Định lượng và thử độ hòa tan của chế phẩm có chứa trimethoprim, sulfamethoxazol bằng quang phổ đạo hàm

Định lượng dung dịch nhiều thành phần bằng quang phổ đạo hàm .... Theo quy định của Dược điển Việt Nam V, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được sử dụng để định lượng đồng thời

QUANG PHỔ ĐẠO HÀM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội trong suốt thời gian em làm thực nghiệm tại bộ môn

Em xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các thầy cô

và toàn thể cán bộ công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập tại trường

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn tới chị Lưu Thị Ngọc Hân (Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội) và bạn Nguyễn Thị Ngọc Thụy đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và đồng hành cùng em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã luôn động viên và khuyến khích em trong quá trình học tập cũng như thời gian em thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Lã Thị Phương Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC BẢNG 2

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 3

ĐẶT VẤN ĐỀ 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về sulfamethoxazol và trimethoprim 5

1.1.1 Một số đặc điểm lý hóa của sulfamethoxazol và trimethoprim 5

1.1.2 Một số phương pháp định lượng đồng thời sulfamethoxazol và trimethoprim 6

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) 10

1.2.1 Định luật Lambert-Beer 10

1.2.2 Định lượng dung dịch nhiều thành phần bằng quang phổ đạo hàm 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Máy móc, thiết bị 15

2.2 Đối tượng nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời SUL và TRI bằng quang phổ đạo hàm 17

2.3.2 Ứng dụng phương pháp để định lượng và thử độ hòa tan các chế phẩm nghiên cứu 17

2.3.3 Xử lý kết quả thực nghiệm 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19

3.1.1 Chuẩn bị dung môi 19

3.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19

3.2 Xây dựng phương pháp định lượng 20

3.2.1 Xác định khoảng cộng tính 20

3.2.2 Chọn bước sóng định lượng 21

3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 24

3.2.4 Độ đúng, độ lặp của phương pháp 25

3.3 Kết quả định lượng 26

3.4 So sánh kết quả định lượng 27

3.5 Thử độ hòa tan 28

3.5.1 Quy trình thử 29

3.5.2 Kết quả 29

3.6 Bàn luận 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 36

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

SUL Sulfamethoxazole Sulfamethoxazol

TRI Trimethoprim Trimethoprim

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UV Ultraviolet Tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Một số đặc điểm lý hóa của sulfamethoxazol và trimethoprim 5

Bảng 2: Một số phương pháp định lượng đồng thời sulfamethoxazol và trimethoprim 6 Bảng 3: Các chế phẩm được nghiên cứu 16

Bảng 4: Khảo sát khoảng tuyến tính 25

Bảng 5: Độ đúng, độ lặp của các phương pháp 25

Bảng 6: Kết quả định lượng SUL trong các chế phẩm nghiên cứu (n=3) 26

Bảng 7: Kết quả định lượng TRI trong các chế phẩm nghiên cứu (n=3) 26

Bảng 8: Kết quả so sánh bằng thẩm định t cặp giữa phương pháp đạo hàm bậc 1 giao điểm không và HPLC 27

Bảng 9: Kết quả so sánh bằng thẩm định t cặp giữa phương pháp đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối và HPLC 28

Bảng 10: Kết quả phần trăm hàm lượng hoạt chất hòa tan so với nhãn của các chế phẩm viên nén, viên nang sau 60 phút 29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1: Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss 12 Hình 2: Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15 µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml

(đường nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đường nét đứt) trong methanol Mũi tên chỉ bước sóng định lượng 13 Hình 4: Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn SUL 40,0 mg/L, TRI 8,0 mg/L, phổ cộng và

phổ hỗn hợp với hàm lượng SUL, TRI tương ứng 20 Hình 5: Phổ đạo hàm bậc 1 của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L), TRI (4-9,6

21 mg/L) và chế phẩm bột uống Supertrim

Hình 6: Phổ đạo hàm bậc 2 của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L), TRI (4-9,6

22 mg/L) và chế phẩm viên nén Biseptol

Hình 7: Phổ đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn SUL (20-48 mg/L) +

TRI 8 mg/L, dung dịch chuẩn SUL 40 mg/L và chế phẩm viên nén Biseptol,

23 với số chia là dung dịch chuẩn TRI 8 mg/L

Hình 8: Phổ đạo hàm bậc 1 phổ tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn SUL 40mg/L + TRI

(4-9,6 mg/L) và chế phẩm viên nén Trimeseptol, với số chia là dung dịch

24 chuẩn SUL 20 mg/L

Hình 9: Đường cong hòa tan của viên nén Biseptol 29 Hình 10: Đường cong hòa tan của viên nang Sulfareptol 29

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cotrimoxazol là một hỗn hợp bao gồm sulfamethoxazol (5 phần) và trimethoprim (1 phần), được biết đến là kháng sinh phổ rộng trong điều trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu, hô hấp và tiêu hóa Sulfamethoxazol là một sulfonamid có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic, ức chế giai đoạn I - quá trình tổng hợp acid dihydrofolic của vi khuẩn nhờ có ái lực cao với dihydrofolat synthetase Trimethoprim

là một dẫn chất của pyrimidin, ức chế giai đoạn II của quá trình tổng hợp acid folic của

vi khuẩn do khả năng gắn cạnh tranh và ức chế đặc hiệu dihydrofolat reductase (là enzym xúc tác cho phản ứng chuyển acid dihydrofolic thành acid tetrahydrofolic) [5] Cotrimoxazol không những có tác dụng diệt khuẩn nhờ sự ức chế nối tiếp của sulfamethoxazol và trimethoprim mà còn có tác dụng hiệp đồng chống lại sự phát triển của các vi khuẩn kháng từng thành phần thuốc

Theo quy định của Dược điển Việt Nam V, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để định lượng đồng thời sulfamethoxazol và trimethoprim trong viên nén Cotrimoxazol [2] Với mong muốn đề xuất một phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất này trong các dạng bào chế khác nhau (viên nén, viên nang, bột pha dung dịch…) bằng kỹ thuật đạo hàm phổ tử ngoại (sử dụng dung môi, hóa chất thông dụng, không qua chiết tách riêng từng thành phần), đề tài:

ʺĐịnh lượng và thử độ hòa tan của chế phẩm có chứa Trimethoprim, Sulfamethoxazol bằng quang phổ đạo hàmʺ

đã được tiến hành với hai mục tiêu:

- Xây dựng phép định lượng đồng thời các hoạt chất trong hỗn hợp hai thành phần sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phép biến đổi đạo hàm phổ tử ngoại

- Ứng dụng phép định lượng này để xác định hàm lượng của sulfamethoxazol và trimethoprim trong một số chế phẩm hiện đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sulfamethoxazol và trimethoprim

Một số đặc điểm lý hóa của sulfamethoxazol và trimethoprim

1.1.1.

Bảng 1: Một số đặc điểm lý hóa của sulfamethoxazol và trimethoprim [2] [21] [22]

Sulfamethoxazol Trimethoprim Công

Thực tế không tan trong nước (610

mg/L ở 37oC), dễ tan trong aceton,

hơn tan trong ethanol 96%

Tan trong dung dịch natri hydroxyd

loãng và dung dịch acid loãng

Rất khó tan trong nước (400 mg/L

ở 25oC), khó tan trong ethanol 96% Tan trong cloroform (1,82 g/100mL) và methanol (1,21 g/100mL)

Một số phương pháp định lượng đồng thời sulfamethoxazol và trimethoprim 1.1.2.

Bảng 2: Một số phương pháp định lượng đồng thời sulfamethoxazol và trimethoprim

1 HPLC - Pha động: nước : acetonitril : triethylamin,

- Dung môi hòa tan: methanol

- Dung môi pha loãng: pha động

viên nén

- Dung môi hòa tan: methanol

- Dung môi pha loãng: pha động

viên nén

- Dung môi hòa tan: methanol

- Dung môi pha loãng: pha động

- Khoảng tuyến tính: TRI (150 - 1300

viên nén

[14]

- Dung môi hòa tan mẫu: methanol

- Dung môi pha loãng: nước

- Khoảng tuyến tính: TRI (5 - 30 /mL);

SUL (5 - 30 /mL)

viên nén

- SUL: hòa tan trong dung môi nước và HCl, thêm KBr Sau đó làm lạnh trong nước đá rồi chuẩn độ bằng natri nitrit 0,1M

viên nén

- Dung môi hòa tan: ethanol

- Dung môi pha loãng: cyclodextrin 10% hoặc nước

[15]

- Dung môi hòa tan chuẩn: nước

- Dung môi pha loãng chuẩn gốc: đệm Britton Robinson 0,1 mol/L (pH 9)

- Dung môi hòa tan mẫu thử: NaOH 0,1

- = 5 nm

- Khoảng nồng độ tuyến tính: 10 - 100

- Số chia: TRI (15 ), SUL (2 )

viên nén

[17]

- Bình phương tối thiểu một phần (PLS) (

= 2 nm), khoảng bước sóng lựa chọn:

 SUL: 230 - 318 nm

 TRI: 258 - 318 nm

viên nén

[12]

A: độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang D, hoặc độ tắt E)

T: độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang), đặc trƣng cho độ trong suốt của dung dịch

I0: Cường độ ánh sáng đơn sắc tới dung dịch

I: Cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã qua dung dịch

K: Hệ số hấp thụ, phụ thuộc vào bản chất, môi trường, bước sóng ánh sáng đơn sắc và đặc trưng cho bản chất chất tan trong dung dịch

l: Bề dày lớp dung dịch

C: Nồng độ chất tan trong dung dịch

 Điều kiện áp dụng định luật Lambert-Beer:

- Chùm tia sáng phải đơn sắc

- Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp

- Dung dịch phải trong suốt

- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của tia UV-Vis

Định lượng dung dịch nhiều thành phần bằng quang phổ đạo hàm [3] [4] 1.2.2.

Phương pháp quang phổ đạo hàm dựa trên nguyên tắc lấy đạo hàm bậc 1, bậc 2,… của phổ hấp thụ nhằm thu được nhiều hơn các thông tin để định lượng hỗn hợp đa thành phần

 Cơ sở của phương pháp quang phổ đạo hàm

Theo định luật Lambert-beer ta có:

A= K.C.l Đạo hàm bậc n của A:

l C d

K d d

A d

n n n

Hình 1: Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss

Theo tính chất của đạo hàm ta có thể thấy:

- Các giá trị cực trị ở đạo hàm bậc n sẽ có giá trị 0 tại đạo hàm bậc n + 1

- Các điểm uốn ở đạo hàm bậc n sẽ trở thành cực trị tại đạo hàm bậc n + 1

Do đó, từ một pic ban đầu sau n lần đạo hàm sẽ có n cực trị mới Sự xuất hiện của các cực trị này sẽ làm tăng khả năng phân tích phổ ban đầu

 Phổ đạo hàm của hỗn hợp nhiều chất

Vì phổ đạo hàm là kết quả biến đổi từ phổ hấp thụ nên giá trị của phổ đạo hàm tại các bước sóng cũng có tính cộng tính như phổ hấp thụ của dung dịch có nhiều thành phần trong điều kiện tương tác giữa các thành phần là không đáng kể và có thể bỏ qua

( )

(

) Trong đó, Ki và Ci lần lượt là hệ số hấp thụ và nồng độ của chất i trong dung dịch

có n thành phần (1 ≤ i ≤ n)

1.2.2.1 Phương pháp đạo hàm giao điểm không

Phương pháp đạo hàm giao điểm không dựa trên nguyên tắc lựa chọn một bước sóng mà tại đó đạo hàm độ hấp thụ của một trong hai thành phần cần định lượng bằng

0 và thành phần còn lại khác 0 Như vậy tại bước sóng đó có thể định lượng được một thành phần mà không bị ảnh hưởng của thành phần còn lại Nếu hỗn hợp có ba thành phần thì phải tìm được một bước sóng để đạo hàm độ hấp thụ của hai trong ba thành phần bằng 0, thành phần còn lại khác 0 Công việc này không phải lúc nào cũng thực hiện được Vì vậy, phương pháp đạo hàm giao điểm không được ứng dụng phổ biến để định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần Với phương pháp này thường sử dụng phổ đạo hàm bậc một hoặc hai

Hình 2: Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15 µg/mL; (2) 20 µg/mL; (3) 30 µg/mL (đường nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/mL; (2) 50 µg/mL; (3) 75 µg/mL (đường nét

đứt) trong methanol Mũi tên chỉ bước sóng định lượng [9]

1.2.2.2 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối

Xét dung dịch có hai thành phần S1, S2 và có tính chất cộng tính ánh sáng

Khi đó:

( ) Chia phổ hấp thụ của dung dịch trên cho phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn S1 có nồng

độ ta được phổ tỷ đối:

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

- Cuvet thạch anh bề dày 1 cm

- Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan)

- Cân phân tích A&D GR-200 (Nhật Bản), d = 0,1 mg

- Máy đo pH Mettler Toledo 8630

- Máy ly tâm Hettich EBA 21

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC 2030C 3D Plus

- Các dụng cụ khác: bình định mức (10; 25; 50; 100 mL), pipet chính xác (1; 2; 5; 10 mL), pipet tự động 1000 µL Nichipet EX, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống

đong, phễu lọc, giấy lọc…

- Máy thử hòa tan kiểu cánh khuấy

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu bao gồm 5 loại chế phẩm có chứa hỗn hợp

sulfamethoxazol và trimethoprim hiện đang lưu hành trên thị trường (bảng 4)

Bảng 3: Các chế phẩm được nghiên cứu

STT Đối tượng Đặc điểm

1 Viên nén Cotrimstada - Nhà sản xuất: Công ty TNHH LD

STADA – Việt Nam

- Số lô SX: 150619

- Số đăng ký: VD-23491-15

- Ngày sản xuất: 26/06/19

- Hạn sử dụng: 26/06/22

- Tất cả các chế phẩm (viên nén, viên nang và gói bột) đều có công thức cho một đơn vị liều dùng:

Sulfamethoxazol: 400 mg

Trimethoprim: 80 mg

Tá dược vừa đủ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời SUL và TRI bằng quang phổ 2.3.1.

- Kiểm tra độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

Ứng dụng phương pháp để định lượng và thử độ hòa tan các chế phẩm 2.3.2.

đường chuẩn R2 ≥ 0,990 So sánh độ đúng của các phương pháp quang phổ đạo hàm

và HPLC bằng phần mềm EXCEL với kiểm định thống kê t cặp với độ tin cậy 95%

Giá trị trung bình:

n

X X

)(

n

i i

Phương sai: S2

=

1

) (

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Chuẩn bị dung môi

3.1.1.

Dung môi cho phép đo quang phổ là dung dịch HCl 0,1N được pha theo DĐVN

V như sau: pha loãng 8,5 mL acid hydrocloric đặc với nước vừa đủ 1000 mL

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

3.1.2.

- Dung dịch chuẩn SUL:

 Cân chính xác khoảng 0,0500 g SUL chuẩn cho vào trong bình định mức 100

mL, thêm dung dịch HCl 0,1N, lắc, siêu âm khoảng 15 phút, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ 100 mL lắc đều thu được dung dịch gốc SUL 500 mg/L

 Từ dung dịch gốc SUL 500 mg/L pha thành dãy các dung dịch chuẩn có nồng

độ lần lượt là: 20; 24; 28; 32; 36; 40; 44; 48 mg/L

- Dung dịch chuẩn TRI:

 Cân chính xác khoảng 0,0500 g TRI chuẩn cho vào trong bình định mức 100

mL, thêm dung dịch HCl 0,1N, lắc, siêu âm khoảng 15 phút, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ 100 mL lắc đều thu được dung dịch gốc TRI 500 mg/L

 Hút chính xác 10 mL dung dịch gốc TRI 500 mg/L cho vào bình định mức 50

mL, thêm dung dịch HCl 0,1N vừa đủ thu được dung dịch chuẩn TRI 100 mg/L

 Từ dung dịch chuẩn TRI 100 mg/L pha thành dãy các dung dịch chuẩn có nồng

độ lần lượt là: 4,0; 4,8; 5,6; 6,4; 7,2; 8,0; 8,8; 9,6 mg/L

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp SUL và TRI: các dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp được pha

từ dung dịch gốc SUL 500 mg/L và dung dịch chuẩn TRI 100 mg/L

 Thuốc bột: cân khối lượng của 20 gói bằng cân phân tích, cắt mở gói, lấy hết thuốc ra, dùng bông lau sạch bột thuốc bám mặt trong, cân khối lượng vỏ gói để xác định lượng bột thuốc trung bình trong gói