HOÀN THIỆN QUY TRÌNH kỹ THUẬT REAL TIME PCR từ các BỆNH PHẨM SINH học để ĐỊNH DANH VI SINH vật hệ TIẾT NIỆU SINH dục

Tôi xin cam đoan khóa luận “Hoàn thiện quy trình kỹ thuật Real time PCR từ các bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu sinh dục” dưới sự hướng dẫn của TS.. Đánh giá kết

TR ƯỜ NG Đ I H C Y HÀ N I Ạ Ọ Ộ

NGUY N TH QUỲNH Ễ Ị

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT

REAL - TIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA

KHÓA 2013 - 2019

HÀ NỘI – 2019

TR ƯỜ NG Đ I H C Y HÀ N I Ạ Ọ Ộ

NGUY N TH QUỲNH Ễ Ị

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH KỸ THUẬT

REAL - TIME PCR TỪ CÁC BỆNH PHẨM SINH HỌC ĐỂ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT HỆ TIẾT NIỆU - SINH DỤC

Ngành đào tạo : Bác sĩ đa khoa

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Nguyễn Thị Trang, giảng viên Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học

Y Hà Nội, người đã hướng dẫn tận tình, quan tâm, động viên, giúp đỡ emtrong quá trình nghiên cứu và học tập để em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên, các anh chị nội trútrong Bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ vàchỉ bảo cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư việntrường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thànhkhoá luận tốt nghiệp này

Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnhủng hộ, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho em không chỉ trong thời gianthực hiện khóa luận mà còn trong suốt quá trình học tập và làm việc

Hà N i, ngày ộ 31 tháng 05 năm 2019

Nguy n ễ Th Quỳnh ị

Tôi xin cam đoan khóa luận “Hoàn thiện quy trình kỹ thuật Real

time PCR từ các bệnh phẩm sinh học để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu sinh dục” dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Trang là hoàn toàn do tôi

-thực hiện Các số liệu và kết quả trong khóa luận là trung -thực và chưa từngcông bố trước đây

Hà N i, ngày ộ 31 tháng 05 năm 2019

Nguy n ễ Th Quỳnh ị

A Adenine

ATP Adenosin triphosphate

CDC The Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh)

CE European Conformity

Ct Cycle threshold (Chu kỳ ngưỡng)

ddATP Dideoxyadenosine triphosphate

HSV Herpes simplex virus

IVD In Vitro Diagnostic Medical Devices

OD Optical density (Mật độ quang)

PCR Polymerase chain reaction

PHEC Punjab Higher Education Commission

PID Pelvic Inflammatory Disease (Viêm vùng chậu) RNA Ribonucleic acid

STD Sexually Transmitted Diseases

(Bệnh lây truyền qua đường tình dục)

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

MỤC LỤC

Chương 1: T NG QUANỔ 3

1.1 Khái niệm bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

1.2 Dịch tễ học bệnh STD trên thế giới và tại Việt Nam 3

1.3 Các phương pháp phát hiện vi khuẩn hệ tiết niệu - sinh dục hiện nay 4

1.3.1 Quan sát trực tiếp 4

1.3.2 Nuôi cấy 6

1.3.3 Giải trình tự gen 7

1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase 10

1.3.5 Real - time PCR 12

Chương 2: Đ I TỐ ƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C UỨ 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 16

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 16

2.2 Địa điểm nghiên cứu 16

2.3 Thời gian nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 16

2.4.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu 16

2.4.3 Thu thập mẫu nghiên cứu 17

2.4.4 Quy trình nghiên cứu 18

2.5 Quy trình kỹ thuật định tính DNA 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục18 2.5.1 Hóa chất và dụng cụ 18

2.5.2 Quy trình định tính DNA 12 khuẩn gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục 19

2.6 Phân tích kết quả 23

2.8 Đạo đức nghiên cứu 24

Chương 3: K T QU NGHIÊN C UẾ Ả Ứ 25

3.1 Kết quả hoàn thiện quy trình chiết tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm 25 3.2 Đánh giá kết quả của kỹ thuật Real - time PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn đường tiết niệu -sinh dục 28

3.2.1 Thông tin chung của đối tượng nghiên cứu 28

3.2.2 Tình trạng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục……… 30

3.2.3 Tỷ lệ các căn nguyên gây viêm đường tiết niệu - sinh dục 31

3.2.4 Tỷ lệ đơn nhiễm và đồng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục.33 Chương 4: BÀN LU NẬ 35

4.1 Về hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm 35

4.2 Về đánh giá kết quả của kỹ thuật Real - time PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu -sinh dục 38

4.2.1 Về đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 38

4.2.2 Về tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục 38

4.2.3 Về tỷ lệ các căn nguyên gây bệnh đường tiết niệu - sinh dục 39

4.2.4 Về tỷ lệ đơn nhiễm và đồng nhiễm khuẩn gây bệnh đường sinh dục - tiết niệu 41

K T LU NẾ Ậ 42

KHUY N NGHẾ Ị 43

TÀI LI U THAM KH OỆ Ả

Bảng 2.1 Danh sách 12 khuẩn đường tiết niệu - sinh dục được định danh 19

Bảng 3.1 Kết quả chiết tách DNA từ các mẫu dịch âm đạo, dịch niệu đạo .25

Bảng 3.2 Kết quả chiết tách DNA từ các mẫu nước tiểu 26

Bảng 3.3 Kết quả chiết tách DNA từ các mẫu tinh dịch, dịch màng tinh hoàn

27

Bảng 3.4 Tỷ lệ đơn nhiễm và đồng nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục.33

Hình 1.1 Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo nhận định nấm và

Trichomonas vaginalis 5

Hình 1.2 Trichomonas vaginalis 6

Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP 9

Hình 1.4 Các bước cơ bản trong phản ứng PCR 11

Hình 1.5: Phương pháp Real - time PCR với tác nhân phát huỳnh quang SYBR Green I 12

Hình 1.6: Phương pháp Realtime - PCR với mẫu dò Taqman 13

Hình 1.7 Biều đồ khuếch đại của Real - time PCR 15

Hình 1.8 Biểu đồ chuẩn của Real - time PCR 16

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 18

Hình 2.2: Máy đo quang phổ Nanodrop 2000 21

Hình 2.3 Hình minh họa đo OD của DNA bằng máy Nanodrop 2000 22

Hình 2.4 Kết quả Real - time PCR của mẫu dương tính 24

Hình 2.5 Kết quả Real - time PCR của mẫu âm tính 24

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo lứa tuổi 29

Hình 3.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn đường tiết niệu - sinh dục từ các mẫu bệnh phẩm sinh học (2018) 30

Hình 3.3 Tỷ lệ các căn nguyên gây viêm đường tiết niệu - sinh dục từ các mẫu bệnh phẩm sinh học (2018) 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) hiện là nhóm bệnh truyềnnhiễm phổ biến nhất ở hầu hết các quốc gia, đặc biệt là ở nhóm tuổi 15 - 50,ảnh hưởng trầm trọng đến sức khỏe con người, đặc biệt là sức khỏe sinh sản.Mặc dù có những tiến bộ quan trọng về mặt chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa(ví dụ như tiêm chủng), chúng vẫn là những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vàphổ biến nhất [1] Tỷ lệ mắc STD trên toàn thế giới do vi khuẩn và virus đượcước tính là hơn 125 triệu trường hợp mỗi năm [2] Theo thống kê của Tổ chức

Y tế Thế giới (WHO), hàng năm có ít nhất 1/10 người ở độ tuổi hoạt độngtình dục mắc một bệnh trong nhóm STD Tại các nước đang phát triển thuộcchâu Phi, châu Á, STD là một trong năm bệnh thường gặp nhất [3] Nhiễmtrùng tiết niệu sinh dục cũng là một trong số những lý do phổ biến nhất khiếncho một người phụ nữ quyết định đến thăm khám bác sĩ phụ khoa hoặcchuyên gia tiết niệu [4] Ở Việt Nam, theo ước tính thì mỗi năm có gần 1 triệutrường hợp mới mắc bệnh STD, trong đó các bệnh STD phổ biến làchlamydia, lậu, giang mai, trichomonas, HPV, HSV [5], [6]

Thuật ngữ bệnh lây truyền qua đường tình dục (STD) đề cập đến mộtloạt các hội chứng lâm sàng do mầm bệnh truyền từ người bị nhiễm sangngười không nhiễm qua quan hệ tình dục bằng đường âm đạo, hậu môn hoặcqua đường miệng [7] Nhóm bệnh này chủ yếu do vi khuẩn, virus, vi nấm và

ký sinh trùng gây ra, có triệu chứng lâm sàng đa dạng và phương pháp điều trịcũng khác nhau [5] Tuy nhiên, có đến 90% các bệnh lây truyền qua đườngtình dục không có triệu chứng dẫn đến chẩn đoán và điều trị chậm trễ [8] Nếukhông được điều trị kịp thời và kỹ lưỡng, chúng có thể gây ra các biến chứng

đe dọa đến tính mạng như ung thư, vô sinh, thai ngoài tử cung, phá thai tựphát, chết thai, trọng lượng sơ sinh thấp, tổn thương thần kinh và thậm chí tửvong [9] Không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, tính mạng của người nhiễmbệnh, STD còn gây nên những hậu quả nghiêm trọng về mặt kinh tế và xã hội

[10] Tại Hoa Kỳ, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) ướctính chi phí cho các hệ thống chăm sóc sức khỏe của Mỹ để điều trị tám bệnhSTD phổ biến nhất là khoảng 16 tỷ đô la Mỹ mỗi năm [11].

Từ thực tế trên đặt ra vấn đề trong chẩn đoán và điều trị sớm bệnh STD

Đã có rất nhiều phương pháp xét nghiệm để chẩn đoán các tác nhân vi sinhvật và ký sinh trùng gây STD như nhuộm soi, nuôi cấy vi sinh, miễn dịchnhưng hầu hết các phương pháp này độ nhạy và độ đặc hiệu đều khá thấp.Trong những năm gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của ngành sinh học phân tử

đã cho ra đời nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán, phát hiệnnhanh chóng và chính xác các tác nhân gây nhiễm bệnh STD, có thể kể đến

kỹ thuật tách chiết và điện di DNA, kỹ thuật PCR, kỹ thuật xác định trình tựnucleotid trong phân tử DNA, kỹ thuật lai acid nucleic trong đó kỹ thuậtReal - time PCR là một kỹ thuật phổ biến và đang trở thành công cụ chẩnđoán nhạy cảm nhất mà cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp [12],[13] Real - time PCR tuân thủ thường quy chung của PCR nhưng cho mộtđường cong khuếch đại tương tự đường cong phát triển vi khuẩn gồm ba giaiđoạn (kéo dài đến khi dấu hiệu của sản phẩm PCR lớn hơn dấu hiệu nền của

hệ thống, tăng gia tốc kéo dài và tạo hình phẳng), do đó, cả quá trình PCRđược hoàn thiện rõ hơn chứ không phải chỉ là một sản phẩm cuối cùng củaphản ứng sau một số chu kỳ nhất định [14] Vì vậy, với mục đích sàng lọc,phát hiện và điều trị sớm bệnh STD, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu

“Hoàn thiện quy trình kỹ thuật Real - time PCR từ các bệnh phẩm sinh học

để định danh vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục” với hai mục tiêu:

1 Hoàn thiện kỹ thuật chiết tách DNA từ các mẫu bệnh phẩm (dịch

âm đạo, dịch niệu đạo, nước tiểu, tinh dịch, dịch màng tinh hoàn).

2 Mô tả kết quả của kỹ thuật Real - time PCR từ các mẫu bệnh phẩm sinh học ở những bệnh nhân nam giới nhiễm khuẩn tiết niệu - sinh dục.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái ni m b nh ệ ệ lây truy n qua đ ề ườ ng tình d c (STD) ụ

B nh lây lan qua đệ ường tình d c (STD) ch m t nhóm b nh lâyụ ỉ ộ ệtruy n c nam và n gi i, b ng con đề ở ả ữ ớ ằ ường ti p xúc tình d c đ ng gi iế ụ ồ ớhay khác gi i, bao g m c giao h p qua âm đ o, qua mi ng hay qua h uớ ồ ả ợ ạ ệ ậmôn Kh năng lây truy n c a lo i b nh này r t cao và b t c ai cũng cóả ề ủ ạ ệ ấ ấ ứ

th m c căn b nh này n u có đ i s ng tình d c không lành m nh ể ắ ệ ế ờ ố ụ ạ [5],[15]

Có thể chia các bệnh STD ra thành các nhóm lớn theo căn nguyên gâybệnh: do vi khuẩn (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae,Treponema pallidum, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma), vi nấm (nấmCandida), ký sinh trùng (Toxoplasma, Trichomonas vaginalis) Cho đến nay

đã phát hiện ra trên 40 tác nhân vi sinh vật gây bệnh STD, mỗi tác nhân gâybệnh có một bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng riêng [16]

1.2 D ch t h c b nh STD trên th gi i và t i Vi t Nam ị ễ ọ ệ ế ớ ạ ệ

STD là b nh ph bi n trên th gi i, có tác đ ng sâu s c đ n v n đệ ổ ế ế ớ ộ ắ ế ấ ề

s c kh e sinh d c và sinh s n Theo WHO, h n ứ ỏ ụ ả ơ 1 tri u ca STD đệ ược ghi

nh n m i ngày M i năm, có kho ng 357 tri u ca nhi m m i ch tínhậ ỗ ỗ ả ệ ễ ớ ỉriêng trong nh ngữ b nh STD ph bi n: chlamydia (131 tri u), b nh l uệ ổ ế ệ ệ ậ(78 tri u), giang mai (5,6 tri u) và trichomonas (143 tri u)ệ ệ ệ [3]

T i Vi t Nam, STD là m t trong nh ng b nh r t hay g p đ tu iạ ệ ộ ữ ệ ấ ặ ở ộ ổ

ho t đ ng tình d c Theo báo cáo c a Vi n Da li u Qu c gia, h ng năm ạ ộ ụ ủ ệ ễ ố ằ ở

nước ta ghi nh n kho ng 200.000 trậ ả ường h p m i m c STD Tuy nhiênợ ớ ắtheo ước tính c a các chuyên gia thì con s này lên đ n 800 nghìn đ n 1ủ ố ế ế

tri u ngệ ười, trong đó có kho ng 500.000 trả ường h p nhi m chlamydiaợ ễ

đường sinh d c, 150.000 trụ ường h p nhi m l uợ ễ ậ [5]

M c dù t l nhi m b nh cao và gây nhi u bi n ch ng nguy hi m,ặ ỷ ệ ễ ệ ề ế ứ ể

nh ng m c đ ư ứ ộ quan tâm c a c ng đ ng t i v n đ này ch a th t sủ ộ ồ ớ ấ ề ư ậ ự

tương x ng M t s nghiên c u cho th y ki n th c c a ngứ ộ ố ứ ấ ế ứ ủ ười dân vềcác b nh STD, v h u qu c a b nh cũng nh v phệ ề ậ ả ủ ệ ư ề ương pháp đi u trề ịcác b nh này là th p T l ngệ ấ ỷ ệ ười bi t v các b nh này ch chi m dế ề ệ ỉ ế ưới60%, hi u bi t c a các đ i tể ế ủ ố ượng v h u quề ậ ả, cách đi u tr và phòngề ị

b nh STD còn m c dệ ở ứ ưới 50% [17] Đi u tra Qu c gia v V thành niênề ố ề ị

và thanh niên Vi t Nam (2004) cho k t qu : có 0,3% thanh thi u niênệ ế ả ếnói đã t ng m c b nh STD Ph n l n thanh thi u niên đã đi đi u tr t iừ ắ ệ ầ ớ ế ề ị ạcác c s y t công, m t s nh t i đi u tr t i các phòng khám t , m tơ ở ế ộ ố ỏ ớ ề ị ạ ư ộ

s t mua thu c đi u tr và m t vài ngố ự ố ề ị ộ ười nói là không đi u tr gì ề ị [18]

1.3 Các ph ươ ng pháp phát hi n vi ệ khu n h ti t ni u ẩ ệ ế ệ - sinh d c ụ

Hình 1.1 Soi tươi bệnh phẩm dịch âm đạo

nhận định nấm và Trichomonas vaginalis [19]

- Nhuộm soi

Phương pháp nhuộm gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quantrọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm xác định sơ bộ đặctính của các dòng vi khuẩn muốn nghiên cứu theo tính chất bắt màu gram củachúng Vi khuẩn bắt màu hỗn hợp crystal violet - iodin sẽ có màu tím nâu khiquan sát dưới kính hiển vi quang học và được xếp vào nhóm vi khuẩn gramdương Những dòng vi khuẩn khác không giữ được màu crystal violet và bắtmàu fuchsin (đỏ) được xếp vào nhóm vi khuẩn gram âm

Phương pháp nhuộm gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet củathành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn Việc xác định thờigian tẩy màu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn gram dương

và vi khuẩn gram âm Nếu kéo dài thời gian tẩy màu, ngay cả vi khuẩn gramdương cũng không giữ được màu nhuộm ban đầu Ngoài ra, một số loài vikhuẩn gram dương cũng có thể bị tẩy màu dễ dàng và vì thế chúng được coi làcác dòng vi khuẩn có tính chất bắt màu gram thay đổi (có thể âm lẫn dương).Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi khuẩn gram

âm có màu hồng đỏ Fuchsin nhuộm màu mạnh hơn và có màu dễ nhìn hơn

safranin (Haemophilus spp và một vài dòng vi khuẩn kỵ khí không ăn màusafranin) [20].

Hình 1.2 Trichomonas vaginalis [19]

1.3.2 Nuôi cấy

Nuôi cấy tìm vi sinh vật gây bệnh là xét nghiệm dùng môi trường nhântạo để nghiên cứu sự phát triển của vi sinh vật dưới các điều kiện khác nhau.Các vi sinh vật đích trong các xét nghiệm này là: vi khuẩn (kỵ khí, hiếu khí,hiếu kỵ khí tùy tiện), virus, nấm , ngoài ra một số ký sinh trùng khác cũng cóthể nuôi cấy Như vậy, chúng ta thấy rằng chỉ những vi sinh vật mọc đượctrên môi trường nhân tạo mới áp dụng phương pháp xét nghiệm này Đây làloại xét nghiệm cơ bản nhất của labo vi sinh lâm sàng từ tuyến tỉnh trở lên.Các công đoạn của xét nghiệm nuôi cấy tìm vi khuẩn bao gồm:

- Xác định độ nhạy cảm của chủng phân lập được với kháng sinh (khángsinh đồ).

1.3.3 Giải trình tự gen

- Phương pháp giải trình tự của Maxam và Gilbert [21]:

Năm 1976 - 1977, Allan Maxam và Walter Gilbert đã phát triển mộtphương pháp giải trình tự DNA dựa trên sự cải biến hóa học DNA và sự phâncắt giới hạn tại những nucleotid đặc hiệu Phương pháp này đòi hỏi phải gắnphóng xạ tại đầu 5’ kết thúc của sợi DNA (thường bằng một phản ứng kinase

sử dụng gamma - 32P ATP) và đoạn DNA giải trình tự phải được tinh sạch.DNA được xử lý với hóa chất tạo ra các điểm gãy ở một vị trí nhỏ của mộthoặc hai trong số bốn nucleotid của một trong bốn phản ứng (Dimethylsunphat phá hủy G, Glicosidic phá hủy A + G, Hydrazin phá hủy C, Hydrazin+ NaCl phá hủy C + T) Phân tử DNA cải biến này sau đó được làm đứt bởipiperidine nóng ở vị trí các nucleotid cải biến Nồng độ của các chất hóa họcđược điều khiển để trung bình chỉ có một cải biến trên mỗi phân tử DNA.Như vậy, một loạt các đoạn đứt có đánh dấu được tạo ra Các đoạn đứt trongbốn phản ứng được điện di trong làn cạnh nhau trên gel polyacrylamide Đểquan sát kích thước các đoạn đứt, gel được đưa lên phim chụp phóng xạ tựghi X - ray để phát hiện vạch, từ các vạch đó đó ta suy ra trình tự đoạn DNAban đầu

Phương pháp giải trình tự của Maxam - Gilbert ít được sử dụng vìnhững nhược điểm bộc lộ ngày càng rõ như những phức tạp về mặt kỹ thuật,không thể sử dụng trong các kit sinh học phân tử tiêu chuẩn, cũng như việcphương pháp này sử dụng nhiều hóa chất độc hại và gặp những khó khăntrong việc mở rộng quy mô và cải tiến phương pháp

- Phương pháp enzym (phương pháp Sanger) [22]:

Vì phương pháp Sanger có hiệu quả cao hơn đồng thời sử dụng ít hóa

chất độc hại cũng như ít các chất phóng xạ hơn phương pháp của Maxam vàGilbert, nó nhanh chóng trở thành phương pháp được chọn lựa phổ biến hơn.Nguyên lí:

+ Dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase và dideoxynucleotidtriphosphate (ddNTP) trong quá trình tổng hợp DNA

+ Khi DNA polymerase gặp các ddNTP thì dừng lại: enzyme DNApolymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí3’OH (vị trí này cần cho việc hình thành liên kết phosphodieste ở chuỗipolynucletid đang hình thành với các nucleotide kế tiếp), khi gặp nucleotidkhông có nhóm 3’OH ở ddNTP, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra cácđoạn DNA chênh lệch nhau một nucleotid

Ví dụ: Nếu ta thêm ddCTP vào hỗn hợp phản ứng đang tổng hợp DNAthì quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotide sẽ dừng lại ở vị trí C

+ Điện di các đoạn DNA này với việc bổ sung 1% các loại ddNTP riêngbiệt (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) sẽ được bốn bản điện di khác nhau Cácbăng DNA xác định nhờ việc gắn đồng vị phóng xạ vào mồi, hoặc các ddNTP.Dựa vào đó để đọc trình tự DNA

Các vạch DNA được hiện hình bằng cách chụp phóng xạ tự ghi hoặc soitrên tia cực tím, và trình tự DNA có thể được đọc trực tiếp trên film X - rayhoặc hình ảnh của gel

- Phương pháp giải trình tự tự động [23]:

Cấu tạo của máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính yếu: phầnđiện di với gel pop7 và capilary36 và phần phát hiện peak điện di Các mạchđơn DNA trong ống phản ứng giải trình tự được đánh dấu huỳnh quang để cácvạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua chùm tia laser

Nguyên tắc hoạt động: trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có mộtvạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và con mắt

cảm quang sẽ ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu

đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnhtương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự DNA

Ngày nay, người ta dùng bốn màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấubốn loại ddNTP, nhờ vậy, phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉtrong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di một hàng mà khôngcần phải trên bốn hàng khác nhau như trước đây

Hình 1.3: Quy trình giải trình tự gen theo phương pháp ddNTP

1.3.4 Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction: PCR)

Phương pháp này do Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985 Mục đíchcủa phương pháp là phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm

Để thực hiện phương pháp cần có: phân tử DNA ban đầu; hai đoạnDNA mồi (primers), mỗi đoạn gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở haiđầu của phân tử DNA ban đầu (mồi ngược và mồi xuôi); bốn loại Nu (dATP,dCTP, dGTP, dTTP); Taq polymerase (enzym polymerase có tính chịu nhiệt

độ cao, được tách chiết từ loài vi khuẩn Thermus aquaticus) [24]

Mỗi chu kỳ PCR gồm ba giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:

(1) Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép thànhdạng sợi đơn ở nhiệt độ 94 - 950 C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1 -

1,5 phút)

(2) Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40

-650C cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theonguyên tắc bổ sung (A - T, G - C) ở hai đầu DNA cần nhân

(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 720C, DNA Taq polymerase hoạtđộng kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới được tổng hợptheo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu

Sau môt chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn DNA khuôn đượcnhân lên thành hai, các đoạn DNA được nhân bản trong mỗi chu kỳ lại đượccoi là DNA khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Chính vì vậy, sau k chu kỳnhân bản sẽ tạo ra 2k đo nạ DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu [25]

Hình 1.4 Các bước cơ bản trong phản ứng PCR (Andy Vierstraete, 1999)

1.3.5 Real - time PCR

1.3.5.1 Khái niệm

Real - time PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị

được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng nên được gọi là Real - time.Như vậy, có thể nói Real - time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trongống nghiệm thành hàng tỉ bản sao dựa vào chu kỳ nhiệt và kết quả khuếchđại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đạixảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được Trong phương pháp Real

- time PCR, khuếch đại gen và đọc kết quả được thực hiện trong một ốnghay một giếng mẫu Phương pháp này đòi hỏi phải có một máy luân nhiệtđặc biệt, có thiết bị phát huỳnh quang từ một giếng mẫu và được trang bịchương trình vi tính cho phép xử lý kết quả, xác định độ biến đổi cường độhuỳnh quang trong từng phản ứng khuếch đại

Real - time PCR là một cải biến của phương pháp PCR dựa trên chức

năng 5’ - 3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sựcông bố năm 1991 [26] Trong phản ứng Real - time PCR, người ta thường sửdụng tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào mạch đôi(Ethidium Bromide, SYBR Green I, EvaGreen…) hoặc tác nhân dùng đánhdấu mẫu dò đặc hiệu (Taqman probe, FAM, HEX, TAMRA…).

Hình 1.5: Phương pháp Real - time PCR với tác nhân phát huỳnh quang SYBR Green I

Hình 1.6: Phương pháp Realtime - PCR với mẫu dò Taqman

So với PCR truyền thống, Real - time PCR có nhiều ưu điểm hơn như:

- Độ đặc hiệu của Real - time PCR cao hơn rất nhiều so với PCR truyềnthống do sử dụng mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại

- Real - time PCR cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ sửdụng các chất phát quang đặc hiệu, lượng sản phẩm khuếch đại có thể địnhlượng ở từng chu kỳ phản ứng

- Dữ liệu Real - time PCR có thể được đánh giá mà không cần phảiđiện di trên gel giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệmthực hiện được.

- Việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ốngđóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sauphản ứng PCR [13].

1.3.5.2 Một số ứng dụng của Real - time PCR trong định danh vi sinh vật

Năm 2005, Caliendo AM cùng cộng sự (Khoa bệnh học và Phòng thínghiệm Y khoa, Trường Đại học Y khoa Emory, Atlanta, GA 30322, Hoa Kỳ)

đã tiến hành nghiên cứu "Cải thiện việc phát hiện Trichomonas vaginalis (T.vaginalis) bằng Real - time PCR so với nuôi cấy" 524 mẫu bệnh phẩm, thuthập từ các phụ nữ Mỹ gốc Phi và trẻ vị thành niên tham gia vào các chươngtrình dự phòng HIV - 1, được tiến hành phân tích để phát hiện T vaginalis bằngcách nuôi cấy trực tiếp và Real - time PCR Kết quả, 36/524 mẫu dương tínhkhi nuôi cấy và 54/524 mẫu dương tính trong thử nghiệm Real - time PCR[27]

Năm 2013, ZhangMJ cùng c ng s (ộ ự Phòng Kiểm soát và Phòng ngừaBệnh truyền nhiễm Quốc gia, Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa BệnhTrung Quốc) tiến hành nghiên cứu "Phát triển và ứng dụng Real - time PCR

để trực tiếp phát hiện và định lượng Campylobacter jejuni (C jejuni) trongphân người" 242 mẫu phân được phân tích để phát hiện sự có mặt của C.jejuni bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trực tiếp và Real - time PCR Kết quả,20/242 (8.3%) chủng C jejuni đã được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn, trongkhi 41/242 (16.9%) mẫu dương tính với Real - time PCR Kết luận, độ nhạycủa việc phát hiện vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cao hơn rất nhiều khi sử dụngReal - time PCR so với phương pháp nuôi cấy trực tiếp [28]

Tóm lại, Real - time PCR là kỹ thuật khuếch đại gen, có nhiều ưu điểm

so với PCR truyền thống cũng như các phương pháp định danh vi khuẩn khác,được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong di truyền học, công nghệ sinh họccũng như nhiều lĩnh vực của cuộc sống

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

- Tất cả các bệnh nhân được chỉ định làm xét nghiệm Real - time PCRđịnh danh hệ khuẩn đường tiết niệu - sinh dục

- Bệnh nhân tình nguyện tham gia vào nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Bệnh nhân có mẫu lấy không đảm bảo đúng quy trình

- Bệnh nhân không tình nguyện tham gia vào nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.4.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu

2.4.2.1 Mục tiêu 1:

Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 50 mẫu bệnh phẩm để hoàn thiện quy trình:

 10 mẫu dịch âm đạo

 10 mẫu dịch niệu đạo

 10 mẫu nước tiểu

2.4.3 Thu thập mẫu nghiên cứu

- Thu thập thông tin từ phiếu phỏng vấn đã soạn sẵn:

Các đối tượng tham gia trả lời phiếu phỏng vấn nhằm cung cấp cácthông tin bao gồm tuổi, tiền sử về các bệnh lây truyền qua đường tình dục

- Khám và lấy bệnh phẩm:

Bệnh nhân được khám để phát hiện tình trạng bệnh lý đường sinh dụctrên lâm sàng: tình trạng viêm, tổn thương và phát hiện các khối u Bệnhphẩm thu được được chuyển về Trung tâm Tư vấn Di truyền - Bệnh Viện Đaihọc Y Hà Nội, bảo quản ở 4oC để phục vụ cho các xét nghiệm tiếp theo

Mẫu nghiên cứu sau thu thập được tiến hành phân tích tại Trung tâm Tưvấn Di truyền - Bệnh Viện Đai học Y Hà Nội

2.4.4 Quy trình nghiên cứu

2.5 Quy trình kỹ thu t đ nh tính DNA 12 khu n đ ậ ị ẩ ườ ng ti t ni ế ệu - sinh

d c ụ

 Hóa chất:

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu

Real - time PCR định danh vi sinh vật hệ tiết niệu - sinh dục ở từng loại mẫu

Phân tích và đánh giá kết quả hoàn thiện quy trình Real - time

PCR Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA

Thu thập thông tin bệnh nhân (tuổi, tiền sử STD)

Thu thập, bảo quản (2 - 8°C) và phân loại mẫu

Chiết tách DNA

Nước tiểu (10 mẫu)

Dịch niệu đạo (10 mẫu)

Tinh dịch (10 mẫu)

Dịch âm đạo

(10 mẫu)

Dịch màng tinh hoàn (10 mẫu)

Mô tả kết quả trên 854 bệnh nhân nam giới

- Hóa chất tách chiết DNA: bộ kit tách DNA - express đạt chuẩn IVD và

CE Châu Âu của công ty Lytech (Nga)

- Hóa chất cho Real - time PCR: Bộ kit Real - time PCR xác định 12chủng khuẩn của công ty Lytech (Nga) định tính DNA 12 khuẩn đường tiếtniệu - sinh dục (gồm 12 kit riêng lẻ) Bộ kit này được khuyến cáo sử dụng chodịch niệu đạo và dịch âm đạo