NGBH) có tên khoa học là Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith, họ Nhân sâm (Araliaceae), thuộc chi Acanthopanax (Decne & Planch.)

Miq và đã được khẳng định về tên khoa học từ những năm 1965 [3, 5] Tên khác: tế trụ ngũ gia, tiểu ngũ trảo phong,

1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố

Cây bụi, cao 2-3 m, phân cành nhiều, có nhiều gai sắc Lá kép chân vịt, có cuống dài 1,5-2,5 cm.Cụm hoa tán, thường mọc ở các kẽ lá non, cuống cụm hoa dài 1-2cm Hoa nhỏ màu trắng ngà hoặc trắng xanh, có cuống dài 0,6-1 cm, đài 5, nhỏ; cánh hoa 5, hình tam giác nhỏ tròn đầu; nhị 5, chỉ nhị ngắn Vòi nhụy ngắn, đầu chẻ 2, bầu

2 ô Quả gần hình cầu, hoặc cầu hơi dẹt, đường kính 3mm, khi chín màu tím đen Vò

nát lá, vỏ thân và vỏ rễ có mùi thơm đặc biệt (Hình 1.1) [1, 2]

Hình 1 1:Một số hình ảnh cây NGBH (Acanthropanaxgracilistylus W.W.Smith)[1]

NGBH là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng Cây sinh trưởng phát triển tốt ở vùng núi cao (trên 1500m) có khí hậu mát quanh năm NGBH sinh trưởng phát triển mạnh trong mùa mưa ẩm, tạm ngừng sinh trưởng trong mùa đông, lạnh và ít mưa Hàng năm, NGBH mọc ra 2 loại chồi là chối ngắn (vào khoảng tháng 12) và chồi dài mọc rải rác vào thời kỳ mưa ẩm và tập trung vào tháng 5 đến tháng 7; cây có hiện tượng rụng lá vào mùa đông và bắt đầu từ tháng 10 NGBH ra hoa nhiều vào tháng 4 -

- huyện Bắc Hà; xã Hầu Thào - huyện Sa Pa) - là những vùng sát biên giới phía Bắc Cây chủ yếu được trồng, sau có thể bị hoang dại hóa [5, 6, 7]

1.1.3 Giá trị sử dụng

Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ rễ và vỏ thân của cây NGBH được sử dụng làm thuốc bổ, mạnh gân xương, tăng trí nhớ, chữa đau lưng, tê chân, trẻ em chậm biết đi và bồi bổ cho phụ nữ sau khi sinh Tuy nhiên, việc sử dụng loài NGBH còn hạn chế, do trên thực tế cây hiếm gặp ở Việt Nam Bộ phận dùng là vỏ thân và vỏ rễ được thu vào mùa hạ và mùa xuân Lá tươi được kết hợp với một số cây thuốc khác dùng để bó gãy xương, [5, 10]

1.1.4 Thành phần hóa học

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài NGBH, tuy nhiên chủ yếu là các công trình nghiên cứu của nhóm tác giả Trung Quốc Thành

phần hóa học được tìm thấy trong loài A.gracilistylus gồm syringin,

4-methoxysaliryaldehyd, các alkaloid, saponin [28], sesamin, acid kaurenoic, acid hydroxy-kauran-18 oic và acid stearic [60] Syringin hay còn có tên khác là eleuthrosid

16-a-B (Hình 1.2) được biết đến như là chất chính có trong vỏ rễ của loài NG16-a-BH, chất này

đã được phân lập từ những năm 1971 bởi nhóm tác giả người Nhật [9].Đến nay, hợp chất này đã được chứng minh một số tác dụng sinh học như: tác dụng chống viêm trên chuột và cơ chế của chúng đối với tác dụng chống viêm [49]; tác dụng kích thích tăng cường giải phóng insulin liên quan đến tăng hoạt động giao cảm của chuột có ý thức [37], tác dụng tăng cường giải phóng acetylcholin, kích thích các thụ thể muscarinic M3 trong tế bào tuyến tụy và làm tăng quá trình giải phóng insulin dẫn đến hạ đường huyết [29]

5

Hình 1 2:Cấu trúc hóa học của syringin

Ở Việt Nam, thành phần hoá học của NGBH đã được giới thiệu trong một số tài liệu như “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt

Nam” Trong vỏ rễ loài A gracilistylus W.W.Smith gồm syringin, acid

(-)-ent-haur-16-en-19-oic, acid kauronic và acid ent-16a, 17-dihydroxykauran-19-oic Ba hợp chất ester 3 -hydroxy-olean-typ triterpenoid glycosyl từ lá đã được xác định là 28-O-C-L rhamnopyranosyl(1→4) --D-glucopyranosyl ester của 3 , 29-dihydroxy-olean-12-ene-oic acid, 3, 29-dihydroxy-23-oxo-olean-12-en-28-oic và 3 , 23, 29-trihydroxy-olean-12-en-28-oic [5, 10] Syringin cũng đã được chiết xuất và phân lập từ vỏ thân NGBH thu hái tại Việt Nam [9]

1.1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý đã được thực hiện của cây Ngũ gia bì hương

1.1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

✓ Tác dụng chống ung thư và ức chế khối u

Shan và cộng sự (1999) đã nghiên cứu tác dụng ức chế in vitro của dịch chiết loài A.gracilistylus trên tế bào lympho người, kết quả cho thấy dịch chiết loài

A.gracilistylus có hoạt tính điều hoà miễn dịch trên các tế bào lympho người và có khả

năng ứng dụng trong điều trị một số bệnh liên quan như dị ứng và miễn dịch [36] Năm 2005, nhóm nghiên cứu này đã công bố cơ chế ức chế khối u và tác dụng chống ung thư của NGBH [45, 47]

✓ Tác dụng điều trị đái tháo đường

Acankoreagenin được phân lập từ lá cây A.gracilistylus được chứng minh có tác dụng điều trị bệnh đái tháo đường Trong đánh giá in vitro, tác dụng điều trị đái

tháo đường được đánh giá dựa trên tác dụng ức chế α-glucosidase (IC 50 13,01 M),

α-6

amylase (IC 50 30,81 M) và PTP1B (IC 50 16,39 MM) Phân tích tác động bài tiết insulin của dòng tế bào RIN-m5F cho thấy rằng acankoreagenin làm tăng giải phóng insulin trong các tế bào RIN-m5F Nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng acankoreagenin làm giảm sản xuất NO, hoạt động của caspase-3 và nồng độ các chất tham gia phản ứng oxy hóa trong các tế bào bị tổn thương bởi con đường cytokin [31]

✓ Tác dụng tăng cường trí nhớ

Các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm, cho thấy cao chiết cồn 70% của vỏ thân NGBH và syringin có tác dụng ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase (AchE- là một enzym có vai trò quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại vi,

có thể làm chậm tiến triển của bệnh suy giảm trí nhớ), có khả năng phục hồi và ngăn

chặn tổn thương tế bào gây ra bởi protein Ab1-42 và Ab25-35 trên in vitro, loại

protein quan trọng trong tiến triển của bệnh Alzheimer [8].Hiện nay trên thị trường có một số loại thuốc được điều chế từ NGBH giúp tăng cương trí nhớ và bổ não như: Brain Tonic, Wu ja pi (Trung Quốc) Đây là các loại thuốc được chiết xuất từ vỏ rễ của NGBH

1.1.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Mặc dù NGBH đã được dùng để làm thuốc trong y học cổ truyền từ rất lâu nhưng cho đến nay ở Việt Nam chưa nhiều công trình công bố nào về tác dụng dược lý của loài cây này Một số nghiên cứu mới chỉ chứng minh được tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết cồn NGBH trên động vật thực nghiệm nhưng chưa có đủ bằng chứng để chứng minh tác dụng này trên con người [8]

1.2 Tổng quan về bệnh tự kỷ

1.2.1 Sơ lược về bệnh tự kỷ

Tự kỷ - “Autism” là thuật ngữ để chỉ những rối loạn đặc trưng trong việc khó khăn thiết lập các mối quan hệ, tương tác với xã hội Đây là một tên gọi do nhà tâm lý Leo Kanner đưa ra năm1943 Ông mô tả chi tiết hành vi của nhóm trẻ này bao gồm:

"Thiếu quan hệ tiếp xúc về mặt tình cảm với người khác; các thói quen thường ngày rất giống nhau về tính cách kỳ dị và tỉ mỉ; không có ngôn ngữ nói hoặc ngôn ngữ nói khác thường; rất thích xoay các đồ vật hình tròn; có kỹ năng mức cao về nhìn nhận

7

không gian hoặc giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngoài có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn, thông minh" [23, 25]

Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ Rối loạn phổ tự kỷ (tên tiếng anh là

“Autism Spectrum Disorder (ASD)”)

Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa ra khái niệm “Tự kỷ là một dạng khuyết tật phát triển tồn tại suốt cuộc đời, thường xuất hiện trong 3 năm đầu đời Tự kỷ là do rối loạn thần kinh, gây ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của não bộ Tự kỷ có thể xảy ra ở bất cứ cá nhân nào không phân biệt giới tính, chủng tộc hoặc điều kiện kinh tế - xã hội Đặc điểm của tự kỷ là những khiếm khuyết về tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ và có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại” Đây được coi là khái niệm tương đối đầy đủ và đựợc sử dụng phổ biến nhất

1.2.2 Dịch tễ

Theo thống kê của tổ chức WHO (2019), ước tính rằng trên thế giới cứ 160 trẻ thì có một trẻ mắc ASD Ước tính này đại diện cho một con số trung bình và tỷ lệ lưu hành báo cáo thay đổi qua các nghiên cứu

Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) công bố năm 2014 tỷ lệ rối loạn phổ tự kỷ là 1/68 trẻ, tăng 30% so với năm 2012 [4] Tỷ lệ mắc ASD ở nhiều nước thu nhập thấp và trung bình cho đến nay vẫn chưa được biết

ASD dường như ảnh hưởng đến nam nhiều hơn so với nữ Trẻ em trai mắc tự

kỷ gấp 3 lần so với trẻ em gái [30]

Tại Việt Nam, theo thống kê sơ bộ của Bộ Lao Động - Thương Binh Xã Hội, Việt Nam có khoảng 200000 người mắc chứng tự kỷ và số lượng trẻ được chẩn đoán

và điều trị ngày càng tăng lên Theo nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm

2019, tỷ lệ mắc tự kỷ ở miền Bắc Việt Nam là 75,2 /10000 trẻ Cũng trong nghiên cứu này tác giả còn chỉ ra rằng tỷ lệ mắc rối loạn tự kỷ cao hơn ở những trẻ em sống trong môi trường đô thị Mức độ đô thị hóa càng tăng dẫn đến trẻ có nguy cơ mắc bệnh càng cao hơn [21]

8

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ

Các nhà khoa học không biết chính xác nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ Bởi vì rối loạn rất phức tạp và không có hai người mắc chứng tự kỷ giống hệt nhau, có

lẽ có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tự kỷ Trên cơ sở khảo cứu các nghiên cứu về nguyên nhân của hội chứng tự kỷ, các nhà khoa học chia thành hai nhóm yếu tố nguy

cơ liên quan đến hội chứng tự kỷ chính là yếu tố di truyền học và yếu tố rủi ro môi trường

1.2.3.1 Yếu tố di truyền học

Các nghiên cứu về sự liên hệ giữa tỷ lệ tự kỷ với các anh chị em trong gia đình

có trẻ tự kỷ cho thấy, trong các trẻ sinh đôi cùng trứng, khi có một đứa trẻ bị tự kỷ thì nguy cơ mắc chứng tự kỷ của đứa trẻ còn lại cao đến 70-90%, tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng chỉ khoảng 30% và 3-19% ở anh chị em nói chung [59] Những kết quả này

đã dẫn đến một nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làm sáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra ASD

✓ Các hội chứng di truyền liên quan đến ASD

Các rối loạn di truyền đã biết có thể bao gồm các đặc điểm tự kỷ trong biểu hiện lâm sàng, chẳng hạn như hội chứng Fragile X, xơ cứng củ, u xơ thần kinh, phenylketon niệu và hội chứng Rett Các rối loạn gen đơn lẻ phổ biến nhất mà được coi như nguyên nhân của ASD là hội chứng Fragile X và xơ cứng củ [18, 23, 59]

Hội chứng Fragile X được gây ra bởi sự đột biến của bộ 3 nucleotid CGG lặp

lại ở vùng chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) dẫn

đến sự tăng cường quá trình sao chép của nó và đi kèm với sự ức chế phiên mã [54] Trong khi 1- 3% trẻ em được chẩn đoán tự kỷ có hội chứng Fragile X, ít nhất một nửa

số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành vi tự kỷ [23]

Tương tự với bệnh xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC), đây là một rối loạn di truyền đặc trưng bởi các khối u lành tính trong não và các cơ quan khác,

động kinh và các suy giảm nhận thức TSC được gây ra bởi đột biến gen hemarrtin và

tuberin mã hóa TSC1 và TSC2 tương ứng Khoảng 25-50% người khuyết tật trí tuệ

mắc TSC đáp ứng các tiêu chuẩn chẩn đoán tự kỷ nhưng chỉ có 1,1-1,3% số người được chẩn đoán mắc ASD ban đầu có TSC [23]

9

✓ Nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen

Kết quả nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen và phân tích toàn bộ vùng mã hóa

đã xác định được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷ [14, 59] Những gen này có chức năng và vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như phiên mã và tái cấu trúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân giải protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương tế bào

và hình thành các synap thần kinh (Hình 1.3) [54]

Hình 1 3: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các chức năng

sinh học khác nhau [54]

Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định Neurobeachin (NBEA) là gen

ứng cử viên cho ASD trên nhiễm sắc thể 13q sau các báo cáo ban đầu rằng đột biến

chuyển đoạn nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến

tự kỷ vô căn ở trẻ nam [12, 56] Đột biến xóa đoạn gen này cũng được công bố có liên

quan đến bệnh [39] NBEA mã hóa protein neo A-kinase (AKAP) liên kết với tiểu đơn

vị điều hòa của protein kinase A (PKA), được xác định là protein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển não [12] Các nghiên cứu

trên mô hình động vật chỉ ravai trò của NBEA trong nhiều quá trình của tế bào như cấu

tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh qua màng tế bào, củng cố trí nhớ ngắn hạn [54]

1.2.3.2 Yếu tố rủi ro môi trường

Các yếu tố môi trường có thể đóng góp vào một tỷ lệ đáng kể rủi ro ASD Một

số đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đã mô tả các yếu tố trước khi sinh và chu sinh, cũng như các yếu tố chế độ ăn uống và lối sống của bà mẹ

Nhiễm trùng tử cung có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh tự

kỷ Mối liên hệ giữa nhiễm trùng mẹ và nguy cơ tự kỷ được cung cấp thêm bằng các kết quả với mô hình gặm nhấm của nhiễm trùng mẹ Nhiễm virus thai kỳ kích hoạt phản ứng miễn dịch của mẹ, có thể gây nhiễu loạn sự phát triển não bộ của thai nhi [16]

Tiếp xúc với thuốc trong khi mang thai đã được đề cập làm tăng nguy cơ tự kỷ trong các phân tích tổng hợp gần đây nhất [19] Phơi nhiễm trước khi sinh với valproat

là một yếu tố nguy cơ được công nhận đối với ASD, đặc biệt là trong ba tháng đầu của thai kỳ [13] Thai nhi tiếp xúc với valproat có nguy cơ mắc ASD cao gấp 8 lần Một ức chế tuyến yên của NLGN3 được quan sát thấy trong tiểu vùng vùng đồi thị và vỏ não somatosensory của chuột trước khi sinh tiếp xúc với valproat [14] Đối với thuốc chống trầm cảm, bao gồm các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc, các nghiên cứu được kiểm soát tốt cho thấy không có rủi ro không rõ ràng [13], mặc dù có ý kiến cho rằng việc tiếp xúc với thuốc chống trầm cảm khi mang thai làm tăng nhẹ nguy cơ mắc ASD, đặc biệt là trong 3 tháng đầu

1.2.4 Dấu hiệu, triệu chứng và các vấn đề chẩn đoán chung

ASD có thể ảnh hướng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh Tuy nhiên, vì không có dấu ấn sinh học đáng tin cậy, chẩn đoán phải được thực hiện trên cơ sở hành vi Cẩm nang thống kê và chẩn đoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ (DSM)-5, được xuất bản năm 2013, nhằm mục đích giúp chẩn đoán ASD một cách đơn giản hơn Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sựthiếu hụt và bất thường ở 3 yếu tố chẩn đoán cốt lõi là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành

vi có tính lặp lại [11] Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đoán bao gồm việc xuất hiện của ít

11

nhất 3 dấu hiệu của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi có phản ứng quá mức Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt hay ngôn ngữ cơ thể Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khuôn Trẻ không hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội.Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụt trong khả năng học tập và nhận thức thiếu hụt ngôn ngữ, động kinh, bất thường vận động, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hóa [34, 54] đi kèm với rối loạn giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học [42] Ngoài ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm với các rối loạn khác, bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X) và các bệnh tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý - Attention deficit hyperactivity disorder - ADHD) [13]

vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) ABA đã được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và phòng khám điều trị Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường [61]

Với hướng điều trị bằng thuốc, hiện tại, không có loại thuốc nào có thể chữa khỏi rối loạn phổ tự kỷ (ASD) Nhưng một số loại thuốc có thể giúp điều trị một số triệu chứng liên quan đến ASD, đặc biệt là một số hành vi nhất định.Risperidon và aripiprazol đã cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD Việc sử dụng hai loại thuốc này, phần lớn trẻ em cho thấy sự cải thiện về sự cáu kỉnh và kích động, bao gồm gây hấn, tự gây thương tích và các hành vi gây rối khác Cả hai loại thuốc này nằm trong nhóm thuốc chống loạn thần không điển hình, tuy nhiên không phải tất cả các loại thuốc tương tự đều hữu ích đối với ASD Cả hai loại thuốc cũng có thể gây ra tác dụng phụ, bao gồm an thần và tăng cân, làm tăng

12

nguy cơ mắc các vấn đề sức khỏe sau này Một vài loại thuốc thường được sử dụng để điều trị ADHD, bao gồm methylphenidat, atomoxetin và guanfacin cũng cho thấy lợi ích đối với các triệu chứng ADHD ở ASD, xảy ra ở một phần tư trẻ em Tuy nhiên, mỗi loại thuốc này mang lại ít lợi ích hơn và nhiều tác dụng phụ hơn ở những người mắc ASD hơn trong số những người mắc ADHD nói chung [13]

Việc sử dụng thuốc cần thận trọng, nên ưu tiên cho các phương pháp điều trị có nguy cơ thấp hơn, bao gồm các can thiệp về hành vi hoặc tâm lý xã hội

1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ

Trong thập kỷ qua, nhiều tiến bộ sâu rộng đã đạt được trong chẩn đoán phân tử ASD và xác định được các gen liên quan đến ASD Để tìm hiểu đặc tính chức năng của các gen này, xác định các dấu ấn sinh học mới cho ASD và nghiên cứu bệnh lý phân tử, một số mô hình động vật bao gồm linh trưởng, chuột và ruồi giấm đã được sử dụng

Nghiên cứu ASD trên chuột, nhìn chung có 2 loại mô hình chính là mô hình di truyền và mô hình không di truyền Các mô hình di truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm các gen tương đồng của chuột với các gen có liên quan

tới ASD ở người như FMR1, NBEA, UBE3A, Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 cho thấy sự thiếu hụt tương tác xã hội, sự hiếu động và suy giảm nhận thức, tương đồng với các triệu chứng tự kỷ ở người NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn

chức năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi

xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học tập không gian và trí nhớ ở chuột Chuột

knockout gen UBE3A cũng cho thấy các tương tác xã hội bị suy giảm, hành vi lặp đi

lặp lại…[22, 54]

Bên cạnh đó, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Các mô hình động vật không di truyền của ASD được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hóa học như axit valproic (VPA), thalidomid và ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA khi mang thai làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở trẻ em VPA là thuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các rủi ro liên quan đến việc sử dụng

13

VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ Bệnh tự kỷ do VPA có khả năng gây ra bởi các khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ thống limbic và thân não để gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap Mô hình này có thể đại diện tốt hơn cho nhiều trường hợp tự kỷ vô căn có nguồn gốc môi trường / biểu sinh hơn so với các mô hình đột biến gen mang đột biến trong các gen liên quan đến tự kỷ [36]

Trong các năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để mô phỏng bệnh lý rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh ruồi giấm Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm tự

kỷ trên thế giới như: gen dABCA13, rugose, dUBE3A, dFMR1,…[54] Việc tổng hợp

nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng mô hình ruồi giấm biến đổi gen cho bệnh tự kỷ cũng góp phần xác định được được vai trò của các nhóm gen liên quan,làm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh

1.3 Tổng quan về ruồi giấm

Ruồi giấm có tên khoa học là Drosophila melanogaster, là sinh vật được sử

dụng trong lĩnh vực di truyền học với lịch sử nghiên cứu hơn 100 năm Nó được nhà di truyền học người Mỹ - T.H Morgan sử dụng trong phòng nghiên cứu từ những năm đầu thế kỷ XX Ngày nay ruồi giấm là loài được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm di truyền Nó được coi là sinh vật mô hình có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử hay các vấn đề sinh học cơ bản

từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hóa

1.3.1 Chu kỳ vòng đời

Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành Ruồi cái có thể tạo ra tới 1500 trứng trong suốt cuộc đời của nó.Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Phôi này sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi

14

thụ tinh Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29oC khoảng 30-40 ngày (Hình

1.3) [17, 41]

Hình 1 4:Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm[17]

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên

4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [41]

1.3.3 Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm

Hệ thống thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm tương đối đơn giản, chỉ chứa 32 nơron vận động ở mỗi nửa phân đoạn ở bụng và cấu trúc thần kinh cơ của nó (NMJ) là lớn, cá thể hóa, dễ dàng quan sát [27] Các khớp thần kinh NMJ của ấu trùng sử dụng các thụ thể glutamat ionotropic (Glamour) tương đồng với các thụ thể glutamat loại AMPA trong não của động vật có vú NMJ ruồi giấm hiển thị một số tính năng, bao gồm khả năng tiếp cận cấu trúc, tính năng rập khuôn và khả năng tiếp cận các thao tác

di truyền, do đó nó được coi là mô hình thuận tiện và hữu ích để làm sáng tỏ các cơ chế hình thành khớp thần kinh, truyền synap, tính mềm dẻo và thoái hóa khớp thần kinh [32, 50]

15

Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm được cấu tạo bởi các nút bouton bao gồm các vùng chức năng chính như vùng hoạt động trước synap (pre-synap active zone), vùng sau synap chứa các protein tín hiệu (protein signaling) và thụ thể glutamat (GluR) Các bouton tại NMJ của ấu trùng được bao quanh bởi một cấu trúc màng được gọi là mạng lưới sau synap (SSR), chứa các thụ thể dẫn truyền thần kinh, phần khung

và các phân tử tín hiệu (Hình 1.5.A) [20]

Hình 1 5:Cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction) ở ấu trùng ruồi

giấm[20],[32]

A: Các vùng chức năng chính của sợi thần kinh cơ; B: Phân loại một số dạng bouton chính dựa vào ảnh chụp tế bào thần kinh cơ với kháng thể anti –HRP và kháng thể anti-DLG dưới kính hiển vi huỳnh quang; C: Phân loại bouton dựa vào kích thước, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) và loại chất dẫn truyền thần kinh (NT)

Có 3 loại bouton: Loại I, II và III Chúng khác nhau về kích thước và hình dạng, chất dẫn truyền thần kinh, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) bao quanh chúng Bouton loại I sử dụng chất dẫn truyền là glutamat, được chia thành hai lớp: Ib (lớn) và

Is (nhỏ) SSR được nhuộm bởi kháng thể anti-Discs-Large (DLG), màng này có ởcảbouton Ib và Is Các bouton loại Ib được bao quanh bởi màng SSR nhiều hơn so với các bouton loại Is, dẫn đến sự khác biệt giữa hai loại Anti-DLG không đặc hiệu với loại II và loại III Kháng thể anti-HRP đặc hiệu với màng tế bào thần kinh tiền

synap và cho phép quan sát tất cả các loại bouton (Hình 1.5.B, C) Hầu hết các nghiên

cứu kiểm tra NMJ trên nhóm cơ số 4, nhóm cơ số 6/7,hoặc nhóm cơ số 12 [32]

16

1.3.3 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose gây bệnh tự kỷ

Năm 2015, Wise và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được mối liên quan giữa

đột biến gen rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện của rối

loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm [58] Một nghiên cứu trước đó đã báo cáo rằng gen

rugose được phân phối theo mô hình hạt giống như mạng Golgi trong các tế bào tế bào

thần kinh [55] Các đột biến gen rugose rất khả thi trong nghiên cứu tự kỷ, ruồi biểu

hiện những khiếm khuyết về khả năng học tập và thay đổi cấu trúc hình thái não và cấu trúc khớp thần kinh ở NMJ Các nghiên cứu khác tiết lộ rằng các đột biến mất

chức năng của gen rugose cũngthể hiện cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng và khiếm

khuyết trong các tương tác xã hội, thói quen suy yếu và tăng động ở ruồi trưởng thành

[58] Những phát hiện này chỉ ra rằng đột biến Drosophila rugose biểu hiện các đặc

điểm kiểu hình tương tự như ASD của con người và do đó, có thể là một mô hình phù hợp để nghiên cứu ASD, đồng thời qua đó chúng ta có thêm hiểu biết rõ ràng hơn về

vai trò của gen NBEA trong rối loạn phổ tự kỷ

Trong dự án “Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/ hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ và cơ chế tác dụng” do PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng làm chủ nhiệm với mục tiêu ứng dụng mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ để sàng lọc dược liệu, GS Masamitsu Yamaguchi, Giám đốc trung tâm ruồi giấm, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản đã cung cấp chủng ruồi giấm đột biến gen

rugose giúp phục vụ công tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng hỗ trợ/ điều

trị hội chứng tự kỷ, được thực hiện nghiên cứu tại khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu

17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao chiết cồn70% từ vỏ thân, rễ cây NGBH (Acanthopanax gracilistylus

W.W.Smith) với hiệu suất chiết 9,48% - do PGS TS Đỗ Thị Hà, khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu cung cấp

Nguồn gốc: NGBH do khoa Tài Nguyên-Viện Dược liệu thu hái tại Hà Giang

và xác định tên khoa học Mẫu nghiên cứu được bảo lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài Nguyên, Viện Dược Liệu

2.1.2 Động vật nghiên cứu

Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) trong các giai đoạn của chu kỳ phát triển

do Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản cung cấp với 2 chủng:

CantonS (FBst0064349): chủng hoang dại

Rugose (FBst0009801- CG44835): chủng ruồi giấm chuyểngen rugosemang

bệnh tự kỷ

Ruồi giấm được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25±1oC với chu kỳ sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ)

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

✓ Hóa chất, thuốc thử

Bảng 2 1: Hóa chất

18

8 Kháng thể anti-HRP có gắn huỳnh quang

FICT

Thermo Fisher, Mỹ

15 Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich,Đức

19 Một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng

thí nghiệm

✓ Dụng cụ, thiết bị:

Bảng 2 2: Dụng cụ, thiết bị

2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung Quốc

4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi

ấu trùng

Việt Nam

6 Đĩa petri 90 mm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ

8 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX73 Olympus, Nhật Bản

19

Đức

2.2 Nội dung nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu:

20

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn NGBH trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi

2.2.1.1 Đánh giá tương tác cộng đồng (Social space assay)

Dựa trên mô hình đánh giá được tiến hành theo mô tả trước đây của tác giả Simon và cộng sự (2012) [48], chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng cải thiện tính tập trung cộng đồng của ruồi giấm mang bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn NGBH

Quy trình thí nghiệm

Buồng đánh giá có dạng hình tam giác bằng nhựa (có chiều dài các cạnh tam giác là 15,2cm) dày 0,5cm được đậy chặt bởi 2 tấm kính (có kích thước 18cm x 18cm)

(Hình 2.1)

Hình 2 1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá tương tác cộng đồng của ruồi giấm

Ruồi mới nở được phân đực, cái riêng và chuyển vào các ống chứa thức ăn chuẩn / mẫu nghiên cứu với số lượng ~40 con/ống và được nuôi trong 3-4 ngày Ruồi được gây mê, sau đó cho vào buồng tam giác được đóng lại bằng 2 phiến kính Để buồng dựng đứng để ruồi tỉnh Đập nhẹ buồng thí nghiệm đảm bảo toàn bộ ruồi ở cùng

1 thời điểm xuất phát ở đáy buồng Đợi 30 phút cho ruồi tự do vận động, giao tiếp với nhau Chụp ảnh ghi lạibằng máy ảnhvà phân tích kết quả

21

2.2.1.2 Đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm dựa trên mô tả trong nghiên cứu của Wise và cộng sự (2015) [58] để đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm mang bệnh tự kỷ được sử dụng cao chiết cồn NGBH

và lô ruồi mang bệnh tự kỷ được điều trị với cao chiết cồn NGBH ở 2 liều tương ứng

là 2 và 4 mg/ml Cho mỗi con vào 1 ống theo dõi tương ứng với từng lô Đặt ống theo

dõi vào máy theo dõi hoạt động thức- ngủ của ruồi Trikinetics (Hình 2.2) Theo dõi

trong vòng 5 ngày, chu kì sáng/tối 12 giờ/12 giờ ở điều kiện 25oC Số lần ruồi di chuyển qua một chùm tia hồng ngoại cắt ngang vuông góc ở giữa ống theo dõi được ghi lại 30 phút/lần