XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN STK11 TRÊN một số BỆNH NHÂN mắc hội CHỨNG PEUTZ JEGHERS BẰNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN

NGUYỄN PHƯƠNG ANHXÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN STK11 TRÊN MỘT SỐ BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG PEUTZ - JEGHERS BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2015 - 2019 HÀ N

NGUYỄN PHƯƠNG ANH

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN STK11 TRÊN MỘT SỐ BỆNH

NHÂN MẮC HỘI CHỨNG PEUTZ - JEGHERS

BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2015 - 2019

HÀ NỘI - 2019

NGUYỄN PHƯƠNG ANH

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN STK11 TRÊN MỘT SỐ BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG PEUTZ - JEGHERS

BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Ngành đào tạo: Cử nhân Xét nghiệm Y học

Khoa Kỹ Thuật Y Học đã truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết vàthực hành trong suốt thời gian học ở trường Trong năm học cuối cùng này,khóa luận tốt nghiệp chính là một trong những cột mốc đáng nhớ nhất, đánhdấu cho quá trình học tập và nghiên cứu của em tại trường đại học Việc tiếnhành nghiên cứu, làm khóa luận tốt nghiệp đã giúp em học hỏi được rất nhiềukiến thức và kinh nghiệm làm việc

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc tới PGS.TS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa

Kỹ Thuật Y Học, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein,Trường Đại học Y Hà Nội, người đã tận tình giúp đỡ, luôn đưa ra những lờikhuyên hữu ích cũng như những lời góp ý tâm huyết giúp em hoàn thiện bàikhóa luận

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung

tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, ngườiThầy đã tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận tại Trung tâm

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Đại học,Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thànhkhóa luận

Em xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Quý Hoài, là người đã trực

tiếp hướng dẫn, chia sẻ cho em những kỹ thuật và kinh nghiệm hữu ích trong

quá trình thực hiện khóa luận, cùng các cán bộ tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đã giúp em hoàn chỉnh khóa luận.

Lời cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã quantâm, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Nguyễn Phương Anh

LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi: Phòng Quản lý Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Tôi tên là Nguyễn Phương Anh, sinh viên tổ 31 lớp Y4I, chuyên ngành

Cử nhân Xét nghiệm Y học, niên khóa 2015 – 2019, trường Đại học Y HàNội

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡcủa thầy cô và các cán bộ tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

cứ công trình nghiên cứu nào trước đây

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Người làm cam đoan

Nguyễn Phương Anh

RNA Ribonucleic Acid

OD Optical Density (Độ hấp thụ quang)

(Hiện tượng đa hình đơn nucleotid)

(Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hội chứng Peutz – Jeghers 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu của Hội chứng Peutz – Jeghers 3

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Peutz – Jeghers 4

1.1.3 Triệu chứng và chẩn đoán của hội chứng Peutz - Jeghers 7

1.1.4 Điều trị hội chứng Peutz – Jeghers 10

1.2 Tổng quan về gen STK11 13

1.2.1 Vị trí của gen STK11 13

1.2.2 Chức năng của gen STK11 13

1.2.3 Một số đột biến gen STK11 liên quan đến hội chứng Peutz - Jeghers .17 1.3 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen STK11 18

1.3.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 18

1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4 Quy trình nghiên cứu 25

2.5 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 26

2.5.1 Dụng cụ, trang thiết bị 26

2.5.2 Hóa chất 27

2.6.3 Kỹ thuật PCR 31

2.6.4 Kỹ thuật giải trình tự gen 33

2.7 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

3.1 Kết quả tách chiết DNA 35

3.2 Kết quả khuếch đại exon 2 của gen STK11 36

3.3 Kết quả giải trình tự exon 2 trên gen STK11 37

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41

4.1 Quy trình và kết quả tách chiết DNA 41

4.2 Quy trình và kết quả PCR 44

4.3 Kết quả giải trình tự gen 46

KẾT LUẬN 51 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

TÀI LIỆU THAM KHẢO

chứng Peutz – Jegher 6

Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại exon 2 của gen STK11 27

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR giải trình tự 33

Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA được tách chiết 36

Bảng 3.2 Các biến đổi trên exon 2, intron 2 của gen STK11 của 5 mẫu bệnh nhân 38

Hình 1.2 Polyp trong hỗng tràng của bệnh nhân mắc PJS 9

Hình 1.3 DBE kỹ thuật nội soi bóng đôi 11

Hình 1.4 Vị trí gen STK11 trên nhánh ngắn NST số 13

Hình 1.5 Cấu trúc protein STK11/LKB1 ở người 14

Hình 1.6 Sự hoạt hóa protein STK11/LKB1 từ nhân ra tế bào chất 15

Hình 1.7 Chức năng và tín hiệu của protein STK11/LKB1 15

Hình 1.8 Các giai đoạn của phản ứng PCR 18

Hình 1.9 Cấu trúc của ddNTP 21

Hình 1.10 Phương pháp giải trình tự gen của Sanger 22

Hình 1.11 Giải trình tự gen bằng máy tự động 24

Hình 3.1 Minh họa kết quả đo mật độ quang học trên máy Nano Drop 2000c của mẫu DNA PJ05 sau khi tách chiết 35

Hình 4.1 Những đột biến được phát hiện trong nghiên cứu ở Ý năm 2013 50

Được đặt tên theo hai nhà khoa học là Jan Peutz và Harold Jeghers, hộichứng Peutz – Jeghers là một rối loạn di truyền trội tự phát, đặc trưng bởi cácpolyp ở đường tiêu hóa và tổn thương sắc tố niêm mạc Những bệnh nhânmắc hội chứng này thường xuất hiện những đốm màu trên môi, nướu răng,mắt, lỗ mũi, trên niêm mạc miệng và thưa thớt trên da Polyp xuất hiện chủyếu ở ruột non, sau đó là đại tràng và dạ dày Những polyp đường tiêu hóanày có thể dẫn đến chảy máu mạn tính và thiếu máu, gây ra tắc nghẽn và táiphát nhiều lần đòi hỏi phải phẫu thuật nội soi lặp đi lặp lại và cắt bỏ ruột, từ

đó ảnh hưởng đến tình trạng tâm lý và làm giảm chất lượng cuộc sống củabệnh nhân PJS

Năm 1988, đột biến trên gen STK11 (còn được gọi là LKB1) đã được

phát hiện là nguyên nhân gây ra hầu hết các trường hợp mắc hội chứng

Peutz-Jeghers Gen STK11 là gen ức chế khối u, có vai trò trong việc ngăn chặn các

tế bào phát triển và phân chia quá nhanh hoặc không kiểm soát được Đột

biến trên gen này có thể làm thay đổi cấu trúc hoặc chức năng của proteinSTK11, phá vỡ khả năng hạn chế sự phân chia tế bào Sự phát triển của tế bàokhông được kiểm soát dẫn đến sự hình thành các polyp không ung thư và khối

u ung thư ở những người mắc hội chứng Peutz-Jeghers Tuy nhiên, vẫn cómột tỷ lệ thấp những người mắc hội chứng Peutz-Jeghers không mang đột

biến gen STK11, trong những trường hợp này, nguyên nhân của hội chứng

vẫn đang được nghiên cứu thêm [3]

Trong suốt nhiều thập kỷ qua đã có rất nhiều nghiên cứu về khía cạnhlâm sàng cũng như cơ chế bệnh học phân tử của hội chứng Peutz - Jegherstrên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu chính

thức nào về đột biến gen liên quan đến bệnh Vì vậy, đề tài nghiên cứu: “Xác

định đột biến gen STK11 trên một số bệnh nhân mắc hội chứng Peutz

-Jeghers bằng kỹ thuật giải trình tự gen” được thực hiện với mục tiêu: Sử

dụng kỹ thuật giải trình tự gen phát hiện đột biến trên exon 2 gen STK11

trong hội chứng Peutz – Jeghers.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu Hội chứng Peutz – Jeghers

Hội chứng Peutz-Jeghers (thường được viết tắt là PJS) là một rối loạn

di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự phát triển của cácpolyp mô đệm trong đường tiêu hóa (chủ yếu ở ruột non) và tổn thương niêmmạc sắc tố PJS lần đầu tiên được báo cáo trên một cặp sinh đôi cùng trứngvới các đốm sắc tố da được mô tả bởi bác sĩ J.T.Connor vào năm 1895 vàđược minh họa bởi Hutchinson vào năm 1896 [4,5] Sau đó, tình trạng củacặp song sinh đã phát triển trở thành những tiến triển đặc trưng của PJS đượcbiết đến ngày nay: một người đã tử vong vì bệnh lồng ruột ở tuổi 20, và ngườikia tử vong vì ung thư vú ở tuổi 52 [6,7]

Các triệu chứng đặc trưng của PJS đã được bác sĩ Jan Peutz đưa ravào năm 1921 trên một gia đình nguời Hà Lan (gia đình Harrisburg) là mộtgia đình có polyp trong đường tiêu hóa và xuất hiện sự hình thành sắc tố Bêncạnh đó các polyp ở mũi cũng được mô tả trong báo cáo ban đầu của Peutz[8] Phả hệ của gia đình người Hà Lan này sau đó được tiếp tục được theo dõi[9,10] Harold Jeghers (1904 -1990), một bác sĩ người Mỹ, đã mô tả 10trường hợp từ các gia đình khác nhau trong nghiên cứu của ông :“Tổng quan

về đa polyp ruột và những đốm melanin ở niêm mạc miệng, môi và các ngón”vào năm 1949 cùng với McKusick và Katz Nghiên cứu đã xác định mối quan

hệ giữa các tổn thương sắc tố, polyposis đường tiêu hóa và nguy cơ mắc ungthư biểu mô khi mà khoảng một nửa số bệnh nhân của ông có khối u ác tínhđường tiêu hóa [3] Tên “Hội chứng Peutz-Jeghers” được giới thiệu bởi bác sĩ

X quang Andre J Bruwer vào năm 1954 [11] Những nghiên cứu mô tả môhọc đầu tiên về polyp mô đệm (hamartomatous polyps) được viết vào năm

1957 bởi Horrilleno và các đồng nghiệp [12] Từ đó, xu hướng phát triển cácpolyp này ở đường tiêu hóa trên và dưới đã được phát hiện ở một số hội

chứng khác Năm 1998, đột biến gen STK11 gây bệnh Peutz - Jeghers đã

được xác định và cho phép phát hiện sớm bệnh và sàng lọc các thành viêntrong gia đình

Hội chứng Peutz - Jeghers là rối loạn hiếm gặp ảnh hưởng đến nam

và nữ với xác suất như nhau và có thể xảy ra ở bất kỳ nhóm chủng tộc nào Tỷ

lệ mắc bệnh ước tính của PJS trong cộng đồng dao động từ 1/50.000 đến1/200.000 Một vài nghiên cứu cho thấy căn bệnh này có thể phổ biến hơn ởmột số quốc gia như Hà Lan và Trung Quốc Phụ nữ có nguy cơ mắc ung thưcao hơn nam giới, vì PJS làm tăng khả năng phát triển ung thư vú, buồngtrứng, cổ tử cung và tử cung [13]

Tại Việt Nam hiện chưa có báo cáo chính thức nào về tỷ lệ hiện mắccũng như các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến hội chứng Peutz –Jeghers

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Peutz – Jeghers

Hội chứng Peutz - Jeghers là một tình trạng di truyền trội gây ra bởi

đột biến gen STK11 Gen bất thường có thể được di truyền từ bố hoặc mẹ

hoặc có thể là kết quả của một đột biến mới (de novo) ở cá thể bị ảnh hưởng.Khả năng truyền gen bất thường từ cha mẹ sang con cái là 50% cho mỗi lầnmang thai, nguy cơ là như nhau đối với nam và nữ Khoảng 70-90% bệnh

nhân PJS được xác định có đột biến gen STK11, điều đó có nghĩa là các gen

khác có thể liên quan đến căn bệnh này Hơn 200 đột biến gây bệnh đã đượcbáo cáo và sự xâm nhập của các đột biến này được cho là 100%, có nghĩa làmột cá nhân mang đột biến gây bệnh sẽ luôn dẫn đến sự phát triển bệnh

Gen STK11 mã hóa một loại protein có liên quan đến sự điều hòa phân

chia tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) Nó cũng tương tác

với p53, một loại protein ức chế khối u chính Các đột biến gây bệnh trong

gen STK11 dẫn đến sự ngừng hoặc rối loạn sản xuất protein do gen và sự phát

triển của tế bào không được kiểm soát, gây nên sự ngăn chặn quá trìnhapoptosis ở tế bào biểu mô ruột, từ đó có thể dẫn đến sự phát triển của polyp

mô đệm (hamartomas) và ung thư Các polyp đường tiêu hóa được tìm thấytrong hội chứng Peutz-Jeghers là các polyp mô đệm điển hình Đặc trung môhọc của loại polyp này sự tăng sinh và lan rộng cơ trơn rộng khắp polyp Cácđốm sắc tố đen (các tế bào melanocytic) được cho là do viêm và tắc nghẽn dichuyển melanin từ các tế bào nơi nó được sản xuất (melanocytes) đến các tếbào hình thành lớp ngoài cùng của da (keratinocytes) Ung thư phát với bệnhnhân mắc hội chứng Peutz-Jeghers với tần suất cao hơn so với dân số nóichung [13]

Bảng 1.1 Nguy cơ mắc ung thư trong cộng đồng và trên bệnh nhân mắc

hội chứng Peutz – Jegher [14]

Loại ung thư

Nguy cơ mắc trong cộng đồng nói chung

Người đã mắc hội chứng

Peutz-Jeghers Nguy cơ mắc

ung thư

Độ tuổi trung bình khi chẩn đoán

Ung thư đại trực

Ung thư buồng

Cervix (adenoma

Ung thư tinh hoàn

1.1.3 Triệu chứng và chẩn đoán của hội chứng Peutz- Jeghers

Hội chứng Peutz - Jeghers (PJS) đặc trưng với các polyp đường tiêuhóa, xuất hiện sắc tố niêm mạc và khuynh hướng phát triển ung thư ở bệnhnhân Polyp được tìm thấy trong hội chứng Peutz - Jeghers thường xuất hiện ởtuổi thiếu niên và giai đoạn sớm của tuổi trưởng thành Một phần ba số ngườimắc hội chứng này phải trải qua các triệu chứng trong 10 năm đầu đời [15]

Độ tuổi trung bình của lần xuất hiện polyp đầu tiên là 11-13 tuổi; khoảng 50%

các bệnh nhân đã trải qua các triệu chứng ở tuổi 20 [16] Polyp đường tiêuhóa có thể dẫn đến chảy máu mạn tính và thiếu máu, gây ra tắc nghẽn và táiphát nhiều lần đòi hỏi phải phẫu thuật nội soi lặp đi lặp lại và cắt bỏ ruột Sựtăng sắc tố da xuất hiện ở những bệnh nhân PJS là hiện tượng trên cơ thể cónhững đốm màu trên môi, nướu răng, mắt, lỗ mũi và trên niêm mạc miệng; vàxuất hiện thưa thớt trên da, các ngón tay, lòng bàn chân, lòng bàn tay, khuvực hậu môn và niêm mạc ruột Các sắc tố đặc trưng có ở 95% bệnh nhân vàđược gây ra bởi các đại thực bào sắc tố ở lớp hạ bì Chúng thường có thể làcác đốm phẳng, màu xám xanh đến nâu và có kích thước 1-5 mm Nhữngđốm này có thể được phân biệt với các tàn nhang thông thường vì tàn nhang

sẽ không xuất hiện trong khoang miệng, thưa thớt gần môi và lỗ mũi, và sẽkhông xuất hiện ở trẻ sơ sinh Sự tăng sắc tố thậm chí có thể biến mất trongthời niên thiếu

Hình 1.1 Đốm sắc tố ở môi và niêm mạc miệng bệnh nhân mắc PJS [17]

Bệnh nhân mắc hội chứng PJS bên cạnh các các triệu chứng về tăngsắc tố da còn có các triệu chứng như đau thắt ở vùng bụng; phân lẫn máu cóthể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc nôn mửa Chụp X quang ruột non sửdụng thuốc cản quang hoặc nội soi sẽ thấy nhiều polyp trong ruột non.

Hình 1.2 Polyp trong hỗng tràng của bệnh nhân mắc PJS [17]

Bệnh nhân có thể bị lồng ruột với các triệu chứng: đau bụng đột ngột,

dữ dội, đối với trẻ em cơn đau có thể khiến trẻ quấy khóc về đêm, bỏ chơi, bỏ

bú, mỗi cơn đau kéo dài 5-15 phút, cơn đau mất đi đột ngột Sau cơn đau, trẻ

có thể lại tiếp tục bú hoặc chơi nhưng các triệu chứng lại tái diễn sau đó, trẻnôn ra thức ăn, nôn ra dịch xanh hoặc vàng Đại tiện ra máu là một trongnhững dấu hiệu muộn, máu lẫn chất nhầy, có thể đỏ hoặc nâu và cũng có thể

có vài giọt máu tươi chảy ra hậu môn Bí trung - đại tiện vì khối lồng gây tắcruột hoàn toàn hoặc khi ruột không tắc hoàn toàn, bệnh nhân vẫn tiếp tục đạitiện được Sờ thấy khối lồng: lúc bệnh nhân dịu cơn đau, sờ thấy khối lồng là

một khối dài, di động, mặt nhẵn, đau khi ấn Bệnh nhân thường mệt lả, ít hoạtđộng Nhiệt độ cơ thể tăng cao Chụp X quang cho thấy hình ảnh khối lồngruột Siêu âm thấy hình ảnh khối lồng.

Chẩn đoán PJS được xác định bằng một hoặc nhiều polyp mô đệmtrong đường tiêu hóa được xác nhận bằng mô bệnh học, và ít nhất là hai trongnhững điều sau đây:

 Polyp trong ruột non

 Hiện tượng tăng sắc tố ở miệng, môi, ngón tay, ngón chân

 Ít nhất một người thân được chẩn đoán với PJS

Có 2 trong 3 tiêu chí lâm sàng trên sẽ cho kết quả dương tính.Khoảng 70 - 90% bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng về PJS có đột biến gen

STK11 Xét nghiệm di truyền phân tử cho đột biến này được thực hiện trên

lâm sàng [18]

1.1.4 Điều trị hội chứng Peutz – Jeghers

Điều trị hội chứng PJS chủ yếu là dùng phẫu thuật để cắt bỏ cácpolyp và phòng tránh ung thư hóa của các polyp này Bệnh nhân mắc hộichứng Peutz - Jeghers thường phải thực hiện nhiều lần phẫu thuật trong đời

Có thể phẫu thuật mổ hở hoặc mổ nội soi để giải quyết những vấn đề củađường tiêu hóa và ngoài đường tiêu hóa Nội soi cắt polyp nhỏ và mổ hở cắtpolyp lớn, nếu cần có thể phải cắt một đoạn ruột Có thể phải mở bụng và cắtmột đoạn ruột của bệnh nhân có biến chứng lồng ruột, tắc ruột hay xuất huyếttiêu hóa liên tục Có hai phương thức cơ bản trong chẩn đoán và điều trị cáckhối u ruột non: nội soi bóng đôi (Double balloon enteroscopy hay DBE) vànội soi ruột trong phẫu thuật (Intra-operative enteroscopy hay IOE)

Hình 1.3 DBE kỹ thuật nội soi bóng đôi

(Nguồn: http://medicalj-center.info)

DBE là một phương pháp nội soi mới cho phép kiểm tra và điều trịhỗng tràng và hồi tràng ở hầu hết tất cả các bệnh nhân Hệ thống này bao gồmmột ống nội soi 200 cm và ống trên 145 cm có bóng cao su mềm ở đầu củachúng Bằng cách sử dụng những quả bóng này để kẹp chặt thành ruột, ốngnội soi có thể được đưa vào xa hơn mà không hình thành các vòng ruột thừa[19] Hiện nay tại Việt Nam, đa số các bệnh viện chỉ phổ biến nội soi dạ dày

và nội soi đại tràng, tức là soi từ trên miệng xuống và soi từ hậu môn lên, ruộtnon ở đoạn giữa thì chưa soi được, do phương tiện hạn chế Thiết bị nội soibóng kép (bóng đôi) này sẽ giúp các bác sĩ có thể nội soi đoạn ruột non này

và đặc biệt là có thể can thiệp điều trị như: cắt polyp, cầm máu hoặc sinh thiếttổn thương khi cần

IOE là sự kết hợp của phẫu thuật với nội soi Nó cho phép thao tác đểđảm bảo toàn bộ ruột non được trực quan hóa và gần như tất cả các polypđược cắt bỏ theo phương pháp nội soi hoặc phẫu thuật [20] IOE được dànhriêng cho bệnh nhân chảy máu giữa ruột lớn, tổn thương không thể tiếp cậnđược bằng nội soi bóng và các tổn thương khó điều trị hoặc không thể điều trịbằng nội soi bóng Thủ thuật diễn ra trong phòng mổ với sự hợp tác chặt chẽcủa bác sĩ nội soi và bác sĩ phẫu thuật là một trong những ưu điểm củaphương pháp IOE.

Đối với việc điều trị PJS, cần phải loại bỏ tất cả các polyp ruột noncàng nhiều càng tốt (ít nhất là các polyp lớn hơn 5 mm) Trong một nghiêncứu năm 2004, Oncel và các cộng sự đã so sánh hai nhóm bệnh nhân mắcPJS Nhóm đầu tiên gồm tám bệnh nhân chỉ điều trị tập trung vào các triệuchứng chảy máu hoặc tắc nghẽn Những bệnh nhân này cần 23 ca phẫuthuật tiếp theo trong vòng 87 năm theo dõi bệnh nhân (2,64 ca phẫu thuậtmỗi năm) Nhóm thứ hai gồm ba bệnh nhân được phẫu thuật sử dụng IOE,với việc loại bỏ tất cả các polyp ruột non Những bệnh nhân này không cầnphẫu thuật thêm trong vòng 21 năm theo dõi tiếp theo [21] Loại bỏ kịpthời tất cả các polyp ruột non và sàng lọc cẩn thận là tiêu chuẩn vàng chobệnh nhân PJS

Để phòng tránh ung thư, cần sàng lọc ung thư thường xuyên chonhững bệnh nhân mắc PJS và phòng tránh bệnh cho những người có tiền sửgia đình mắc PJS Đối với trẻ em nên bắt đầu nội soi đại tràng năm 8 tuổi.Nếu nhìn thấy polyp, cần nội soi và thăm khám đều đặn 2 đến 3 năm 1 lần;nếu không nhìn thấy polyp, cần nội soi lại vào năm 18 tuổi Siêu âm và nộisoi tụy để sàng lọc ung thư tuyến tụy, bắt đầu từ năm 30 đến 35 tuổi, hoặc trẻhơn 10 tuổi so với tiền sử chẩn đoán ung thư tuyến tụy trẻ nhất trong gia đình.Những người mắc bệnh PJS nên tránh hút thuốc, do nguy cơ mắc ung thư

phổi khá cao Để sàng lọc ung thư cho phụ nữ mắc bệnh PJS, tự kiểm tra vúhàng tháng hoặc kiểm tra vú hàng năm ở bệnh viện Bắt đầu từ năm 20 tuổi,những bệnh nhân này cần khám phụ khoa hàng năm, làm xét nghiệm phết tếbào cổ tử cung, siêu âm qua đường âm đạo hoặc sinh thiết tử cung Đối vớinam giới mắc PJS: hàng năm kiểm tra và siêu âm tinh hoàn khi đến tuổitrưởng thành, sau đó định kỳ mỗi năm 1 lần [22]

1.2 Tổng quan về gen STK11

1.2.1 Vị trí của gen STK11

Gen STK11 có tên đầy đủ là “Serine/Threonine Kinase 11” Ngoài ra,gen còn có các tên gọi khác như: LKB1, PJS, Serine/threonine-protein kinase 11,STK11_HUMAN, NY-REN-19 STK11 là tên định danh chính thức được viếtbởi Tổ chức bộ gen người (Human Genome Organisation - HUGO)

Gen STK11 nằm trên nhánh ngắn (p) của NST số 19, vị trí: 19p13.3, từ

cặp base 1.205.799 đến cặp base 1.228.435, với kích thước 22.636 bp và gồm

9 exon

Hình 1.4 Vị trí gen STK11 trên nhánh ngắn NST số 19

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/)

1.2.2 Chức năng của gen STK11

Đột biến trong gen STK11 (serine/threonine-protein kinase 11 hay tên

hiệu là LKB1) trên nhiễm sắc thể 19p13.3 được xác định là nguyên nhân ditruyền chính của PJS vào năm 1998 [13]

Hình 1.5 Cấu trúc protein STK11/LKB1 ở người

(Nguồn: http://atlasgeneticsoncology.org/) Gen STK11 mã hóa cho protein STK11 gồm 433 acid amin trọng

lượng phân tử khoảng 48 kDa, biểu hiện ở nhiều vị trí trong cơ thể ngườitrưởng thành cũng như các mô của thai nhi, đặc biệt là ở tuyến tụy, gan, tinhhoàn và cơ xương [23] Acid amin từ 38 - 43 tạo thành miền tín hiệu định vịnhân (the nuclear localization signal – NLS, một trình tự acid amin ngắn giúpprotein được đưa vào nhân) Các acid amin từ 49 - 309 tạo thành miềnserine/threonine kinase, được bảo tồn tiến hóa , trong đó phần lớn các đột biếnsai nghĩa liên quan đến PJS xảy ra ở miền này, dẫn đến hoạt động kinase bịsuy giảm và ức chế tăng trưởng tế bào [24] STK11 không có miền xuất khẩuhạt nhân (nuclear export signal – NES, trình tự acid amin ngắn giúp proteinđược đưa ra khỏi nhân), nên nó cần tương tác với các protein khác để đượcxuất ra khỏi nhân Do đó, việc kích hoạt STK11 có liên quan đến sự di chuyểncủa nó ra tế bào chất khi hình thành liên kết với STRADα và protein MO25[25] Khi phức hợp với STRADα và MO25 nằm trong tế bào chất, proteinSTK11 phosphoryl hóa (chuyển hóa gốc phosphate từ acid amin serin vàthreonine sang phân tử khác) và hoạt hóa kinase họ AMP (AMPK hay 5'

AMP-activated protein kinase là một enzyme có vai trò quan trọng trong việccân bằng năng lượng nội môi của tế bào, chủ yếu là để hoạt hóa sự hấp thu vàoxy hóa glucose và acid béo khi năng lượng của tế bào thấp), ví dụ AMPKα1,AMPKα2, NUAK1, NUAK2, SIK1, SIK1, SIK1, SIK1 MARK4, BRSK1,BRSK2 và SNRK [26]

Hình 1.6 Sự hoạt hóa protein STK11/LKB1 từ nhân ra tế bào chất [27]

Protein ức chế khối u STK11 là một serine/threonine kinase đóng vaitrò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào và sự bất hoạt của nó có liên quan đến

sự hình thành khối u trong các loại ung thư khác nhau Thông qua một số chấttrung gian, STK11 điều chỉnh các quá trình tế bào quan trọng liên quan đến sựphân cực của tế bào, chuyển hóa năng lượng và tăng trưởng tế bào

Hình 1.7 Chức năng và tín hiệu của protein STK11/LKB1 [27]

AMPK bị phosphoryl hóa và được kích hoạt bởi STK11 là một yếu tốthể hiện sự quan trọng trong chức năng của STK11 STK11 cảm nhận cácđiều kiện khi năng lượng tế bào thấp và bảo vệ các tế bào khỏi chu trình chết

tế bào bằng cách kích thích tầng tín hiệu AMPK STK11 tác động đến quátrình kiểm soát tăng trưởng tế bào thông qua nhiều đường truyền tín hiệu khácnhau, một trong số đó là đường truyền tín hiệu qua mTOR Do các bệnh ungthư khác nhau có liên quan đến việc kích hoạt AMPK và ức chế mTOR, chấtkích hoạt AMPK dược lý (metformin) và chất ức chế mTOR (rapamycin) đềuđang được sử dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư

STK11 cũng tham gia vào quy định chu kỳ tế bào và sự chết tế bàotheo chương trình (apoptosis) Tín hiệu STK11/AMPK có thể gây dừng chutrình tế bào ở pha G1 khi chu kỳ tế bào tiến triển từ pha G1 sang S, thông qua

sự điều hòa cyclin D1, cyclin D3, và sự điều hòa của p53, p21 và p27 Ngoài

ra, STK11 đã được chứng minh là tín hiệu đến điều chỉnh sự chết tế bào theochương trình thông qua p53 Ở chuột, loại bỏ đồng thời phức hợp p53 vàSTK11 làm tăng tốc độ khởi phát và tăng tỷ lệ xuất hiện polyp, cho thấySTK11 và p53 cùng có tác động đến việc phát triển khối u Các đột biếnSTK11 liên quan đến PJS đã được chứng minh là làm giảm hoạt động p53 Sựphá vỡ cân bằng cân bằng nội môi giữa quá trình tăng sinh tế bào và sự chết

tế bào theo chu trình là nguồn gốc cho sự phát triển ung thư khi mà các tế bàokhối u không chỉ tăng sinh mất kiểm soát mà còn tránh được sự chết theo chutrình Do đó, tín hiệu STK11/AMPK/p53 đóng một vai trò nổi bật trong chứcnăng của protein STK11 thông qua khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào vàkích hoạt quá trình apoptosis [28]

1.2.3 Một số đột biến gen STK11 liên quan đến hội chứng Peutz-Jeghers

Đột biến gen STK11 được coi là nguyên nhân chính gây nên PJS Hiện nay, khoảng 396 đột biến gen STK11 đã được phát hiện ở những bệnh nhân

mắc bệnh PJS hoặc các rối loạn khác [29], bao gồm đột biến sai nghĩa và vônghĩa (29,8%), đột biến mất và chèn đoạn nhỏ (38,9%), đột biến lặp đoạn(20,5%), đột biến splice-site (thay đổi quá trình cắt nối exon hoàn thiện RNA)

(9,8%) và các loại đột biến khác (1,0%) Các đột biến gen STK11 khác được

tìm thấy trong PJS bao gồm đột biến thêm nucleotide, mất nucleotide hoặcmất toàn bộ gen Những đột biến này có thể gây ra lệch khung đọc hoặc vônghĩa, dẫn đến việc xuất hiện mã kết thúc sớm, thay đổi cấu trúc protein vàmất hoạt động kinase Bên cạnh đó, vị trí và loại đột biến cũng có liên quanđến nguy cơ ung thư [27] Năm 2006, H Mehenni và các cộng sự đã tiến hànhnghiên cứu trên 149 bệnh nhân mắc hội chứng Peutz Jeghers bị đột biến trên

gen STK11 để xác định nguy cơ tích lũy ung thư theo độ tuổi của bệnh nhân Kết quả đã xác nhận rằng những người mang đột biến trên gen STK11 có

nguy cơ mắc ung thư cao suốt đời và những bệnh nhân đột biến trên exon 6

của gen STK11 có nguy cơ ung thư cao hơn đột biến tại các vị trí khác [30] Bệnh nhân mắc bệnh PJS có chứa đột biến gen STK11 cũng có nguy cơ mắc

ung thư cao hơn, với nguy cơ 81% ở tuổi 70 [31]

Mối tương quan giữa đột biến gen STK11 và đặc điểm lâm sàng trong PJS đã được mô tả trước đây Các đột biến sai nghĩa trong STK11 thường dẫn

đến sự khởi phát muộn hơn của PJS, trong khi các đột biến làm xuất hiện mãkết thúc sớm, làm cho protein ngắn hơn bình thường có thể khiến bệnh khởiphát sớm hơn Trong một nghiên cứu năm 2010, Salloch và các cộng sự đãkết luận rằng những bệnh nhân bị đột biến làm protein ngắn hơn bình thường

có xu hướng phát triển nhiều polyp và ung thư hơn, khiến những bệnh nhânnày phải tiến hành nhiều lần phẫu thuật trong cuộc đời [32]

1.3 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen STK11 1.3.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp mang tính cáchmạng được phát triển bởi Kary Mullis vào những năm 1980 Đây là một kỹthuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản một hay vài đoạn DNAthành nhiều bản sao Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc biến tính, hồi tínhcủa DNA bởi nhiệt độ và khả năng của DNA polymerase tổng hợp chuỗiDNA mới bổ sung cho chuỗi mẫu ban đầu

Hình 1.8 Các giai đoạn của phản ứng PCR 1: Giai đoạn biến tính; 2: Giai đoạn gắn mồi; 3: Giai đoạn kéo dài

( Nguồn https://en.wikipedia.org/)

Phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn

 Giai đoạn 1 (giai đoạn biến tính): giai đoạn này được thực hiện với

nhiệt độ cao từ 94 - 95°C Trong quá trình này đã làm đứt các liên kết hidro,

từ đó DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn tạo mạch khuôn cho quá trìnhtổng hợp

 Giai đoạn 2 (giai đoạn gắn mồi): trong giai đoạn này nhiệt độ được hạ

thấp xuống về nhiệt độ gắn mồi cho phép các đoạn oligonucleotid gắn với sợiDNA khuôn Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt

sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi Nhiệt độ gắn mồi này thayđổi tùy theo đặc điểm của từng cặp mồi

 Giai đoạn 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên đến 72°C là

nhiệt độ hoạt động tối ưu nhất của enzym Taq polymerase, dưới tác động của

enzym này các mạch đơn được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung [33]

Để khuếch đại thành công đoạn gen đích, chu kỳ nhiệt gồm ba giaiđoạn trên được nhắc lại 25 – 40 lần Số lượng chu kỳ tùy thuộc vào mục đíchứng dụng cụ thể Cuối cùng sản phẩm của phản ứng được làm lạnh về nhiệt

độ phòng hoặc 4oC, tùy theo mục đích sử dụng và loại thiết bị tạo chu kỳnhiệt được sử dụng

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR nhằm khuếch đại các đoạn genmong muốn để phục vụ cho kỹ thuật giải trình tự gen ở bước sau

Thành phần của phản ứng PCR

 Dung dịch đệm PCR: Thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổitùy theo loại enzym được sử dụng, thông thường các công ty bán enzym DNApolymerase sẽ kèm theo dung dịch đệm 10x Trong dung dịch đệm 10xthường bao gồm: Tris - HCl (pH 8,3 ở 25oC); KCl; MgCl2; gelatin; Tween -20; NP – 40 Trong đó, MgCl2 là một tronng những thành phần quan trọngnhất vì hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóngchảy của DNA mạch đôi và tăng khả năng bắt cặp, khả năng gắn của mồi vàokhuôn từ đó ảnh hưởng đến sự đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng

 DNA khuôn: Đoạn DNA cần nhân bản Đoạn DNA này cần đảm bảonồng độ và chất lượng tinh sạch, tránh nhiễm các DNA ngoại lai khác để tối

ưu hóa phản ứng

 Cặp mồi đặc hiệu: Là những đoạn oligonucleotid mạch đơn dài 20-30nucleotid có trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của hai đầu đoạnDNA khuôn Mỗi cặp mồi có một mồi xuôi và một mồi ngược

 Enzym DNA polymerase: Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq

polymerase, được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus phân lập được

trong bùn đất của các suối nước nóng, là một enzyme có khả năng chịu nóng

mà không bị phân hủy ở nhiệt độ cao Taq polymerase cho thấy hoạt tính tối

ưu của nó ở khoảng 72°C với sự có mặt của các ion Magie

 Các nucleotid (dNTPs): Là những đoạn oligonucleotid mạch đơn dài20-30 nucleotid có trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của haiđầu đoạn DNA khuôn Mỗi cặp mồi có một mồi xuôi và một mồi ngược.

 Nước cất khử ion

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trình tựsắp xếp của 4 loại nucleotid: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine) và C(Cytosine) trên phân tử DNA Những nghiên cứu đầu tiên về giải trình tựDNA được thiết lập bởi Ray Wu tại Đại học Cornell vào năm 1970 FrederickSanger sau đó dựa trên những nghiên cứu của Ray Wu để phát triển phươngpháp giải trình tự DNA và cùng các cộng sự phát minh ra kỹ thuật giải trình

tự gen bằng phương pháp enzym vào năm 1977 Thành phần của kỹ thuật nàybao gồm DNA sợi đơn cần giải trình tự; enzyme DNA polymerase; đoạn mồi;deoxynucleotidetriphosphate (dNTPs) và một thành phần đặc biệt đó là di -deoxynucleotidetriphosphates (ddNTPs)

Hình 1.9 Cấu trúc của ddNTP

(Nguồn: https://bio.libretexts.org)

ddNTP là một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tửdeoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường deoxyribosekhông phải là nhóm hydroxyl (–OH) mà là –H Các ddNTP có nhiệm vụ dừngviệc tổng hợp mạch bổ sung do không hình thành được liên kếtphosphodieste Các ddNTP tham gia vào phản ứng tại nhiều thời điểm khácnhau và tạo ra các sợi đơn DNA có kích thước khác nhau Để thực hiện kỹthuật giải trình tự này, đầu tiên khuếch đại đoạn DNA cần giải trình tự Sửdụng một đoạn mồi bổ sung với trình tự của vector và gắn vào đầu 3’ củavector gần vị trí chèn DNA Phản ứng sau đó được tiến hành trong 4 ốngnghiệm, mỗi ống được cung cấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do(một trong bốn loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ) và một trong bốndideoxynucleic (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Nồng độ của mỗi ddNTPđược điều chỉnh thận trọng, thường chỉ dùng một lượng nhỏ, khoảng 1%.Trong quá trình tổng hợp chuỗi, enzym DNA polymerase sẽ gắn các dNTPvào để kéo dài chuỗi Do hàm lượng rất thấp nên thỉnh thoảng mới có 1dideoxynucleotid được gắn vào chuỗi và lúc đó phản ứng tổng hợp chuỗi bịdừng lại Như vậy trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA có chiềudài khác nhau, và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP tương ứng đãcho vào ống đó Tiến hành điện di 4 ống phản ứng trên 4 hàng của một gelpolyacrylamid để phân tách các đoạn DNA Do một trong 4 dNTP có đánhdấu phóng xạ nên khi dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi, các mạch đơn trên gelđiện di sẽ tạo các vạch sáng trên phim X quang Giải trình tự Sanger có thểthực hiện với các đoạn DNA khoảng 400 - 900 cặp base Tuy nhiên, giải trình

tự DNA theo phương pháp Sanger là tốn kém và không hiệu quả cho các dự

án nghiên cứu có quy mô lớn hơn, ví dụ như trình tự toàn bộ hệ gen người

Hình 1.10 Phương pháp giải trình tự gen của Sanger

(Nguồn: https://www.onlinebiologynotes.com)

Năm 1986, thiết bị giải trình tự ADN tự động đầu tiên được phát minhbởi Lloyd M Smith và được sản xuất bởi công ty Applied Biosystems Nóhoạt động dựa trên nguyên tắc sử dụng ddNTP của Sanger và đã giúp cho cácnhà khoa học hoàn thành dự án hệ gen người vào năm 2003 Trong các máynày, các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang với 4 màu khác nhau Nhờ vậyphản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện

di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệthống điện di thường là điện di mao quản Hệ thống máy gồm nhiều mao quảnchứa gel polyacrylamide cho phép phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di

Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín

hiệu huỳnh quang một cách chính xác Nguyên tắc hoạt động của máy làtrong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thìphân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnhquang tương ứng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độđỉnh sáng (peak) trong biểu đồ Dựa vào biểu đồ này, máy sẽ phân tích cácđỉnh cường độ sáng, so sánh với các màu, nhận diện được loại nucleotid vàcho ra trình tự DNA đích [34]

Hình 1.11 Giải trình tự gen bằng máy tự động

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Sanger_sequencing)

Hiện nay, tại phần lớn các phòng thí nghiệm đều sử dụng máy giải trình

tự gen tự động Ưu điểm của những máy giải trình tự này là có thể phân tích

nhiều mẫu trong một lần điện di, phần mềm tự động cho kết quả, giúp tiếtkiệm thời gian và công sức của người làm kĩ thuật Nghiên cứu này được thựchiện bằng máy giải trình tự gen tự động, đem lại kết quả nhanh chóng vàchính xác của các gen cần nghiên cứu, từ đó phát hiện chính xác các biến đổitrên gen, do vậy hỗ trợ hiệu quả cho nghiên cứu.

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2018 đến tháng 5/2019

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đạihọc Y Hà Nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu nghiên cứu: gồm 5 bệnh nhân đến khám tại bệnh viện Bạch Mai,

đã được chẩn đoán bị mắc hội chứng Peutz – Jeghers

- Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: Bệnh nhân được xác định có một hoặcnhiều polyp mô đệm trong đường tiêu hóa được xác nhận bằng mô bệnh học,

và ít nhất là hai trong những tiêu chí sau đây:

 Polyp trong ruột non

 Hiện tượng tăng sắc tố ở miệng, môi, ngón tay, ngón chân

 Ít nhất một người thân được chẩn đoán với PJS

Bệnh nhân được xác định có polyp mô đệm và ít nhất 2 trong 3 tiêu chítrên, được chẩn đoán mắc hội chứng Peutz - Jeghers