THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP SÀNG lọc rối LOẠN CHUYỂN hóa bẩm SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ kép

Các bước thực hiện của quy trình sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu...24... ĐẶT VẤN ĐỀRối loạn chuyển hóa bẩm sinh RLCHBS là thuật ngữ mô tảnhó

PHẠM THỊ KIỀU DIỄM

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH BẰNG

PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ KÉP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2015 - 2019

HÀ NỘI – 2019

PHẠM THỊ KIỀU DIỄM

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH BẰNG

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Trần Thị Chi Mai – Trưởng khoa Kỹ thuật Y học, trường Đại học Y Hà Nội và cô Trịnh Thị Phương Dung - giảng viên bộ môn Hóa sinh lâm sàng – khoa Kỹ

thuật Y học, trường Đại học Y Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giảng giải kiến thức và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị nhân viên trong khoa Xét nghiệm Sinh hóa - Bệnh viện Nhi Trung ương đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp mọi thắc mắc để em có thể thực hiện tốt nhất khóa luận.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo đại học, Bộ môn Hóa Sinh, Khoa Kỹ thuật y học, trường Đại Học Y Hà Nội

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian em học tập ở trường.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới cha mẹ, những người đã sinh thành, nuôi dưỡng em, cùng những người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia sẻ, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Dù đã rất cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất, nhưng do là lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu cũng như kiến thức còn hạn chế nên khóa luận của em chắc hẳn vẫn còn có những thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Em xin cam đoan tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực vàchưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.

Em xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về những cam kết này

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Phạm Thị Kiều Diễm

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Sàng lọc sơ sinh và sàng lọc sơ sinh mở rộng 3

1.1.1 Lịch sử phát triển SLSS và SLSS mở rộng 3

1.1.2 Tình hình SLSS và SLSS mở rộng 4

1.2 Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh 6

1.2.1 Khái niệm, phân loại 6

1.2.2 Lâm sàng 8

1.2.3 Chẩn đoán 9

1.2.4 Điều trị, tiên lượng 9

1.3 Thẩm định/ xác nhận phương pháp 10

1.3.1 Khái niệm 10

1.3.2 Mục đích 10

1.3.3 Khi nào cần tiến hành thẩm định/ xác nhận phương pháp 11

1.3.4 Nội dung của thẩm định phương pháp 12

1.3.5 Hướng dẫn NBS04A CLSI 14

1.3.6 Hướng dẫn đánh giá độ chính xác của FDA – Hoa Kỳ 15

1.4 Phương pháp khối phố kép 16

1.4.1 Nguyên lý phương pháp khối phổ kép 16

1.4.2 Lịch sử ứng dụng phương pháp khối phổ kép trong sàng lọc phát hiện bệnh RLCHBS 18

1.5 Giới thiệu thiết bị phân tích hóa sinh LCMS – 8040 Shimadzu 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Chất liệu nghiên cứu 22

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 22

2.3.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3.3 Bộ công cụ nghiên cứu và kĩ thuật thu thập số liệu 28

2.3.4 Phân tích và xử lý số liệu 29

2.3.5 Đạo đức nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Kết quả đánh giá độ tập trung 30

3.1.1 Kết quả đánh giá độ tập trung ngắn hạn 30

3.2.2 Kết quả đánh giá độ tập trung dài hạn 32

3.3 Kết quả đánh giá độ chính xác 34

3.3.1 Kết quả đánh giá độ chính xác của acid amin 34

3.3.2 Kết quả đánh giá độ chính xác của acylcarnitine 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 36

KẾT LUẬN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh

AST Aspartate Amino Transferase

ALT Alanin Amino Transferase

CLSI Clinical Laboratory Standard Institute

LCMS Liquid Chromatograph mass spectrometer

MRM Multiple reaction monitoring

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các bước thực hiện của quy trình sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm

sinh trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 24

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá độ tập trung ngắn hạn của các xét nghiệm acid

amin trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 30Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ tập trung ngắn hạn của các xét nghiệm

acylcarnitine trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 31Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tập trung dài hạn của các xét nghiệm acid amin

trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 32Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ tập trung dài hạn của các xét nghiệm

acylcarnitine trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 33Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ chính xác của các xét nghiệm acid amin trên

máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 34Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ chính xác của các xét nghiệm acylcarnitine

trên máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 35

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa nguyên tắc kỹ thuật MS/MS 16Hình 1.2 Máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu 20Hình 1.3 Đồ thị khối phổ của phản ứng định lượng các chất sàng lọc sơ sinh

của máy LCMS – 8040 Shimadzu 21

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh (RLCHBS) là thuật ngữ mô tảnhóm bệnh lý di truyền phân tử do những rối loạn của cấu trúc gen dẫn tới cáckhiếm khuyết khác nhau trong cấu trúc và chức năng của các enzym, hormon,thụ thể (receptor), protein vận chuyển và các đồng yếu tố (cofactor) tham giavào các quá trình chuyển hóa các chất dinh dưỡng trong cơ thể Theo các báocáo từ khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ươngtrong vài năm gần đây, tần suất mắc bệnh khoảng 1/5000 trẻ sinh ra, trong đó

tỷ lệ tử vong lên đến 48% [1] Có trên 1000 bệnh lý rối loạn chuyển hóa khácnhau, tỷ lệ mới mắc 1/500 [2] Bệnh rối loạn chuyển hóa là một gánh nặng vớibản thân người bệnh, gia đình và xã hội Việc điều trị đòi hỏi thời gian dài vàcòn tùy thuộc vào mức độ nặng nhẹ của bệnh Cho đến nay, bệnh vẫn chưa cóphương pháp điều trị đặc hiệu mà chỉ dừng lại ở các biện pháp điều trị hỗ trợnhằm hạn chế các dấu hiệu của bệnh Bởi vậy, sàng lọc sơ sinh là cần thiết choviệc phát hiện sớm, để có những can thiệp, hỗ trợ kịp thời, nâng cao chất lượngcuộc sống cho bệnh nhân, đồng thời giảm bớt gánh nặng cho gia đình Ở ViệtNam, có nhiều bệnh nhân mắc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh nhưng không đượcchẩn đoán xác định sớm đã dẫn đến những di chứng nặng nề, từ rối loạn tâmthần vận động đến toàn trạng suy sụp dần, thậm chí là tử vong [1]

Các chương trình sàng lọc sơ sinh phát hiện thấy rối loạn có thể điều trị

ở trẻ sơ sinh trước khi chúng bắt đầu có biểu hiện lâm sàng Chương trình sànglọc sơ sinh là một hệ thống toàn diện bao gồm giáo dục, sàng lọc, theo dõi kếtquả xét nghiệm bất thường, xét nghiệm khẳng định, chẩn đoán, điều trị và đánhgiá kết quả và hiệu quả định kỳ Trong thập kỷ qua, kỹ thuật phân tích khối phổ

đã trở thành công nghệ chủ chốt trong lĩnh vực sàng lọc sơ sinh, thay thế các kỹthuật sàng lọc cổ điển nhờ khả năng phân tích đồng thời nhiều chất chuyển hóa

trong cùng một mẫu máu thấm khô và vì vậy có thể sàng lọc nhiều bệnh một lúc.

Hệ thống khối phổ kép (MS/MS) là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rốiloạn chuyển hóa acid béo, acid amin và acid hữu cơ [3], [4]

Khoa Sinh hóa - Bệnh viện Nhi Trung ương đã được trang bị hệ thốngsàng lọc bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh bằng MS/MS với danh mục cácbệnh lý có thể phát hiện lên đến 55 bệnh rối loạn chuyển hóa khác nhau nhằmphục vụ cho sàng lọc, chẩn đoán các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh Để

có thể áp dụng thiết bị MS/MS vào sàng lọc bệnh lý rối loạn chuyển hóa, cầnphải thẩm định phương pháp trước khi đưa vào sử dụng

Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Thẩm định phương pháp sàng lọc rối loạn chuyển hoá bẩm sinh bằng phương pháp khối phổ kép” với mục tiêu:

Xác nhận quy trình kỹ thuật định lượng một số acid amin và acylcarnitine trong giọt máu thấm khô bằng MS/MS.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Sàng lọc sơ sinh và sàng lọc sơ sinh mở rộng

1.1.1 Lịch sử phát triển SLSS và SLSS mở rộng

1.1.1.1 Sàng lọc sơ sinh

Sàng lọc sơ sinh được biết đến từ những năm 1960 bởi Robert Guthrie(1916-1995) - một nhà y sinh học người Mỹ khi ông tìm ra phương pháp pháthiện phenylketon niệu (PKU) bằng việc sử dụng xét nghiệm ức chế vi khuẩnbán định lượng phenylalanine trong các mẫu máu toàn phần chích từ gót chântrẻ sơ sinh được thấm trên giấy lọc Ông nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilistrên môi trường thạch với sự có mặt của chất đối kháng phenylalanine là β-2-thienylalanine để kìm hãm sự phát triển của chúng Tuy nhiên với sự có mặtcủa phenylalanine từ mẫu bệnh phẩm thấm trên giấy lọc, sự ức chế không còn

và vi khuẩn phát triển được dưới sự quan sát bằng mắt thường [4], [21]

Vào năm 1968, hướng dẫn quyết định một bệnh có sàng lọc sơ sinh haykhông được Wilson và Jungner đưa ra dưới sự ủy quyền của WHO [5] Hướngdẫn gồm có 10 tiêu chí và được trình bày trong ấn phẩm “Nguyên tắc và thựchành sàng lọc rối loạn chuyển hóa sơ sinh” Đến những năm 1970, bệnh suy giápbẩm sinh là bệnh thứ hai được thêm vào danh sách sàng lọc sơ sinh

Tới năm 2000, đã có dưới 10 bệnh đáp ứng những tiêu chí này đượcthực hiện sàng lọc tại Mỹ [6]

1.1.1.2 Sàng lọc sơ sinh mở rộng

Các công nghệ nền tảng mới như phương pháp khối phổ kép MS/MScho phép xác định chính xác nhiều rối loạn trên một mẫu thông qua một quy

trình phân tích duy nhất Điều này đã vi phạm một trong số 10 tiêu chí củaWilson và Jungner Nhưng chính điều này đã thay đổi sâu sắc cách tiếp cậnsàng lọc sơ sinh, từ một xét nghiệm cho một rối loạn thành một xét nghiệmcho nhiều rối loạn.

Năm 2001, một hội đồng chuyên gia từ Đại học Di truyền Y khoa Hoa

Kỳ đã đánh giá 84 rối loạn khác nhau Tới năm 2006, một danh sách các rốiloạn phổ biến và thống nhất cho sàng lọc sơ sinh gồm 29 rối loạn cốt lõi và 25rối loạn thứ cấp Bốn mươi hai trong số 54 rối loạn này được phát hiện bằng

kỹ thuật khối phổ kép MS/MS Phần còn lại của các rối loạn (thiếu máu hồngcầu hình liềm, thalassemia, suy giáp bẩm sinh, tăng sản tuyến thượng thậnbẩm sinh, thiếu biotinidase, galactosemia do thiếu enzyme chuyển hóagalactose, mất thính lực bẩm sinh, xơ nang) được phát hiện bằng các phươngpháp khác [4]

1.1.2 Tình hình SLSS và SLSS mở rộng

1.1.2.1 Trên thế giới

Ngày nay, hầu hết tất cả các nước phát triển đã mở rộng các chươngtrình sàng lọc sơ sinh từ khoảng 20 đến hơn 40 bệnh chuyển hóa Trong đó cóthể kể đến Mỹ với sàng lọc trên 30 bệnh [6] Trái ngược với Mỹ, các nướcchâu Âu có dịch vụ chăm sóc y tế tiêu chuẩn cao như Anh và Pháp, vẫn sànglọc dưới 10 bệnh Chương trình sàng lọc sơ sinh hiện tại của Anh có phạm vitương đối hẹp với 5 bệnh là PKU, suy giáp bẩm sinh, bệnh lý hemoglobin(hemoglobinopathies), xơ nang và thiếu hụt acylCoA dehydrogenase chuỗitrung bình Tại Pháp cũng có 5 bệnh được sàng lọc sơ sinh là: PKU, tăng sảntuyến thượng thận bẩm sinh, suy giáp bẩm sinh, bệnh hồng cầu hình liềm và

xơ nang [4]

Danh sách các bệnh sàng lọc sơ sinh không thống nhất và thay đổi theotừng quốc gia và thậm chí từ vùng này sang vùng khác trong cùng một quốcgia, tùy thuộc vào tài trợ, quy định, kỹ thuật được sử dụng và tỷ lệ mắc mộtrối loạn cụ thể trong dân số Bên cạnh đó, mặc cho những thách thức kinh tế,nhiều nước thu nhập thấp và trung bình vẫn cố gắng thực hiện sàng lọc ít nhấtmột vài rối loạn và phát triển một chương trình quốc gia bao gồm: theo dõi,chẩn đoán, điều trị, giáo dục và đánh giá các bệnh này.

1.1.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam áp dụng sàng lọc sơ sinh khá muộn so với các nước trong khuvực Dự án đầu tiên được khởi động năm 1998 khi Bệnh viện Nhi Trung ươngtham gia dự án RAS/6/032 do cơ quan Nguyên tử Năng lượng quốc tế (IAEA)tài trợ Tỉ lệ mắc được phát hiện lúc đó của suy giáp bẩm sinh tại Hà Nội là 1/2.500 trẻ sinh ra và thiếu hụt G6PD là 2% trẻ trai [7] Năm 1998 – 2004, sànglọc sơ sinh phát hiện các rối loạn chuyển hóa di truyền được thực hiện chủyếu bởi các dự án nhỏ lẻ do các tổ chức quốc tế tài trợ Năm 2004 – 2006, Ủyban Dân số, Gia đình và Trẻ em Việt Nam phối hợp với Bệnh viện Nhi Trungương xây dựng mô hình sàng lọc sơ sinh phát hiện các bệnh rối loạn chuyểnhóa di truyền Các bệnh được thử nghiệm sàng lọc là suy giáp bẩm sinh vàthiếu G6PD

Trong giai đoạn 2006 – 2010, Bộ Y tế đã triển khai đề án “Nâng caochất lượng dân số thông qua xây dựng và mở rộng hệ thống sàng lọc trướcsinh và sơ sinh đến năm 2010” Đề án được triển khai thí điểm năm 2007 vớihai trung tâm sàng lọc, chẩn đoán trước sinh và sơ sinh khu vực phía Bắc làBệnh viện Phụ sản Trung ương và phía Nam là Bệnh viện Từ Dũ thành phố

Hồ Chí Minh Năm 2009 đã thành lập thêm Trung tâm sàng lọc để hướng dẫnchỉ đạo, hướng dẫn chuyên môn cho khu vực Miền Trung và Tây Nguyên và

càng ngày đề án càng được mở rộng về địa bàn trong phạm vi cả nước Năm

2011, đề án mở rộng thêm 17 tỉnh thành mới, nâng tổng số tỉnh được triểnkhai đề án là 51 tỉnh/thành phố [8]

Tiếp đó phải kể đến dự án nâng cao nhận thức về sàng lọc, chẩn đoán

và điều trị một số rối loạn chuyển hóa bẩm sinh giai đoạn 2014 – 2018 dưới

sự kí kết của Vụ Chăm sóc sức khỏe bà mẹ và trẻ em thuộc Bộ Y tế với Bệnhviện Nhi Trung ương Từ tháng 12/2017 Bệnh viện Nhi Trung ương đã tiếnhành triển khai sàng lọc mở rộng 55 bệnh RLCHBS cho tất cả các trẻ mớisinh Như vậy có thể đánh giá, tuy công tác sàng lọc sơ sinh của Việt Nam bắtđầu khá muộn nhưng chúng ta đã càng ngày càng hiểu rõ tầm quan trọng của

nó Công tác sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh cũng từ đó mà càng ngàycàng được quan tâm và mở rộng

1.2 Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh

1.2.1 Khái niệm, phân loại

Bệnh chuyển hóa bẩm sinh là bệnh hiếm nhưng rất nặng Bệnh xảy ra

do biến đổi cấu trúc gene gây thiếu hụt các enzym, protein vận chuyển,receptor hoặc các đồng yếu tố (co-factor) dẫn đến các lệch lạc trong quá trìnhchuyển hóa chất Đa số bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường

Bệnh có biểu hiện ở nhiều cơ quan, là hậu quả của tình trạng ngộ độctích tụ các chất không chuyển hóa được hoặc do thiếu năng lượng Các triệuchứng có thể xuất hiện từ giai đoạn bào thai hoặc có khoảng nghỉ vài ngày saukhi sinh khi chất mà cơ thể không thể chuyển hóa được cung cấp từ ngoàivào Các cơ quan có tốc độ chuyển hóa càng cao, càng dễ bị tổn thương như:tim, não, ống thận, gan,

Bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thường được chia làm bốn loại [9]như sau:

- rối loạn chuyển hóa carbohydrate

- rối loạn chuyển hóa acid amin

- rối loạn chuyển hóa acid hữu cơ

- các bệnh rối loạn dự trữ thể tiêu bào

Trong bốn nhóm bệnh trên, nếu trẻ mắc bệnh trong nhóm bệnh chuyểnhóa carbohydrate sẽ xuất hiện sớm các triệu chứng Trên lâm sàng, chúng ta

có thể không phân biệt được với trẻ bị bệnh tim mạch với các triệu chứng nhưrối loạn nhịp tim, hạ thân nhiệt hoặc tăng trương lực cơ, co giật, Tuy nhiênvới sự xuất hiện sớm của các triệu chứng lâm sàng, phần nào đó trẻ có khảnăng được chẩn đoán đúng bệnh sớm hơn Với nhóm bệnh rối loạn dự trữ thểtiêu bào có hơn 50 loại bệnh khác nhau Trẻ bị mắc bệnh thuộc nhóm cácbệnh rối loạn dự trữ thể tiêu bào - một “nhà máy xử lý rác” của tế bào lại cócác triệu chứng như co giật, mất trí nhớ, gan lách sưng to và rối loạn hìnhthành xương Tuy nhiên chỉ có 10 bệnh trong nhóm này có thể điều trị bằngthuốc (số khác được điều trị bằng ghép tủy) còn các bệnh trong nhóm này trên

hệ thần kinh thì khả năng phục hồi chức năng kém [10]

Nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa acid amin là nhóm bệnh hay gặp nhấttrong số bốn nhóm bệnh nói trên [11] Mặc dù là nhóm bệnh hay gặp nhấtnhưng có thể nói đây là nhóm bệnh có việc điều trị và tiên lượng bệnh tốt hơn

cả Trẻ mắc bệnh thuộc nhóm này sẽ điều trị bằng thuốc hoặc thậm chí cónhững trẻ chỉ cần có chế độ ăn uống phù hợp là được Song song với đó, trẻvẫn có khả năng phát triển bình thường về tâm thần vận động Bên cạnh đócũng phải kể đến nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa acylcarnitine Nhóm bệnhnày có thể điều trị bằng thuốc kết hợp với chế độ ăn uống hợp lý bởi trẻ mắcnhóm bệnh này có thể bị tích lũy acylcarnitine hoặc thiếu hụt carnitine

Carnitine có sẵn trong các loại thuốc bổ sung dinh dưỡng hoặc bột dinhdưỡng và thức ăn hàng ngày của chúng ta Như thế có thể thấy rằng có hainhóm bệnh là rối loạn chuyển hóa acid amin và acylcarnitine có tiên lượng tốt

và việc điều trị dễ áp dụng, ít tốn kém Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôilựa chọn nghiên cứu các bệnh rối loạn chuyển hóa sơ sinh về acid amin vàacylcarnitine

1.2.2 Lâm sàng

1.2.2.1 Thời kì sơ sinh

Nếu có biểu hiện ở giai đoạn bào thai, trẻ sinh ra non tháng, nhiều dị tậthoặc nhẹ cân không rõ nguyên nhân

Bệnh thường khởi phát khi bắt đầu cho trẻ ăn hoặc thay đổi chế độ ănvới các biểu hiện như:

- Toàn trạng suy sụp dần, bỏ bú, ói, suy hô hấp, mất nước

- Biểu hiện tổn thương thần kinh: rối loạn tri giác, hôn mê, cogiật,

- Tổn thương gan: suy gan, hoại tử tế bào gan, ứ mật

- Suy tim: bệnh cơ tim, rối loạn nhịp tim

- Huyết học: thiếu máu, bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm

- Nước tiểu hoặc mồ hôi có mùi bất thường

- Dị dạng bề ngoài có thể gặp

1.2.2.2 Sau thời kì sơ sinh

Các bệnh cảnh có thể gặp:

- Bề ngoài bất thường: thường biểu hiện ở vẻ mặt, xương khớp,

da, lông mi, tóc, hộp sọ

- Bệnh gan mật: vàng da ứ mật, suy gan,

- Thần kinh: co giật, chậm phát triển tâm thần vận động, thoái hóavõng mạc,

- Thận: đa niệu, mất nước mãn tính,

- Bệnh cơ tim.

- Nội tiết: tiểu đường, suy giáp, đái tháo nhạt,

- Các triệu chứng khác như: hạ đường huyết tái phát, nhiễm trùngnặng, ói mãn tính,

để xác định chính xác nguyên nhân điều quan trọng nhất cần làm là thực hiệncác xét nghiệm sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh như suy giáp, thiếu hụtG6PD, tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh và đặc biệt các xét nghiệm địnhlượng acid amin và acylcarnitine

1.2.4 Điều trị, tiên lượng

Điều trị đặc hiệu khác nhau tùy vào từng bệnh lý

Tiên lượng bệnh phụ thuộc rất nhiều vào việc điều trị sớm Càng pháthiện bệnh sớm, tiên lượng càng tốt Ví dụ với một trẻ bị mắc PKU cần tuântheo chế độ ăn kiêng hạn chế thực phẩm có phenylalanine ngay sau sinh càngsớm càng tốt [12] Về chế độ ăn kiêng, trẻ cần kiêng các thực phẩm như sữa

và phô mai, trứng, đậu nành, thịt gà, thịt bò hoặc thịt lợn, Những trẻ theo chế

độ ăn kiêng PKU sẽ không đủ chất dinh dưỡng thiết yếu từ thực phẩm Do đó,

một trẻ sơ sinh được chẩn đoán bị PKU nên được bổ sung sữa bột đặc biệtcho trẻ sơ sinh Sữa này có thể được trộn với một lượng nhỏ sữa mẹ hoặc sữabột thông thường để đảm bảo trẻ có đủ phenylalanine cho sự phát triển bìnhthường nhưng không đủ để gây hại [12], [13] Bên cạnh đó, Cơ quan Quản lýThực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê duyệt thuốc sapropterindihydrochloride để điều trị PKU Đây là một dạng BH4 - một chất trong cơthể giúp chuyển hóa phenylalanine [14] Nếu được phát hiện sớm và điều trịkịp thời, trẻ vẫn phát triển khỏe mạnh và bình thường về tâm thần vận động.

1.3 Thẩm định/ xác nhận phương pháp

1.3.1 Khái niệm

Khi một phương pháp xét nghiệm muốn được đưa vào ứng dụng cầnđược chứng minh qua các đánh giá khác nhau Hiện nay có nhiều thuật ngữkhác nhau được sử dụng để mô tả phạm vi của các thực nghiệm đánh giáphương pháp như: đánh giá phương pháp (Evaluation), thẩm định phươngpháp (Validation), xác nhận phương pháp (Verification) hay chứng minhphương pháp (Demonstration) trong đó được quan tâm nhiều nhất là thẩmđịnh phương pháp và xác nhận phương pháp

Thẩm định phương pháp (Validation) là khẳng định bằng kiểm tra vàcung cấp các bằng chứng khách quan cho thấy các yêu cầu cụ thể của mộtphương pháp định sử dụng có thể đáp ứng được Kết quả của thẩm địnhphương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kếtquả phân tích Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếunếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy

Xác nhận phương pháp (Verification) là khẳng định bằng kiểm tra cácbằng chứng khách quan cho thấy các yêu cầu cụ thể của một phương phápđịnh sử dụng có thể đáp ứng được

1.3.3 Khi nào cần tiến hành thẩm định/xác nhận phương pháp

Việc tiến hành thẩm định phương pháp được tiến hành trong ba trườnghợp chính sau đây:

Thứ nhất, việc thẩm định phương pháp được tiến hành trước khi ta đưamột thiết bị mới hay phương pháp mới vào sử dụng [15] Với một thiết bị mớihay phương pháp mới, trước khi được tung ra thị trường, nhà sản xuất cũng

đã phải thẩm định và đưa ra các tuyên bố Tuy nhiên trước khi đưa máy mớivào sử dụng, phòng xét nghiệm vẫn phải thẩm định lại một lần nữa Bởi vớimỗi phòng xét nghiệm khác nhau thì điều kiện môi trường, trang thiết bị máymóc, nhân viên, là khác nhau Cho nên việc thẩm định lại phương pháp haythiết bị ấy là rất cần thiết để khẳng định nó phù hợp với những tuyên bố củanhà sản xuất

Thứ hai, khi có bất kì chỉnh sửa, cải tiến phương pháp hay sự di chuyểnthiết bị, ta đều cần phải thẩm định lại [15] Để phù hợp với sự tiện ích cũngnhư ứng dụng của phòng xét nghiệm, phương pháp phân tích có thể được cảitiến hay chỉnh sửa Sự chỉnh sửa, cải tiến ấy có thể là mở rộng phạm vi ápdụng cho nhiều loại đối tượng hơn, có thể là thay đổi mẫu phân tích từ huyếttương sang máu toàn phần hay cải tiến bước phân tích nào đó Có thể là sựthay đổi vị trí thiết bị theo mật độ sử dụng, theo bố trí, vị trí của khoa phòngxét nghiệm Tất cả những điều này đều làm cho kết quả phân tích có sự saikhác cho nên việc thẩm định lại là vô cùng cần thiết.

Thứ ba, việc thẩm định này cũng được thực hiện tại các khoảng thờigian nhất định để đánh giá hiệu năng của phương pháp đang sử dụng [15].Chúng ta đều biết, với một phòng xét nghiệm, trong một thời gian nhất địnhcác điều kiện có thể thay đổi đi Có thể là điều kiện môi trường thay đổi, cóthể là thay đổi nhân viên, thay đổi hóa chất, thuốc thử Tất cả đều có tácđộng đến kết quả xét nghiệm Ngoài ra, trong trường hợp kết quả phân tíchmẫu kiểm tra chất lượng hoặc kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống nằmngoài giới hạn cho phép thì phương pháp cũng cần được xác nhận lại Tuynhiên, các thông số cần thẩm định lại phụ thuộc vào mức độ ảnh hưởng củacác thay đổi đến các thông số của phương pháp

1.3.4 Nội dung của thẩm định phương pháp

Thẩm định phương pháp là một công việc rất khó khăn và tốn kém, tuynhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quảxét nghiệm Cần cân nhắc mục đích yêu cầu của từng phương pháp và nguồnlực để lựa chọn thông số thẩm định cho phù hợp [15], [16], [17] Đối với cácphương pháp phân tích hóa học định lượng, các thông số bao gồm:

- Độ đặc hiệu, tính chọn lọc (Specifility/Selectivity)

- Độ nhạy phân tích (Sensitivity)

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve)

- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

- Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation – LOQ)

- Độ lệch (Bias)

- Độ chính xác (Trueness)

- Độ tập trung (Precision)

- Độ xác thực (Accuracy)

- Độ ổn định của phương pháp (Robustness/Ruggedness)

- Độ không đảm bảo đo (The measurement uncertainty)

1.3.4.1 Độ tập trung

Độ tập trung là mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiện độc lậptrên cùng một mẫu và trong cùng điều kiện thực hiện, được biểu thị dưới dạng

độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) [19]

Độ tập trung là các kết quả xét nghiệm thu được gần nhau, ít phân tán

Độ tập trung tương ứng với khoảng cách giữa kết quả xét nghiệm thu đượccủa cùng một mẫu và trong cùng điều kiện thí nghiệm Sự phân tán của cáckết quả xét nghiệm thu được càng nhỏ thì độ tập trung càng cao và ngược lại[16], [17], [19] Độ tập trung chịu ảnh hưởng nhiều của các sai số ngẫu nhiên

Nguyên tắc kiểm tra độ tập trung là kiểm tra tính “lặp lại” của các kếtquả xét nghiệm (làm nhiều lần xét nghiệm với cùng một kỹ thuật trên cùngmột mẫu xét nghiệm) Đây được xem như thực nghiệm đầu tiên trong đánhgiá một phương pháp mới Một phương pháp không tập trung thì nó có thểkhông chính xác, do vậy nếu phương pháp không tập trung thì không cần phảitiến hành tiếp các thực nghiệm khác nữa Có hai loại độ tập trung cần kiểmtra: độ tập trung ngắn hạn (short-term precision) hay độ tập trung trong mộtlần chạy (within-run precision) và độ tập trung dài hạn (long-term precision)hay độ tập trung giữa các lần chạy (between-run precision)

• Độ tập trung ngắn hạn:

- Kiểm tra khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của chính mẫu

đó cho dù nó được đặt ở bất kỳ vị trí nào trong lần chạy Để đánh giá tính lặplại kết quả trong một khoảng thời gian ngắn, hoặc mẫu bệnh phẩm hoặc QCđược đặt ở các vị trí bất kỳ trong lần chạy đó [16], [17]

• Độ tập trung dài hạn :

- Đánh giá khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của một mẫukhi chạy nhiều lần khác nhau Giả thiết là không có can thiệp y tế nào hoặcthay đổi tình trạng sức khỏe của bệnh nhân giữa các lần lấy mẫu, độ tập trungdài hạn giúp kiểm tra PXN có đạt được kết quả cơ bản là không thay đổi chomột chất phân tích trên một bệnh nhân cụ thể cho dù mẫu có được chạy ở cácngày khác nhau Độ tập trung giữa các lần chạy cũng cần phải được kiểm tra

ở ít nhất hai nồng độ khác nhau Các nồng độ này đặc trưng cho các giá trịthấp, trung bình, cao trong khoảng tuyến tính đã thiết lập được và tương ứngvới các giá trị gặp ở bệnh nhân Các nồng độ này thường liên quan đến cácđiểm có tính quyết định y khoa [16], [17]

1.3.4.2 Độ chính xác

Độ chính xác là mức độ gần đúng giữa các kết quả một phép đo và giátrị thật của phép đo Mỗi chất trong mẫu thử đều có trị số thực của nó, việcxác định trị số thực của mỗi thành phần trong một mẫu huyết thanh hay mẫuchuẩn hết sức khó khăn Những kết quả có trị số gần đến thực là trị số có độxác thực cao [15] Mục đích của kiểm tra độ chính xác của kỹ thuật nhằmphát hiện và loại bỏ những sai số hệ thống có thể xảy ra trong quá trình làmxét nghiệm Sai số hệ thống luôn có chiều hướng và gây ra tất cả các kết quảxét nghiệm hoặc cao hơn hoặc thấp hơn giá trị thực

Một phương pháp xét nghiệm thu được kết quả đúng khi kết quả xấp xỉbằng trị số thực của nó Trị số thực là khái niệm lý tưởng rất khó thực hiệnđược trên thực tế mà chỉ có giá trị thực theo quy ước Người ta phải lặp lạinhiều lần trên cùng một mẫu và kết quả cũng phải lặp lại nhiều lần được coi là

số thực

Nguyên tắc kiểm tra độ chính xác là kiểm tra sự gần đúng của các kếtquả xét nghiệm với giá trị thực của chất phân tích Nếu một phương phápkhông đảm bảo được độ chính xác thì nó không được xác nhận

1.3.5 Hướng dẫn NBS04A CLSI

Hướng dẫn NBS04A của CLSI đưa ra tiêu chuẩn xác nhận độ tập trungngắn hạn và độ tập trung dài hạn của phương pháp sàng lọc rối loạn chuyểnhóa bẩm sinh bằng MS/MS Quy trình được tiến hành trong 20 ngày với điềukiện hệ thống xét nghiệm phải được thực hiện nội kiểm hàng ngày Khi kếtquả nội kiểm không đạt hoặc gặp khó khăn trong quá trình vận hành hệ thốngxét nghiệm, cần loại bỏ kết quả và tiến hành chạy lặp lại thêm một lần nữa

Độ tập trung ngắn hạn: Thực hiện phân tích 20 lần liên tiếp trên 3 mứcnồng độ trong 1 ngày Kết quả thu được sử dụng các thuật toán thống kê đểphân tích kết quả Từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD), tính CV Tiêuchuẩn cho độ tập trung ngắn hạn là CV dưới 25% [16]

Độ tập trung dài hạn: Thực hiện phân tích 20 lần liên tiếp trên 3 mứcnồng độ trong 20 ngày Kết quả thu được sử dụng các thuật toán thống kê đểphân tích kết quả Từ giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (SD), tính CV Tiêuchuẩn cho độ tập trung dài hạn là CV dưới 35% [16]

1.3.6 Hướng dẫn đánh giá độ chính xác của FDA – Hoa Kỳ

Hướng dẫn về thẩm định phương pháp của Cơ quan Quản lý Thựcphẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) được công bố vào năm 2013 và đượccập nhật vào năm 2018 Hướng dẫn đưa ra các khuyến nghị cho việc pháttriển, thẩm định, xác nhận và sử dụng các phương pháp nghiên cứu sinh họctrong nghiên cứu

Thông tin trong hướng dẫn này áp dụng cho các quy trình phân tíchnhư máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu và mô Đối vớiđánh giá độ chính xác, hướng dẫn khuyến nghị mẫu đánh giá là ba mứcnồng độ QC thấp, trung bình và cao với tối thiểu là 06 lần chạy/02 ngày.Tiêu chuẩn chấp nhận là giá trị trung bình chạy phải nhỏ hơn hoặc bằng

±20% giá trị đích [20]

1.4 Phương pháp khối phố kép

1.4.1 Nguyên lý phương pháp khối phổ kép

MS/MS là thiết bị sử dụng để phân tách và định lượng các ion dựa trên

tỷ số khối lượng/điện tích của chúng (mass/charge ratio) MS/MS tạo ra cácphần tử tích điện từ mẫu cần phân tích, sau đó sử dụng điện và từ trường đểphân tách và đo lường khối lượng của các phần tử tích điện Bộ phận pháthiện sẽ tạo ra đồ thị phổ khối của các đỉnh có thể định lượng được bằng cácchuẩn nội để xác định lượng mỗi chất có mặt trong mẫu

Hình 1.1 Sơ đồ minh họa nguyên tắc kỹ thuật MS/MS

MS/MS gồm 2 MS nối với nhau bởi một bộ phận gọi là collision cell.Trước khi đi vào MS thứ nhất, mẫu được ion hoá bằng fast atom bomardmenthoặc electrospray (FAB-MS/MS hoặc ES-MS/MS) Quá trình này tạo điệntích nhưng không phân cắt các hợp chất hữu cơ trong mẫu MS thứ nhất phântách các ion gốc (parent ions) theo trình tự số khối (mass/charge ratio) vàchuyển sang bộ phận collision chamber Bộ phận collision chamber phân cắtcác ion gốc chuyển các mảnh ion sang MS thứ hai Mẫu hình của các mảnhion của mỗi ion gốc được phân tích và so sánh với phổ đã biết của các chấtchuẩn nội Toàn bộ quá trình ion hoá và phân tích kết quả mất khoảng 2 phút.MS/MS là một công cụ hiệu quả giúp sàng lọc các rối loạn chuyển hoáacid béo, acid amin và acid hữu cơ niệu Định lượng acid amin, carnitine tự

do và acylcarnitine đòi hỏi phải tách chiết mẫu máu thấm khô bằng dung dịchchứa nội chuẩn đồng vị ổn định (Stable isotope labeled internal standards) và

phân tích trên MS/MS Tín hiệu của mỗi chất phân tích trong mẫu so với nộichuẩn tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích trong mẫu Dữ liệu được thu nhậnbằng phương pháp MRM (Multiple Reaction Monitoring) Trong phươngpháp này, sản phẩm của mỗi chất phân tích sau khi qua bộ phận va chạm(collision cell) được đo lường Dữ liệu được thu và xử lý bởi phần mềm cungcấp cho hệ thống [18].

Hệ thống MS ba tứ cực (triple quadrupole) sử dụng cho phép đo lườngnày được kiểm soát bằng máy tính, phát hiện các phân tử ion hoá trong mẫutheo số khối (m/z) Mẫu tách chiết được đưa vào bộ ion hoá bằng tia điện(electrospray ionization - ESI) của MS nhờ hệ thống sắc ký lỏng (LC), baogồm bơm mẫu tự động, bơm, khử khí của dung môi ESI tạo sự ion hoá nhẹ,nơi mà các ion được tạo thành khi dung môi bay hơi ESI tạo các phân tửproton hoá hoặc khử proton, được lựa chọn để đưa vào máy phân tích khối đểphát hiện

Trong hệ thống MS/MS, các ion được lựa chọn của các chất phân tíchđược phân tách trong tứ cực thứ nhất (Q1), chuyển sang tứ cực thứ 2(Collision cell) nơi mà khí trơ có áp lực cao gây phân mảnh đặc hiệu Một ionsản phẩm của mỗi chất phân tích được lựa chọn đưa vào Q3 và phát hiện bởiđầu dò

1.4.2 Lịch sử ứng dụng phương pháp khối phổ kép trong sàng lọc phát

hiện bệnh RLCHBS

Bệnh RLCHBS đang càng ngày càng được quan tâm bởi tầm quantrọng của nó Tuy nhiên phương pháp để phát hiện chính xác và phát hiệnđược nhiều bệnh nhất cũng là một mối bận tâm hàng đầu Hiện nay, rất nhiềuphòng xét nghiệm trên thế giới, trong đó có Việt Nam đã ứng dụng phươngpháp khối phổ kép trong sàng lọc phát hiện bệnh RLCHBS

Từ những kĩ thuật phát hiện đơn lẻ định lượng phenylalanine qua sự ứcchế của vi khuẩn những năm 1960 đến việc phát hiện ra rối loạn chuyển hóaacid hữu cơ và acid béo qua kỹ thuật phân tích sắc ký khí (GC) trước nhữngnăm 1980 Tuy nhiên mẫu bệnh phẩm của kỹ thuật này là nước tiểu và phép

đo dựa vào thời gian tồn tại của chất cần phân tích Cho nên độ đặc hiệukhông cao Tới cuối những năm 1970, nhược điểm này đã được khắc phụcphần nào khi kết hợp phát hiện quang phổ khối của một hợp chất tại một thờiđiểm cụ thể bởi kỹ thuật GC/MS Kỹ thuật này đã trở thành tiêu chuẩn vàng

để xác định các rối loạn chuyển hóa từ mẫu bệnh phẩm là nước tiểu [22] Tuyvậy, với xét nghiệm carnitine thường bao gồm carnitine tự do, không ester hóa

và carnitine toàn phần (carnitine tự do cộng với ester hóa) thì việc định lượngcarnitine ester hóa là không chính xác Bởi nó được tính bằng carnitine toànphần trừ đi carnitine tự do [21] Do đó, việc thiết lập các phương pháp mới để

đo carnitine và acylcarnitine trở nên quan trọng

Kết quả là, một dạng MS mới cho các mẫu bệnh phẩm không bay hơi,được gọi là MS bắn phá nguyên tử nhanh (FAB) đã ra đời Kỹ thuật này đượctìm ra và phát triển bởi Michael Barber tại Đại học Manchester năm 1980[23] FAB/MS tạo ra sự phân mảnh nhỏ trong quá trình ion hóa Tính năngnày thường được gọi là ion hóa mềm Sau khi ion hóa, máy quang phổ khốiphát hiện và định lượng các ion trong một hỗn hợp phức tạp Tuy nhiên, đểphân tích các chiết xuất sinh học phức tạp, các khối lượng chồng chéo và bị

ức chế dẫn đến phổ khối lượng không thể giải thích được và do đó không có ýnghĩa Để khắc phục nhược điểm này, người ta đã bổ sung sắc ký lỏng để táchacylcarnitine với nhau và từ các hợp chất khác có trong mẫu Tuy nhiên chiphí thực hiện là khá cao [21]

Với những tiến bộ nhanh chóng trong công nghệ MS, đến những năm

1990 sự ra đời của các hệ thống khối phổ kép (MS/MS) có giá cả phải chănghơn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, từ đó loại bỏ nhu cầu tách sắc ký đãđược áp dụng vào sàng lọc rối loạn chuyển hóa bẩm sinh với bệnh phẩm làmáu toàn phần được thấm trên giấy lọc Không thể phủ nhận việc chuẩn bịmẫu bệnh phẩm cho MS/MS đơn giản hơn những kỹ thuật trước đó mà cònphải kể đến khả năng phân tích mẫu rất nhanh của phương pháp này MS/MS

có khả năng phân tích các hợp chất khác nhau trong một phân tích duy nhấtvới một khoảng thời gian rất ngắn (dưới 2 phút) Số lượng bệnh được pháthiện bởi MS/MS trung bình là khoảng 20, với phạm vi từ 10 đến 40 bệnh[21] Như vậy có thể khẳng định, phương pháp khối phổ kép có ứng dụng rấtlớn đối với sàng lọc RLCHBS

1.5 Giới thiệu thiết bị phân tích hóa sinh LCMS – 8040 Shimadzu

Máy sắc ký lỏng khối phổ LCMS – 8040 Shimadzu là dòng máy có tốc

độ và năng suất cao, hiệu quả và tiết kiệm tối đa chi phí cho phòng xétnghiệm Hệ thống máy này được thiết kế cho các phòng xét nghiệm vừa đếnlớn Máy có độ tin cậy cao, có khả năng chạy tối đa 200 mẫu cho một lần Thểtích mẫu cần hút cho một lần chạy là 5µl

LCMS – 8040 được thiết kế để cung cấp độ nhạy giám sát phản ứng(MRM) với tốc độ chuyển đổi cực nhanh, lên tới 555 MRM mỗi giây, đạtđược nhờ công nghệ tế bào va chạm UFsweeper TM của Shimadzu, khả nănggia công bốn cực chính xác độc quyền và công nghệ cung cấp điện cao áp độcđáo Ngoài ra, LCMS – 8040 có tính năng chuyển mạch phân cực nhanh ởmức 15 msec Với hiệu suất tốc độ cao này, LCMS – 8040 có thể cải thiệnđáng kể thông lượng phân tích Tối ưu hóa MRM trong các hệ thống LCMScủa Shimadzu dựa trên một loạt các phân tích tiêm dòng tự động nhanh

chóng, chỉ cần vài phút để thực hiện Nhiều hợp chất có thể được tối ưu hóatheo trình tự không giám sát Các tham số MRM được tối ưu hóa mang lại lợiích bảo trì dễ dàng Vật tư tiêu hao như các dòng khử màu (DL) và mao mạchESI, cũng có thể thay thế cho nhau.

Thiết bị sử dụng phương pháp khối phổ kép với hai bộ phận MS nối vớinhau bằng một bộ phận chuyển tiếp

Hình 1.2 Máy phân tích LCMS – 8040 Shimadzu

Bộ phận phát hiện sẽ tạo ra đồ thị phổ khối của các đỉnh có thể địnhlượng được bằng các chuẩn nội để xác định lượng mỗi chất có mặt trong mẫu