XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN SCN5A TRÊN một số BỆNH NHÂN mắc hội CHỨNG BRUGADA BẰNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN

---***---TRẦN YẾN THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SCN5A TRÊN MỘT SỐ BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG BRUGADA BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Ngành đào tạo: Cử nhân Xét nghiệm Y học... Hơn hai thập kỷ

-*** -TRẦN YẾN THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SCN5A TRÊN MỘT SỐ BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG BRUGADA BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2014 - 2018

HÀ NỘI-2018

-*** -TRẦN YẾN THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SCN5A TRÊN MỘT SỐ BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG BRUGADA BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Ngành đào tạo: Cử nhân Xét nghiệm Y học

đánh dấu cho quá trình học tập và nghiên cứu của sinh viên tại trường đại học.Việc tiến hành nghiên cứu, làm khóa luận tốt nghiệp đã giúp em học hỏi đượcrất nhiều, không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinh nghiệm làmviệc

Với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa Kỹ

Thuật Y Học, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, TrườngĐại học Y Hà Nội, người đã tận tình giúp đỡ, luôn đưa ra những lời khuyênhữu ích cũng như những lời góp ý tâm huyết giúp em hoàn thiện bài khóaluận

Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung

tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội,người Thầy đã tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận tại Trung tâm

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Đại học,Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thànhkhóa luận

Em xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Quý Hoài, là người đã trực

tiếp hướng dẫn, chia sẻ cho em những kỹ thuật và kinh nghiệm hữu ích trong

quá trình thực hiện khóa luận, cùng các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đã giúp em hoàn chỉnh khóa luận.

Lời cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã quantâm, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Trần Yến Thảo

-**** -LỜI CAM ĐOAN

Kính gửi: Phòng Quản lý Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội

Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡcủa thầy cô và các anh chị tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, tất cả các

số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

cứ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2018

Người viết khóa luận

Trần Yến Thảo

DNA Deoxyribonucleic Acid

ECG Electrocardiogram (Điện tâm đồ)

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid

OD Optical Density (Độ hấp thụ quang)

SNP Single Nucleotide Polymorphism

(Hiện tượng đa hình đơn nucleotid)

(Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase)

Na v 1.5 Voltage-gated sodium channel

(Kênh natri có tính chất cổng điện thế)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về hội chứng Brugada 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu Hội chứng Brugada 3

1.1.2 Lâm sàng của hội chứng Brugada 4

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Brugada 6

1.1.4 Điều trị hội chứng Brugada 9

1.2 Tổng quan về gen SCN5A 9

1.2.1 Vị trí của gen SCN5A 9

1.2.2 Chức năng của gen SCN5A và protein Nav1.5 10

1.2.3 Một số đột biến gen SCN5A liên quan đến hội chứng Brugada 13

1.3 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen SCN5A 14 1.3.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) 14

1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4 Quy trình nghiên cứu 20

2.5 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 21

2.5.1 Dụng cụ, trang thiết bị 21

2.5.2 Hóa chất 22

2.6 Quy trình kỹ thuật 24

2.6.1 Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm 24

2.6.2 Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi 25

2.7 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Kết quả tách chiết DNA 32

3.2 Kết quả khuếch đại 29 exon của gen SCN5A 33

3.3 Kết quả giải trình tự 29 exon trên gen SCN5A 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41

4.1 Kết quả tách chiết DNA 41

4.2 Kết quả PCR 43

4.3 Kết quả giải trình tự gen 45

KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Các đột biến gen liên quan đến hội chứng Brugada 8

Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại 29 exon của gen SCN5A 23

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 2.3 Nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 29 exon trên gen SCN5A 28

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR giải trình tự 30

Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA được tách chiết 33

Bảng 3.2 Các biến đổi trên gen SCN5A của 4 mẫu bệnh nhân 48

Hình 1.2 Vị trí gen SCN5A trên nhánh ngắn NST số 3 9

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Nav1.5 11

Hình 1.4 Mô tả hoạt động của kênh natri tim Nav1.5 12

Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR 16

Hình 1.6 Cấu trúc ddNTP và dNTP 17

Hình 1.7 Phương pháp giải trình tự gen của Sanger 18

Hình 1.8 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động 19

Hình 3.1 Minh họa kết quả đo mật độ quang họcbằng máy Nano Drop 2000c của mẫu DNA BrS-01 sau khi tách chiết 32

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 của mẫu bệnh nhân BrS-04 33

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 của mẫu bệnh nhân BrS-04 34

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29a, 29b, 29c, 29d, 29e của mẫu bệnh nhân BrS-04 34

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại các exon 29f, 29g, 29h, 29i, 29k, 29n, 29m của mẫu bệnh nhân BrS-04 35

Hình 3.6 Kết quả giải trình tự exon 2 mẫu BrS-01, BrS-02, BrS-03, BrS-04 37

Hình 3.7 Kết quả giải trình tự exon 29c mẫu BrS-03 37

Hình 3.8 Kết quả giải trình tự exon 29h mẫu BrS-01, BrS-02, BrS-03, BrS-04 38

Hình 3.9 Kết quả giải trình tự exon 29i mẫu BrS-01, BrS-02, BrS-03, BrS-04 39

Hình 3.10 Kết quả giải trình tự exon 29m mẫu BrS-01, BrS-02, BrS-04 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xu hướng bệnh tật trên thế giới đang có sự thay đổi với sự gia tăng về

tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng của các bệnh mạn tính so với các bệnh lâynhiễm Điều này dẫn đến dự đoán rằng đến năm 2030 các bệnh không lâynhiễm sẽ chiếm hơn ba phần tư số ca tử vong trên toàn thế giới [1] Một trongnhững bệnh mạn tính nguy hiểm được coi là nguyên nhân gây tử vong hàngđầu là bệnh tim mạch [2]

Năm 2015, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có khoảng 20 triệu

ca tử vong do các bệnh về tim mạch, chiếm 30% tổng số ca tử vong trên toànthế giới [1] Bên cạnh một số căn bệnh quen thuộc như bệnh mạch vành, độtquỵ, rối loạn nhịp tim hay suy tim thì gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quantâm đến Hội chứng Brugada Căn bệnh còn được gọi là “cái chết thầm lặng”với đặc điểm gây ra chứng đột tử về đêm trong khi ngủ, vô cùng nguy hiểm

Brugada là tên một hội chứng bệnh của tim do giảm tổng hợp hay giảmchức năng các protein vận chuyển ion natri, kali, canxi qua màng, gây rối loạnnhịp tim và tăng nguy cơ đột tử do tim Hội chứng Brugada được công bố trên

y văn thế giới lần đầu tiên vào năm 1992 với những mô tả đặc trưng: blocknhánh phải, đoạn ST trên hình ảnh điện tâm đồ chêch cao và hiện tượng đột tử

do tim không rõ nguyên nhân Người mắc hội chứng Brugada thường không

có triệu chứng lâm sàng điển hình mà chỉ có một vài biểu hiện khó phân biệtvới các bệnh tim mạch khác như ngất, ngừng tim đột ngột, rung thất,… Dovậy việc chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân mắc hội chứngBrugada gặp rất nhiều khó khăn

Một căn bệnh mới được phát hiện đã thu hút nhiều đề tài nghiên cứunhằm hiểu rõ các khía cạnh của bệnh với hi vọng tìm ra phương pháp điều trị

hiệu quả cũng như phòng ngừa, ngăn chặn kịp thời sự phát triển của nó Hộichứng Brugada chủ yếu do đột biến gen gây ra, gần 20 gen đã được phát hiện

và cho rằng có liên quan đến bệnh Gen SCN5A là gen được phát hiện đầu tiên

và cũng là gen được các nhà nghiên cứu quan tâm nhất Gen có chức năng mãhóa cho tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Nav1.5 (Voltage-gated sodiumchannel) – một protein màng quan trọng, tham gia vào quá trình dẫn truyềnxung điện của cơ tim giúp tim co bóp nhịp nhàng Ở những bệnh nhân mắc

hội chứng Brugada, đột biến gen SCN5A gây giảm tổng hợp hoặc giảm chức

năng kênh natri tim Nav1.5, dẫn đến rối loạn nhịp tim, nguy hiểm nhất làchứng đột tử

Hơn hai thập kỷ qua đã có rất nhiều nghiên cứu về khía cạnh lâm sàngcũng như cơ chế bệnh học phân tử của hội chứng Brugada trên thế giới, tuynhiên tại Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu chính thức nào về đột

biến gen liên quan đến bệnh Vì vậy, đề tài nghiên cứu: “Xác định đột biến

gen SCN5A trên một số bệnh nhân mắc hội chứng Brugada bằng kỹ

thuật giải trình tự gen” được thực hiện với mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật giải

trình tự gen phát hiện đột biến gen SCN5A trong hội chứng Brugada.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về hội chứng Brugada

1.1.1 Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu Hội chứng Brugada

Vào giữa thế kỷ 20 (1953), Osher và Woff đã phát hiện ra mô hình điệntâm đồ với block nhánh phải, kết hợp với độ cao phân đoạn ST, tuy nhiên tạithời điểm lúc bấy giờ dấu hiệu đó được coi là bình thường, không liên quanđến đột tử do tim

Trong những năm 80 của thế kỷ 20, Trung tâm kiểm soát dịch bệnh(CDC – Center for Disease Control) ở Atlanta đã quan sát thấy tỷ lệ đột tửcao bất thường ở những người tị nạn châu Á di cư đến Hoa Kỳ, chủ yếu ởđông bắc Thái Lan Cái chết đột ngột chủ yếu vào ban đêm ở những ngườiđàn ông trẻ và trung niên được biết đến ở các nước châu Á bằng nhiều cái tênkhác nhau như “Pokkuri” ở Nhật Bản, “Lai-tai” ở Thái Lan, “Bangungut” ởPhi-lip-pin, “Dream Disease” ở Hawaii [3]

Năm 1992, hai anh em người Tây Ban Nha Pedro và Josep Brugada đãphát hiện một mô hình điện tâm đồ riêng biệt chưa từng được mô tả trước đó

ở một nhóm gồm 8 bệnh nhân Cả 8 bệnh nhân đều không có bất thường vềcấu trúc tim, nhưng lại có triệu chứng tái phát nhiều lần của sự ngừng tim độtngột, block nhánh phải, đoạn ST trên hình ảnh điện tâm đồ chênh cao và tronggia đình có người tử vong đột ngột do tim không rõ chính xác nguyên nhân.Những bất thường này được mô tả, khẳng định có liên quan đến một mô hìnhbệnh tật và lần đầu tiên được đưa vào y văn thế giới

Năm 1996, thuật ngữ “Hội chứng Brugada” được sử dụng để mô tả tìnhtrạng block nhánh phải, đoạn ST chênh lên và tử vong đột ngột do tim

Năm 1998, một số nghiên cứu đã chỉ ra sự liên quan giữa đột biến gen

SCN5A-gen mã hóa tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Nav1.5 và hội chứng

Brugada Các nghiên cứu sau đó đã phát hiện ra nhiều gen liên quan đếnbệnh, hầu hết mã hóa cho các kênh ion natri, kali, canxi hoặc protein liênquan đến các kênh đó

Theo thống kê, tỷ lệ mắc hội chứng Brugada trên thế giới là 5/10.000,

tỷ lệ có sự dao động ở nhiều vùng trên thế giới, ước tính khoảng 0,15% ở cácnước châu Á, từ 0,1% đến 0,02% ở các nước Trung Đông và dưới 0,02% ởcác nước phương Tây [4], [5] Hội chứng thường được phát hiện ở nhữngngười đàn ông trẻ tuổi (độ tuổi <40 đến 45), tỷ lệ mắc ở nam gấp 8-10 lần sovới nữ giới [6] Tỷ lệ tử vong do hội chứng Brugada chiếm khoảng 4-12%tổng số ca tử vong bất ngờ và khoảng 20% tổng số ca tử vong ở những bệnhnhân tim mạch bình thường, do vậy Brugada được xếp vào nhóm nhữngnguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho nam giới dưới 40 tuổi [7]

Tại Việt Nam hiện chưa có báo cáo chính thức nào về tỷ lệ hiện mắc cũngnhư các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến hội chứng Brugada

1.1.2 Lâm sàng của hội chứng Brugada

Hình ảnh bất thường trên điện tâm đồ (Electrocardiography - ECG) trởthành một trong những dấu hiệu của hội chứng Brugada do sự tái cực và khửcực bất thường của tế bào cơ tim Bất thường này xảy ra khi bệnh nhân không

có biểu hiện thiếu máu cục bộ, rối loạn điện giải hay bất kì bất thường nào vềcấu trúc tim đã được mô tả như các bệnh tim mạch đã biết Bệnh nhân mắchội chứng Brugada có hình dạng ECG đặc trưng bởi độ chênh của đoạn STtrong chuyển đạo trước tim V1, V2, V3 với ba type ECG:

 Type 1: điển hình với đoạn ST hình vòm, chênh lên ≥ 2 mm (0,2 mV),kèm theo sóng T âm

 Type 2: đoạn ST hình yên ngựa, với độ chênh cao nhất ≥ 2 mm, theosau là dạng hình máng có độ chênh ≥ 1mm

 Type 3: có thể có hình thái của một trong hai loại 1 hoặc loại 2, nhưngvới ST chênh < 1mm

Hình 1.1 Ba dạng đoạn ST chênh thường thấy ở bệnh nhân mắc hội

chứng Brugada

(Nguồn: http://circ.ahajournals.org/)

Chẩn đoán lâm sàng phân biệt hội chứng Brugada:

1 ECG thuộc type 1 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3),không liên quan đến các bệnh tim cấu trúc đã được mô tả, đồng thời

có một trong các biểu hiện: rung thất, nhịp nhanh thất đa hình, ngất,ngừng hô hấp ban đêm, tiền sử gia đình về tử vong đột ngột do tim(< 45 tuổi) với ECG dạng đặc trưng của hội chứng Brugada

Bệnh nhân có ECG type 1 nhưng không có những triệu chứng lâmsàng như trên, gọi là mô hình ECG tự phát (không phải hội chứngBrugada)

2 ECG thuộc type 2 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3),sau khi bệnh nhân sử dụng một số thuốc chẹn kênh natri: Ajimaline(1 mg/kg thể trọng, 10 mg/phút), flecanide (2 mg/kg thể trọng, tối đa

150 mg, trong 10 phút) và procainamide (10 mg/kg, 100 mg/phút)thì hình dạng ECG chuyển sang type 1 Bệnh nhân có các chỉ tiêulâm sàng tương tự như mục (1) Nếu bệnh nhân không có sự thayđổi trong phân đoạn ST khi đáp ứng với thuốc chẹn kênh natri sẽkhông được coi là mắc hội chứng Brugada

3 ECG type 3 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3), và cókhả năng chuyển dạng ECG type 1 khi kích thích bởi thuốc chẹnkênh natri Bệnh nhân có các chỉ tiêu lâm sàng như mục (1) Sựchuyển đổi dạng ECG do thuốc từ type 3 sang type 2 không đượckết luận hội chứng Brugada [6]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Brugada

Hội chứng Brugada chủ yếu do đột biến gen gây ra Sự xuất hiện củađột biến dẫn đến giảm tổng hợp hoặc giảm chức năng các protein – kênh iontim natri, kali, canxi, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia hoạt động

co bóp của cơ tim thông qua quá trình điện học Quá trình này diễn ra do sựbiến đổi hiệu điện thế giữa mặt trong và mặt ngoài của tế bào cơ tim nhờ sự dichuyển của các ion (chủ yếu là ion K+ và Na+) Ở trạng thái nghỉ, màng tế bàođang ở trạng thái cực hóa do phía trong màng tế bào mang điện tích âm hơnphía ngoài màng tế bào Ở trạng thái điện thế hoạt động sẽ xuất hiện hai giaiđoạn là giai đoạn khử cực và giai đoạn tái cực Giai đoạn khử cực là giai đoạnkhử bỏ trạng thái cực hóa của cơ tim nhờ lượng lớn ion Na+ ồ ạt di chuyển vàobên trong màng tế bào, khiến điện thế trong màng tế bào trở nên dương tínhtương đối so với phía trong màng tế bào Sau giai đoạn khử cực, tế bào có xuhướng lặp lại các thăng bằng ion về trạng thái nghỉ nhờ sự khuếch tán của ion

K , khi đó điện thế ngoài màng tế bào trở lại dương tính tương đối so với mặttrong tế bào, giai đoạn này là tái cực

Trong hội chứng Brugada, việc thiếu hụt cũng như khiếm khuyết vềcấu trúc và chức năng các kênh ion gây ảnh hưởng đến quá trình điện thế hoạtđộng, dẫn đến rối loạn nhịp tim Kết quả là tim bơm máu không hiệu quả,không đủ máu di chuyển đến các cơ quan của cơ thể, điều này có thể dẫn đếntình trạng ngất xỉu nếu nhịp bất thường đó kéo dài trong thời gian ngắn hoặcđột tử do tim nếu nhịp bất thường xuất hiện trong thời gian dài

Hội chứng Brugada do đột biến gen trội trên nhiễm sắc thể (NST)thường, có thể di truyền từ bố mẹ cho con cái Tuy nhiên, theo các nghiên cứugần đây thì chỉ dưới 40% trường hợp mắc hội chứng Brugada có liên quanđến di truyền từ gia đình [4], các trường hợp còn lại chủ yếu do tự phát và chođến nay cơ chế vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ

Hình ảnh phân đoạn ST chênh cao trên điện tâm đồ không chỉ xuất hiệntrong hội chứng Brugada mà còn xuất hiện trên một số bệnh như: mất cânbằng điện giải (do hạ thân nhiệt, suy thượng thận, giảm kali máu, tăng calcihuyết,…), các bệnh thần kinh (loạn dưỡng cơ Duchenne, loạn dưỡng cơ tim,chứng Friendreich,…), các độc tố hoặc chất độc (cocaine, ethanol, heroin,…),bệnh cơ tim và màng ngoài tim (viêm cơ tim, viêm màng ngoài tim, loạn sảnthất phải, loạn nhịp thất,…),… Để phân biệt các chứng bệnh này với hộichứng Brugada cần tiến hành làm test kiểm tra với các thuốc chẹn kênh natrinhư: flecanide, ajmaline, procainamide,… Khi làm test này nếu test âm tính(ECG trở về dạng bình thường) thì không phải hội chứng Brugada, nếu testdương tính (ECG vẫn giữ nguyên dạng điển hình của Brugada) cùng với cáctriệu chứng đề cập ở mục 1.1.2 có thể kết luận hội chứng Brugada

Gần 20 gen đã được phát hiện liên quan đến hội chứng Brugada, chủyếu là các gen liên quan đến mã hóa kênh natri và protein liên kết với kênh

natri, trong đó SCN5A là gen được các nhà khoa học quan tâm nhiều nhất.

Bảng 1.1 Các đột biến gen liên quan đến hội chứng Brugada [4]

STT Kênh ion

Gen liên quan đến hội chứng Brugada

Vị trí của gen gen mã hóa Protein do

Tỷ lệ đột biến trong số những người mắc hội chứng Brugada

1.1.4 Điều trị hội chứng Brugada

Bản chất của nhịp tim bất thường trong hội chứng Brugada liên quanđến cấu trúc các kênh ion tim, do đó việc sử dụng các thuốc chống loạn nhịpnhư amiodarone, β-blockers là không hiệu quả trong việc điều trị bệnh, cácthuốc như flecainide, propafenone, procainamide là chống chỉ định Vậy nên

để điều trị hội chứng Brugada, chủ yếu sử dụng phương pháp cấy ghép máykhử rung tim (ICD, Implantable cardioverter-defibrillator), đây được xem làphương pháp hiệu quả nhất vì nó tự phá rung khi có rối loạn nhịp thất hay khi

có rung thất xuất hiện

Tuy nhiên, đôi khi các loại thuốc như quinidine, tedisamil cũng được

sử dụng để ngăn chặn sự nguy hiểm tiềm ẩn của rối loạn nhịp tim Điều trịbằng thuốc này cũng là phương pháp hữu ích bổ sung cho phương pháp cấyghép ICD [9]

1.2 Tổng quan về gen SCN5A

1.2.1 Vị trí của gen SCN5A

Gen SCN5A có tên đầy đủ là “sodium voltage-gated channel alpha subunit

5” Ngoài ra, gen còn có các tên gọi khác như: HB1; HB2; HH1; IVF; VF1;HBBD; ICCD; LQT3; SSS1; CDCD2; CMD1E; CMPD2; PFHB1; Nav1.5

Gen SCN5A nằm trên nhánh ngắn của NST số 3, vị trí: 3p22.2, từ cặp

base 38.548.061 đến cặp base 38.649.673, với kích thước 101.612 bp và gồm

29 exon [10]

Hình 1.2 Vị trí gen SCN5A trên nhánh ngắn NST số 3

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/)

1.2.2 Chức năng của gen SCN5A và protein Nav 1.5

Chức năng của gen SCN5A là mã hóa cho tiểu đơn vị alpha của kênh

natri tim (Nav1.5), và là gen liên quan đến nhiều rối loạn nhịp tim có tính chất

di truyền

1.2.2.1 Cấu trúc protein Na v 1.5

Có 9 loại kênh natri (Nav1.1-1.9) phân bố ở các mô khác nhau trong cơthể, các kênh này đều gồm hai tiểu phần: alpha và beta Tiểu đơn vị alpha cócấu trúc lỗ rỗng cho phép các dòng ion Na+ đi qua màng tế bào Và được mã

hóa bởi 9 gen (SCN1-5A và SCN8-11A) tương ứng với tiểu phần alpha của 9

loại kênh (Nav1.1-1.9), trình tự các acid amin của các protein tương đồng đếnhơn 50% [11] Tiểu đơn vị beta không trực tiếp cho dòng ion Na+ đi quanhưng có chức năng tương tác, hỗ trợ hoạt động cho tiểu đơn vị alpha Ởngười có 4 loại tiểu đơn vị beta (β1-β4 và β1B) được mã hóa bởi 4 gen tương

ứng (SCN1B-SCN4B).

Tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Nav1.5 được mã hóa bởi gen

SCN5A, gồm 2016 acid amin, trọng lượng phân tử vào khoảng 227 kDa Tiểu

đơn vị alpha được cấu thành bởi một chuỗi liên tục gồm bốn miền D1-D4.Trong mỗi miền chứa sáu phân đoạn xuyên màng S1-S6 và được liên kết vớimiền liền kề bởi các vòng liên kết (ID1-2, ID2-3, ID3-4) [12]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Na v 1.5

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Các phân đoạn từ S1 đến S4 tạo thành miền VSD (Voltage sensingdomain) – miền cảm biến điện áp Phân đoạn S4 của mỗi miền chứa các acidamin tích điện dương có vai trò cảm biến điện áp, giúp mở kênh trong giaiđoạn khử cực P-loop là vùng hình thành lỗ rỗng nằm giữa phân đoạn S5 vàS6 của mỗi miền, quyết định tính thấm của ion Na+ qua màng tế bào Do vậychỉ cần một thay đổi acid amin trong vùng P-loop cũng có thể sẽ ảnh hưởngtới quá trình điện thế hoạt động của cơ tim IFM (isoleucine-phenylalanine-methionine) là vùng khử hoạt tính nhanh Còn tiểu đơn vị beta nằm giữa vùngP-loop, đóng vai trò kích hoạt sau khi kênh natri ngừng hoạt động [13]

1.2.2.2 Hoạt động của kênh Na v 1.5

Kênh natri tim Nav1.5 tham gia vào giai đoạn khử cực của quá trìnhđiện thế hoạt động, đồng thời cũng đóng vai trò quan trọng trong việc dẫntruyền tim

Hoạt động của kênh Nav1.5 phụ thuộc cơ bản vào cảm biến điện áp,nhờ sự thay đổi điện thế màng sẽ làm thay đổi cấu trúc kênh, nên còn đượcgọi là kênh có cánh cổng điện thế (voltage – gate channel) Kênh có hai cổng,cổng hướng về phía ngoài màng tế bào là cổng hoạt hóa, cổng hướng về phíatrong gọi là cổng khử hoạt [14].

Hình 1.4 Mô tả hoạt động của kênh natri tim Na v 1.5

(Nguồn: https://f1000research.com/)

Ở trạng thái nghỉ, cổng hoạt hóa đóng, cổng khử hoạt mở, ion Na+

không vào được bên trong màng tế bào

Ở trạng thái hoạt hóa kênh natri: điện thế màng tăng dần từ -90mV vềphía 0, đến ngưỡng nhất định sẽ làm biến đổi đột ngột hình dáng cổng hoạthóa, khiến cổng chuyển sang vị trí mở, tính thấm màng tế bào cũng tăng lêngấp nhiều lần giúp ion Na+ ồ ạt di chuyển qua kênh vào trong màng tế bào.Trạng thái này kéo dài khoảng vài phần vạn giây

Ở trạng thái khử hoạt kênh natri: sự tăng điện thế làm mở cổng hoạthóa thì đồng thời cũng làm đóng cổng khử hoạt chỉ sau vài phần vạn giây.Cổng khử hoạt đóng lại từ từ, khiến kênh natri đóng, ion Na+ không vào trong

tế bào được, điện thế màng dần trở về trạng thái nghỉ Chỉ khi điện thế màng

đã quay trở về tới hoặc gần tới mức điện thế nghỉ lúc đầu thì cổng khử hoạt

mới có thể bắt đầu trạng thái mở ra, đó là cơ sở của việc kế tiếp đóng mởkênh natri tạo nên một xung điện [15].

1.2.3 Một số đột biến gen SCN5A liên quan đến hội chứng Brugada

Đột biến gen SCN5A được tìm thấy ở ít nhất 10 bệnh tim khác nhau,

ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng hoặc mức độ biểu hiện của kênh natri

Nav1.5 [16] Đột biến gen SCN5A có thể dẫn đến mất, giảm hoặc tăng chức

năng của kênh Nav1.5 liên quan đến một loạt các bệnh về tim Đột biến mất

hoặc giảm chức năng gen SCN5A có thể gây ra hội chứng Brugada, bệnh giãn

cơ tim, hội chứng viêm xoang, rung tâm nhĩ bệnh Lev- Lenègre,… Đột biếntăng chức năng là nguyên nhân gây ra hội chứng QT kéo dài type 3 và một sốbệnh khác

Trong hội chứng Brugada đột biến gen SCN5A dẫn đến giảm chức năng

protein kênh natri tim Nav1.5, dẫn đến thay đổi tính chất cổng điện thế (hoạthóa chậm, bất hoạt chậm, phục hồi hoạt động cho kênh natri chậm) hoặc giảmtính thấm đối với ion Na+ [7]

Tỷ lệ đột biến gen SCN5A trong cộng đồng khoảng 0% đến 0,08% [17].

Trong quần thể người Da trắng, tỷ lệ đột biến gen SCN5A xuất hiện trongkhoảng 20-25% [4] trường hợp mắc hội chứng Brugada Còn ở châu Á, tỷ lệđột biến gen này khoảng 10-15% [4] trường hợp mắc hội chứng Brugada,trong đó ở Nhật Bản tỷ lệ đột biến khoảng 11-14%, còn ở Đài Loan là khoảng

8% [18] Đến năm 2010, gần 300 đột biến SCN5A được báo cáo liên quan đến

hội chứng Brugada, bao gồm: đột biến mất hoặc thêm nucleotid, đột biến tạo

mã kết thúc sớm, đột biến thay thế cặp nucleotid, đột biến splice-site (thay đổiquá trình cắt nối exon hoàn thiện RNA) [4]

Năm 2010, Kapplinger J.D và Cs khi nghiên cứu hồi cứu trên 2111bệnh nhân mắc hội chứng Brugada (78% nam, tuổi trung bình 39 ± 15 năm),qua việc thu thập thông tin từ 9 trung tâm trên khắp thế giới (5 trung tâm ở

châu Âu, 3 trung tâm ở Hoa Kỳ, 1 trung tâm ở Nhật Bản) đã xác định được

293 đột biến trên gen SCN5A (274 đột biến xuất hiện trên các exon, 19 đột biến trên các intron) Theo nghiên cứu này, các exon trên gen SCN5A có số

lượng đột biến khác nhau và không đồng đều, trong đó exon 28 có số lượngđột biến cao nhất; các exon 9, exon 16, exon 23 cũng có số lượng đột biếntương đối cao [19]

1.3 Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen SCN5A

1.3.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinhhọc phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm ra nhiều bảnsao Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA vànguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase Phản ứngđòi hỏi sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu củatrình tự DNA khuôn và bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc táccho sự tổng hợp hai mạch DNA mới từ mạch khuôn

Thành phần của phản ứng PCR

 DNA khuôn: Đoạn DNA khuôn tinh sạch, không đứt gãy là một yếu tố

quan trọng giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác

 Mồi: Là những đoạn oligonucleotid mạch đơn dài 20-30 nucleotid có

trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của hai đầu đoạn DNAkhuôn Mỗi cặp mồi có một mồi xuôi và một mồi ngược

 Các nucleotid (dNTPs): Là hỗn hợp của 4 loại dATP, dCTP, dTTP,

dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA

 Enzym DNA polymerase: Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở nhiệt

độ cao

 Dung dịch đệm: Thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy

theo loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hìnhthành một phức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảycủa DNA mạch đôi và tăng khả năng bắt cặp, khả năng gắn của mồivào khuôn

Các giai đoạn của phản ứng PCR

 Giai đoạn 1 (giai đoạn biến tính): giai đoạn này được thực hiện với

nhiệt độ cao từ 94-95°C Quá trình này tách DNA mạch kép thành 2mạch đơn bằng cách làm đứt các liên kết hidro tạo mạch khuôn cho quátrình tổng hợp

 Giai đoạn 2 (giai đoạn gắn mồi): trong giai đoạn này nhiệt độ hạ thấp

hơn so với giai đoạn biến tính, thường duy trì nhiệt độ 50-60ºC chophép mồi bắt cặp với mạch khuôn

 Giai đoạn 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên đến 72°C là

nhiệt độ hoạt động tối ưu nhất của enzym Taq polymerase, dưới tác

động của enzym này các mạch đơn được tổng hợp theo nguyên tắc bổsung [20]

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen mongmuốn để phục vụ cho kỹ thuật giải trình tự gen ở bước sau

Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắpxếp của 4 loại nucleotid A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T(Thymine) trong phân tử DNA

Năm 1977, Frederick Sanger cùng các cộng sự đã phát minh ra kỹ thuậtgiải trình tự gen bằng phương pháp enzym, với nguyên lý: Sử dụngdideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc tương tự nhưphân tử deoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đườngdeoxyribose không phải là hydroxyl (-OH) mà là (-H), để dừng việc tổng hợpmạch bổ sung do không hình thành được liên kết phosphodieste.

Hình 1.6 Cấu trúc ddNTP và dNTP

(Nguồn: http://www.onlinebiologynotes.com)

Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một ddNTP tự do gắn vàochuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’phosphat với nhóm3’hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi Tuy nhiên, nếu một ddNTPđược gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừnglại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo,tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau hơn kém nhau 1 nucleotid Dựavào đó người ta đã sử dụng 4 ống phản ứng khác nhau, trong mỗi ống chứachứa 4 loại nucleotid (A, T, G, C) và một trong 4 loại ddNTP (ddATP,ddCTP, ddGTP, ddTTP); sau một thời gian phản ứng, điện di sản phẩm của 4ống nghiệm trên gel agarose sẽ xác định được trình tự của DNA ban đầu [21]

Hình 1.7 Phương pháp giải trình tự gen của Sanger

(Nguồn: http://www.scq.ubc.ca/)

Hiện nay trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng phương pháp giảitrình tự gen bằng máy tự động Nguyên lý của phương pháp này giống vớiphương pháp enzym của Sanger Tuy nhiên, các ddNTP trong phương phápnày được đánh dấu huỳnh quang với 4 màu khác nhau và được thực hiệntrong cùng một ống nghiệm Máy giải trình tự gồm 2 phần: phần điện di vớigel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Trong suốt quá trìnhđiện di mỗi khi có vạch điện di xuất hiện, máy sẽ ghi nhận và lưu lại thànhđỉnh cường độ sáng trên biểu đồ Từ biểu đồ này, máy sẽ phân tích các đỉnhcường độ sáng, so sánh với các màu và cho ra trình tự DNA tương ứng [22]

Hình 1.8 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

(Nguồn: https://www.khanacademy.org/)

Ưu điểm của phương pháp này là phản ứng giải trình tự có thể thựchiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phảitrên bốn hàng khác nhau như phương pháp enzym của Sanger, phần mềmmáy tính sẽ tự động giải trình tự dữ liệu từ hệ thống điện di và cho hình ảnhkết quả giải trình tự, từ đó tiết kiệm thời gian, công sức của người làm kỹthuật Việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen sẽ phát hiện được chính xác cácbiến đổi trên gen, đồng thời cũng phát hiện được nhiều biến đổi cùng lúc, cácbiến đổi mới cũng như các biến đổi nằm rải rác trên gen, do vậy tối ưu hơn sovới các kỹ thuật khác

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2017 đến tháng 5/2018

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đạihọc Y Hà Nội

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm nghiên cứu: gồm 4 bệnh nhân đến khám tại Viện Tim TP HồChí Minh, trong khoảng thời gian từ tháng 01/2018 đến tháng 4/2018,

đã được chẩn đoán bị mắc hội chứng Brugada theo tiêu chuẩn chẩnđoán của hội nhịp tim châu Âu

- Tiêu chuẩn chọn mẫu: bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng được mô tảgiống với mục 1.1.2, được chẩn đoán mắc hội chứng Brugada

- Tiêu chuẩn loại trừ:

 Bệnh nhân chỉ có ECG dạng Brugada

 Bệnh nhân có các triệu chứng được xác định do bệnh lý khác cóđặc điểm ECG tương tự hội chứng Brugada như: nhồi máu cơtim, cơn đau ngực do co thắt mạch vành, bệnh cơ tim dãn nở,một số tình trạng rối loạn nhịp khác,…

 Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp mô tảcắt ngang

2.4 Quy trình nghiên cứu

 Bước 1: Thu thập mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân

 Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

- Tách DNA bằng kit The Wizard® Genomic DNA Purification

của hãng Promega

- Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phươngpháp đo mật độ quang

 Bước 3: Thực hiện kỹ thuật PCR khuếch đại 29 exon của gen SCN5A.

- Khuếch đại các vùng gen với mồi đặc hiệu

- Kiểm tra sản phẩm bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose

 Bước 4: Giải trình tự 29 exon của gen SCN5A.

 Bước 5: Đọc và phân tích kết quả bằng phần mềm CLC MainWorkbench

2.5 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.5.1 Dụng cụ, trang thiết bị

- Tủ lạnh thường SANYO và tủ âm ARCTIKO

- Pipet định mức và đầu côn các loại 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl,2,5µl

- Ống Eppendorf loại 1,5 ml và 0,2 ml

- Máy ly tâm để bàn (Eppendorf Centrifuge 5424R)

- Máy vortex (Eppendorf Mix Mate)

- Máy Spindown E-centrifuge (Eppendorf)

- Máy lắc nhiệt (Eppendorf Thermomixer 5437)

- Găng tay, giấy thấm vô trùng

- Cốc đong, bình thủy tinh

- Cân điện tử AB204 (Mettler Toledo)

- Lò vi sóng (Saiko)

- Khay đổ gel

- Máy đo OD Nano Drop 2000c (Thermo)

- Máy PCR Eppendorf vapo.protect (Eppendorf)

- Máy điện di EC 300XL Power Supply (Thermo)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động UVP (Eppendorf)

2.5.2 Hóa chất

- Hóa chất tách chiết DNA:

 Hóa chất theo kit The Wizard® Genomic DNA Purification của

hãng Promega bao gồm: Dung dịch Cell Lysis Solution, NucleiLysis Solution, RNase Solution, Protein Precipitation Solution,DNA Rehydration Solution

 Ethanol 70%, Isopropanol

- Hóa chất PCR:

 Nước PCR (nước cất được khử ion, không chứa enzym cắt giới hạn,DNAase, RNAase,…nói cách khác không chứa bất kỳ thành phầnnào khác)

 GoTaq Master Mix (2X): chứa 4 loại dNTP, Taq polymerase,

MgCl2, buffer, loading dye

 GoTaq Hot Start Master Mix (2X): chứa 4 loại dNTP, Taq

polymerase đã bổ sung kháng thể bất hoạt, MgCl2, buffer, loadingdye

 Oligonucleotid (Đoạn mồi): gồm 40 cặp mồi theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại 29 exon của gen SCN5A

Tên

Kích thước (bp)

E28 GGGCTTTGGGCTCACTAGAGGGTAG GGGTTGTACATGGCATTCAGCAGAG 486

- Hóa chất điện di:

 Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 10X (Promega) gồm: Trisbase, Boric acid, EDTA Khi sử dụng pha thành 1X

 Bột agarose (Promega)

 Ethidium bromide 10 mg/mL (Beckman)

 DNA Gene Ruler 100 bp/DNA Ladder (Promega)

- Hóa chất cho giải trình tự gen:

 Buffer Big dye 5X (ABI)

 Big dye Teminator v3.1 (ABI)

 EDTA

 Hi-Di fomamide (ABI)

2.6 Quy trình kỹ thuật

2.6.1 Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm

Lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA (1mg EDTA/1ml máutoàn phần), quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng

Mẫu máu nên được dùng để tách DNA càng sớm càng tốt, nếu chưadùng ngay cần bảo quản ở 4-8°C (trong vòng 24h), và bảo quản -20°C (có thểbảo quản được 1 năm).

2.6.2 Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi

2.6.2.1 Tách chiết DNA

 Nguyên lý

Trong máu toàn phần, DNA tập trung ở các tế bào bạch cầu, do vậy đểthu được DNA cần thực hiện ba bước cơ bản: phá vỡ tế bào; loại bỏ protein

và peptide; kết tủa DNA và tinh sạch

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu, DNA từ máu ngoại vi đã được

tách chiết theo kit The Wizard® Genomic DNA Purification Kit của hãng

Promega Quá trình tách chiết DNA từ máu toàn phần theo kit cũng tuân thủtheo nguyên tắc trên

 Quy trình

- Bước 1: Cho 900 µl Cell Lysis Solution vào ống 1,5 ml

- Bước 2: Thêm 300 µl máu toàn phần

- Bước 3: Vortex 5-6 lần

- Bước 4: Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng (phá vỡ hồng cầu)

- Bước 5: Ly tâm 14000 vòng/3phút ở 22°C

- Bước 6: Loại bỏ dịch nổi

 Lặp lại bước 1-6 đến khi thấy tủa trắng (không thêm 300 µl máutoàn phần)

- Bước 7: Thêm 300 µl Nuclei Lysis Solution, mix bằng pipet

- Bước 8: Ủ 37°C trong 1 giờ

 Nếu sau 1 giờ chưa tan hết tủa, cho thêm 100 µl Nuclei LysisSolution Ủ tiếp ở 37°C đến khi tan hết tủa

- Bước 9: Thêm 1,5 µl RNase Solution.

- Bước 10: Ủ 37°C trong 15 phút

- Bước 11: Thêm 100 µl Protein Precipitation Solution (Nếu đã thêmNuclei Lysis Solution ở bước 8, cho 130 µl Protein PrecipitationSolution.)

- Bước 12: Lắc đều trong 10-20 giây

- Bước 13: Ly tâm 14000 vòng/3 phút ở 22°C

- Bước 14: Chuyển dịch nổi sang một ống mới chứa 300 µl Isopropanol

- Bước 15: Lắc và quan sát tủa DNA

- Bước 16: Ly tâm 14000 vòng/3 phút

- Bước 17: Loại bỏ dịch nổi

- Bước 18: Thêm 300 µl cồn 70%, lắc 5-10 lần

- Bước 19: Ly tâm 14000 vòng/3 phút

- Bước 20: Bỏ dịch nổi, để khô 56°C trong 20 phút

- Bước 21: Thêm 50 µl DNA Rehydration Solution

- Bước 22: Ủ 65°C trong 1h và để qua đêm ở nhiệt độ phòng

2.6.2.2 Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA

 Nguyên lý

Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 260 nm của hai đơnphân cấu tạo nên DNA là base purin và pyrimidin, người ta sử dụng giá trị mật

độ quang ở bước sóng 260 nm để xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu

Ngoài ra, mật độ quang tại bước sóng 280 nm còn xác định được nồng

độ protein (một số acid amin có nhân thơm dị vòng gồm tyrosin, tryptophan,histidin, phenylalanin có mật độ quang lớn nhất tại bước sóng 260 nm),carbohydrat có mật độ quang lớn nhất tại bước sóng 230 nm Từ đó dựa vào

tỷ lệ A260/A280, A260/A230 để kiểm tra chất lượng của DNA tách chiết

Sản phẩm DNA tách chiết sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạchbằng cách đo mật độ quang trên máy Nano Drop 2000c Sản phẩm đạt yêucầu khi tỷ lệ A260/A280 = 1,8 – 2,0 và A260/A230 > 2.

Chú ý: Tất cả sản phẩm DNA tách chiết có nồng độ trên 50 ng/µl cần

pha loãng xuống nồng độ 50 ng/µl để chuẩn bị cho phản ứng PCR Sản phẩmDNA tách chiết được bảo quản ở 4°C trong thời gian ngắn hoặc lưu giữ ởnhiệt độ -20°C trong thời gian dài

2 GoTaq Master Mix (2X) hoặc GoTaq

Hot Start Master Mix (2X)

5

Sử dụng GoTaq Hot Start Master Mix (2X) cho các mồi E1, E7, E10,E18, E29f, E29i, E29k, E29n Các mồi còn lại sử sụng GoTaq Master Mix(2X)

2.6.3.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

94°C/5 phút – 94°C/30 giây – Tgm/30 giây – 72°C/30 giây – 72°C/5 phút

37 chu kỳ