Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc bách bộ ( radix stemonae) đang lưu hành trên địa bàn hà nội

Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng phân lập được từ các mẫu bách bộ nghiên cứu 18 Bảng 3.4.. Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân lập được từ các mẫu bách bộ nghi

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến

TS Trần Trịnh Công – giảng viên bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học

Dược Hà Nội Thầy là người đã định hướng cho tôi ngay từ những ngày đầu làm khóa luận Trong suốt thời gian làm khóa luận, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cám ơn các thầy giáo, cô giáo, các chị kỹ thuật viên và các

em làm nghiên cứu khoa học tại bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược

Hà Nôi đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Bên cạnh đó, tôi xin trân trọng cám ơn Ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi và giúp đỡ

tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình tôi, đến các bạn của tôi Họ là những người luôn bên cạnh khích lệ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 21 tháng 6 năm 2020 Sinh viên

Trần Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……….1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Bách bộ……… 2

1.2 Một số nét chính về đặc điểm sinh học của các chi nấm quan trọng 2

1.2.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries………2

1.2.2 Chi Penicillium Link ex Fries……… ………5

1.3 Tình hình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên thảo dược trên thế giới 8 1.4 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở trong nước 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu………13

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc……… 13

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu………13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp xác định hàm ẩm dược liệu……… 14

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc………14

2.3.3 Phương pháp phân loại nấm mốc ……… 15

2.3.4 Các chỉ số đánh giá mức độ nhiễm nấm………15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc bách bộ 16

3.1.1 Hàm ẩm của các mẫu bách bộ nghiên cứu……… 16

3.1.2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu bách bộ nghiên cứu………… 16

3.1.3 Một số ý kiến bàn luận……… ……… 27

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29

1 Kết luận 29

2 Kiến nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFPA : Aspergillus Flavus Parasiticus Agar

A flavus : Aspergillus flavus

A niger : Aspergillus niger

A fumigatus : Aspergillus fumigatus

A aculeatus : Aspergillus aculeatus

A parasiticus : Aspergillus parasiticus

A tamari : Aspergillus tamari

A corymbifera : Absidia corymbifera

R stolonifer : Rhizopus stolonifer

P marneffei : Penicillium marneffei

C lunata : Curvularia lunata

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 3.1 Hàm ẩm của các mẫu vị thuốc bách bộ nghiên cứu 16

Bảng 3.2 Số lượng các chủng, chi và loài nấm phân lập được

từ 10 mẫu bách bộ nghiên cứu

17

Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của một số loài quan trọng

phân lập được từ các mẫu bách bộ nghiên cứu

18

Bảng 3.4 Đặc điểm vi học của một số loài quan trọng phân

lập được từ các mẫu bách bộ nghiên cứu

19

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Cấu trúc sinh Conidi của chi Aspergillus 4

Hình 1.2: Cấu trúc sinh Conidi dạng chổi của chi Penicillium 7

Hình 3.1: Loài A niger nhiễm trên vị thuốc bách bộ 20

Hình 3.2: Loài A parasiticus nhiễm trên vị thuốc bách bộ 21

Hình 3.3: Loài A fumigatus nhiễm trên vị thuốc bách bộ 22

Hình 3.4: Loài A flavus nhiễm trên vị thuốc bách bộ 23

Hình 3.5: Loài Penicillium sp1, P sp2 nhiễm trên vị thuốc bách bộ 24

Hình 3.6: Loài Rhizopus stolonifer nhiễm trên vị thuốc bách bộ 25

Hình 3.7: Loài Absidia corymbifera nhiễm trên vị thuốc bách bộ 25

Hình 3.8: Loài Curvularia lunata nhiễm trên vị thuốc bách bộ 26

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nguyên liệu làm thuốc y học cổ truyền và các chế phẩm đông dược đa phần có nguồn gốc từ thực vật [9] Hiện nay, ở nước ta các phương pháp, phương tiện chế biến, bảo quản dược liệu còn nghèo nàn lạc hậu, chủ yếu vẫn dùng phương pháp truyền thống là phơi sấy theo kinh nghiệm Điều đó làm cho các loại dược liệu, các vị thuốc đông dược rất dễ bị nấm mốc xâm nhiễm

và phát triển, nhất là trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở Việt Nam Ngoài việc là giảm chất lượng thuốc như làm giảm hàm lượng vitamin, alkaloid, lipid, protid, tinh bột, và các hoạt chất khác, nấm mốc còn sinh ra độc tố (mycotoxin) gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng [3], [11]

Trong các loại thảo dược đang được lưu hành hiện nay thì bách bộ là một vị thuốc giàu thành phần dinh dưỡng được sử dụng trong các bài thuốc đông y chữa ho, chữa giun và diệt sâu bọ Thành phần hóa học chứa các chất như glucid, lipid, protid, … [9], thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta Cho đến nay, các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc trên dược liệu bách bộ vẫn còn hạn chế Để góp phần đảm bảo chất lượng và an toàn trong sử dụng thảo dược nói chung, vị

thuốc bách bộ nói riêng, đề tài “Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên vị

thuốc bách Bộ (Radix Stemonae) đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội” đã

được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Phân lập các chủng nấm mốc nhiễm trên vị thuốc bách bộ nghiên cứu

2 Phân loại các chủng nấm phân lập được đến cấp chi và loài

PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Bách bộ

Cây bách bộ có tên khoa học là Stemona tuberosa Lour

Thuộc họ Bách bộ Stemonaceae

Bộ phận dùng là rễ sấy khô hay phơi khô (Radix Stemonae) của cây bách bộ Thành phần hóa học : Ngoài các chất như gluxid (2,3%), lipid (0,83%), protid (9%), các axid hữu cơ v,v… trong rễ bách bộ người ta thường lấy được nhiều alkaloid

Tác dụng dược lý: chữa ho, chữa giun, diệt sâu bọ

1.2 Một số nét chính về đặc điểm sinh học của các chi nấm quan trọng

Nấm mốc (nấm sợi), đặc biệt là các chi nấm bất toàn như Aspergillus, Penicillium, Fusarium … có vai trò quan trọng trong lĩnh vực y dược cũng như

đời sống con người Nhiều loài của các chi nấm này có khả năng gây bệnh nấm

cơ hội, sinh độc tố, … ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Chúng có mặt ở khắp nơi trên thế giới, nhiễm và phát triển trên các hạt lương thực, thảo dược

và các sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật nói chung làm giảm chất lượng và sinh các mycotoxin gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng

1.2.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries

Chi Aspergillus do Micheli mô tả năm 1729, sau đó năm 1832 được Fries chấp nhận và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Sau này Fries lại xem xét bổ sung và được các nhà phân loại học công nhận nên được mang tên Aspergillus

Fries ex Fries

Về mặt phân loại học, chi Aspergillus có những đặc điểm sau:

- Hệ sợi nấm: Gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc

- Tế bào chân (foot-cell): Là một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm Bộ máy mang bào tử trần phát triển

từ đây

- Giá bào tử trần: Phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần như thẳng góc với trục của tế bào chân và thương ở trên mặt cơ chất Giá bào tử không phân nhánh, không có (hoặc ít có) vách ngang (Hình 1.1)

- Bọng đỉnh giá (vesicle): Là phần phình to ở đỉnh ở giá bảo tử trần Chúng có thể phình to ra thành bọng hình chùy, hình elip, hình gần cầu hay hình cầu, không có vách ngăn Bọng hữu thụ này mang các cuống thể bình và thể bình (Hình 1.1)

- Thể bình (phialide) và cuống thể bình (metulae): Là tế bào trực tiếp sinh conidi, nằm trên các bọng đỉnh giá Các thể bình hoặc song song và họp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn

bộ bề mặt bọng Thể bình hoặc được sinh ra trực tiếp từ bọng gọi là thể bình một lớp (uniseriate), hoặc đươc sinh ra trên các cuống ngắn (metulae) xuất phát từ bọng gọi là thể bình hai lớp (biseiriate) Việc xác định các lớp thể bình đôi khi rất khó do lớp đầu tiên (metulae) rất bé và

dễ bị che khuất bởi bào tử hoặc lớp thể bình thứ cấp (phialide)

- Các bào tử trần: được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở gần miệng bao giờ cũng non nhất, càng

xa càng già), không phân nhánh, không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài tùy từng loài (Hình 1.1)

- Khối bào tử trần (conidial head): cả các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của bọng đỉnh giá họp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head) Khối bào tử trần đỉnh bọng có thể có hình cột, hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn Một số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium)

Hình 1.1 Cấu trúc sinh conidi của chi Aspergillus Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ

chất khác nhau, nhất là các loại cơ chất có nguồn gốc thực vật như các loại hạt lương thực, thảo dược và các sản phẩm chế biến từ các nguồn cơ chất này [27]

Về vai trò của chi Aspergillus, nhiều loài được dùng trong công nghệ lên men,

sản xuất enzym (amylase, protease …), sản xuất các acid hữu cơ (acid citric,

acid glucomic)…[26], [27] Tuy nhiên chi Aspergillus lại được quan tâm đặc

biệt bởi khả năng sinh độc tố (mycotoxin) và ký sinh gây bệnh ở người và

động vật Một số độc tố quan trọng do các loài của chi Aspergillus tạo ra như

aflatoxin, ochratoxin A, patulin, citrinin và acid cyclopiazonic [17], [23], [30] Trong đó, quan trọng nhất phải nói đến là aflatoxin

Aflatoxin là một nhóm chất, trong đó quan trọng nhất là các aflatoxin B1, B2, G1, G2 và M1 Các aflatoxin nhóm B (B1, B2) và G (G1, G2) lần lượt

phát huỳnh quang màu xanh blue (B) và green (G) trong bức xạ UV (365nm)

và là các aflatoxin thường gặp trong tự nhiên [17], [23] Aflatoxin M1 là chất chuyển hóa sinh học của aflatoxin B1 trong cơ thể thể người và động vật, thường gặp trong sữa (Milk), nhất là các động vật cho sữa (do thức ăn bị nhiễm aflatoxin B1) Đây là 5 aflatoxin được quan tâm phân tích và có qui định hàm lượng tối đa cho phép trên lương thực, thực phẩm và thảo dược trên thế giới Aflatoxin rất bền với nhiệt, không bị phá hủy ở nhiệt độ đun nấu bình thường (100oC) [23]

Về khả năng gây ung thư trên người và động vật của aflatoxin, IARC (tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế) đã đưa ra đánh giá rằng: Có bằng chứng đầy

đủ về khả năng gây ung thư ở người và động vật của hỗn hợp các aflatoxin (B1, B2, G1, G2) xuất hiện tự nhiên và của từng aflatoxin B1, G1, M1, với bằng chứng giới hạn đối với aflatoxin B2 và bằng chứng chưa đầy đủ đối với aflatoxin G2 Trong đó, khả năng gây ung thư gan là chủ yếu [27], [33] Ngoài

ra, aflatoxin B1 còn gây tổn thương đáng kể hệ miễn dịch, đặc biệt với miễn dịch qua trung gian tế bào, làm tăng khả năng nhạy cảm với nhiễm trùng do vi khuẩn và ký sinh trùng của cơ thể [33]

Aflatoxin thường nhiễm trên lương thực, thực phẩm, dược thảo và chủ

yếu do 2 loài Aspergillus flavus và A parasiticus sinh ra Loài A flavus thường sinh các aflatoxin nhóm B, trong khi A parasiticus sinh cả afaltoxin nhóm B &

C [17]

Loài nấm của chi Aspergillus có khả năng ký sinh gây bệnh cơ hội phổ biến nhất ở người và động vật trên thế giới là A fumigatus [32].

1.2.2 Chi Penicillium Link ex Fries

Chi Penicillium thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp nấm bất toàn

trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo 1886

Chi Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau:

- Khuẩn lạc thường phát triển nhanh, thường ngả màu xanh lá cây, đôi khi

có màu trắng, chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp dày các conidiophore

- Conidiophore có thể mọc lên từ cơ chất, từ các sợi khí sinh, từ các bó sợi

bò lan trên mặt thạch, hoặc các bó sợi thẳng đứng chặt hay lỏng Conidiophore không màu, có thành nhẵn hay ráp, có thể đơn độc hoặc kết thành bó, cấu tạo gồm một giá đỡ (stipe) và được kết thúc bằng một vòng của các thể bình (phialide), đây là cấu trúc chổi một vòng (monoverticillate), hoặc kết thúc bằng các chổi đa vòng, gồm các nhánh

và cuống thể bình - metulae (các nhánh gần đoạn cuối mang một vòng phialide)

- Tất cả các tế bào giữa metulae và stipe được xem như là các nhánh (rami)

- Kiểu phân nhánh: có thể có 1 giai đoạn phân nhánh (monoverticillate), 2 giai đoạn phân nhánh (biverticillate) hoặc 3 (terverticillate) tới nhiều hơn các giai đoạn phân nhánh

- Thể bình thường có hình chai, với phần đáy hình trụ và phần cổ đặc trưng, hoặc dạng mác với phần đáy dẹp nhiều hay ít, thon nhỏ tới một đỉnh khá nhọn (acerose) Conidi sắp xếp thành dạng chuỗi dài, khô, phân

ly hay dạng cột, có dạng hình cầu, elip, hình trụ hoặc hình thoi, không màu, hoặc hơi xanh lá cây, thành nhẵn hoặc ráp Một số loài tạo hạch nấm (sclerotium)

Hình 1.2 Cấu trúc sinh conidi dạng chổi của chi Penicillium

* Hình dạng và kích thước khuẩn lạc:

Khuẩn lạc 5-6 cm đường kính, màu lục vàng, lục xanh, mặt dạng nhung, đôi khi có vài vùng xốp bông nhẹ, nhiều rãnh xuyên tâm Mặt trái khuẩn lạc và môi trường xung quanh màu vàng, màu nâu tươi Giọt tiết màu vàng chanh Giá bào tử trần nhẵn, phát triển từ hệ sợi nền, phần lớn (3,0-3,5) x (150-350)

µm, mang 1-2 nhánh Nhánh cùng với các vòng cuống thể bình, các vòng thể bình tạp thành chồi ba vòng Nhánh nhẵn (3,0-3,5) x (15-25) µm Cuống thể bình 2-5 cái trên đỉnh một nhánh (2-3) x (12-15) µm Thể bình xếp thành từng vòng 4-6 cái trên đỉnh một cuống thể bình (2,0-2,5) x (8-10) µm Bào tử trần hình eclip, nhẵn, (2,5-3,5) x (3-4) µm, thành cột dài tới 200µm [26]

Một số loài Penicillium được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp

thực phẩm và dược phẩm Một số loài có khả năng sản xuất kháng sinh tự

nhiên Một trong số đó là penicillin được lấy chủ yếu từ P chrysogenum

Penicillin là kháng sinh đầu tiên được sử dụng trong y học

Một số loài sinh các chất tiết và mùi sẽ giúp nhận ra vị trí phân loại của chúng Tuy nhiên, cần lưu ý là hít phải bào tử và các chất bay hơi có thể bị

stress, gây ảnh hưởng tới sức khỏe May mắn là các loài có khả năng gây bệnh

ở người của chi nấm này ít hơn nhiều so với chi Aspergillus và chỉ giới hạn ở loài P marneffei [3], [30] Chi Penicillium có khả năng sinh một số độc tố

quan trọng như: ochratoxin A, patulin và citrinin [6], [26]

1.3 Tình hình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên thảo dƣợc trên thế giới

Dược thảo thường bị nhiễm các loài nấm sinh độc tố có nguồn gốc từ đất trồng trọt Sự xuất hiện tự nhiên của nhiều độc tố nấm trên các nguyên liệu làm thuốc có nguồn gốc thực vật và các dược thảo truyền thống đã được thông báo

từ nhiều nước trên thế giới [14], [19], [30]

Dược thảo được xác định là việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thực vật trong thực hành trị liệu, là một thực tế tồn tại từ ngàn xưa, trước khi thuốc hiện đại phát triển, phổ biến và vẫn được sử dụng cho đến tận ngày nay Mặc dù thuốc kháng sinh đã được đưa vào sử dụng từ những năm 1940, nhưng vẫn có tới 80% dân số tin dùng các cây thuốc bản địa trong điều trị bệnh Do các dược thảo có nguồn gốc thực vật nên thường bị nhiễm, hư hỏng bởi nấm trước thu hoạch, trong quá trình vận chuyển và bảo quản Trong quá trình phát triển của nấm, nhiều mycotoxin được tạo thành, và là các chất gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng Sự gây hư hỏng cho dược thảo không chỉ gây ra nhiều tác động bất lợi đến cộng đồng người sử dụng, mà còn làm giảm hiệu quả và tiềm năng sử dụng của thuốc Một số nhà nghiên cứu còn nhận xét, nấm mốc

và mycotoxin là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây tụt hậu nền công nghiệp dược thảo Ấn Độ (một nước có nền y học cổ truyền lâu đời nhất trên thế giới với thảo dược là nguồn nguyên liệu chính) [19]

Mycotoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của nấm Một số chi nấm

thường có thể tạo ra các mycotoxin là Aspergillus, Penicillium và Fusarium

Hiện nay, đã phát hiện được khoảng 400 mycotoxin, trong đó, các mycotoxin phổ biến nhất là aflatoxin, ochratoxin A, fumonisin, deoxynivalenol,

zearalenon Các mycotoxin này đã được thông báo về khả năng gây ung thư, độc với hệ thần kinh, gây quái thai hoặc suy giảm miễn dịch Nhiều thực phẩm

và thức ăn như ngô, lúa, gạo, đậu phộng có thể bị nhiễm các mycotoxin vì chúng có thể được hình thành từ trước thu hoạch, thời gian thu hoạch và làm khô và trong khi bảo quản Hầu hết cây thuốc và các bộ phận của chúng như:

lá, rễ, hạt đều có thể bị nhiễm các loại nấm khác nhau trong quá trình bảo quản Khi được bảo quản nhiều ngày, chúng trở nên nhạy cảm với sự phát triển của nấm mốc và hình thành mycotoxin Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhiễm nấm là điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, phương thức thu hoạch, làm khô và bảo quản Ở các điều kiện khác nhau thì tình trạng nhiễm nấm và hình thành mycotoxin cũng khác nhau Khả năng nhiễm nấm tăng lên ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [14]

Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên 12 dược thảo dạng hạt gồm: Thảo quyết minh (cassia seed), hạt cây tơ hồng (chinese dodder seed), hạt ý dĩ (coix seed), sa uyển tử (flastem milkvetch seed), hạt sen (lotus seed), hạt vải (lychee seed), đào nhân (peach seed), hạt tiêu (pepperweed seed), hạt mạ đề (plantain seed), bá tử nhân (platycladi seed), hạt màn màn (spiderflower seed), và hạt quýt (tangerin seed) cho thấy: 27 loài thuộc 12 chi nấm phân lập được từ các mẫu hạt được tiệt trùng bề mặt Trong đó, loài

Chaetomium globosporum là phổ biến nhất (chiếm tỷ lệ 23%), tiếp sau là loài Microascus trigonosporus (12%) và Alternaria alternata (9%) Với hệ vi nấm

bề mặt, 34 loài thuộc 7 chi đã được phát hiện Trong đó, Aspergillus niger và Penicillium polonicum là các loài phổ biến nhất (lần lượt là 12% và 15%) Các

mẫu hạt dược thảo đã được kiểm tra khả năng nhiễm 2 độc tố chính là ochratoxin và aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) bằng thiết bị siêu hiệu năng cao kết nối với detector khối phổ 2 lần (UPLC-MS/MS) cho thấy: Các mẫu hạt bá

tử nhân (từ cây trắc bá) đã bị nhiễm độc tố aflatoxin B1 (52,0 µg/kg) và hạt

quýt đã phát hiện thấy độc tố ochratoxin A (92,3 µg/kg), quá qui định cho phép (5 µg/kg và 20 µg/kg) của châu Âu [16]

Một nghiên cứu của Matei và cộng sự [25] trên 10 mẫu chè thuốc được bán ở các hiệu thuộc hạt Cluj của Rumani Kết quả cho thấy, 4 mẫu có mức độ nhiễm nấm cao gồm: chè quả tầm xuân (rosehip tea) với 7.818 khuẩn lạc (CFU)/gam, chè húng quế ngọt (sweet basil tea) phát hiện được 118.636 CFU/g, chè đen (black tea) bị nhiễm ở mức 192.272 CFU/g, và chè common nettle (common nettle tea) có mức nhiễm 204.545 CFU/g Trong đó, các loài

của chi Fusarium nhiễm vượt quá nhiều so với qui định (100 CFU/g) Kết quả

phân tích mycotoxin cho thấy: 7/10 mẫu có lượng aflatoxin toàn phần vượt quá mức qui định cho phép (10 ppb) Trong số 7 mẫu này, có 3 mẫu vượt quá ngưỡng 100 ppb, mẫu nhiễm cao nhất là 437,17 ppb và trung bình của 7 mẫu

bị nhiễm là 109,21 ppb

Bokhari và cộng sự [15] đã nghiên cứu mức độ nhiễm nấm và độc tố fumonisin trên 47 mẫu của 15 loại chè thuốc được thu thập từ các siêu thị và các phố chợ ở Jeddah (Arập Xêut) kết quả cho thấy: Hệ vi nấm khá phong phú với 25 loài thuộc 13 chi đã phân lập được từ các mẫu nghiên cứu Trong số đó,

Aspergillus, Penicillium, và Fusarium là các chi có khả năng sinh nhiều độc tố

và phân lập được nhiều nhất Kết quả phân tích fumonisin bằng HPLC cho thấy: lượng độc đố phát hiện được dao động trong khoảng 0-260 µg/kg Như vậy, sự có mặt của các loài nấm sinh độc tố đã đưa đến rủi ro nhiễm mycotoxin tiềm tàng Trong khi mức độ sử dụng nguồn dược thảo trên thế giới ngày càng tăng, cho thấy sự cần thiết phải có các qui định về chỉ tiêu nấm mốc và mycotoxin trong các loại thảo dược thô để giảm rủi ro về sức khỏe của người tiêu dùng

Nghiên cứu chất lượng thuốc về tiêu chuẩn vi sinh trên 303 mẫu của 3 nhóm dược thảo và gia vị gồm: 11 loại thuộc nhóm sử dụng lá, 6 loại sử dụng quả và 3 loại sử dụng hoa Kết quả xác định và đếm vi sinh vật bằng các môi

trường nuôi cấy chuẩn cho thấy: Bên cạnh việc bị nhiễm ở tỷ lệ cao quá qui

định cho phép về vi khuẩn (coliform, tụ cầu vàng, và Salmonella), cả nấm men

và nấm sợi đã phát hiện thấy trong tất cả các mẫu nghiên cứu Trong đó,

Aspergillus và Penicillium là các chi nấm có số loài phân lập được nhiều hơn

so với các chi Alternaria, Absidia, Mucor, Rhizoctonia và Cladosporium Các

mẫu phân tích không phát hiện thấy độc tố aflatoxin (B1, B2, G1 và G2) Tuy nhiên, các tác giả đã khuyến cáo: các loại dược thảo và gia vị thực vật là những sản phẩm có rủi ro cao, cần có nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện pháp chống lây nhiễm [18]

Để đánh giá mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên vỏ quế (từ cây quế

Cinamomum zeylanicum ), 50 mẫu dược liệu này được thu thập từ các hiệu bán

lẻ ở khu vực miền đông của Arập Xeut Tổng số 1.126 chủng nấm thuộc 8 loài

của 2 chi Aspergillus, Penicillium đã được phân lập và nhận diện từ 50 mẫu

nghiên cứu Các chủng nấm đã phân lập được từ tất cả các mẫu vỏ, thuộc các

loài Aspergillus terreus, A glaucus, A flavus, A fumigatus, A clavatus, A niger, Penicillium restrectum và Penicillium sp Phân tích mycotoxin trên các

mẫu vỏ cho thấy: các aflatoxin B1, B2 và G1 được phát hiện ở nồng độ thấp (không vượt quá 4,67 µg/kg) từ 62% các mẫu nghiên cứu, và 17 mẫu không phát hiện thấy các aflatoxin này [13]

Khati [24] đã khảo sát mức độ nhiễm nấm và aflatoxin trên 10 mẫu thảo dược thô của 10 cây thuốc, được bảo quản ở các địa điểm khác nhau, thuộc bang Haridwar, Ấn Độ Kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đã bị nhiễm một

hoặc nhiều chi nấm gồm: Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Chaetomium, Cladosporium, Curvularia, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Rhizoctonia và Verticillium Trong số các chủng nấm phân lập được, loài Aspergillus flavus xuất hiện với tần số cao nhất (23,6%), tiếp sau là loài A niger (19,2%) Kết

quả phân tích aflatoxin cho thấy: 2/10 mẫu đã bị nhiễm aflatoxin B1 Từ kết quả phân tích nấm mốc và độc tố cho thấy: Các thảo dược có thể tiềm ẩn rủi ro

đối với sức khỏe của người tiêu dùng Đồng thời cho thấy sự cần thiết phải kiểm tra chặt chẽ các thảo dược trước khi cho phép đưa vào sử dụng trong cộng đồng

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm mốc và độc tố nấm mốc trên thảo dược ở trong nước

Trong nước, trong khoảng 10-15 năm trở lại đây các công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và mycotoxin trên thảo dược không nhiều Một

số công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố trên một số vị thuốc (được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược) bằng phương pháp đặt trực tiếp trên môi trường PDA [2], [4], [5], [6], [7], [10], [12] Trong các công trình này, phương pháp phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái vi học trên môi trường chuẩn Czapek Dox Bên cạnh phương pháp hình thái, phương pháp

sinh hóa (sử dụng môi trường AFPA) để nhận diện 2 loài A flavus và A.parasiticus cũng được áp dụng Kết quả phân lập và phân loại cho thấy, các chủng nấm phân lập được chủ yếu thuộc chi Aspergillus, tiếp sau là chi Penicillium và nhóm nấm tiếp hợp với các chi Rhizopus, Absidia và Mucor Trong đó, các loài có khả năng sinh độc tố như A flavus, A niger thường

chiếm tỷ lệ cao [3], [8], [9] Kết quả phân tích độc tố cho thấy, một số vị thuốc dạng quả, hạt (hạt sen, ý dĩ) bị nhiễm aflatoxin quá mức cho phép của ngành y

tế [12]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

10 mẫu bách bộ được thu thập từ các hiệu thuốc đông dược thuộc địa bàn

Hà Nội (phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm), được chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập và phân loại nấm

2.1.2 Môi trường phân lập và xác định nấm mốc

Môi trường PDA (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Khoai tây gọt vỏ: 200; Glucose: 20; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C) 5,6 ±0,2

Môi trường DGM (Dichloran Glycerol Medium Base), Himedia, Ấn Độ Thành phần (g/l): Peptone: 5; Glucose: 10; KH2PO4: 1; MgSO4: 0,5; Dichloran: 0,002; Chloramphenicol: 0,1; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C): 5,6

± 0,2

Môi trường xác định 2 loài A flavus và A parasiticus: ADM (Aspergillus

Differentiation Medium Base) Himedia, Ấn Độ Thành phần (g/l): Peptone: 10; Cao nấm men: 20; Ferric amonium citrate: 0,5; Dichloran: 0,002; Thạch: 15;

pH cuối cùng (25o

C): 6,3 ± 0,2

Môi trường Czapek Dox Agar (Himedia, Ấn Độ) Thành phần (g/l): Đường kính: 30; NaNO3: 2,0; KCl: 0,5; K2HPO4: 1,0; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,01; Thạch: 15; pH cuối cùng (25o

C): 7,3 ± 0,2

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Kính hiển vi Axiostar plus, Carl Zeiss (Đức), gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số Canon (Nhật Bản)

Tủ cấy vô trùng Aura VF48 (Đức)

Tủ ấm Memmert (Đức)

Tủ sấy SEL LAB (Đức)

Nồi hấp tiệt trùng Hiclave HVE - 25, Hirayama (Nhật Bản)