đánh giá hiệu quả sàng lọc virus hbv, hcv, hiv của máu và chế phẩm máu bảng kỹ thuật nat (nucleic acid testing)

DANH MỤC CÁC CHỨ VIẾT TẢTAIDS : Acquirred Immune Deficiency Symdrome Hội chứng suy giâm miễn dịch mắc phảiAnti HBs : Anti Hepatitis B surface Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virus vi

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TÉ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

LUẬN ÁN BÁC SỸ CHUYÊN KHOA II

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SÀNG LỌC VIRUS HBV, HCV, HIV CỦA MÁU VÀ CHẾ PHẨM MÁU BẢNG

KỸ THUẬT NAT (NUCLEIC ACID TESTING)

Tôi xin cam đoan đây là công trinh nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, két quà nghiên cứu trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa lừng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Tác giả luận văn

Bs Hoàng Thị Như Mai

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

ĐẠT VẮN ĐÈ

CHƯƠNG I: TỐNG QUAN Y VÃN 4

1.1 Tình hình truyền máu 4

1.1.1 Trên thể giới 4

1.1.2 Tại Việt Nam 7

1.2 Các virus chính gây bệnh qua dường truyền máu 8

1.2.1 Đặc điểm sinh học của HBV 8

1.2.2 Đặc điềm sinh học cùa HCV 13

1.3 Tinh hình sàng lọc các bệnh lây nhiễm qua dường truyền máu 25

1.3.1 Trên thế giới 25

1.3.2 Tại Việt Nam 27

1.4 Các biện pháp bảo đảm an toàn truyền máu, phòng lây nhiễm HBV, HCV, HĨV trong dơn vị máu hiến tại Ngân Hàng Máu BVTMHH 28

1.4.1 Lụa chọn người hiến máu an toàn 28

1.4.2 Một số phương pháp xét nghiệm sàng lọc HBV, HCV, HĩV 28

CHƯƠNG II: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 43

2.1 Đối tượng nghiên cửu 43

2.2 Vật liệu nghiên cửu 43

2.2.1 Cờ mầu nghiên cứu 43

2.2.2 Hóa chất xét nghiệm 43

2.23 Trang thiết bị 43

2.3 Phương pháp nghiên cứu 44

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 44

2.3.2 Quy trình 44

2.33 Các kỳ thuật sử dụng ưong nghiên cửu: 46

2.3.4 Nội dung nghiên cứu 46

2.4 Xử lý số liệu 49

2.5 Vấn đề y đức 49

CHƯƠNG III: KÉT QUẢ NGHIÊN cứư 50

3.1 Đặc điểm của dối tượng hiến máu 50

3.2 Kct quà phát hiện HBV, HCV HĨV bằng xét nghiệm sàng lọc huyết thanh 52

3.3 Kết quà phát hiện HBV, HCV HĨV bằng xét nghiệm sàng lọc NAT 54

3.3.1 Kết quà NAT khi thực hiện vói mẫu trộn 6 54

3.3.2 Tỷ lệ nhiễm virus HBV, HCV, HTV dược sàng lọc bằng kỳ thuật NAT khi chạy riêng từng mẫu 55

3.3.3 Kct quà kiềm tra ưên túi huyết tương 55

3.3.4 Kết quà NAT dịnh tính và định lượng 56

3.3.5 Kết quà ngoại kiềm tra 57

CHƯƠNG IV: BÀN LƯẶN - 61

4.1 Đặc điểm của người hiến máu 61

4.2 Xác dịnh tỷ lệ dương tính HBV, HCV, HTV khi thực hiện kỳ thuật xét nghiệm huyết thanh học 62

4.3 Xác định tý lệ dương tính HBV , HCV , HTV khi thực hiện kỹ thuật xét nghiêm NAT 65

4.3.1 Kết quà NAT khi thực hiện với mầu ưộn 6 65

4.3.2 Ti lệ nhiễm virus HBV, HCV, HIV dược sàng lọc bằng kỳ thuật NAT 66

4.3.3 Kết quà kiềm tra ưên túi huyết tương 69

4.3.4 Két quà NAT định tính và định lượng 70

4.3.5 Kiềm tra chất lượng trong quy trình kỳ thuật NAT 72

4.4 Đánh giá hiệu quả giữa hai phương pháp kỳ thuật xét nghiệm huyết thanh học và kỳ thuật NAT 73

4.4.1 Nghiên cửu hiệu quà sử dụng kỷ thuật NAT ương việc nâng cao tính an toàn sinh học của các chế phẩm máu 73

4.4.2 Đánh giá hiệu quả giữa hai phương pháp kỳ thuật xét nghiệm huyết thanh học và kỳ thuật NAT 74

KẾT LUẶN - 76

KIẾN NGHỊ—— 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỨ VIẾT TẢT

AIDS : Acquirred Immune Deficiency Symdrome (Hội chứng suy giâm

miễn dịch mắc phải)Anti HBs : Anti Hepatitis B surface (Kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt

virus viêm gan B)Anti HBc : Anti Hepatitis B core (Kháng thế kháng kháng nguyên lõi virus viêm

gan B)Anti Hbe : Anti Hepatitis B e (Kháng thể kháng kháng nguyên e virus viêm gan

B)

Au : Australia (Nước úc)

BN : Bệnh nhân

BV.TMHH : Bệnh viện Truyền máu Huyết học

CMIA : Chemiluminescense immuno assay (Kỹ thuật hoá phát quang)

DNA : Desoxyribonucleic Acid

ELISA : Enzyme Linked Immunosorben Assay (Kỳ thuật miễn dịch gắn

enzym)ECLTA : Electrochemiluminescense immunoassay (Kỳ thuật diện hoá phát

quang)EIA : Enzyme Immunoassay (Kỹ thuật miễn dịch enzym)

FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm và dược

phẩm Hoa Kỳ)HBcAg : Hepatitis B core Antigen (Kháng nguyên lõi virus viêm gan B)

HBsAg : Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan

B)HBeAg

HBV

: Hepatitis B e Antigen (Kháng nguyên E virus viêm gan B): Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HCV : Hepatitis V virus (Virus viêm gan C)

IDNAT : Individual NAT

KN Kháng nguyên

KT Kháng thể

MP NAT Mini Pool N/\T

NAT Nucleic Acid Testing

NRL National Reference Laboratory

PCR Polymerase Chain Reaction (Phàn ứng khuếch dại chuỏi)RNA Acid Ribonucleic

TMA Transcription Mediated Amplification

TMP Trans Membrance Protein

VHHTMTW Viện Huyết học truyền máu Trung ương

WHO World Health Organization

XN Xét nghiệm

DANH MỤC BẢNG, BIẺU

Trang

Bảng 1.1: Xét nghiệm viêm gan B NAT sàng lọc dơn vị máu 26

Bảng 3.1 Tỷ lệ hiến máu phân loại theo giới tính 50

Bảng 3.2 Tỷ lệ phát hiện HBV, HCV, HĨV dương tính ờ người hiến máu 52

Bàng 3.3 Tỷ lệ nhiễm HBV, HCV, HIV bằng xét nghiệm sàng lọc huyết thanh52 Bàng 3.4 Kết quà NAT khi thực hiện với mẫu trộn 6 54

Bảng 3.5 Kết quả xét nghiệm NAT phân biệt HBV, HCV, HTV 55

Bảng 3.6 Kết quà NAT xét nghiệm trên túi huyết tương 55

Bảng 3.7 Kết quà NAT định tính và dịnh lượng 56

Bàng 3.8: Kểt quà chạy kiểm tra với bộ mẫu Panel Acrometrix MPX 57

Bàng 3.9: Kết quà chạy kiềm tra với bộ mẫu Panel Acrometrix HIV-1 HCV? HBV 57

Bảng 3.10 Kết quã ngoại kiềm ưa dợt 24/06/2015 58

Bâng 3.11 Kết quã ngoại kiềm ưa dợt 30/09/2015 59

Bàng 3.12 Kết quã ngoại kiềm ưa 16/03/2016 60

Bàng 4.1 So sánh tỳ lệ nhiễm HBV, HCV, HTV với các tác già khác 62

Bàng 4.2 So sánh tý lệ HBV-DNA dương tính với các tác giã khác 66

Bảng 4.3 So sánh tý lệ HCV-RNA dương tính với các tác già khác 67

Bâng 4.4 So sánh tỷ lệ HĨV-RNA dương tinh với các tác già khác 69

Biểu dồ 3.1 Tỷ lệ hiến máu phân loại theo giới tính 50

Biểu dồ 3.2 Tỷ lệ hiến máu phán loại theo nhóm tuổi 51

Biểu dồ 3.3 Tỳ lệ dối tượng nghiên cứu theo mục dich hiến máu 51

Biểu dồ 3.4 Tỷ lệ nhiễm HBV theo nhóm tuồi 53

Biểu dồ 3.5 Tỷ lệ nhiễm HCV theo nhóm tuồi 53

Biểu dồ 3.6 Tỷ lệ nhiễm HTV theo nhóm tuổi 54

Biểu dồ 3.7 Kết quà NAT định tinh và định lượng 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1: cấu trúc virus HBV 9

Hình 1.2: Chu trình sống của HBV 11

Hình 1.3: Diễn biến huyết thanh cùa người nhiễm HBV 12

Hình 1.4: cấu trúc virus HCV 14

Hĩnh 1.5: Chu trình sống của HCV 17

Hình 1.6: Diẻn biến huyết thanh của người nhiễm HCV 18

Hình 1.7: cấu trúc virus HIV 20

Hĩnh 1.8: Chu trinh sống cùa HĨV 23

Hình 1.9: Diễn biến huyết thanh của người nhiễm HTV 24

Hình 1.10: Nguyên lý kỳ thuật ELTSA 29

Hình 1.11: Nguyên lý kỳ thuật vi hạt hoá phát quang 30

Hình 1.12: Nguyên lý kỳ thuật diện hoá phát quang 32

Hình 1.13: cấu trúc phức hợp bắt cặp trong ECLIA 32

Hình 1.14: Nguyên tắc kỳ thuật TMA 38

Hình 1.15: Nguyên tắc phàn ứng Realtime-PCR với đoạn dò Taqman 40

Hình 2.1: Real time PCR 48

Sơ dồ 1.1: Sàng lọc HBV, HCV và HTV bằng kỳ thuật huyết thanh và kỳ thuật NAT theo hướng dẫn hoạt dộng truyền máu thông tư 26/2013/TT-BYT 46

ĐẶT VẮN ĐÊ

Mồi năm thông qua cuộc vận dộng toàn dân hiến máu, lượng máu tiếp nhận từcác dối tượng hiến máu tình nguyện ngày càng tăng cao nhưng vấn dề dặt ra là hàng triệudơn vị máu dó cỏ thực sự an toàn không? Chính Ví vậy, việc dâm bão các dơn vị máu antoàn cho diều trị là một trong những việc làm rất cần thiết An toàn truyền máu là nộidung xuyên suốt ơong chiến lược truyền máu cùa mỏi quốc gia, trong dó sảng lọc các tácnhân lây truyền qua dường máu luôn dược xem là mục tiêu quan trọng nhằm giảm thiểu

ở mức thấp nhất nguy cơ lây nhiễm qua dường máu khi sử dụng các chế phẩm máu vớimục đích diều trị Sàng lọc các tác nhân lây truyền qua truyền máu của túi máu hiến làmột ưong các chiến lược cùa các ngân hàng máu

Tồ chức y tế thế giới (WHO) dâ khuyến cáo việc sàng lọc HBV, HCV và HTV

là bắt buộc cho tất cà các dơn vị máu [181- Theo ước tính của WHO nhu cầu sử dụngmáu trong diều trị hãng năm của mỗi quốc gia tính theo dơn vị bằng 2 % dân số Ờ ViệtNam, với dân số 90 ưiệu người, mỏi năm cần khoảng 1800 000 dơn vị tương dương 450

000 lít máu dể dáp ứng nhu cầu diều trị, cấp cứu và dề phòng thảm họa Công tác sànglọc các tác nhân lây truyền qua dường máu dâ dược áp dụng từ năm 1971 với xét nghiệmtìm kháng nguyên bề mặt của virus gây viêm gan B (HBsAg), từ năm 1985 với xétnghiệm sàng lọc virus suy giâm miễn dịch ở người (HIV) và từ năm 1990 với xét nghiệmsàng lọc virus viêm gan c (HCV) Tử dó, các kỳ thuật sàng lọc ngày càng phát triển.Hiện nay, ờ nhũng ngân hàng máu lớn tại Việt Nam, việc sàng lọc tất cà các mẩu máuhiến là bắt buộc đối với những nhiễm trùng sau và sử dụng các dấu ấn sau:

• HIV-1 và HĨV-2 sàng lọc dối với sự kết hợp kháng nguyên kháng thề HTV haycác kháng thể kháng HĩV

• Viêm gan virus B: sàng lọc kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg)

• Viêm gan virus C: sàng lọc sự kết hợp kháng nguyên kháng thể HCV hay cáckháng thề kháng HCV

• Syphilis (Treponema pallidum): sàng lọc các kháng thể treponema dạc hiệu.Tuy nhiên ờ giai đoạn cừa sổ, các xét nghiệm huyết thanh học tuy dâ phát triểnmạnh về dộ nhạy vã độ dặc hiệu, cùng chưa thực sự dâm bão việc phát hiện virus lây quadường truyền máu

Cùng với sự phát triên của kỳ thuật sinh học phân tử, kỳ thuật NAT (NucleicAcid Testing) dã dược nhiều nước trên thế giới áp dụng trong sàng lọc máu, góp phần

giúp giâm nguy cơ lây nhicm qua dường truyền máu cho người nhận Kỳ thuật này dãdược sử dụng ớ các nước phát triển vào cuối thập niên 1990 và dầu nhừng nãm 2000.Hiện nay dà có khoảng 33 quốc gia ơên thế giới sử dụng kỹ thuật NAT cho phát hiệnHTV và khoảng 27 quốc gia sử dụng kỳ thuật này cho phát hiện HBV [19] Kỳ thuậtNAT có dộ nhạy vã dộ dặc hiệu cao cho phép phát hiện và nhân bàn dặc hiệu theo hàm

mũ các trình tự đích của tác nhân gây bệnh từ một lượng nhỏ virus, do dỏ, cho phép pháthiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh Hơn the nữa, NAT có thể được sử dụng dểphát hiện dồng thời HTV, HBV, HCV thông qua một xét nghiệm trong thời gian 4-5 giờ,dâm bảo an toàn cho dơn vị máu truyền

Tại Việt Nam kỳ thuật NAT mới dược triên khai thường quy tại Hà Nội, thànhphố Hồ Chí Minh và Huế năm 2015, Viện Truyền máu Huyết học cần Thơ triền khaiNAT năm 2016 Tại Ngân Hảng Máu bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành phố HồChí Minh, kỹ thuật NAT sàng lọc HBV, HCV, HTV dà thực hiện từ tháng 02/2014 [71-Với thời gian hơn một năm thực hiện kỳ thuật NAT ưong sàng lọc máu chúng tôi tiếnhành nghiên cửu, đảnh giá hiệu quã sàng lọc virus HBV, HCV, HĨV của máu và chếphẩm máu bằng kỳ thuật NAT nhằm hướng tới công tác xét nghiệm sàng lọc sớm các tácnhân lây qua dường truyền máu một cách chính xác, dảm bào an toàn, chất lượng chomáu và chế phẩm sử dụng trong diều trị

Mục tiêu tổng quát:

Đánh giá hiệu quà việc sử dụng xét nghiệm sàng lọc huyết thanh học và kỳ thuậtNAT dể phát hiện virus HBV, HCV, HTV của người cho máu tại Ngân hàng máu Bệnhviện Truyền mãu Huyết học

Mục tiêu chuyên biệt:

1 Xác dịnh ti lệ dương tính HBV, HCV, HTV bang xét nghiệm sàng lọc huyếtthanh học

2 Xác dịnh ti lệ dương tính HBV, HCV, HTV bằng kỳ thuật NAT

3 Đánh giá hiệu quà giữa hai phương pháp kỳ thuật xét nghiệm huyết thanh học

và kỳ thuật NAT

CHƯƠNG I TÒNG QUAN Y VẪN 1.1 Tinh hình truyền máu

Năm 1667, áp dụng thí nghiệm cùa L Lower, J Denis - Giáo sư triết học vàtoán học Paris, cố vấn và là thầy thuốc cùa vua Louis XĨV dà truyền máu cũa một con bêcho một bệnh nhân rối loạn hành vi, lần thử nhất không thấy biều hiện gì và thí nghiệmdược tiến hành lần thứ hai và phản ứng truyền máu xảy ra Hai tháng sau, bệnh nhân lạiphát bệnh và Denis dã thực hiện lại liệu pháp này, hôm sau bệnh nhân tử vong Từ dóGiáo Hoàng ra sắc lệnh cấm truyền máu Sau dó rất lâu, các thí nghiệm tương tự khôngdược thực hiện trong thời gian dài

Năm 1818, J Blundell thực hiện truyền máu cho những phụ nử mất máu sausinh với người cho là chồng bệnh nhân Máu dược truyền bằng syringe hoặc dụng cụchứa dặt ưên cao, nhưng do không kiểm soát dược lượng máu truyền hoặc máu bị dôngnên phàn ứng tan máu và máu mất nhiều là nguyên nhân có thể gây chết cả người cho vàngười nhận

Ông lại tiến hành truyền máu cho 10 bệnh nhân thì 5 bệnh nhân thành công, cóthể do ngẫu nhiên phù hợp nhóm máu Từ dó, việc truyền máu ơở nên thông dụng hơnnhưng vẫn còn nhiều tai biến Phương pháp truyền máu thời kỳ này là truyền trực tiếp,nối thông giừa tĩnh mạch người cho và tĩnh mạch bệnh nhân Sau dó J Blundell dã sửdụng biện pháp dùng bơm tiêm lấy máu người cho truyền cho bệnh nhân, vì vậy việctruyền máu dờ phiền phức hơn

Năm 1869, Braxton Hicks truyền máu có dùng chống dông bằng dung dịchphosphat cho một số bệnh nhân chày máu sân khoa nhưng hầu hết dều từ vong

Năm 1901, Karl Landsteiner phát hiện ra hệ nhóm máu ABO trong dó có 3nhóm máu là A, B, o và các ngưng kết tố tương ứng, sau dó học trò của ông là Decasstilo

và Sturli phát hiện nhóm máu AB Đây là một bước ngoặc mờ ra một thời kỳ mới ưongtruyền máu

Năm 1913, Reuben Ottenberg nêu vấn dề hòa hợp nhóm máu ữong truyền máu

và dưa ra sơ dồ truyền máu mang tên ông Từ dó việc truyền máu dược thực hiện dựaưên sự lựa chọn nhóm máu ABO hòa hợp giữa người cho và người nhận nên khắc phụcdược tình ưạng tử vong do tan máu khi truyền nhầm nhóm máu

Năm 1914, Albert Hustin, L Agote, R Lewisohn, R Weil dã tim ra chấtchống dông Natri Citrate và việc bảo quản máu trong diều kiện lạnh ra dời Phương phápnày dâ làm thay dổi quan niệm về truyền máu vì trước kia người bệnh phải chở máu, thìbây giờ máu dà chờ người bệnh Máu từ vùng này chuyền sang vùng khác, từ hậuphương ra tuyền tuyển cấp cứu hàng loạt thương binh mất máu kịp thời Phương phápnày dược sữ dụng ưong suốt chiến tranh thế giới thứ ĩ, thay thế cho phương pháp truyềnmáu trực tiếp

Năm 1936 - 1939, Fantus dã xây dựng ngàn hàng máu dầu tiên tại Chicago.Levin và Stetson (năm 1939), Landsteiner và Weiner (năm 1940) phát hiện hệnhóm máu Rh, cùng với nhóm ABO dã cỏ ỷ nghĩa quyết định làm giám các rủi ro ưongtruyền máu

Năm 1943, J Loutit vã p Mollison chinh lý dung dịch chống dông ACD, dàtạo diều kiện bào quàn lâu dài máu ờ 4°c, kéơ dài thời gian bào quàn máu 3 - 4 tuần Từ

dó, việc truyền máu trờ nên rộng rãi do cung cấp máu kịp thời và thuận tiện ở hầu hết cácnước Hàng triệu lít máu dà dược thu gom phục vụ diều trị cho thương bệnh, binh

Nãm 1952, Walter và Murphy mô tã kỳ thuật lấy máu kín bằng túi polyvinyl,sau dó, Gibson và cộng sự phát triển hệ thống lấy máu bằng túi dèo thay the chai thủytinh làm cho quy trình lấy máu dược thực hiện ưong hệ thống kín, dâm bào vô trùng.Năm 1957, ông và cộng sự dã tìm ra chất cống dông Ciưate - Phosphate - Dextrose(CPD), sau dó là CPD có thêm Adenin (CPD-A) Những dung dịch CPD và CPD-A hơnhằn ACD do duy trì chức năng hô hấp cùa hồng cầu, bào vệ màng hồng cầu duy trì áplực thẩm thấu nên khi truyền máu, dặc biệt trong truyền máu khối lượng lớn an toàn hơn

và thời gian lưu trừ làu dài hơn

Việc sản xuất các thành phần máu cũng ngày càng phát triển Vào những năm

1940, sau một thời gian truyền máu toàn phần, các chuyên gia nhận thấy có nhiều taibiến như quá tài tuần hoàn, rối loạn dông máu nên ờ Mỹ và các nước châu Âu, người tatách huyết tương từ máu toàn phần và thực hiện phương chàm người bệnh “Cần gì truyềnnấy, không cần không truyền”

Từ những năm 1970, việc sàn xuất các thành phần máu ngày càng phát triển donhu cầu về truyền các thành phần máu như túa lạnh yếu tố VTTĨ, Albumin, ngày cảngtăng

Năm 1990 dến nay, vấn dề truyền máu dược quan tâm không chi dâm bão antoàn bang cách phù họp về mặt miễn dịch mà dàm bão không truyền bệnh nhiễm trùngcho người nhận bằng các biện pháp sàng lọc Ngày nay, với sự phát triển của khoa học

kỳ thuật, trên 600 kháng nguyên nhóm máu ngoài hệ ABO dà dược phát hiện, các túi lấymáu có màng lọc bạch cầu, có chất bảo quân và chất nuôi dưỡng ưu việt hơn, các phươngpháp chiết tách thành phần máu bằng máy tách tự dộng, các kỳ thuật sinh học phân tửứng dụng ưong truyền máu, tiến hành các biện pháp bào dảm an toàn truyền máu về mặtmiễn dịch như truyền máu hòa họp kháng nguyên phenotype (máu trước khi truyền phảidược dịnh nhóm máu ABO, Rh, xét nghiệm hòa họp ờ 22°c, 37°c, AHG - Anti HumanGlobulin, sàng lọc và dịnh danh kháng thề bất thường), hệ kháng nguyên bạch cầu (HLA

- Human Leucocyte Antigen) nên làm cho truyền máu an toàn hơn và cứu sống dược rấtnhiều người bệnh

Theo WHO, dể dáp ứng nhu cầu máu của một quốc gia, cần 2% dân số cùamột nước cho máu 1 lần’ nãm Ớ nhùng nước phát triển, có ngân hàng máu thực sự, việcgiáo dục hiến máu tự nguyện, không lấy tiền dà trờ thành việc cần phải làm Hiện tại, vẫnchưa sàn xuất dược chất thay thế máu, vì vậy việc sử dụng máu từ người hiến máu dềdáp ứng nhu cầu cap cứu vả diều trị bệnh là cần thiết An toàn truyền máu trở thành luậtquốc gia, luật quốc tế và dược kiểm soát chặt chè

1.1 J Tại Việt Nam

Trước năm 1954, truyền máu do quân dội Pháp tồ chức tại bệnh viện ĐồnThủy (nay là bệnh viện Trung ương Quần dội 108) và một số bệnh viện tại Sài Gòn.Trong suốt chiều dài lịch sử, công tác truyền máu dâ góp phần không nhó trong côngcuộc cửu chữa nhân dân nơi hậu phương, thương bệnh binh nơi tiền tuyến Trong thờigian này, máu dược lấy vào chai, tiến hành một số xét nghiệm sàng lọc như giang mai,

sốt rét, HTV, virus viêm gan B (HBsAg), nhóm máu ABO và làm phàn ứng chéo rồitruyền cho bệnh nhân [81.

Từ năm 1993 - 2005, truyền máu ờ nước ta phát triển theo hướng hiện dại củathế giới, từng bước giảm dần hiến máu chuyên nghiệp (HMCN), tãng dần hiến máu tìnhnguyện (HMTN) và phát dộng toàn dân tham gia hiến máu Giai đoạn này, chúng ta dàtừng bước thay thế chai máu bằng túi dẽo có dung dịch bào quàn, thực hiện sàng lọc 5tác nhân lây nhicm qua dường truyền máu là HTV/AIDS, HBV, HCV, giang mai, sốt rétcho tất cà các dơn vị máu tiếp nhận theo khuyến cáo của WHO

Năm 2001, chương trình An toàn truyền máu (ATTM) quốc gia dược phêduyệt Hiện nay, chúng ta dang phấn dấu xây dựng chất lượng các sản phẩm máu và dịch

vụ truyền máu theo tiêu chuẩn châu Âu và dà dạt dược phần nào mục tiêu dề ra là sốlượng dơn vị máu tiếp nhận cũng như tý lệ HMTN ngày càng cao, loại thể tích máu lớnngày cảng tăng, truyền máu chủ yếu là chế phẩm máu

AN TOÀN KHỐNG LÂY LAN BỆNH

Chính sách quổc gia

MỤC TIÉU QUAN TRỌNG

SẢNG LỌC HIV, HCV.HBV

1.2 Các virus chính gây hệnh qua đường truyền máu

Trong xét nghiệm sàng lọc máu nói riêng và ữong chấn đoán bệnh nói chung,xét nghiệm virus luôn là một ơong nhùng xét nghiệm liên tục dược nâng cấp nhờ có sựhiểu biết ngày càng sâu về sinh học phân tứ của virus

1.2.1 Đặc điềm sinh học của HBV

pháp diều trị dối với HBV, dâ phát hiện dược 5 loại virus chính gây nên bệnh viêm gan

dó là virus viêm gan A, B ,c, D, E [36]

Viêm gan do virus viêm gan B hiện nay vẫn là một bệnh rất phổ biến trên toànthe giới và luôn là mối quan tâm lớn dối với công tác y tế cùa toàn cầu Bệnh có ti lệngười mac cao và thường gầy nên nhùng hậu quã nặng nề như xơ gan và ung thư gannguyên phát Viêm gan là tồn thương tại gan với sự có mặt của các té bào bị viêm trong

mô gan Tinh ơạng bệnh có thể phát triển tới việc gây sẹo tại gan Viêm gan cấp tính làkhi bệnh chi kéo dài dưới 6 tháng, viêm gan mãn rinh là khi bệnh kéo dài hơn

Theo dánh giá cùa các nhà nghiên cứu thì không có sự giống nhau về triệuchứng và sự dáp ứng lại liệu pháp kháng virus của bệnh nhân mắc bệnh viêm gan mãntính ờ các vùng khác nhau trên thế giới do có sự khác nhau giữa các kiều gen của HBV[51]

1.2.1.2 Dịch tễ học nhiễm HBV ờ thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức y tế thế giới có khoảng 30% dân số thế giới, tương dương hơn 2

tỳ người dang song dã bị nhiễm HBV Châu Á và Tây Thái Binh Dương là vùng lưuhành cao của HBV chiếm ba phần tư số nhiễm HBV ưên thế giới [25,31,43], khoảng 350triệu người nhiễm mãn tính và trở thành người mang virus [26,57], khoảng 1 - 2 ưiệutrưởng hợp tữ vong mỗi năm Việt Nam là vùng có tỷ lệ nhiễm HBV rất cao 10-15%,trong dó tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B dược ước tính khoảng 8,8% ờ phụ nừ và 12,3% ởnam giới Nhiễm virus viêm gan B mãn tính là nguyên nhân chính gây bệnh gan ờ ViệtNam như xơ gan và ung thư gan

1.2.1.3 Cấu trúc hình thề HBV

1.2.13.1 Cấu trúc HBV

Hình 1.1: cấu trúc virus HBV

[Nguồn: WWW.bbguy.org]

Thuộc nhóm DNA, họ Hepadnavữidae gồm: vỏ bọc, nhân (capsid), genome.

Lớp vỏ bọc: 2 lớp lipoprotein, chửa 3 loại protein và dều là thành phần cơ bảncũa kháng nguyên HBs/\g:

Protein nhỏ có 226 acid amin, chiếm ti lệ cao nhất, mang quyết định khángnguyên HBsAg

Protein trung bình có khoảng 280 acid amin, tính miễn dịch cao, cảm thụ vớialbumin và là thụ thề dể virus tiếp cận tế bào gan

Protein lớn gồm 380 - 400 acid amin, mang quyết định kháng nguyên HBs/\g,

nó có vai trò trong liên kết và xám nhập của virus vào tế bào gan

Lớp capsit: Gồm 183 acid amin, mang dặc trung cùa HBcAg và kháng nguyênlòi HBcAg liên quan den sự nhân lên của virus

Lớp ưong cùng: Gồm genome cùa virus (DNA) vả các enzym như polymerase

- DNA, proteinkinase

1.2.13.2 Hệ gen HBV, chu trình nhân lên cùa HBV

Hệ gen ADN của HBV chi dược thấy ở dạng vòng kép Chuỗi dài hay chuỗi (-)phần lón là dạng vòng phức và liên kết cộng hóa trị với enzyme reverse transcriptase ởdầu 5’[501- Chuỗi ngắn hay chuỏi (+) có chiều dài chiếm khoảng 50-80% so với chuỗi(-) với dầu 5' cố dịnh vả dầu 3' tụ do Gắn với dầu 5' của chuỗi (+) là oligoribonucleotideduợc chụp mũ Hệ gen của virus có 4 hệ thống dọc mở dược xê dịch bộ mã hóa cho 4bàn sao mARN Bàn sao dài nhất (3,5 kb) làm khuôn cho quá trình sao chép hệ gen và sựbiểu hiện của phần tiền lõi hay lõi và polymerase (polproteins) Pol có 3 vùng chính là

vùng amin dầu cùng, reverse transcriptase và RNaseH Vùng tận cùng của protein cũngdóng vai trò then chốt trong việc dóng gỏi ARN Bản sao mã kích thước 2,4 kb mã hóacho các protein pre SI, pre S2 và HBsAg, trong khi bản sao kích thước 2,1 kb chi mã hóacho các protein pre S2 và HBsAg Bân sao nhò nhất mã hóa cho protein X Protein X làprotein không cấu trúc, nó dóng vai ưò như các protein diều hòa của virus và ành hưởngtới số lượng protein của nhân ữong sự diều khiển chu trình té bào, sao chép và sửa chùaADN [50].

Chu trình sống của HB V bắt dầu khi virus gắn vào tế bào vật chủ (tế bào gan)

Sự tấn công vào tế bào có sự tham gia trung gian của vùng pre-S I của HBsAglớn Sau khi liên kết với thụ thể và virion cởi bò lóp vỏ, các nhân của virus trong tế bàochất dược vận chuyển tới nhân bên Ưong - nơi hệ gen vòng lòng lẽo và kép dược chuyênthành ADN vòng dóng (cccADN) và tồn tại như vi thề nhiễm sắc của virus Sự chuyềndổi dược thực hiện bởi các enzyme của tế bào vật chù Các vi thể nhiễm sắc của virus làmkhuôn cho quá ơình sao mã 4 loại mARN của virus bởi ARN polymerase lĩ của tế bàovật chủ Các ARN này dược dóng gói và sau dó diễn ra quá ưình tổng hợp chuỗi âm vàchuồi dương Trong các mảnh nhân của tế bào chất, sự sao chép của hệ gen HBV diễn ranhờ cơ chế tồng hợp không liên tục của chuỗi (-) Cuối cùng, sự hình thành virion theophương thức này chồi ơong mạng lưới nội chất là nơi tất câ các protein bề mặt virusviêm gan dược tổng hợp Sau khi nãy chồi, các virion dược dưa ra ngoài chủ yếu theocách vận chuyền của bọng và tiếp tục lây nhiềm sang các tế bào khác Trong khi tấn côngcác tế bào gan, HBV không trực tiếp giết các tế bào vật chủ do nó dược giãi phóng khỏi

tế bào mà không cần dung giải chúng Vi thế, sự tổn thương của gan là do sự ảnh hưởnglẫn nhau một cách trực tiếp giữa hệ thống miễn dịch cùa vật chủ với các tế bào gan bịnhiễm HBV [381

Hình 1.2: Chu trình sống của HBV

[Nguồn: http://cugh.org]

1.2.13.3 Các marker sử dụng trong chẩn đoán HBV

HBsAg: kháng nguyên bề mặt, phát hiện ờ múc dộ cao

HBeAg: kháng nguyên nhân, liên quan với tái tồ hợp lượng lớn virus, khà năngtruyền HB V ờ cá thể rất cao, gặp ở bệnh nhân viêm gan cấp

HBcAg: Kháng nguyên nhân

Anti-HBs: thề hiện có thề dã nhiễm HBV, kháng thẻ truyền tù mẹ sang conhoặc kháng thể do vacxin HBsAg

Anti-HBe: chi diêm nhiễm trùng HBV

IgM anti-HBc: chi điểm nhiễm trùng HBV, có thẻ phát hiện 5 - 6 tuần sau phơinhiễm

HBsAg là kháng nguyên bề mặt của viêm gan B, xuất hiện sớm nhất tronghuyết thanh HBsAg mất di sau 2 - 3 tháng nhưng cùng có thể tồn tại 6 tháng hay suốtdời Neu một người có HBsAg dương tinh ưên 6 tháng có nghĩa là người dó mang HBVmãn tính

Anti HBs là kháng thể chống lại KN bề mặt của virus viêm gan B, xuất hiện rấtmuộn sau 1 - 3 tháng kề từ khi HBV xâm nhập vào cơ thề, lúc dó HBsAg thường hếtưong huyết thanh Anti HBs có vai trò bảo vệ cơ thề, dồng thời Anti HBs cũng có giá trịđánh giá hiệu quả của vaccine

HBeAg là kháng nguyên nhân của virus HBV, xuất hiện sau HBsAg, nồng dộcủa HBeAg tồn tại cùng với nồng dô HBsAg ơong huyết thanh, giảm sau khoảng thờigian 10 tuần nhiễm bệnh và thường mất sớm hơn HBs/Xg Khi HBeAg tồn tại trong máu

có nghía virus dang dược nhân lên rất mạnh, láy nhiễm ở thời kỳ này khá cao

Anti HBe: là kháng thế chống lại HBeAg, kháng thề thường xuất hiện ngay saukhi HBeAg mất di Khi có mặt Anti HBe là dấu hiệu tốt của dáp ứng miễn dịch, khảnăng lây truyền ở thời kỳ này rất thấp, virus không sinh sản

HBcAg là kháng nguyên lõi xuất hiện trong nhân tể bào gan, không xuất hiệnữong huyết thanh HBcAg rất có giá trị chẩn doán nhiễm HBV vì HBcAg dương tinh thìluôn có HBsAg dương tính

Anti HBc là kháng thể chống lại HBcAg, là dấu ấn miền dịch xuất hiện sau khinhiễm HBV Kháng thề HBc gồm hai loại: Kháng thề HBc loại IgM thưởng tồn tại tronggiai doạn nhiễm cấp và mất ưong giai đoạn hồi phục, kháng thể HBcĩgG tồn tại nhiềunăm ưong huyết thanh của bệnh nhân dã bị nhiễm HBV Anti HBc có tác dụng như mộtchi điểm chửng tỏ sự có mật của HBcAg

1.2.13,4 Diễn biến huyết thanh và các giai đoạn cửa sổ của người nhiễm HBV

các dấu ấn miễn dịch dược phát hiện trong huyết thanh của bệnh nhàn, thưởng phải saunhicm HBV 50 - 60 ngày.

1.2J Đặc điềm sinh học của HCV

1.2.2.1 Bệnh viêm gan c

Trước dây, virus viêm gan B dược xem là nguyên nhân chính dẩn dến viêmgan do truyền máu nhưng sau khi các phương pháp chẩn doán và phòng ngừa virus nàydược công bố thì tình ưạng viêm gan do truyền máu vẫn tiếp tục xảy ra Các trưởng hợpnày dược gọi là viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu Tác nhân gây bệnh

là một loại virus chưa biết và rất khó xác định Mâi dến năm 1989, sau nhiều thừ nghiệm,nhóm nghiên cứu của Choo [431 dã thành công trong việc nhân dòng một phần kiểu gencủa virus này, gọi là virus viêm gan c và xây dựng thành công phương pháp phát hiệnnhờ kháng thề kháng HCV ơong máu Nghiên cứu này cũng chi rõ, HCV là thủ phạmchính gây ra các trường hạp viêm gan không A, không B và lây sau truyền máu Sựnhiễm HCV trong thời gian dài là nhân tố chính dẫn đến viêm gan mạn tính, xo gan vàung thư gan [311

Viêm gan c là bệnh truyền nhiễm, chủ yếu ành hưởng dến gan, do siêu vi viêmgan c (HCV) gây ra Bệnh thường không có ưiệu chứng, nhưng viêm mạn tính có thể dẫnđến mô sẹo ờ gan và cuối cùng là xơ gan Nhìn chung, triệu chứng của xơ gan biểu hiện

rõ sau nhiều năm mắc phải Trong một số trường hợp, bệnh nhân xơ gan sỗ bị suygan,ung thư gan hoặc thực quàn và giàn tình mạch dạ dày có thề gây từ vong

HCV dược xếp vào họ Fiaviviridae, dược chia thành 6 kiểu gen (genotype)

chính và hơn 50 kiểu phụ (subtype) khác nhau Giữa các kiều gen khác nhau, ưình tựơong hệ gen HCV sai khác khoảng 1/3 còn giữa các kiểu phụ khác nhau trong cùng mộtkiểu gen thì sự khác biệt ít hơn nhưng vẫn ở mức đáng kể Một số nghiên cứu dã tìm thấy

có một vài khác biệt ưong cách gây bệnh cùa các kiểu gen, mặc dù bãn chất và quy môcủa chúng vẫn dang dược bàn cài Do dó, kiểu gen HCV có ảnh hường lớn dển quá trìnhdiều trị Theo tính toán, mỏi ngày trong cơ thề người bệnh có khoảng 1012 the HCV mớidược sân sinh [25,3 II

1.22.2 Dịch tễ học nhiễm HCV ờ thế giới và Việt Nam

HCV dược xem là tác nhân chính chịu trách nhiệm cho 90% - 95% các trườnghợp viêm gan không-A và B sau truyền máu [341 HCV xây ra ơên toàn cầu nhưng ítdược biết den vì nhiễm trùng thường không có triệu chứng Tuy nhiên, tần suất dược ghinhận thay đổi từ 0,5 - 2,0% ở Tây Âu dến cao như 20% ở Ai Cập Virus này dược coi làmột "sát thủ thầm lặng" do da số bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng trong suốtthời gian dài nhiễm HCV nên gan bị hủy hoại nặng nhung bệnh nhân không biết Hiệnnay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng dồng cho thấy virus này là một mối longại nghiêm trọng Tổng cộng trên thế giới có khoảng 200 triệu người (khoảng 3% dân

số thế giới) dang bị nhiễm HCV và 3-4 triệu người mới nhiễm mỗi năm [50], Tỳ lệnhiễm HCV ờ các khu vực trên thế giới là khác nhau, trong dó các nước châu Phi vàchâu Á có tỳ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới > 10% dân so

Ò Việt Nam, các công trình nghiên cứu cho thấy:

• Tỷ lệ anti-HCV (+) ờ người bình thường là 4,31 %

• Tỷ lệ anti-HCV (+) ở người truyền máu nhiều lần cao: Đỏ Trung Phấn 15,2% ,Phan Bích Liên 15%

1.22.3 Cấu trúc HCV

Envelope glycoprotein

HCV dược xếp vào họ Flaviviridae, là virus ARN sợi đơn dương, có hình cầu

với dường kính khoảng 55-56 nm gồm: vỏ bọc, nhân, genome

Vỏ bọc: Gồm lớp lipid và protein xuyên màng, protein màng giúp virus tiếpcận tế bào dich

Nhân: protein dã dược phosphoryl hóa, làm nhiệm vụ diều hòa sao chép gen.Genome: Sợi RNA cấu trúc bời 9400 acid amin và các gen mã hóa protein hạtvirus cần cho sự sao chép HCV

Sợi ARN virus dược dóng gói ưong vò capsid hình thành từ các protein lõi vàbao bọc ngoài cùng là lóp võ bọc gồm các glycoprotein (hình 1.4) Hệ gen của HCV cỏkích thước khoảng 9,6 kb vừa là nơi chửa và bão quân thông tin di truyền, vừa có chứcnăng như mARN làm khuôn tổng hợp protein HCV phân lập dược từ các bệnh nhânthuộc các khu vực khác nhau trên thế giới có thề khác nhau về kích thước hệ gen [431.cấu trúc ARN của HCV bao gồm hai dầu tận cùng 5’ và 3’ không mà hóa, ở giừa là vùng

mã hóa cho protein cấu trúc (C, E1, E2) và protein không thuộc nhóm cấu trúc (NS2,NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B)

Vùng 5’ không mã hóa (5'-noncoding viết tắt là 5’-NC) có tính bảo thủ rất cao,gồm khoảng 341 - 344 nucleotide Giừa các sợi HCV riêng biệt, giừa các kiều phụ vàkiều gen khác nhau thi dộ tương dồng về trình tự 5’-NC tối thiều là hơn 90% Đây cùng

là phần duy nhất ưong hệ gen HCV cho thấy sự tương dồng với hộ gen của các virus dàbiết khác, chảng hạn, so với các pesti virus thì sự tương dồng là khoảng 50% Chính vìvậy, dây là vùng trình tự lý tường dể thiết kế các cặp mồi cho xét nghiệm RT-PCR pháthiện sự có mặt của HCV

Tương tự như tất cã virus khác, HCV không thề tự tái bàn vì nó không có dầy

dủ các nguyên liệu cần thiết Vi vậy, dể tái bân, virus phải nhiễm vào tế bào vật chủ vàchiếm lấy bộ máy sao chép cùa tế bào, bao gồm các enzyme và protein Sau khi nhiễmvào tế bào vật chủ, các bước tái bàn của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất Cà hai loạiprotein của tế bào và virus dều giúp cho HCV tái bản một cách dẻ dàng Hệ gen cùaHCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein virus khác nhau, bao gồm các protein cấu trúc(protein vỏ và protein lõi) giúp hình thành vỏ capsid và các protein không thuộc nhómcấu trúc (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) liên quan den quá ơình tái bàn củavirus Các nghiên cứu gần dây dà làm sáng tỏ chức năng của nhiều protein ưong số này.Tuy nhiên, vai ơò của một vài protein cũng như một số khía cạnh của quá trình tái bân

virus và mối tương quan giừa protein virus và tế bào chủ vẫn chưa dược hiểu một cáchdầy dù.

Chu trình tái bản cùa HCV gồm các bước sau:

• Gắn vào tế bào vật chù: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tương tác giừa lớp vỏprotein của virus (protein El và E2) với các phân từ là thụ thề bề mặt khâm trên màngngoài tế bào dích

• Xâm nhập vào tế bào chủ và cời lóp vò bọc, giải phóng ARN virus, HCV divào tế bào dích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể Sau khi HCV gắn lên bề mặt thụthể, các tế bào dồng hóa thụ thể sè hình thành một túi màng mỏng chứa HCV

• Sau khi vào trong tế bào, HCV sè giãi phóng hệ gen vào tế bào chất của tế bàochủ và bắt dầu quá trình tái bản

• Dịch mã hệ gen HCV thành protein virus: Khi dược giải phóng, ARN cùaHCV dược dùng làm khuôn dề tồng hợp các protein của nó HCV sử dụng các thànhphần của tế bào chủ, dặc biệt là ribosome dể tiến hành dịch mã Ọuá ưình này chi dòi hòimột vài thành phần trong bộ máy dịch mã của tế bào chủ chứ không phải là tất cả Điều

dó cho phép HCV khời dộng dịch mã hiệu quà ngay cà khi các diều kiện tế bào khôngthuận lợi Sản phẩm dầu tiên của quá trình dịch mã là một sợi polyprotein dài khoáng

3000 acid amin có chứa tất cà 10 protein virus cần cho quá trình tái bản của HCV Đầy làquá trình then chốt dối với HCV vì nếu không có các protein quan trọng này sè khôngtạo dược các virus mới

• Tái bân hệ gen HCV: Quá trình tái bản xảy ra nhở enzyme polymerase NS5B,

là một protein không thuộc nhóm cấu trúc, tồng hợp ARN ữên sợi khuôn ARN gồm haibước chính: 1) hệ gen virus goc dược dùng làm khuôn dể tổng hợp sợi ARN âm và 2) sợiARN âm sau dó dược dùng làm khuôn dể tồng hợp sợi ARN dương của HCV mới Haisợi ARN mới tổng hợp có thề gan với nhau hình thành ARN sợi dôi, trong khi dó, tế bàocho rang ARN sợi dôi là báo hiệu nhiễm virus và sẽ kích hoạt hàng rào phòng thủ của tếbào dể ngăn chặn quá trình tái bãn và phá hủy ARN virus Hơn nữa, polymerase HCVkhông thể dọc dược tít ARN dang ờ dạng sợi dôi Vì vậy, dế ưánh hàng rào phòng thủcủa tế bào và duy ưì quá ơình tái bàn, HCV phải giữ cho các sợi ARN âm và dương táchrời nhau Lúc này enzyme helicase, nằm trong vùng trình tự mã hóa cho protein khôngthuộc nhóm cấu trúc NS3, thực hiện nhiệm vụ bang cách bám vào và tách các sợi ARN

ra trong suốt quá trình tái bàn hệ gen

• Đóng gỏi virus mới và giãi phóng chúng ra khỏi tế bào chủ: Các hạt virus mới baogồm 3 thành phần chính là sợi dơn ARN hệ gen HCV, vò capsid và lớp vỏ bọc của virus.Các virus mới sau dó dược chuyển tới màng ngoài cùa tế bào vật chủ, giải phóng rangoài và lầy nhiễm cho các tể bào mới.

Hinh 13: Chu trình sống của HCV

fNguon: WWW.bbguy.org]

1.2.2.4 Các marker sữ dụng trong chẩn đoán HCV

Anti HCV: Có mật ờ bệnh nhân nhicm HCV (bằng ELISA)

IgM anti HCV: Có mặt ờ viêm gan c cấp tính (bang ELTSA)

Có thể rút ngắn giai doạn phát hiện anti-HCV bang cách kết hợp kháng nguyênlõi, NS3 và c10ũ

RNA của virus trong huyết thanh (bằng PCR)