Từ dịch chiết thân cây Chiêu liêu cườm (MEXX) 23 hợp chất đã được phân lập, bao gồm quinon (2 hợp chất), polyphenol (8 hợp chất), triterpen (11 hợp chất) và steroid (2 hợp chất). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp với so sánh các tài liệu tham khảo.
Trang 1ĐẠI HỌC SÀI GÒN OF SAIGON UNIVERSITY
Email: tcdhsg@sgu.edu.vn ; Website: https://tapchikhoahoc.sgu.edu.vn
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN
TRÍ NHỚ CỦA THÂN CÂY CHIÊU LIÊU CƯỜM (XYLIA XYLOCARPA) Chemical composition and memory improving effects of Xylia Xylocarpa
TS Lâm Thị Mỹ Linh(1), ThS Lê Minh Tuấn(2), PGS.TS Cấn Văn Mão(3),
ThS Đoàn Thị Trúc Măn(4), PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Mai(5)
(1),(2) Trường Đại học An Giang
(3) Học viện Quân y
(4) Đài Khí tượng Thủy văn Khu vực Nam Bộ
(5) Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM
TÓM TẮT
Từ dịch chiết thân cây Chiêu liêu cườm (MEXX) 23 hợp chất đã được phân lập, bao gồm quinon (2 hợp chất), polyphenol (8 hợp chất), triterpen (11 hợp chất) và steroid (2 hợp chất) Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ kết hợp với so sánh các tài liệu tham khảo Cao chiết metanol của cây MEXX cũng được sử dụng trong thí nghiệm đánh giá hành vi trên mê lộ Morris và mê
lộ chữ Y trên chuột, nhằm đánh giá khả năng suy giảm nhận thức do scopolamin thường xuất hiện ở các bệnh nhân Alzheimer (AD) Kết quả thí nghiệm cho thấy, MEXX (100 mg/kg) cải thiện tình trạng giảm thay thế tự phát do scopolamin gây ra
Từ khóa: dịch chiết, quinon, polyphenol, triterpen, steroid, bệnh Alzheimer, Chiêu liêu cườm, mê lộ
nước Morris, mê lộ chữ Y
ABSTRACT
From the extracts of Xylia xylocarpa (MEXX), 23 compounds were isolated, including quinone (2
compounds), polyphenol (8 compounds), triterpenes (11 compounds) and steroids (2 compounds) The structure of these compounds is determined by the spectral methods combined with the comparison of references The methanol extract of MEXX was also tested for memory improving effects on Morris water maze and Y – maze to evaluate behavioral function due to scopolamine which induced from Alzheimer’s patients The results showed MEXX (100 mg/kg) improved scopolamine-induced decrease
in spontaneous alternation
Keyword: Extracts, quinone, polyphenol, triterpenes, steroids, Alzheimer’s disease, Xylia xylocarpa,
Morris water maze, Y – maze
1 Đặt vấn đề
Tổn thương suy giảm trí nhớ là biểu
hiện thường gặp trong nhiều bệnh thoái
hóa não Điển hình là bệnh Alzheimer
(AD), một rối loạn thoái hóa tấn công não
và dẫn đến sa sút trí tuệ, là rối loạn phổ biến nhất của tuổi già với những dấu hiệu mất trí nhớ, suy giảm ngôn ngữ, thị giác không gian, rối loạn cảm giác, vận động, nhận thức… có xu hướng tiến triển [1,2]
Trang 2Xylia xylocarpa (Roxb.) Taub là thực
vật họ đậu, được trồng nhiều ở Burma,
Việt Nam, Campuchia, và Ấn Độ Ở Việt
Nam Xylia xylocarpa còn được gọi là
Chiêu liêu cườm, Căm xe Trong y học cổ
truyền Việt Nam, một số bộ phận của cây
Chiêu liêu cườm như nhánh, thân và hoa
được sử dụng để điều trị một số bệnh
[3,4,5]
Qua quá trình sàng lọc hoạt tính ức chế
enzym acetylcholinesterase của hơn 140
cây dược liệu đã phát hiện được khả năng
ức chế mạnh của cây Chiêu liêu cườm
Tham khảo tài liệu trên thế giới và trong
nước cho thấy chi Xylia còn ít được nghiên
cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học [6,7,8]
Do đó, bài báo này công bố về việc
phân lập và xác định cấu trúc của 23 hợp
chất được phân lập từ thân cây Chiêu liêu
cườm Và dịch chiết metanol từ thân cây
này tiếp tục được thử nghiệm khả năng tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột nhắt trắng
2 Phương pháp nghiên cứu
2.1 Trích ly và phân lập các hợp chất
từ thân cây Chiêu liêu cườm
Mẫu thân cây Chiêu liêu cườm được thu hái ở tỉnh Đắk Lắk vào tháng 10/2015 và được định danh bởi tiến sĩ Lưu Hồng Trường, viện trưởng Viện Sinh thái học miền Nam
Bột khô thân cây Chiêu liêu cườm (9,0
kg) được trích bằng phương pháp hoàn lưu trong dung môi methanol (sơ đồ 1), thu được cao MeOH (0,48 kg) Phần cao MeOH được phân tán vào nước rồi tiến hành trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung
môi n-hexan, etyl axetat và n-butanol Các
phần dịch trích được thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được các loại cao phân đoạn
tương ứng là cao n-hexan (21,6 g), cao EtOAc (52,5 g), cao n-butanol (180 g) và
cao nước (225,8 g)
Sơ đồ 1 Sơ đồ điều chế các mẫu cao methanol
Áp dụng phương pháp sắc ký cột silica
gel pha thường trên cao EtOAc để tách
thành các phân đoạn có độ phân cực khác
nhau Tiếp tục sử dụng các phương pháp
sắc ký trên các phân đoạn thu được như sắc
ký cột silica gel pha thường hoặc pha đảo,
sắc ký lớp mỏng điều chế Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) kết hợp soi đèn UV, hiện vết bằng dung dịch H2SO4 30% và nung nóng Từ cao etyl axetat của thân cây Chiêu liêu cườm đã phân lập được 23 hợp
Mẫu cây
Cao MeOH
Trích nóng với MeOH
Cô quay
Trang 3chất đánh số từ CLC-1 cho đến CLC-23,
trong đó có 1 hợp chất mới (CLC-14) lần
đầu tiên được công bố trên thế giới
2.2 Xác định cấu trúc các hợp chất
phân lập được từ thân cây Chiêu liêu cườm
Các hợp chất tinh khiết sau khi được
phân lập sẽ được chạy phổ cộng hưởng từ
hạt nhân (NMR) 1 chiều (1H-NMR, 13
C-NMR và DEPT-C-NMR), 2 chiều
(HMBC-NMR và HSBC-(HMBC-NMR) và phổ MS (đối với
hợp chất mới) Kết hợp với so sánh tài liệu
tham khảo để xác định cấu trúc của hợp chất
2.3 Mô hình in vitro trong việc thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym AChE của các hợp chất phân lập được từ thân cây Chiêu liêu cườm
Trong môi trường đệm pH = 7,4, dưới tác dụng của enzym AChE sẽ xúc tác quá trình thủy phân acetylthiocholin tạo thành axetat và thiocholin Sau đó, thiocholin sinh ra sẽ phản ứng với acid 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo ra 5-thio-2-nitrobenzoat có màu vàng với bước sóng hấp thu cực đại tại 412 nm
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của
những mẫu khảo sát, galantamin hoặc
berberin được sử dụng là chất đối chứng
dương
2.3.1 Mô hình in vivo trong việc thử
nghiệm hoạt tính ức chế enzym AChE
[9,10,11,12, 13,14,15]
Chuột nhắt trắng, giống đực, khỏe
mạnh 10 – 12 tuần tuổi, trọng lượng 20 –
30 g/ con, do ban chăn nuôi động vật Học
viện Quân y cung cấp, được phân nhóm
như sau:
60 chuột chia thành 5 nhóm, mỗi
nhóm 12 con chuột:
- Nhóm đối chứng: chuột chỉ được dùng nước muối sinh lý;
- Nhóm Scop 1,5 mg: chuột được tiêm scopolamin liều 1,5 mg/kg;
- Nhóm CLC 50 mg + Scop 1,5 mg: chuột được uống cao chiết Chiêu liêu cườm liều 50 mg/kg và tiêm scopolamin liều 1,5 mg/kg;
- Nhóm CLC 75 mg + Scop 1,5 mg: chuột được uống cao chiết Chiêu liêu cườm liều 75 mg/kg và tiêm scopolamin liều 1,5 mg/kg;
- Nhóm CLC 100 mg + Scop 1,5 mg: chuột được uống cao chiết Chiêu liêu
5-Thio-2-nitrobenzoat
Trang 4cườm liều 100 mg/kg và tiêm scopolamin
liều 1,5 mg/kg
Chuột được chăm sóc và nuôi trong
phòng đủ thoáng mát, nhiệt độ ổn định
24-26oC, ăn uống đầy đủ, chu kỳ sáng tối
được duy trì 12/12 giờ
Động vật thực nghiệm được đánh giá
tác dụng cải thiện trí nhớ trên 3 bài tập: mê
lộ nước, nhận thức đồ vật và mê lộ chữ Y
2.3.2 Bài tập mê lộ nước (Morris water maze)
Động vật được chia làm các nhóm, mỗi chuột được đánh số khác nhau Động vật thả cho bơi tự do trong bể nước không có bến
đỗ để làm quen trong 60 giây Sau 1 ngày tiến hành thử nghiệm với từng động vật
Hình 1 Hình ảnh cấu tạo mê lộ nước (Morris water maze)
2.3.3 Bài tập nhận thức đồ vật (Object
recognition - ORT)
Động vật được chia thành các nhóm,
mỗi chuột được đánh số khác nhau Một
ngày trước tiến hành thực nghiệm ORT,
chuột được đặt vào buồng tập (không có đồ vật) cho phép tự do khám phá không gian mới Các ngày tiếp theo thử nghiệm ORT được tiến hành qua 2 giai đoạn: giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra
Hình 2 Hình ảnh cấu tạo buồng tập Object recognition
2.3.4 Bài tập mê lộ chữ Y (Y maze)
Động vật được chia thành các nhóm,
mỗi chuột được đánh số khác nhau Bài tập
được tiến hành 1 lần:
- Chuột được thả vào một cánh bất kỳ, cho chuột tự vận động trong 10 phút
Bến đỗ
Vật 1
Vật 3
Trang 5Hình 3 Hình ảnh cấu tạo mê lộ chữ Y (Y maze)
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học
của thân cây Chiêu liêu cườm
Từ thân cây Chiêu liêu cườm, 23 hợp
chất đã được phân lập và phân loại thành
bốn nhóm hợp chất: quinon, phenol đơn vòng, triterpen và steroid Trong đó, hợp chất CLC-14 là hợp chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới
Hình 4 Cấu trúc của 23 hợp chất phân lập từ thân cây Chiêu liêu cườm
Cánh A
Cánh B
Cánh C
Trang 6Hợp chất CLC-14 (5,8 mg) có dạng bột, màu trắng, tan trong dung môi cloroform
Bảng 1 Số liệu phổ NMR của hợp chất CLC-14 (trị số trong ngoặc là J tính bằng Hz)
Vị trí Loại carbon
Hợp chất CLC-14 (CDCl3)
(1H→13C)
1 >CH2
1,62 m
3 >CH- 3,19 dd (11,4; 4,8) 79,1 1, 2, 4, 5, 23, 24
15 >CH2 1,82 m
1,59 m
33,8
14, 16, 27
16 >CH2
2,00 m
3β-Hopan-3-ol-28,22-olid
(CLC-14)
Trang 7Vị trí Loại carbon
Hợp chất CLC-14 (CDCl3)
(1H→13C)
19 >CH2
2,41 dt (13,3; 3,5)
21 >CH- 2,13 t (4,4) 42,6 17, 20, 22
Hình 5 Tương quan 1H-1H COSY, HMBC và NOESY của hợp chất CLC-14
Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS
của hợp chất CLC-14 cho mũi ion phân tử
giả [M+H]+ ở m/z 457,3674 (theo tính toán
lý thuyết cho CTPT C30H49O3, sai lệch 0,8
mmass) Do đó, CTPT C30H48O3 của
CLC-14 là hoàn toàn phù hợp Tra cứu
Sci-Finder (15/12/2015) cho thấy đây là hợp
chất mới, lần đầu tiên được công bố và
được đặt tên là (3β)-hopan-3-ol-28,22-olid
3.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym AChE theo mô hình in vitro các hợp chất phân lập được từ Chiêu liêu cườm
23 hợp chất tinh khiết phân lập từ thân cây Chiêu liêu cườm (CLC-1 đến CLC-23) được thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme AChE (Bảng 2)
Trang 8Bảng 2 Hoạt tính ức chế enzym AChE của các hợp chất phân lập từ cây Chiêu liêu cườm
(µM)
CLC-1 53,28 ± 0,81 45,98 ± 0,67 40,5 ± 1,9 35,22 ± 0,69 77,3 CLC-2 54,01 ± 0,24 49,49 ± 0,58 47,23 ± 0,75 45,8 ± 1,5 54,4 CLC-3 31,60 ± 0,28 25,82 ± 0,22 16,2 ± 2,3 2,30 ± 0,56 >100
CLC-5 34,47 ± 0,74 21,25 ± 0,66 8,3 ± 1,7 - >100
CLC-7 37,58 ± 0,34 19,02 ± 0,54 4,2 ± 1,8 - >100 CLC-8 40,19 ± 0,59 27,00 ± 0,25 10,6 ± 1,0 - >100
CLC-11 53,7 ± 1,5 41,7 ± 1,4 30,7 ± 1,1 16,5 ± 1,0 84,9
CLC-13 53,45 ± 0,24 30,58 ± 0,55 15,8 ± 1,5 - 86,5 CLC-14 55,7 ± 1,2 41,96 ± 0,55 35,0 ± 1,5 30,89 ± 0,55 79,5 CLC-15 56,30 ± 0,25 43,9 ± 1,1 37,75 ± 0,78 27,7 ± 2,6 75,7 CLC-16 30,2 ± 1,4 20,0 ± 1,2 7,32 ± 0,99 - >100 CLC-17 51,7 ± 2,9 38,25 ± 0,22 27,3 ± 1,5 15,8 ± 1,3 93,4 CLC-18 55,8 ± 2,1 38,5 ± 1,7 27,6 ± 1,0 10,8 ± 2,7 83,9 CLC-19 58,67 ± 0,88 36,5 ± 1,1 26,38 ± 0,45 22,30 ± 0,92 75,0 CLC-20 60,9 ± 1,4 46,2 ± 2,3 38,96 ± 0,97 34,56 ± 0,14 62,0 CLC-21 51,02 ± 0,75 40,8 ± 2,9 35,7 ± 1,3 32,7 ± 2,8 94,6
Berberin 58,5 ± 1,4 45,40 ± 0,31 38,8 ± 1,5 34,9 ± 1,3 0,67
Galantamin 83,8 ± 2,1 76,1 ± 1,2 62,68 ± 0,95 38,73 ± 1,15 1,71
(): Không có hoạt tính
Trang 9Dựa vào giá trị IC50 của 23 hợp chất
tinh khiết phân lập được từ thân cây Chiêu
liêu cườm, nhận thấy 11 hợp chất (chiếm
47,8%) có hoạt tính với giá trị IC50 < 100
µM, những hợp chất này đều có giá trị IC50
trong khoảng 50-100 µM (Bảng 2)
3.3 Kết quả đánh giá tác dụng cải
thiện trí nhớ của cao MeOH từ cây Chiêu
liêu cườm trên chuột nhắt
Cao chiết MeOH từ thân cây Chiêu
liêu cườm (MeOH-CLC) được thử nghiệm tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột nhắt trắng qua các bài tập như sau:
3.3.1 Bài tập mê lộ nước (Morris water maze)
Ảnh hưởng của cao chiết MeOH-CLC với liều lượng (50, 75 và 100 mg/kg) trên không gian học tập được đánh giá bằng cách sử dụng mê lộ nước Kết quả được mô
tả ở Hình 6 với n = 12
0 10 20 30 40 50
Chứng Scop 1.5mg CLC 50mg +
Scop 1.5mg
CLC 75mg + Scop 1.5mg
CLC 100mg + Scop 1.5mg
0 2 4 6 8 10 12
Chứng Scop 1.5mg CLC 50mg + Scop 1.5mg CLC 75mg + Scop 1.5mg CLC 100mg + Scop 1.5mg
0
10
20
30
40
50
60
Chứng
Scop 1.5mg
CLC 50mg + Scop 1.5mg
CLC 75mg + Scop 1.5mg
CLC 100mg + Scop 1.5mg
Ngày
Ngày
(C)
Hình 6 Ảnh hưởng của cao chiết Chiêu liêu cườm lên thời gian bơi (giây) (A),
quãng đường bơi (m) (B) và thời gian bơi trong góc phần tư 1 (giây)
của nhóm chuột nghiên cứu trong mê lộ nước (C)
Như vậy, cao chiết MeOH-CLC có tác
dụng cải thiện trí nhớ không gian đối với
những nhóm chuột được gây suy giảm trí
nhớ bằng scopolamin Ở liều cao chiết 100
mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ tốt
nhất
3.3.2 Bài tập nhận thức đồ vật (Object Recognization Test – ORT)
Ảnh hưởng của cao chiết MeOH-CLC với liều lượng (50, 75 và 100 mg/kg) đối với khả năng nhận thức đồ vật được mô tả
ở Hình 7 với n = 12
Trang 10(A)
(B)
(C)
0 10
20
30
1.5mg CLC 50mg + Scop 1.5mg
CLC 75mg + Scop 1.5mg
CLC 100mg + Scop 1.5mg
Vật thể 1 Vật thể 2
0 10 20 30 40 50
Chứng Scop 1.5mg CLC 50mg
+ Scop 1.5mg
CLC 75mg + Scop 1.5mg
CLC 100mg + Scop 1.5mg Vật thể 1 Vật thể 3 (mới)
0 5 10 15 20
Chứng Scop 1.5mg CLC 50mg +
Scop 1.5mg
CLC 75mg + Scop 1.5mg CLC 100mg + Scop 1.5mg
Hình 7 Ảnh hưởng của cao chiết methanol từ thân cây Chiêu liêu cườm
của nhóm chuột nghiên cứu trong giai đoạn luyện tập (A), giai đoạn kiểm tra (B)
và quãng đường di chuyển (C) trong bài tập nhận thức đồ vật Như vậy, cao chiết MeOH-CLC có
tác dụng cải thiện nhận thức đối với
những nhóm chuột được gây suy giảm trí
nhớ bằng scopolamin Ở liều cao chiết
100 mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ
tốt nhất
3.3.3 Bài tập mê lộ hình chữ Y (Y maze)
Ảnh hưởng của cao chiết MeOH-CLC với liều lượng (50, 75 và 100 mg/kg) đối với phần trăm thay đổi luân phiên và tần suất vào cánh cửa của chuột trong bài tập
mê lộ chữ Y được thể hiện qua Hình 8
0 10 20 30 40 50 60
1.5mg CLC 50 mg + Scop 1.5mg
CLC 75
mg + Scop 1.5mg
CLC 100
mg + Scop 1.5mg 0
20
40
60
80
100
1.5mg CLC 50 mg + Scop 1.5mg
CLC 75 mg + Scop 1.5mg
CLC 100 mg + Scop 1.5mg
Hình 8 Phần trăm thay đổi luân phiên (A) và tần suất vào cánh cửa
(B) của các nhóm chuột nghiên cứu trong mê lộ chữ Y Như vậy, cao chiết MeOH-CLC có tác
dụng cải thiện trí nhớ làm việc đối với
những nhóm chuột được gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin Ở liều cao chiết 100
Trang 11mg/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ tốt nhất
4 Kết luận
Từ cao EtOAc của thân cây Chiêu liêu
cườm, X xylocarpa, 23 hợp chất đã được
phân lập và xác định cấu trúc (Hình 4)
Trong 23 hợp chất phân lập được có một
hợp chất mới lần đầu tiên công bố trên thế
giới (CLC-14) Tất cả 23 hợp chất này đều
là lần đầu tiên phát hiện có trong cây Chiêu
liêu cườm và trong chi Xylia Các hợp chất
phân lập được từ thân cây Chiêu liêu cườm
thuộc bốn nhóm hợp chất bao gồm:
-2 hợp chất quinon: Chrysophanol
(CLC-1) và 2,6-dimethoxyquinon (CLC-2)
-8 hợp chất phenol đơn vòng: Acid
ferulic (CLC-3), metyl ferulat (CLC-4),
metyl 3-(4-hydroxyphenyl)-2-metoxy
carbonyl propionat (CLC-5), acid
protocatechuic (CLC-6), acid vanilic
(CLC-7), vanilin (CLC-8), metyl galat
(CLC-9) và acid syringic (CLC-10)
-11 hợp chất triterpen: Acid oleanolic
(CLC-11),
3β-hydroxy-18α-olean-28,19β-olid (CLC-12), 3
β-acetoxy-19β,28-epoxy-28-oxo-18α-oleanan (CLC-13), lupeol
(CLC-15), norlupen (CLC-16),
28-norlup-20(29)-en-3β-hydroxy-17β-hydroperoid
(CLC-17), betulin (CLC-18), aldehyd betulinic 19), acid betulinic (CLC-20), acid betulonic (CLC-21) và hợp chất
mới 3β-hopan-3-ol-28,22-olid (CLC-14) -2 hợp chất steroid: β-sitosterol
(CLC-22) và
β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (CLC-23)
Cao chiết từ thân cây Chiêu liêu cườm liều 50 mg/kg, 75 mg/kg và 100 mg/kg; đặc biệt là cao chiết ở liều 100 mg/kg có tác dụng cải thiện nhận thức đáng kể trên chuột đã gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin:
-Tăng cường khả năng học tập, hình thành trí nhớ: làm giảm thời gian và quãng đường chuột bơi từ khi thả vào nước đến khi tìm thấy bến đỗ từ ngày 1 đến ngày 7 trong bài tập mê lộ nước, tăng thời gian và tần suất khám phá đồ vật mới trong bài tập nhận thức đồ vật
-Cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ làm việc không gian và khả năng gợi lại trí nhớ: làm tăng % thay đổi luân phiên tự phát trong bài tập mê lộ chữ Y và tăng thời gian chuột bơi trong góc phần tư trước đây
có đặt bến đỗ (ngày 8) trong bài tập mê lộ nước
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bệnh, Bệnh học Tâm thần (2005), "Bộ môn Tâm thần và Tâm lý y học", Nhà xuất bản quân đội nhân dân, tr 88 - 105
[2] Jeffrey L và Cummings M.D (2004), "Alzheimer’s Disease.", New England Journal
of Medicine, 351, pp 56-67
[3] Võ Văn Chi (1991), Cây thuốc An Giang, Ủy ban Khoa học-Kỹ thuật An Giang, An
Giang
[4] Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, 2, Nhà xuất bản Khoa Học Kỹ
Thuật chi nhánh TP HCM
[5] Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà Nội