ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN của một số nấm lớn tại KIM bôi TỈNH hòa BÌNH và XUÂN sơn TỈNH PHÚ THỌ đối với một số VI KHUẨN gây BỆNH

Các tài liệu, số liệu, kết quả được sử dụng trong khóa luận là chính xác, khoa học và đúng với quá trình nghiên cứu của bản thân tôi tại Phòng thí nghiệm – Trung tâmnghiên cứu và phát tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

KHOA MÔI TRƯỜNG

==============

NGUYỄN THỊ NGA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MỘT SỐ NẤM LỚN TẠI KIM BÔI TỈNH HÒA BÌNH VÀ XUÂN SƠN TỈNH PHÚ THỌ ĐỐI VỚI MỘT SỐ

VI KHUẨN GÂY BỆNH

HÀ NỘI – NĂM 2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG HÀ NỘI

KHOA MÔI TRƯỜNG

==============

NGUYỄN THỊ NGA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA

MỘT SỐ NẤM LỚN TẠI KIM BÔI TỈNH HÒA BÌNH VÀ

XUÂN SƠN TỈNH PHÚ THỌ ĐỐI VỚI MỘT SỐ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi Nguyễn Thị Nga xin cam đoan rằng khóa luận này là thành quả của bản thântôi trong suốt thời gian làm khóa luận vừa qua

Khóa luận tốt nghiệp là thành quả từ sự nghiên cứu hoàn toàn thực tế trên cơ sởcác số liệu theo dõi thực tế mới được thực hiện theo hướng dẫn của giáo viên hướngdẫn

Các tài liệu, số liệu, kết quả được sử dụng trong khóa luận là chính xác, khoa học

và đúng với quá trình nghiên cứu của bản thân tôi tại Phòng thí nghiệm – Trung tâmnghiên cứu và phát triển nấm

Khóa luận được thực hiện hoàn toàn mới là của riêng tôi không sao chép bất cứ

số liệu của tài liệu nào khác

Mọi sự tham khảo sử dụng trong khóa luận đều được trích dẫn các nguồn tài liệutrong báo cáo và danh mục tài liệu tham khảo

Cuối cùng tôi xin cam đoan rằng khóa luận này là hoàn toàn trung thực, chínhxác và khoa học

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Nga

LỜI CẢM ƠN

Lời nói đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ban lãnh đạo nhàtrường, ban lãnh đạo khoa Môi trường, các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm cùngcác quý thầy cô Trường Đại học Tài nguyên và Môi trường Hà Nội đã dìu dắt vàtruyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại đây cũng như đã độngviên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất để em được học tập, nghiên cứu trong suốt thờigian làm khóa luận

Đặc biệt, chúng em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất đến: TS

Lê Thanh Huyền - giảng viên khoa Môi trường- Trường Đại học Tài nguyên và Môitrường Hà Nội - cô đã hướng dẫn và chỉ bảo cho chúng em trong suốt quá trình hoànthành khóa luận tốt nghiệp Cô đã tận tình chỉ bảo cho chúng em những kiến thức lýthuyết và những thực nghiệm quý báu cùng với đó là những lời động viên và truyềnđạt cho em rất nhiều cảm hứng, kinh nghiệm, cũng như các kĩ năng làm việc Cô làngười trực tiếp hướng dẫn em chỉnh sửa hoàn thiện khóa luận này

Em xin trân trọng cảm ơn đề tài “Nghiên cứu các loài nấm lớn có giá trị để bổsung vào danh mục loài nguy cấp, quý hiếm được ưu tiên bảo vệ và đề xuất biện phápbảo tồn, phát triển”, mã số TNMT.2018.04.11 đã hỗ trợ em thực hiện khóa luận này.Tiếp theo, chúng em xin được cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ ân cần chỉ bảo nhiệttình của TS.Cồ Thị Thùy Vân cùng với chị Hoàng Thị Soan là người hướng dẫn embên Trung tâm nghiên cứu và phát triển nấm - Viện di truyền nông nghiệp Việt Namtrực tiếp để giúp em hoàn thành quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Đồng thời em xin gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô khoa Môi trường đãcho em những đóng góp, góp ý, lời động viên bổ ích trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã cố gắng hoàn thiện tốt khóa luận của mình nhưng chắc chắn sẽ khôngthể tránh khỏi những xơ xuất, thiếu sót Vì vậy em kính mong nhận được sự thông cảm

và mong nhận được nhiều ý kiến từ các thầy, cô giáo để khóa luận tốt nghiệp của emđược hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Nga

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Hàm lượng chất khô của một số loài nấm (%)

Bảng 1.2.Hàm lượng nguyên tố thiết yếu trong một số loài nấm (mg /kg chất khô)Bảng 2.1 Danh mục các dụng cụ, thiết bị, hóa chất và thành phần MT sử dụng

Bảng 3.1.Bảng theo dõi đường kính trung bình của hệ sợi nấm trong môi trường cóthành phần thay đổi

Bảng 3.2.Kết quả tách thuần nấm lớn dưới dạng hệ sợi nấm trên môi trường PGABảng 3.3.Kết quả tách thuần nấm lớn dưới dạng hệ sợi nấm trên môi trường hữu cơBảng 3.4.Kết quả tách thuần nấm lớn dưới dạng hệ sợi nấm trên môi trường vô cơBảng 3.5.Khả năng kháng E.coli bằng hệ sợi trong điều kiện nhiệt độ thay đổi

Bảng 3.6 Khả năng kháng S aureus bằng hệ sợi trong điều kiện nhiệt độ thay đổi

Bảng 3 7 Khả năng kháng P aeruginosa bằng hệ sợi trong điều kiện nhiệt độ thay đổi

Bảng 3 8 Khả năng kháng B.subtilis bằng hệ sợi trong điều kiện nhiệt độ thay đổi

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong sinh quyển, rừng là một nhân tố quan trọng để bảo vệ môi trường và đảmbảo cho sự phát triển bền vững Hệ sinh thái rừng đa dạng và được cấu tạo bởi nhiềuthành phần trong đó nấm lớn là một thành phần của hệ sinh thái rừng Nó không chỉgiữ vai trò quang hợp cung cấp O2 cho con người và mọi sinh vật khác mà còn đóngvai trò cân bằng hệ sinh thái giúp hệ sinh thái của chúng ta đa dạng và phong phú hơn.Ngoài ra nhiều loài nấm còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp như côngnghiệp thực phẩm, sản xuất chế phẩm hóa học, sử dụng trong y dược sản xuất các loài

thuốc quý Nấm lớn là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng (Termitomyces

albuminosus, Macrocybe gegantea), là nguồn thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng

và được xếp vào loại rau sạch rất giàu dinh dưỡng chứa nhiều protein, các chất khoáng

và vitamin (A, B, C, D, E ) dẫn xuất adenosine có trong Ganoderma capense và

G.amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu Đồng thời

chúng có giá trị và vai trò quan trọng có nhiều loài dùng làm dược liệu, một số loàilàm thuốc phòng chữa ung thư, dùng làm trắng vải, giấy, dùng trong công nghiệp dagiày, dùng để phân giải kim loại năng, chất độc dioxin, Selenium [15]

Hiện nay, trên thế giới đang có xu hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất thiênnhiên có nguồn gốc từ thực vật có tính kháng khuẩn mạnh và đặc biệt là có độ an toàncao (độ độc hay tác dụng phụ thấp), sử dụng để thay thế cho các loại kháng sinh thôngdụng đang bị đề kháng Nước ta lại có một hệ thực vật hết sức phong phú về chủngloại và thành phần loài Trong đó thực vật có thể được sử dụng làm thuốc chiếm tỷ lệkhông nhỏ Nấm cũng nằm trong số các loài có thể sử dụng để thay thế các thành phầnkháng sinh hóa học nhưng ở Việt Nam chưa có nhiều công trình, đề tài nghiên cứuchuyên sâu, mở rộng về tính kháng khuẩn của nấm

Trước đây đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của một

số loài nấm nhưng số lượng vẫn còn khá ít Do đó việc nghiên cứu và khảo sát tìm

kiếm các chủng nấm có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính kháng một số loại vi

khuẩn như: E.coli, S.aureus, P.aeruginosa, B.subtilis dùng để điều trị bệnh cho người

là một điều thú vị và được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Chính vì vậy, em tiến hành

thực hiện đề tài “Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của một số nấm lớn tại Kim Bôi tỉnh Hoà Bình và Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ đối với một số vi khuẩn gây bệnh” với

mục đích tìm ra loài nấm có khả năng kháng một số vi khuẩn kháng kháng sinh phục

vụ cho các nghiên cứu về y dược

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập được hệ sợi nấm lớn tại Kim Bôi tỉnh Hòa Bình và Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ

- Đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn của nấm lớn tại Kim Bôi tỉnh Hòa Bình

và VQG Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ đối với một số vi khuẩn gây bệnh như: E.coli,

S.aureus, P.aeruginosa, B.subtilis.

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các loại nấm lớn tại Kim Bôi tỉnh Hòa Bình và Xuân Sơn tỉnh Phú

Thọ

- Phân lập được các hệ sợi của nấm lớn tại Kim Bôi tỉnh Hòa Bình và Xuân Sơn

tỉnh Phú Thọ

- Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nấm đã phân lập được hệ sợi

đối với một số vi khuẩn gây bệnh: E.coli, S.aureus, P.aeruginosa, B.subtilis.

- Chọn ra được mẫu nấm có khả năng kháng khuẩn tốt nhất từ đó đề xuất biệnpháp bảo quản, lưu giữ và bảo tồn hệ sợi các nấm lớn tại khu bảo tồn thiên nhiênThượng Tiến, huyện Kim Bôi tỉnh Hòa Bình và VQG Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm lớn

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm lớn trên thế giới

Trên thế giới đã xác định được ít nhất 14.000 loài (Trịnh Tam Kiệt, 2013), trong

số đó có khoảng 2000 loài nấm có thể ăn và dùng làm thuốc [11] Ngoài nguồn thu hái

từ tự nhiên, người ta đã trồng được hơn 80 loại theo phương pháp nhân tạo.Ngành sản xuất nấm ăn đã hình thành và phát triển trên thế giới từ hàng trăm năm.Hiện nay có khoảng 2000 loài nấm ăn được và việc nghiên cứu sản xuất nấm ăn trênthế giới ngày càng phát triển mạnh mẽ và trở thành một ngành công nghiệp thực phẩmthực thụ

Thế kỉ XVIII-XIX là giai đoạn Nấm học phát triển mạnh mẽ với nhiều công trìnhnổi tiếng của các tác giả như: Bulliard (791,1813,1815); Fries (1821, 1830, 1832,1838); Saccardo (1888); Karsten (1881, 1889); Patouillard N.(1890-1928) …Vào đầuthế kỉ XX, Nấm học phát triển rực rỡ, trở thành một ngành khoa học thực sự (TrịnhTam Kiệt, 1980)

Trong những năm cuối thế kỉ XX, đầu thế kỉ XXI các nhà nghiên cứu đã kết hợpphân loại truyền thống với phân loại dựa trên những tiêu chuẩn hiện đại như: các phảnứng hóa học, sự phân tính, hệ sợi nấm, đặc điểm nuôi cấy, đặc biệt là cấu trúc phân tửAND đã mang lại những kết quả chính xác hơn [20]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu nấm lớn ở Việt Nam

Từ cuối thế kỉ XIX trở về trước hầu như không có công trình nghiên cứu về phânloại nấm tại Việt Nam Người Việt Nam đầu tiên có công trình nghiên cứu về nấm làPhạm Hoàng Hộ (1953) Ở miền Bắc Việt Nam, việc nghiên cứu nấm được bắt đầuvào năm 1954 tại trường Đại học Tổng hợp Hà Nội lúc bấy giờ với các công trình tiêubiểu của Nguyễn Văn Diễn (1965), Trịnh Tam Kiệt với đề tài “Bước đầu điều tra bộ

Aphyllophorales vùng Hà Nội” (1965, 1966, 1970, ), Hanns Kreisel (1966), P Joly

(1968)

Tiếp sau đó là các công trình của Lê Văn Liễu (1977), Lê Xuân Thám (1996,2001), Ngô Anh (1978, 2003), tiếp tục nghiên cứu về thành phần loài và đặc điểm

sinh học của một số nhóm nấm, đặc biệt là họ nấm Linh chi Ganodermataceae.

Thời gian này cũng xuất hiện những công trình nghiên cứu tổng quan về khu hệnấm lớn Việt Nam của Trịnh Tam Kiệt (1975, 1996, 1998, 1999) nêu lên danh lục các

loài nấm lớn nói chung và bộ Aphyllophorales nói riêng Đặc biệt Trịnh Tam Kiệt và

các tác giả khác đã công bố Danh lục các loài Nấm đã được ghi nhận ở Việt Nam trongDanh lục các loài Thực vật Việt Nam (2001) với tổng số 2.250 loài [11]

Việt Nam là một nước nông nghiệp giàu tiềm năng lâm nghiệp do có nguồn phếphụ phẩm từ nông, lâm nghiệp (rơm, rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô…) đạtmức trên 40 triệu tấn/năm, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm Bên cạnh

đó, điều kiện tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm…) của nước ta rất phù hợp với việc trồng nhiềuloài nấm [1]

Hiện nay việc nuôi trồng nấm đang được đẩy mạnh ở các địa phương trong cảnước và là nguồn thu nhập đáng kể trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng nôngnghiệp, nông thôn Nhận định trên đã được đánh giá cụ thể tại báo cáo (thực trạng và

giải pháp phát triển nấm tại các tỉnh phía Bắc - Hội nghị phát triển nấm các tỉnh phía

Bắc, Đồ Sơn - Hải Phòng 22/9/2011) Đặc biệt Thủ tướng Chính phủ ra Quyết định số

439/QĐ-TTg ngày 16/4/2012 phê duyệt Danh mục sản phẩm quốc gia thực hiện từnăm 2012 thuộc Chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020 trong đósản phẩm nấm ăn và nấm dược liệu là một trong chín sản phẩm được ưu tiên Thôngqua phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu và phát triển sản xuất, tiêu thụ sản phẩmnấm ăn và nấm dược liệu trên thế giới và thực trạng sản xuất nấm ở Việt Nam Nhómnghiên cứu chuyên sâu về nấm ăn, nấm dược liệu được thành lập nhằm cụ thể hóachiến lược của Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam liên quan đến nghiêncứu khoa học trong lĩnh vực phát triển chuyên ngành nấm Phối hợp được sức mạnhtổng hợp, không ngừng đổi mới trong nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệnhằm tạo ra sản phẩm khoa học có giá trị đáp ứng yêu cầu của xã hội

1.1.3 Phân loại và đặc điểm hình thái

• Ngành Blastocladiomycota trước đây từng được cho là một nhánh phân loại của

Chytridiomycota Ngành Blastocladiomycetes là những sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh

của tất cả các nhóm sinh vật nhân chuẩn và chúng giảm phân tạo bào tử, không giốngvới chytrid họ hàng gần của chúng là những loài chủ yếu giảm phân tạo hợp tử

• Ngành Neocallimastigomycota đầu tiên cũng đặt vào ngành Chytridiomycota Những

thành viên của ngành nhỏ này là những sinh vật kỵ khí sống trong hệ tiêu hóa của

những động vật ăn cỏ lớn và cũng có thể sống ở môi trường nước và mặt đất Chúngkhông có ty thể nhưng lại chứa những hydrogenosome là nguồn gốc của ty thể Giống

như chytrid, neocallimastigomycetes có thể tạo ra những bào tử động mà có một hay

nhiều tiên mao ở phía sau

• Ngành Zygomycota (nấm tiếp hợp) có hai lớp: Zygomycetes và Trichomycetes.

Chúng sinh sản hữu tính với những bào tử giảm phân được gọi là bào tử tiếp hợp và vô

tính với túi bào tử Loài mốc bánh mỳ đen (Rhizopus stolonifer) là loài phổ biến thuộc ngành này, một chi khác là Pilobolus có khả năng bắn ra bào tử xa đến vài mét trong không khí Những chi liên quan đến y học bao gồm Mucor, Rhizomucor và Rhizopus.

Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng Nấm tiếp hợp là nhóm đa ngành và có thể có cậnngành trong nhóm phân loại này

• Ngành Glomeromycota là những nấm tạo ra rễ mút phân nhánh (arbuscular

mycorrhizae) ở thực vật bậc cao Sự cộng sinh này đã có từ cổ đại với những bằngchứng cho thấy đã có từ 400 triệu năm về trước

• Ngành Ascomycota (nấm túi hay nấm nang), là nhóm phân loại đông nhất trong Eumycota (Nấm thật) Chúng tạo ra những bào tử giảm phân gọi là bào tử nang

được chứa trong một cấu trúc đặc biệt có dạng giống túi gọi là nang (ascus) Ngànhnày bao gồm nấm nhăn (moscela), vài loại nấm lớn và nấm cục, những nấm men đơn

bào (như các chi Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia và Candida) và nhiều nấm

sợi sống hoại sinh, ký sinh và cộng sinh Nhiều loài nấm nang chỉ trải qua quá trìnhsinh sản vô tính (ở nấm gọi là anamorph), tuy nhiên những dữ liệu phân tử đã giúpnhận dạng được những giai đoạn hữu tính (teleomorph) gần nhất của chúng ở nấmnang Bởi những sản phẩm của quá trình giảm phân được chứa trong nang nấm nên vài

loài nấm nang (như Neurospora crassa) được sử dụng để giải thích những nguyên lý

của di truyền học

• Ngành Basidiomycota (Nấm đảm) sản xuất ra những bào tử chứa trong những thân

gọi là đảm, đa phần những loài nấm lớn đều thuộc ngành này Những loài nấm đảm

quan trọng khác bao gồm nấm Ustilago maydis gây bệnh cho ngô, chi nấm cộng sinh Malassezia gây nên gàu ở người.

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái

Nấm lớn hay quả thể nấm thường để chỉ những loại nấm thuộc ngành

Basidiomycota và Agaricomycetes [11].

Hình 1.1 Hình ảnh cấu tạo của nấm lớn

Khi nấm trưởng thành, dưới mũ nấm có các phiến mỏng (phiến nấm) hay ốngtròn nhỏ li ti Các phiến nấm hay ống nhỏ là phần để sinh ra các bào tử, bào tử đượccoi như hạt giống của cây trồng Nấm có vô số bào tử, một quả thể nấm trưởngthành có hàng tỉ bào tử Khi nấm già mà không được hái, cây nấm sẽ nứt bao, xoè ô vàphát tán bào tử, các bào tử rơi vào không khí hay bay đi xa, bám vào rơm rạ, gỗ, đất.Gặp điều kiện thuận lợi như độ ẩm, nhiệt độ thích hợp chúng nẩy mầm tạo nên câynấm Cây nấm mọc có đủ dinh dưỡng và điều kiện môi trường tốt sẽ phát triển và lặplại quy trình trước đó Điều này giải thích vì sao nấm mọc ngoài tự nhiên mà khôngcần cấy giống nấm [13]

* Hình thái của thể sinh bào tử

Hình 1.2 Hình ảnh về hình thái của thể sinh bào tử

Quả thể hay thể sinh bào tử của nấm rất đa dạng:

Dạng quả mỏng có lớp sợi bện kết rắn chắc; dạng da mỏng; dạng gỗ dày; dạnggò; dạng gối; dạng chải cuộn ngược ở dạng trên giá thể và cuộn lên thành dạng vành,dạng mũ hoàn chỉnh, nối tiếp nhau Chúng rất phổ biến ở các nấm sống trên gỗ

Dạng mũ đính, mũ hình bán cầu dẹp hay dạng sò, hến, dạng quạt chúng đínhvào giá thể trên một diện rộng Quả thể nấm trong trường hợp này thường phẳng, dẹp.Chúng đính đơn độc hay xếp thành dạng ngói lợp, cái nọ trên cái kia

Dạng tán, dạng ô gồm những mũ nấm dính trên cuống nấm với các dạng phụnhư có cuống ngắn đến gần như không cuống, cuống đính phía bên của mũ, cuốnglệch và cuống đính giữa

Mũ nấm cũng gồm rất nhiều dạng khác nhau như: Mũ dạng hẹp, phẳng; mũ dạnghẹp, hơi lồi; mũ dạng hẹo lồi thành gồ; mũ dạng phẳng, dẹp, lõm dạng rốn; mũ dạngphễu; mũ dạng bán cầu; mũ dạng chuông; mũ dạng nón

Bề mặt mũ nấm cũng rất khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài Mũ nhẵn hay cónhững vảy, mụn, u lồi ; có lông thô hay nhày, dính, màu sắc của mũ nấm hết sứckhác nhau Màu sắc của mũ nấm có thể đồng đều hoặc gồm các tông màu khác nhau Thịt nấm cũng rất khác nhau: Chất thịt, chất keo, chất sáp, chất sụn, chất thịt - bì,chất bì, chất mềm, chất gỗ cứng, chất sừng Chúng có cấu trúc đồng nhất phân tầnggồm 2,3 lớp Thịt nấm rất khác nhau về màu sắc, mùi, vị cũng như phản ứng vớikhông khí và các chất hoá học, ví như phản ứng với KOH chuyển sang màu tối ở nhiềunấm có mô màu tối

Cuống nấm có các dạng như: Cuống ngắn; cuống đính bên; cuống nấm rất khácnhau về hình dạng Cuống nấm có thể đặc, xốp hay rỗng ở giữa Chất thịt của cuốngtương tự như mũ hay khác nhau như chất thịt dạng sợi, chất thịt, sụn, sừng, gỗ, Trêncuống có thể nhẵn hay có các phần phụ như vảy, lông, vết nứt cũng như vòng và baogốc đã nêu ra ở trên

Bụi bào tử: Ở nấm lớn chúng đều phóng bào tử một cách chủ động vào khôngkhí Gồm các màu chính sau: bụi bào tử màu trắng; bụi bào tử màu hồng; bụi bào tửmàu vàng gỉ sắt; bụi bào tử màu tím; bụi bào tử màu đen

Tơ nấm trong suốt không màu nhưng khi phát sinh bào tử có màu khác nhau(vàng, đỏ, đen, nâu ) nên người ta dễ nhầm lẫn màu của sợi nấm Với nhóm nấm lớnthì nấm mà ta thường gọi thực ra là quả thể của sợi nấm Quả thể có nhiều hình dạng vàmàu sắc khác nhau Một số nấm được biết đến có thể ăn được đã được chúng ta sử

dụng từ lâu, nhưng vẫn còn rất nhiều loại nấm chưa xác định có độc tố rất mạnh nênchúng ta phải thật cẩn thận khi sử dụng những loại nấm lạ đặc biệt là có màu sắc sặc

Bảng 1.1.Hàm lượng chất khô của một số loài nấm (%)

Loài Carbohydrate Sợi thô Chất đạm thô Chất béo

Nguồn: The nutritional and health benefits of mushrooms (2010)

Các loài được trình bày ở bảng 1.1 cho ta thấy hàm lượng carbohydrate, proteinthô, chất xơ cao, tương đối giàu khoáng chất, và chất béo thô tương đối thấp [27]

Protein và acid amin

Giá trị dinh dưỡng của nấm chủ yếu liên quan đến hàm lượng protein của chúng.Protein nấm được coi là có chất lượng dinh dưỡng cao hơn so với protein thực vật(FAO, 1991) [26] Hàm lượng protein và acid amin trong nấm không chỉ phụ thuộc

vào các yếu tố môi trường và giai đoạn sinh trưởng của quả thể, mà còn phụ thuộc vàocác loài [24] Nấm thường chứa chất đạm thô 12,0–29,3% (bảng 1.1) Tuy nhiên, một

số tác giả xác định hàm lượng protein cao hơn cho Cantharellus cibarius và Lepista

nuda lần lượt là 54 và 59% [22].

Thành phần acid amin trong nấm gần như tốt hơn so với protein đậu nành thậmchí đối với một số loài nấm chế phẩm có thể tương tự như trứng gà [35] Các acidamin thiết yếu không thể được tổng hợp bởi con người nhưng có thể được cung cấpbởi nấm

Một dữ liệu lớn về thành phần acid amin đã được công bố gần đây với 41 loài

nấm từ Vân Nam Trong nghiên cứu đó thành phần acid amin, Dictyophora indusiata

thấp với 8000 mg.kg-1 trọng lượng tươi và chỉ số cao hơn với 32.000 mg.kg-1 trọng

lượng tươi trong acid amin, và tỷ lệ EAA/TAA là 0,27 - 0,51 [31] L crocipodium và

Boletus specio- sus cho thấy tỷ lệ EAA/TAA tương tự với 0,31 và 0,43 tương ứng.

Tỷ lệ các acid amin thiết yếu (EAA) và các acid amin không thiết yếu (TAA) là

0,53 - 0,70 đối với nấm Russula và 0,45 - 0,77 đối với nấm Boletus [35,37] Những kết

quả này đáp ứng tốt với giá trị tham chiếu là 0,6 được FAO / WHO (1973) đề xuất Tỷ

lệ cao hơn được tìm thấy đối với nấm C cornucopioides, S ugoso-annulata, L.

amethystina và C ventricosum, tương ứng là 0,82; 0,96; 1,52 và 1,86 [27] Cỏ đinh

lăng có thành phần các acid amin được coi là một loại cây có giá trị dinh dưỡng cao

nhất Nấm Laccaria amethystina và C ventricosum cho thấy thành phần acid amin

tương tự như của cỏ đinh lăng

Acid aspartic và glutamic là các thành phần giống như bột ngọt (MSG), cung cấphương vị nấm điển hình nhất [32] Tỷ lệ của các acid amin umami đối với tổng số acidamin là tương đối cao và giá trị trung bình là 0,22 [29]

Carbohydrate

Carbohydrate trong thực phẩm cung cấp năng lượng, loại carbohydrate có thểtiêu hóa được tìm thấy trong nấm như: mannitol (0,3-5,5% ) [108], glucose (0,5 -3,6%) [59] và glycogen (1,0 - 1,6%) [25] Loại carbohydrate không tiêu hóa được tạothành một phần lớn trong tổng lượng carbohydrate của nấm, các hợp chất chính loạinày là oligosaccharides và polysaccharides không tinh bột như: chitin, β-glucan vàmannan [23] Hàm lượng carbohydrate của nấm thu được ở Trung Quốc khác nhau ởcác loài và dao động từ 12,8% đến 64,6% (Bảng 1.1) Trong một nghiên cứu của Liu

và đồng nghiệp (2012) [27], hàm lượng carbohydrate của C maxima, C ventricosum,

Stropharia rugoso-annulata, Craterellus cornucopioides và Laccaria amethystina từ

57% đến 65% Hàm lượng carbohydrate lên đến 70% được tìm thấy ở Agaricus

campestris và Armillaria mellea [33], trong khi tỷ lệ thấp gần 13% đã được quan sát

thấy ở Leccinum crocipodium và Russula virecens (bảng 1.1).

Chất xơ thô là một nhóm carbohydrate khó tiêu hóa Nó có thể cải thiện chứcnăng của đường tiêu hóa và cũng làm giảm nồng độ glucose và cholesterol trong máu.Lượng hòa tan và không hòa tan của chất xơ trong nấm Boleztus nhất định là khoảng4-9% và 22-30% tương ứng [29] Một số nấm được tìm thấy có ít chất xơ thô, ví dụ:

cho Craterellus aureus và Sarcodon aspratus giá trị là 5,1% , trong khi đối với nhiều

nghiên cứu khác lên đến 40% đã được công bố

Trong các chất chiết xuất phân cực của G lucidum có hơn 200 polysaccaride đã

được báo cáo với hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch Các polysaccharide hoạttính sinh học chính được phân lập từ loại nấm này là D-glucan với β-1-3 và β-1-6 lànhững liên kết glycoside Cấu trúc cơ bản của các carbohydrate đều thuộc loại β-1-3-D-glucopyran và chuỗi bên với 1-15 đơn vị β 1-6 monoglucosyl với một trọng lượngphân tử trung bình 1.050.000 Da [21,36,37]

Một số ứng dụng của ganoderma polysaccharide là kháng virus, kháng viêm,chống oxy hóa, hạ đường huyết, chống bức xạ và bảo vệ DNA

Lipid

Hàm lượng chất béo thô của nấm thường thấp từ 1,0% đến 6,7% (bảng 1.1).Linoleic và acid linolenic là các acid béo cần thiết cho con người được lấy từ thựcphẩm Acid linoleic thu được từ chất béo acid omega-6 và acid linolenic thu từ acidbéo omega-3 Dữ liệu được công bố trên thành phần acid béo của nấm khá là rời rạc.Giá trị (% của tổng số axit béo) cho stearic, palmitic, linoleic và acid oleic trong

Tricholoma matsutake lần lượt là 2%, 9%, 27% và 58% (Liu, Wang, Zhou, Guo, & Hu,

2010) [28] Tỷ lệ acid béo bão hòa/không bão hòa (SFA/UFA) là một chỉ số quan trọng

để đánh giá hàm lượng acid béo trong nấm [38] Trong nghiên cứu của Liu và cácđồng nghiệp (2012) [27], tỷ lệ SFA/UFA dao động từ 4,3 đến 12,7 cho năm các loàinấm tự nhiên, trong khi giá trị thấp hơn từ 0,7 - 4,5 đã được quan sát đối với nấm trồng[38]

và vitamin D2 được tìm thấy ở một phạm vi 8,9-45 và 4,7-194 mg.100g-1 đối với nấm

như Boletus edulis, Boletus speciosus và T ganhajun [34,39].

Trong một nghiên cứu tìm thấy có sự khác biệt rõ rệt về lượng vitamin trong sảnphẩm Vitamin B1 và B2 bị mất trong quá trình chế biến công nghiệp (đóng hộp)Boletus với tỷ lệ tương ứng là 21-57% và 8-74% [37] Trong một nghiên cứu khác, tỷ

lệ mất vitamin B1 bằng cách xử lý và đóng hộp lên tới 76-82% [39], và 86-99% chovitamine B2 [35]

Khoáng chất

Hàm lượng tro của các quả thể thực tế ít được nghiên cứu nhất, nó được coi làthành phần không đáng kể để đánh giá chất lượng nấm Hơn nữa, hàm lượng tro chỉmang lại tính cơ bản về hàm lượng khoáng chất của các loại quả thể hoặc phần hìnhthái của nó Nấm mọc hoang dã có thể tích tụ trong quả thể của chúng khối lượng lớn

cả hai yếu tố đa lượng và vi lượng cần thiết cho nấm và con người Kali (K) và phốtpho (P) là hai yếu tố phổ biến trong các quả thể sau đó là các nguyên tố Ca, Mg, Na và

Fe Hàm lượng photpho và 8 kim loại trong nấm được đưa ra cho 10 loài nấm đã đượcxác định trong bảng 1.2

Bảng 1.2.Hàm lượng nguyên tố thiết yếu trong một số loài nấm (mg /kg chất khô)

Nguồn: The nutritional and health benefits of mushrooms (2010)

Các công bố về các nguyên tố vi lượng như Cr, Ni, Li, Sr và Sb trong nấm rất ít

Se rất cần trong quá trình sinh tổng hợp các selenoenzyme và về cơ bản là cần

thiết cho con người Đất, trầm tích và nước là nguồn chính của selen trong nấm Giá trịtrung bình của Se trong một số loài nấm được thu thập ở Trung Quốc là 6,8 mg.kg-1 và

tối đa cho Bolrysus chrysenteron (18,8 mg.kg-1) gấp tới 70 lần hàm lượng của Se trong

đất Hàm lượng Se của một số loại nấm Boletus thường vượt quá 10 mg.kg-1 và ở

Boletus aestivalis (reticulatus) từ Bồ Đào Nha là 48,5 mg.kg-1 và ở Boletus pinophilus

ở mức 19,9 mg.kg-1

Đã có một số công bố về hàm lượng của Ge trong thực phẩm và hoa quả Chưa

có bất kỳ công trình nào công bố hàm lượng Ge trong các loài nấm nghiên cứu, ngoại

trừ công bố hàm lượng Ge trong các loài nấm Phellinus ở Đông Bắc Thái Lan từ

0,32-1,70 mg/kg trọng lượng tươi Ge là nguyên tố vi lượng thiết yếu trong cơ thể và rấtquan trọng cho sức khỏe con người Các hợp chất của Ge có một số hoạt tính sinh học,

có hoạt tính chống oxi hóa và là thành phần kích thích miễn dịch được sử dụng đểngăn chặn sự tiến triển của bệnh ung thư và tiêu diệt tế bào ung thư, HIV Các hợp chấthữu cơ của Ge được xem như các chất tăng cường sức khỏe và chống bệnh tật[22,23,24]

1.1.5 Giá trị dược liệu của nấm

Ngoài giá trị cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nấm còn cónhiều giá trị dược liệu như:

Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể

Các polysaccharide trong nấm có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào, thúc đẩyquá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T vàlympho B [18] Nấm linh chi, nấm đầu khỉ còn có tác dụng nâng cao năng lực hoạtđộng của đại thực bào

Kháng ung thư và kháng virus

Qua thực nghiệm, hầu hết các loại nấm ăn đều có khả năng ức chế sự phát triểncủa tế bào ung thư Với nấm linh chi đã được khảo sát và khẳng định lâm sàng Nhiềuloài nấm ăn có tác dụng kích thích cơ thể sản sinh interferon, nhờ đó ức chế được quátrình sinh trưởng của virus [4]

Loài nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) được coi là một dược liệu quý hiếm và đã được sử dụng ở Trung Quốc từ lâu Loài nấm cổ linh chi (Ganoderma

applanatum) cũng từng được coi là một "thần dược" ở Việt Nam, mặc dù không có

bằng chứng cụ thể nào về khả năng trị bệnh của nó Psilocybin và LSD là những chấtgây ảo giác được chiết xuất từ nấm có thể dùng để chữa các bệnh về tâm thần, nhưchứng rối loạn ám ảnh cưỡng chế (OCD) và cũng được dùng với lượng nhỏ để chấpm

dứt những cơn nhức đầu hàng loạt (cluster headache) hay đau nửa đầu LSD mạnh gấp

100 lần psilocybin được tổng hợp vào năm 1938 [7]

Trong số 12.000 loại kháng sinh được biết năm 1995 có khoảng 22% được sảnxuất từ nấm sợi Trong số đó, kháng sinh Penicillin được Alexander Fleming tổng hợp

từ nấm Penicillium chrysogenum vào năm 1928 được sử dụng rất rộng rãi trong chữa

trị y học thế kỷ XX Chúng có thể chữa được các bệnh vi khuẩn như bạch hầu, viêm

phổi, viêm màng não, hôi miệng, giang mai, lậu và kể cả vi khuẩn Staphylococcus gây

ra nhiễm trùng huyết Một loại kháng sinh β-lactam phổ biến khác Cephalosporin cũng

được tổng hợp năm 1948 từ nấm Cephalosporium acremonium Áp dụng công

nghệ ADN tái tổ hợp, nhiều gen đã được chuyển vào những loại nấm với mục đích sảnxuất công nghiệp Nhờ khả năng phát triển nhanh, chúng được nuôi trồng và cho ranhiều loại sản phẩm protein đa dạng giá trị rất lớn trong y học như insulin, vắc-xin viêm gan B, superoxide dismutase, interleukin Ngoài ra các nấm chuyển gencùng với các vi khuẩn còn là những nguồn chính cho các enzym sử dụng trong côngnghệ thực phẩm

Trị liệu các bệnh tim mạch

Nấm ăn có tác dụng điều tiết làm tăng lưu lượng máu động mạch vành và cảithiện tình trạng thiếu máu cơ tim [13] Các loại nấm như: Ngân nhĩ ( mộc nhĩ trắng),mộc nhĩ đen, nấm hương, đông trùng hạ thảo… đều có tác dụng điều chỉnh rối loạnlipid máu, làm hạ cholesterrol,… Ngoài ra mộc nhĩ trắng, mộc nhĩ đen, nấm linh chicòn có tác dụng làm hạ huyết áp

Giải độc và bảo vệ tế bào gan

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại nấm có tác dụng giải độc và bảo vệ tếbào gan rất tốt Ví dụ như nấm hương, nấm linh chi có khả năng làm giảm thiểu tác hạiđối với tế bào gan của các chát như carbon tetrachlorid và prednisone làm tăng hàmlượng glucogen trong gan và hạ thấp men gan [6] Thậm chí những cellulase và xylanase mà nấm tiết ra còn được sử dụng trong sản xuất quần jeans stone-washed cũng như trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Nấm đã được con người sử dụng từ rất lâu: nấm men được sử dụng cho quátrình lên men để tạo ra rượu, bia và bánh mì Một số loài nấm khác được sử dụng đểsản xuất xì dầu (nước tương) Nhiều loại nấm được sử dụng để sản xuất chất khángsinh, gồm các kháng sinh β-lactam như penicillin và cephalosporin Những loại khángsinh này đều được sử dụng rộng rãi trong việc chữa trị các bệnh do vi khuẩn gây ra

như: lao, phong cùi, giang ma và nhiều bệnh khác ở đầu thế kỷ XX, tiếp tục đóng mộtvai trò quan trọng trong hóa học trị liệu kháng khuẩn.

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm

Nguyên liệu và các chất dinh dưỡng: Nấm mọc trên các nguyên liệu khác nhau

sẽ có sự sinh trưởng khác nhau Mọc trên gỗ tự nhiên thì sinh trưởng chậm hơn cònnếu được mọc trên mùn cưa hoặc môi trường giàu dinh dưỡng thì tốc độ tăng trưởng

sẽ nhanh hơn

Nước và độ ẩm : Nếu nước không đủ, sợi nấm sinh trưởng chậm, nếu quá nhiều

thì dễ mọc nấm mốc, thể quả bị thối Các loài nấm ở các giai đoạn sinh trưởng khácnhau nhu cầu về độ ẩm khác nhau Nói chung hàm lượng nước trong môi trường ở giaiđoạn sinh trưởng sợi nấm là 60-70%, độ ẩm không khí trong giai đoạn hình thành thểquả là 85-95% Giai đoạn hình thành thể quả là giai đoạn cần tưới nước liên tục để xúctiến sự phân hoá thể quả

Oxy và C0 2 : Nấm ăn luôn luôn phải hô hấp, nên không thể thiếu oxy và CO2.Các loài nấm khác nhau nhu cầu về oxy và C02 đều khác nhau Khi chưa hình thànhquả thể lượng oxy không lớn lắm nhưng khi hình thành thể quả lượng oxy phải đượctăng lên Độ nhạy cảm của nấm ăn đối với C02 khác nhau rất lớn Các loài nấm mỡ,nấm đầu khỉ, ngân nhĩ, nấm linh chi rất nhạy cảm; còn nấm hương, mộc nhĩ thì độnhạy cảm không rõ rệt Điều này ta cần chú ý khi nuôi trồng và bảo quản nấm

Trị số pH: pH là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận thức ăn và

hoạt động của các loại nấm Phần lớn các loài nấm ăn yêu cầu trị số pH khoảng thích hợp nhất là 5-5,5 Trị số pH ảnh hưởng đến sự nẩy mầm của bào tử, nấm rơm cần

3-8-pH = 7,5 có tỷ lệ nẩy mầm cao nhất, nhưng nếu 3-8-pH = 8 chúng hoàn toàn không nẩymầm

Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của sợi nấm là 30 - 35oC và cho sự hìnhthành của quả thể là 30oC ± 2oC Từ 10 – 20oC, sợi sinh trưởng yếu Dưới 15oC và trên

45oC không xuất hiện quả thể

Ánh sáng:

Nấm không có diệp lục nên không có khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ như thựcvật màu xanh Trong giai đoạn hình thành thể quả người ta chia chúng ra làm 4 loại:+ Không cần ánh sáng khi phân hoá, chỉ cần khi hình thành thể quả

+ Cần ánh sáng nhưng chỉ che tối trong thời gian ngắn

+ Cần ánh sáng

+ Không cần ánh sáng

Người ta thường quan sát màu sắc của nấm để điều chỉnh ánh sáng thích hợp:màu trắng nghĩa là ánh sáng thiếu, màu đen đậm nghĩa là ánh sáng quá thừa, màu xámlông chuột nghĩa là ánh sáng vừa đủ

Không khí: Sự thông khí cần thiết cho quá trình lên men thiếu khí, sinh trưởngcủa sợi nấm và phát triển của quả thể Sự thiếu oxy xảy ra khi độ ẩm của nguyên liệutrồng nấm (mô nấm) quá cao, nguyên liệu bị nén quá chặt Việc thiếu oxy sau vài ngàytoàn bộ quả thể bị chết và mềm nhũn [1].

1.2 Tổng quan về kháng khuẩn của nấm lớn trên thế giới và Việt Nam

Năm 2011, Ofodile Lauretta Nwanneka cùng cộng sự ở Nigeria đã nghiên cứu

ảnh hưởng của hệ sợi nấm Ganoderma đối với vi khuẩn gây bệnh ở người Khi đó

hệ sợi của các mẫu nấm Linh chi được tìm thấy ở Nigeria đã được thử nghiệm trên

một số vi khuẩn gây bệnh ở người bằng việc sử dụng kỹ thuật kép và Weller Các mẫu

nấm thể hiện hoạt tính kháng lại tất cả các vi sinh vật kiểm định gồm Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa [30].

Các nhà khoa học Debendra Nath Roy, A K Azad, Farzana Sultana, A S M.Anisuzzaman đã nghiên cứu thành công hoạt tính kháng khuẩn trong ống nghiệm

của hai loại nấm ăn được là Linh chi (Ganoderma lucidum) và hàu (Pleurotus

Ostreatus) chiết xuất trong dung môi ethyl acetate năm 2016 Tác dụng chống vi

khuẩn của cả hai loại nấm được theo dõi với liều lượng 400 μg/đĩa bằng phươngpháp khuếch tán trên môi trường thạch đối với năm loài vi khuẩn gram dương, nămloài vi khuẩn gram âm và ba loại nấm Nghiên cứu cho thấy rằng chiết xuất từ

Pleurotus Ostreatus có tác dụng vừa phải và Ganoderma lucidum chỉ có tác dụng

kháng khuẩn nhẹ so với Kanamycin (30 µg/đĩa) Tuy nhiên, cả hai loại nấm này đềukhông có hoạt tính kháng nấm đối với nấm kiểm định so với thuốc Nystatin với liềulượng 30 µg/đĩa

Đoàn Suy Nghĩ và Nguyễn Thị Thu Thủy năm 2009 đã nghiên cứu một số chỉ

tiêu sinh hóa và khả năng kháng khuẩn của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum,

được đăng trên tạp chí khoa học của trường Đại học Huế [16] Kết quả nghiên cứu đã

xác định được một số chỉ tiêu sinh hóa của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum:

Flavonoit (7,38 ± 0,20%); hàm lượng đường khử 5,33 ± 0,10%; vitamin C 0,089 ±0,20%) Dịch chiết nấm Hoàng chi bằng nước hay etylic đều có hoạt tính kháng

khuẩn với 2 nhóm vi khuẩn (B.pumilus, B.cereus, B.subtilis, S.aureus) và vi khuẩn (E.coli, S.typhi, V.parahaemoliticus) Dịch chiết Flavonoit từ nấm Hoàng

chi có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với dịch chiết từ nấm Hoàng chi bằngnước hay etylic

Như vậy, đã có các nhà khoa học trong và ngoài nước tham gia nghiên cứu vềkhả năng kháng khuẩn từ nấm lớn nói chung và hàng loạt các công trình được công bốmỗi năm Các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của nấm tương đối lớn, đadạng vàcần tiếp tục được nghiên cứu Tuy nhiên, còn rất hạn chế, đặc biệt tại Việt Nam cònhạn chế các công trình nghiên cứu sâu về khảo sát điều kiện môi trường đến hoạt tính

kháng khuẩn của nấm Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu đề tài trên là rất cần thiết và

có ý nghĩa lớn đối với việc bảo tồn đa dạng sinh học và hoạt tínhkháng khuẩn của nấmlớn ở Việt Nam cũng như trên thế giới

1.3 Khái quát về một số vi khuẩn gây bệnh (E.coli, S.aureus, P.aeruginosa, B.subtilis ) 1.3.1 Khái quát về Escherichia coli

Escherichia coli (viết tắt: E.coli) hay trực khuẩn lị là một loài vi khuẩn Gram

âm, hình que hay có mặt ở thực phẩm, nguồn nước, thường kí sinh trong ruột già của

người và hầu hết các loài thú đẳng nhiệt Đa số các chủng E coli là vô hại mặc dù kí

sinh, chỉ một số dòng có thể gây ngộ độc thức ăn, gây bệnh đường ruột Trong nhữngtrường hợp nhất định, chúng còn giúp vật chủ sản xuất vitamin K2, và chống sự xâmlấn của một vài mầm bệnh khác, tạo nên một mối quan hệ cộng sinh

Các tế bào thường có hình que và dài khoảng 2,0 μm và đường kính 0,25 - 1μm,

với thể tích tế bào là 0,6 - 0,7 µm3 E.coli nhuộm Gram âm vì thành tế bào của nó bao

gồm một lớp peptidoglycan mỏng và màng ngoài Trong quá trình nhuộm màu, E coli

nhuộm màu hồng Màng ngoài bao quanh thành tế bào cung cấp một rào cản đối với

một số loại kháng sinh sao cho E.coli không bị tổn thương.

E.coli thường được nhắc đến nhiều vì nó là loài rất quan trọng trong sinh học

hiện đại, đặc biệt trong di truyền phân tử Ngoài ra, sự có mặt của chúng trong nguồn

nước là một chỉ tiêu quan trọng để đo độ sạch của nước, do E.coli bị thải ra môi trường

qua phân có khả năng tiếp tục tạo nên các quần thể sống tự do, sinh trưởng mạnh trongphân tươi ở điều kiện hiếu khí vài ba ngày rồi mới giảm tăng trưởng

Sự tăng trưởng tối ưu của E.coli xảy ra ở 37oC (98,6oF), nhưng một sốchủng trong phòng thí nghiệm có thể nhân lên ở nhiệt độ lên tới 49oC (120oF)

Hình 1.3.Hình ảnh về Escherichia coli (E.coli )

a, E.coli dưới kính hiển vi b, E.coli trên môi trường 1.3.2 Khái quát về Staphylococcus aureus

- Staphylococcus là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và

thường không có vỏ, có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vikhuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thểđứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ

- Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực

phẩm như: thịt, trứng, sữa và trên da, tóc, lông của người và động vật

- Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò

trong y học:

+ Staphylococcus aureus (S.aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh.

+ Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da).

+ Staphylococcus saprophyticus.

- Staphylococcus được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội, vì có mặt rộng rãi và

thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập

Hình 1.4.Hình ảnh về Staphylococcus aureus (S.aureus)

a, S.aureus dưới kính hiển vi b, S.aureus trên môi trường 1.3.3 Khái quát về Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là trực khuẩn mủ xanh) là vi khuẩn Gram

âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một cực Là một vi khuẩn phổ biếngây bệnh ở động vật và con người

Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhântạo trên khắp thế giới Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bìnhthường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trútrong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo

Vi khuẩn này lây nhiễm và phá hủy các mô của người gây suy giảm hệ miễndịch Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêmnhiễm và nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơthể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người vì vi khuẩnnày phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể Vi khuẩn cũng được phát hiện trêncác dụng cụ y khoa gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch Đây cũng lànguyên nhân gây ra viêm chân lông

Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khí, P.aeruginosa còn được xem như

là sinh vật kị khí tùy nghi vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu mộtphần hay toàn phần khí oxy Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như

là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng có thể lênmen arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất Khả năng thích nghi trong môitrường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan rất quan trọng đối với cơ chế sinh

bệnh của P.aeruginosa.

Hình 1.5.Hình ảnh về Pseudomonas aeruginosa ( P.aeruginosa )

a, P.aeruginosa dưới kính hiển vi b,P.aeruginosa trên môi trường

1.3.4 Khái quát về Bacillus subtilis

Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, gram dương, hiếu khí

thuộc về họ Bacillaceae trong Firmicute Bacillus là vi khuẩn gam dương tính sử

dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất

Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những

chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu

Hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là Bacillus anthracis và Bacillus

cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ thực phẩm tương tự Staphylococcus) Hai loài nổi

tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus subtilis và Bacillus coagulans B subtilis là một sinh

vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót trong độ nóng cao Nó chính là tác

nhân làm cho bánh mì hư B coagulans có thể phát triến đến tận mức pH 4.2 và gây ra vị

chua nặng ở thức ăn đóng hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính acid mà bìnhthường có thể khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất)

Trực khuẩn có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống gay go, chúng cókhả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái "ngủ đông" trongthời gian dài Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là

vô hại

Hình 1.6.Hình ảnh về Bacillus subtilis (B.subtilis)

a, B.subtilis trên môi trườngb, B.subtilis dưới kính hiển vi

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

- Các nấm lớn có kí hiệu như sau: HB19.01, HB19.06, HB19.08, XS19L003,XS19L013, XS19T005, XS19T027, LC thu mẫu tại Kim Bôi tỉnh Hòa Bình và VQGXuân Sơn tỉnh Phú Thọ

- Bốn chủng vi khuẩn kiểm định: Escherichia coli , Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis.

- Que trang, đèn cồn, que móc

- Bình tam giác, cốc, pipet, bếp đun,

KH2PO4

K2HPO4MgSO4.7H2O

- Khoai tây

- Cám ngô/cám gạo

2.4 Môi trường nghiên cứu

● Môi trường PGA (môi trường đối chứng)

- Dịch chiết khoai tây: 750ml/l

- Thạch Agar: 20g/l

- Đường Glucose : 20g/l

- Nước cất: 250 ml/l

Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) – 200g, thêm nước cho đủ 1 lít Đun sôi đến chín

kỹ khoai tây rồi lọc qua vải màn Sau đó mới thêm dextrose/glucose , thạch agar bổsung nước cất cho đủ 1 lít rồi chuyển vào cốc 1000ml đun cho tan thạch Phân vào cácbình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1at trong 60 phút.Môi trường này không cần điều chỉnh pH nhưng để tránh nhiễm khuẩn người ta chothêm kháng sinh vào (cho bằng thao tác vô trùng sau khi đã khử trùng và để nguội môitrường) và thường sử dụng Streptomyxin với nồng độ 30mg/l

• Môi trường PDA

- Dịch chiết khoai tây: 750ml/l

- Thạch Agar: 20g/l

- Đường Dextrose : 20g/l

- Nước cất: 250 ml/l

Tiến hành làm tương tự như môi trường PGA

● Môi trường hữu cơ

- Dịch chiết khoai tây: 750ml/l

ấm, sau đó tiến hành lọc qua vải màn lấy dịch chiết (dd2) Sau đó, đổ trộn dd1 và dd2với nhau, thêm glucose – 20g, 20g thạch agar bổ sung nước cất cho đủ 1 lít rồi chuyểnvào cốc 1000ml đun cho tan thạch Phân chia vào các bình tam giác, đậy nút bông rồihấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1at trong 60 phút

● Môi trường vô cơ

2.4.1 Môi trường thạch đĩa (dùng để nhân giống)

- Các đĩa petri được gói sẵn trong giấy báo hay đưa vào các hộp chuyên dụng trước khikhử trùng mới mang đi đổ môi trường rồi cấy giống nấm

- Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri

đã khử trùng khô( 170oC/2 giờ) khoảng 20ml rồi dùng tay xoay tròn cho môi trườngdàn đều trong đĩa

Lưu ý: Nếu để môi trường vào đĩa petri khi đang nóng quá thì nước bay hơi sẽđọng trên nắp đĩa sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch sẽ dẫn đến dễ nhiễm khuẩnhơn Nếu để môi trường nguội quá mới đổ đĩa thì môi trường có thể bị đông vón lại

2.4.2 Môi trường thạch nghiêng (dùng để giữ giống)

- Sử dụng môi trường PDA/PGA như trên Sau khi khử trùng môi trường và đểnguội xuống khoảng 50oC cho vào phễu nối với ống cao su có gắn kẹp sắt Ấn kẹp sắtcho môi trường chảy vào đáy ống nghiệm (tránh dính vào phần trên của thành ốngnghiệm), nên đổ khoảng 1/5 so với chiều dài của ống nghiệm

- Sau đó gói thành từng bó , có che giấy báo để tránh ướt nút bông rồi đem khửtrùng ở nồi hấp áp lực Khử trùng xong để thẳng đứng cho nước bay hơi hết rồi đặtnghiêng, gối đầu ống nghiệm trên 1 que gỗ Tốt nhất là phần trên của môi trường thạchnghiêng tới cữ 1/3 chiều dài của ống nghiệm, còn phần dưới thì sát đáy ống nghiệm.Các ống nghiệm này được nút bằng nút bông không thấm nước có độ chặt và độ dàivừa phải (nút ngắn và xốp quá dễ bị nhiễm khuẩn, chặt quá nấm khó phát triển vì thiếukhông khí, dài quá dễ chạm vào mép thạch)

- Đợi thạch đã đông, bó lại để vào tủ ấm 37oC trong 1 ngày, nếu ống nào bịnhiễm khuẩn phải loại bỏ

- Dùng thạch nghiêng để cấy sợi nấm đã phân lập được trên đĩa petri và để cấytruyền giữ giống hoặc để nhân giống cấp I cung cấp cho đơn vị sản xuất.

- Để giữ giống đặt ống nghiệm trong tủ lạnh (nhiệt độ 4-10oC) và mỗi tháng cấylại 1 lần

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thu thập tài liệu

Thu thập, kế thừa các tài liệu, số liệu có liên quan đến hướng nghiên cứu docác nhà nghiên cứu trước đây đã đưa ra làm cơ sở cho nghiên cứu

2.5.2 Phương pháp thu mẫu

Thu thập mẫu:

- Vị trí lấy mẫu: Mẫu nấm được lấy ngẫu nhiên tại các nơi dưới gốc cây, trên thâncây gỗ mục và chủ yếu dọc theo trục đường di chuyển chính của Vườn quốc gia XuânSơn và Khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Tiến

- Thời gian thích hợp lấy mẫu: Sau mưa khoảng 2-3 ngày ta tiến hành lấy mẫu vìmưa nấm phát triển rất nhanh

Lưu ý: Khi thu mẫu cần phải cẩn thận không để mẫu bị dập nát, thu mẫu với cáckích thước khác nhau, cả còn non lẫn trưởng thành, nếu mẫu là loài phổ biến với sốlượng lớn, cần thu với lượng thích hợp Lấy mẫu: khi phát hiện mẫu nấm lấy máy ảnhchụp ảnh toàn bộ cây nấm (gồm mũ nấm, lá nấm, cuống nấm) Chụp cùng thước kẻ để

đo kích thước của nấm có thể đo nhanh

- Định vị khu vực có mẫu nấm và ghi chép lại tọa độ

- Quan sát và ghi chép nhanh các đặc điểm bên ngoài của nấm là: màu sắc, khíhậu đặc điểm tự nhiên tại khu vực lấy mẫu có những loài cây chủ yếu mọc xung quanhcây nấm Nếu biết tên nấm có thể ghi nhanh tên mẫu vào giấy

- Tiếp đến tiến hành lấy mẫu: Dùng dao tách nấm ra khỏi giá thể, khi tách cần lấy

cả một mẩu nhỏ gỗ mà nấm sống trên đó Nếu nấm mọc trên đất thì cần lấy cả rễ vàloại bỏ bớt đất đi Không lấy những mẫu bị hư hỏng Lưu ý: Những mẫu nấm có kíchthước nhỏ, dễ gãy vỡ được đựng riêng trong các lọ nhỏ, hộp nhựa Không dùng túinilon để đựng mẫu vì nó không thoát khí và hơi nước, tạo điều kiện thuận lợi cho vikhuẩn phát triển

2.5.3 Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu vật

Mẫu lấy được bảo quản nơi thoáng mát Nếu giấy bọc bị bẩn hay ướt thì đượcthay thế, mô tả, ghi chép tiếp những đặc điểm của nấm vào phiếu điều tra theo mẫu.Chụp ảnh toàn cây nấm, khi bị cắt lớp và rõ mũ nấm.

Nấm được xử lý bằng cách phơi khô tự nhiên, làm khô trong tủ lạnh hoặc sấybằng máy sấy hoa quả ở nhiệt độ 40-45oC Sau khi nấm đã khô thì cho vào hộp hoặcphong bì giấy kèm theo nhãn, tất cả mẫu đựng trong 1 bao to hoặc hộp to, cho silicagel

để hút ẩm chống mốc, hỏng mẫu

2.5.4 Phương pháp phân lập quả thể

Để phân lập các mẫu nấm thường có 3 phương pháp [8]:

• Thu nhận và gây nảy mầm hệ sợi nấm hoặc từ bào tử nấm

• Tách sợi nấm từ các cơ chất có nấm mọc

• Phân lập từ quả thể nấm

Khóa luận của em sử dụng phương pháp phân lập quả thể

 Phân lập quả thể

● Dùng dao mổ hay lưỡi lam khử trùng dưới ngọn lửa đèn cồn cắt lấy một đoạn

thịt nấm từ mũ nấm hoặc cuống nấm và chuyển vào đĩa petri có môi trường PDA (hình2.1)

● Đem đĩa petri nuôi trong tủ ấm ở 30-33oC trong 2 - 3 ngày, các hệ sợi nấm sẽmọc ra lan trên bề mặt môi trường thạch

● Chuyển tiếp các hệ sợi sang môi trường đĩa thạch đến khi mẫu thuần

Hình 2.1.Phân lập nấm từ quả thể với một phần từ mũ nấm hay cuống nấm

2.5.5 Phương pháp cấy chuyền giữ mẫu

Cấy chuyền giống ra môi trường PGA nhằm cấy thuần nấm sau khi lấy mẫu ởVQG Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ và Khu bảo tồn thiên nhiên Thượng Tiến tại huyện KimBôi tỉnh Hòa Bình để phục vụ cho công tác nghiên cứu kháng khuẩn sau này Bảoquản giống giúp tránh sự nhiễm chéo trong công tác nghiên cứu cũng như bảo quảnlượng giống có chất lượng tốt phục vụ cho quá trình cấy chuyền.

* Chuyển (cấy chuyền) nấm [3]

• Dùng que cấy, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn

• Cắt một miếng môi trường có agar và hệ sợi nấm hình vuông có kích thước (1x 1cm) hoặc móc hệ sợi nấm chuyển sang môi trường mới bằng cách úp miếng agar

có khuẩn ty nấm( hệ sợi nấm) lên mặt môi trường mới

• Nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 30-33oC trong vài ngày để hệ sợi mọc lan kín bề mặtthạch

• Quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra độ thuần của mẫu

2.5.6 Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật [9]

a Cấy chuyền VSV sang đĩa petri bằng que cấy

Mẫu VSV sau khi lấy về phục vụ mục đích làm kháng khuẩn đã được phân lập

và loại bỏ hết các tế bào gây hại

- Dùng que cấy vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ vàđợi cho nguội bớt rồi cho từ từ que cấy đầu tròn vào ống nghiệm lấy một ít sinh khốiVSV thuần chủng

- Cấy chuyền sang môi trường thạch trong đĩa petri theo kiểu zíc zắc hoặc chấm điểm

Hình 2.2.Các kiểu cấy VSV trên đĩa thạch [9]

b Cấy chuyền VSV sang ống nghiệm bằng que cấy

Khi nuôi VSV trong ống nghiệm có thể nuôi trong môi trường thạch nghiênghoặc dịch lỏng.

● Cấy chuyền VSV từ các ống giống thuần sang môi trường thạch nghiêng

- Cầm ống giống VSV thuần chủng giữa ngón trỏ và ngón cái đồng thời cầm ốngnghiệm có môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị ở giữa ngón trỏ và ngón giữa bên taytrái Tay phải cầm que cấy, hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng

- Dùng ngón áp út và ngón út bàn tay phải mở nút ống giống VSV thuầnchủng.Tránh đặt nút ống nghiệm xuống bàn Để miệng ống gần ngọn lửa đèn cồn

- Đợi que cấy nguội rồi lấy một ít VSV từ ống giống thuần cấy sang môi trườngthạch mới đã chuẩn bị theo hình zíc zắc

- Hơ miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn lửa đèn cồn rồi nút ống nghiệmlại

- Nhúng que cấy vào cốc cồn rồi hơ trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng

● Cấy chuyền VSV từ các ống giống thuần sang môi trường dịch lỏng: Tiến hànhtương tự như sang môi trường thạch nghiêng

Sau khi cấy xong tiến hành nuôi lắc trong 24h và chuyển sang tủ ấm khoảng

28-32oC để vi khuẩn có thể phát triển được

Hình 2.3.Một số kiểu cấy VSV trên ống thạch nghiêng [9]

2.5.7 Phương pháp định lượng (đo đường kính kháng khuẩn)

- Dùng micropipet lấy 0,1ml dịch nuôi lắc vi khuẩn Ecoli, S.aureus, P aeruginosa,

B.subtilis trang đều bằng que trang lên đĩa petri đã đổ sẵn môi trường thạch MPA Mỗi

đĩa chỉ trang một loại vi khuẩn

- Dùng ống kim loại có đường kính 1cm hoặc lưỡi lam đã được thanh trùng, nhúng cồn,

hơ trên ngọn lửa đèn cồn nhằm đảm bảo độ sạch của dụng cụ là tối ưu nhất Tiếp theodùng dụng cụ đã thanh trùng để cắt lấy 1 miếng thạch trên đĩa đã trang vi khuẩn bỏ đi.Đồng thời cũng thanh trùng lại dụng cụ rồi lấy 1cm2 hệ sợi nấm của từng mẫu nấm đãthuần đặt vào trong lỗ thạch vừa bỏ đi trên môi trường trang vi khuẩn

- Sau đó ghi nhãn, kí hiệu, đánh dấu vị trí từng mẫu nấm cũng như từng loại vi khuẩn,gói kín để trong tủ lạnh 8h rồi nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC-37oC

- Đo đường kính nấm ở 48h-72h-96h-120h

*Chú ý: Tính từ thời điểm trang vi khuẩn lên mặt thạch cho đến khi đặt các mẫunấm lên môi trường nên tiến hành không quá 15 phút để hạn chế sự phát triển mạnhcủa vi khuẩn ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm

Thí nghiệm trên mỗi chủng nấm trên được lặp lại 3 lần đối với mỗi loại vikhuẩn kiểm định

Nếu 19,5 ≥ D-d ≥ 10mm: hoạt tính trung bình

Nếu D-d ≤ 10mm: hoạt tính yếu

2.5.8 Phương pháp khảo sát, theo dõi khả năng lan sợi của hệ sợi nấm

ở một số điều kiện khác nhau.

Để xác định điều kiện môi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhângiống phù hợp cũng như đánh giá khả năng kháng khuẩn từ hệ sợi của 1 số nấm lớn tạiKim Bôi tỉnh Hòa Bình và Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ, ta tiến hành trong 1 số điều kiệnsau:

- Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường PGA (Potato Glucose Agar), nuôi cấy 1-2 ngày trong

tủ ấm sau đó theo dõi hệ sợi nấm ở nhiệt độ 29 - 33oC

- Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường vô cơ gồm : Pepton: 4g/l, đường Glucose:20g/l, thạch agar: 17g/l, MgSO4.7H2O: 1g/l, K2HPO4: 1g/l, KH2PO4: 1g/l, nuôi cấy 1 -

2 ngày trong tủ ấm sau đó theo dõi hệ sợi nấm ở nhiệt độ 29 - 33oC

Hệ sợi nuôi cấy trong môi trường hữu cơ gồm:

- Dịch chiết khoai tây: 750ml/l

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với từng trường hợp

Các chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ lan sợi (đo đường kính hệ sợi), màu sắc và đặcđiểm hình thái hệ sợi nấm (hệ tơ dày hay mỏng, có màu sắc gì)

Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường hấp khử trùng ở 121oC, tương đương

1 atm, trong thời gian 45-60 phút Đổ môi trường vào đĩa Petri vô trùng, để nguội.Tiến hành cấy giống vào đĩa và nuôi cấy theo từng điều kiện môi trường Sau khi cấy 2ngày, theo dõi đo đường kính của hệ sợi nấm cho tới khi hệ sợi lan hết bề mặt thạch.Kết hợp theo dõi, nhận xét hệ sợi nấm và màu sắc

2.5.9 Phương pháp soi kính hiển vi

Nhỏ 3 giọt nước cất nhỏ lên lam kính, sau đó lấy nhíp gắp hệ sợi nấm lần lượt lênmỗi giọt nước, lấy dao lam dầm nát mẫu nấm, tiếp tục lấy lamen kính đậy lên, ấn nhẹ

- Đảm - Basidia (tại lá nấm): Kích thước, hình dạng, có bao nhiêu sừng, màu sắc,cấu trúc (thành dày hay mỏng, nội chất bắt màu hay không bắt màu)

- Cystidia (tại lá nấm): Kích thước, hình dạng, xuất hiện nhiều hay ít, màu sắc,cấu trúc (thành dày hay mỏng, nội chất bắt màu hay không bắt màu)