Khảo sát và lựa chọn quy trình phát hiện 9 loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp PCR có thể áp dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh.
Trang 1KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN MỘT
SỐ LOÀI LACTOBACILLUS TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG
Lê Thị Hiên * , Trần Nguyễn Minh Đoan *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Probiotic là những vi sinh vật có lợi, được bổ sung trong nhiều sản phẩm thực phẩm chức
năng – trong đó Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi khuẩn probiotic Các nhà sản xuất thường công bố tên loài vi khuẩn Lactobacillus trên bao bì nhằm tăng giá trị của sản phẩm Hiện nay, các phương pháp truyền thống để xác định loài Lactobacillus còn hạn chế và phương pháp dựa trên sinh học phân tử được xem là giải pháp tiềm năng Để có được phương pháp hiệu quả nhằm thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực phẩm chức năng được Bộ Y tế giao phó, đồng thời đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực hiện
đề tài này nhằm xây dựng phương pháp định danh một số loài Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật PCR
Mục tiêu: Khảo sát và lựa chọn quy trình phát hiện 9 loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng bằng
phương pháp PCR có thể áp dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế công cộng TP Hồ Chí Minh
Phương pháp nghiên cứu: Lựa chọn quy trình tách chiết DNA; khảo sát độ đặc hiệu của mồi; tối ưu hóa
điều kiện phản ứng PCR; khảo sát mức phát hiện LOD 50 của phương pháp; ứng dụng quy trình phân tích một số mẫu thực tế
Kết quả: Chúng tôi đã lựa chọn được 9 cặp mồi đặc hiệu cho 9 loài vi khuẩn Lactobacillus, bao gồm: L
acidophilus, L rhamnosus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus, L fermentum và L sakei Mức phát hiện LOD 50 của các phương pháp này đều ở mức thấp (dưới 3 CFU/g): thấp nhất 0,7 CFU L acidophilus /g và cao nhất 2,5 CFU L sakei /g trong nền mẫu thực phẩm chức năng dạng lỏng; thấp nhất 0,8 CFU L reuteri /g đến cao nhất 2,7 CFU L sakei /g đối với mẫu thực phẩm chức năng dạng bột Phương pháp có
độ chọn lọc tốt, chỉ phát hiện đặc hiệu đúng chủng mục tiêu
Kết luận: Quy trình bước đầu có thể đưa vào áp dụng để phát hiện 9 loài vi khuẩn Lactobacillus trong thực
phẩm chức năng
Từ khóa: phản ứng PCR, probiotic
ABSTRACT
SURVEYING POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD
TO DETECT SOME LACTOBACILLUS SPECIES IN FUNCTIONAL FOOD
Le Thi Hien, Tran Nguyen Minh Doan
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No 5 - 2019: 429 – 437
Background: Probiotics are live microorganisms that benefit the host's health Most of the probiotics in
many functional food products are lactobacilli These bacteria are labeled to increase the value of the product Currently, traditional methods to identify Lactobacillus species are limited and methods based on molecular biology are considered potential solutions In order to have an effective method to perform the monitoring functional food products follow requirements of the Ministry of Health and at the same time to meet the testing needs of customers, we implemented this study to develop the rapid method for identification some common
*Viện Y Tế Công Cộng TP Hồ Chí Minh
Trang 2Lactobacillus species used in functional foods by PCR technique
Objectives: Assess and select PCR method to detect 9 Lactobacillus species in functional foods that can be
applied in microbiology laboratory of The Southern Regional Centre of Food Safety, Institute of Public Health, Ho Chi Minh City
Methods: Select the DNA extraction procedures; assess the primers’ specificity; optimize PCR conditions;
survey the detection level 50 (LOD 50 ) of the method; apply PCR method to analyse samples
Results: 9 specific primer pairs were selected for 9 Lactobacillus species, including: L acidophilus, L
rhamnosus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus, L fermentum and L sakei The detection level (LOD 50 ) of these methods was low (below 3 CFU / g): range from 0.7 CFU L acidophilus / g to 2.5 CFU L sakei / g in the background of liquid functional food and from 0.8 CFU L reuteri/g to 2.7 CFU L sakei/g for powdered functional food The PCR methods had good selectivity, and could be applied on actual samples
Conclusions: The methods can be applied to detect these Lactobacillus species in functional foods in our
microbiological laboratory
Keywords: polymerase chain reaction, probiotics
ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi
đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi
ích cho sức khỏe của vật chủ(6) Vì những lợi ích
mà probiotic mang lại cũng như sự tự do lựa
chọn sử dụng của người tiêu dùng nên tình hình
sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm probiotic gia
tăng không ngừng Doanh số bán các sản phẩm
probiotic có xu hướng gia tăng trên phạm vi
toàn cầu với tỷ lệ 35%: từ 23,1 tỷ đô la Mỹ (năm
2010) lên 31,3 tỷ đô la Mỹ (năm 2014)(12)
Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi
khuẩn probiotic, được bổ sung vào các sản phẩm
thực phẩm chức năng Tuy nhiên, trước khi
được cho phép bổ sung vào trong thực phẩm
như một probiotic, các chủng vi khuẩn
Lactobacillus cần phải được nghiên cứu và chứng
minh khả năng mang lại lợi ích cho sức khỏe
cũng như an toàn cho con người(7) Vì thế, chỉ có
1 số ít loài Lactobacillus được xem là vi khuẩn
probiotic và được phép đưa vào sử dụng cho
con người Hiện nay, trên thị trường Việt Nam,
có hơn 15 sản phẩm thực phẩm chức năng được
dán nhãn bổ sung các loài Lactobacillus Tuy
nhiên, thông tin này cần được giám sát và kiểm
tra bởi các cơ quan chức năng – trong đó, Viện Y
tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đóng vai
trò không nhỏ
Hiện nay, có 3 nhóm kỹ thuật chính để xác
định loài Lactobacillus Các phương pháp vi sinh
truyền thống dù được xem là tiêu chuẩn vàng,
nhưng số lượng loài vi khuẩn Lactobacillus có thể xác định được còn hạn chế Các phương pháp
dựa trên proteomics lại phát triển trên các thiết
bị, máy móc kỹ thuật cao và đắt tiền Vì thế, các
phương pháp định danh ở cấp độ loài dựa trên kiểu gen được khuyến cáo đưa vào ứng dụng nhiều hơn vì chúng cho kết quả nhanh và chính xác hơn - trong số đó, phương pháp PCR là phương pháp tương đối đơn giản và phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm vi sinh vật
Để có được phương pháp hữu hiệu nhằm thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực phẩm chức năng cũng như đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng phương pháp
định danh một số loài Lactobacillus thường gặp
trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật PCR
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát quy trình xác định 9 loài vi khuẩn
Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức
năng: L acidophilus, L rhamnosus, L casei,
L plantarum, L bulgaricus, L reuteri, L pentosus,
L fermentum và L sakei thông qua việc lựa chọn
mồi đặc hiệu, quy trình tách chiết DNA và tối ưu
hóa điều kiện phản ứng PCR
Trang 3Khảo sát mức phát hiện LOD50 và độ chọn
lọc của quy trình
Ứng dụng quy trình để kiểm tra một số mẫu
thực phẩm chức năng trên thị trường
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu này tiến hành trên các chủng vi
khuẩn Lactobacillus mục tiêu và chủng không
mục tiêu được liệt kê trong bảng 1 Chủng vi
khuẩn L reuteri và L pentosus phân lập từ thực
phẩm chức năng và đã được tiến hành định
danh theo phương pháp PCR - giải trình tự
Bảng 1: Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong
nghiên cứu
Chủng vi sinh vật mục tiêu Chủng vi sinh vật không
mục tiêu
Lactobacillus fermentum
ATCC 9338
Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus casei ATCC
334
Lactobacillus paracasei subsp
paracasei ATCC BAA-52 Lactobacillus plantarum
ATCC 8014
Lactococcus lactis ATCC
19435
Lactobacillus rhamnosus
ATCC 53103
Bifidobacterium bifidum ATCC
29521
Lactobacillus acidophilus
ATCC 4356
Bifidobacterium animalis
subsp lactis ATCC 25527
Lactobacillus delbrueckii ssp
bulgaricus ATCC 11842
Bifidobacterium breve ATCC
15700
Lactobacillus sakei ssp sakei
ATCC 15521
Bacillus cereus ATCC 10876 Lactobacillus reuteri Bacillus subtilis ATCC 6633
Lactobacillus pentosus Escherichia coli ATCC 11775
Staphylococcus aureus ATCC
25923
Listeria monocytogenes ATCC
19115
Salmonella Typhimurium
ATCC 13311
Shigella sonnei ATCC 9290 Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Vibrio parahaemolyticus
ATCC 1780
Enterococcus faecalis ATCC
29212
Cronobacter sakazakii BCRC
13988
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết DNA vi khuẩn
Thực hiện trên 3 quy trình:
Phương pháp tách chiết bằng nhiệt
Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn
ở 10.000g/ 5 phút/ 20- 250C
Sau khi ly tâm, đổ bỏ dịch nổi và rửa sinh khối trong 1mL NaCl 0,85% Vortex hỗn dịch và
ly tâm ở 10.000g/10 phút ở 20 – 250C
Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối trong 0,5ml TE 1X Đun sôi 95oC/15 phút, sau đó đặt ống trong đá 5 phút Ly tâm 10.000g/5 phút/200C - 250C
Chuyển 400µl dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang tube 1,5 ml mới DNA vi khuẩn được bảo quản ở -200C
Phương pháp tách chiết A
Phương pháp này được điều chỉnh lại quy trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự(1) Trong đó, chúng tôi loại bỏ bước bổ sung RNase A để xây dựng quy trình tách chiết A cho phòng thí nghiệm
Phương pháp tách chiết bằng bộ kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, nước sản xuất)
Huyền dịch sau tách chiết được đo độ hấp thụ ánh sáng với máy đo OD (Quawell Q5000, Mỹ) tại các bước sóng 230, 260, 280 nm, thu được các giá trị A230, A260, A280 DNA được đánh giá tinh sạch khi có tỷ số A260/A280 thuộc khoảng 1,8 – 2,0 và tỷ số A260/A230 tốt nhất nếu lớn hơn 1,5
Lựa chọn mồi
Tham khảo một số nghiên cứu đã công bố trước đó về quy trình PCR phát hiện một số vi
khuẩn Lactobacillus trong thực phẩm (liệt kê trong Bảng 2)
Các trình tự mồi đã được kiểm tra mô hình bằng chương trình BLAST trên NCBI Các mồi phù hợp được chọn và đưa vào trong nghiên cứu
Bảng 2: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR được sử dụng trong nghiên cứu
Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham khảo
Trang 4Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham
khảo
L casei casei-F TTATCATGTGGCCGAACAAA 98
o
C/30s, 35x (98oC/30s,
60oC/30s, 72oC/30s); 72oC/5p
L pentosus pentF CAGTGGCGCGGTTGATATC 94
o
C/1p, 30 x (94oC/1p,
55oC/30s, 72oC/1p); 72oC/5p
L delbrueckii
sp bulgaricus
16SbulF AACATGAATCGCATGATTCAAGTTTG 95oC/5p, 25 x (95oC/20s,
62oC/30s, 72oC/1p); 72oC/5p
L acidophilus Laci-F TGCAAAGTGGTAGCGTAAGC 95
o
C/4p; 35 x (95oC/20s;
62oC/30s; 72oC/30s); 72oC/5p
L reuteri Lreu-F CAGACAATCTTTGATTGTTTAG 95
o
C/4p; 35 x (95oC/20s;
60oC/30s; 72oC/30s); 72oC/5p
L plantarum Lpla-F ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT 95
o
C/4p; 35 x (95oC/20s;
60oC/30s; 72oC/30s); 72oC/5p
L rhamnosus Lrha-F CTAGCGGGTGCGACTTTGTT 95
o
C/4p; 35 x (95oC/ 20s;
62oC/30s; 72oC/30s); 72oC/5p
L fermentum Lfer-F ACTAACTTGACTGATCTACGA 95
o
C/4p; 35 x (95oC/20s;
60oC/30s; 72oC/30s); 72oC/5p
L sakei sakeiF GAGCTTGCTCCTCATTGATAA 94
o
C/5p; 35 x (95oC/ 20s;
58oC/30s; 72oC/ 30s); 72oC/ 5p
Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus và
Bifidobacterium sp được nuôi trong môi trường
canh thang De Man Rogosa Sharpe (MRS, Merck
- Đức) ở 37oC trong 48 giờ ở điều kiện kỵ khí
Chủng vi khuẩn khác được nuôi cấy trên
môi trường thạch dinh dưỡng được nuôi cấy
trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB, Merck -
Đức) ở 37oC trong 24 giờ
Phản ứng PCR và diễn giải kết quả
Mỗi chủng được tiến hành phân tích một lần
theo quy trình nhiệt được trình bày trong bảng 2
Thành phần các phản ứng PCR bao gồm: 1X G2
Green GoTaq buffer, 0,5 µM mồi, 10 – 50ng
DNA khuôn PCR được tiến hành trên máy luân
nhiệt Eppendorf Nexus Sau đó, sản phẩm PCR
được điện di trên gel agarose 2%, chạy ở điện thế
100V trong 35 phút; cuối cùng, gel được nhuộm
với thuốc nhuộm Diamond Nucleic Acid Dye
(Promega) và quan sát dưới đèn UV Các phản
ứng PCR cho kết quả vạch điện di không rõ
ràng, có sản phẩm phụ hoặc không đặc hiệu sẽ
được tiến hành tối ưu hóa bằng cách thay đổi 2
thông số sau với Hot-start Taq polymerase
(Takara, Nhật) với thành phần bao gồm 1X Takara PCR buffer, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 0,4U Hot Start Taq Polymerase, 0,5 µM mồi, 10 - 50ng DNA khuôn, nồng độ MgCl2 được thay đổi từ 1,5 - 5,5 mM; nhiệt độ bắt cặp thay đổi trong khoảng ± 5oC
Khảo sát một số thông số của quy trình
Xác định mức phát hiện LOD 50
Với nền mẫu này, chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu khác nhau: thực phẩm chức năng dạng bột
và dạng lỏng Các mẫu thực phẩm chức năng đã được kiểm tra trước cho thấy không có bổ sung
vi khuẩn Lactobacillus
Chuẩn bị 50 mẫu trắng Mỗi mẫu được tiến hành cân 1g (hoặc 1mL) mẫu vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch canh thang MRS Chuẩn bị huyền dịch các chủng vi khuẩn ở 4 mức bậc 2: 20,
2-1, 2-2, 2-3 Tiến hành nhiễm 1 mL từ các ống chủng này vào huyền dịch mẫu (1g mẫu + 9ml canh thang MRS) Mức nhiễm 0 CFU và 101 CFU: mỗi mứcđược tiến hành trên 5 mẫu; 3 mức nhiễm còn lại: mỗi mứcđược tiến hành trên 10 mẫu Lượng vi khuẩn bổ sung sẽ đồng thời được trải 1ml trên đĩa thạch MRS Các mẫu được phân
Trang 5tích theo quy trình LOD50 được tính theo
phương pháp Spearman-Karber(9)
Xác định độ chọn lọc
Độ chọn lọc của phương pháp thể hiện qua
tính chọn lọc bao hàm và chọn lọc loại trừ Các
chủng vi khuẩn mục tiêu được chuẩn bị với
lượng gấp 10 lần mức phát hiện trong 1 ml
huyền dịch mẫu Chọn các chủng vi khuẩn
không mục tiêu thường được bổ sung trong thực
phẩm chức năng có khả năng gây phản ứng
chéo với chủng mục tiêu Các chủng này được
chuẩn bị với lượng gấp 100 lần mức phát hiện
trong 1 ml huyền dịch Bổ sung 1 ml huyền dịch
vi khuẩn được cho vào 9 ml canh thang MRS,
đồng thời được trải và kiểm tra trên đĩa thạch
không chọn lọc thích hợp Mẫu sẽ được tiến
hành phân tích 1 lần theo quy trình nghiên cứu
và ghi nhận kết quả
Áp dụng quy trình để phân tích trên một số
mẫu thực phẩm chức năng thực tế
Chúng tôi tiến hành thu thập 20 mẫu thực phẩm chức năng (2 mẫu ở dạng lỏng và 18 mẫu ở dạng bột) được bán tại các nhà thuốc tại
TP Hồ Chí Minh, ghi nhận thông tin bao bì và
tiến hành phân tích theo quy trình đang khảo sát
KẾT QUẢ
Lựa chọn quy trình tách chiết DNA
Bước đầu tiên trong nghiên cứu và phân tích
về mặt di truyền từ bất kỳ sinh vật nào là quá trình tách chiết và tinh sạch DNA chất lượng Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp cho
phân tích PCR từ vi khuẩn Lactobacillus Từ cùng
1 dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sau 48 giờ,
chúng tôi tiến hành tách chiết theo 3 phương pháp: nhiệt, quy trình A và bộ kit Promega
Để đánh giá hiệu quả của các phương pháp tách chiết, các tỷ số độ hấp thụ A260/A280, A260/A230
và nồng độ DNA của dịch sau tách chiết được so
sánh với nhau, kết quả được thể hiện ở Bảng 3
Bảng 3: So sánh kết quả tách chiết DNA từ 3 phương pháp khác nhau
1 L acidophilus 1,58 2,18 1,86 0,95 1,83 1,84 143,6 459,5 323,0
2 L rhamnosus 1,56 2,25 2,00 1,15 2,14 2,30 279,8 599,7 369,1
3 L bulgaricus 1,45 2,11 2,34 0,88 1,88 1,79 122,6 547,4 368,0
4 L casei 1,60 2,12 1,98 1,04 1,94 2,19 199,9 227,2 348,8
5 L fermentum 1,57 2,22 1,83 0,90 1,99 1,87 190,4 503,2 236,0
6 L plantarum 1,58 2,23 2,02 1,13 2,07 2,26 263,8 429,5 349,7
7 L pentosus 1,39 2,20 2,14 0,93 2,03 2,23 105,2 601,2 353,7
8 L reuteri 1,46 2,23 2,05 0,80 2,30 2,15 177,4 516,3 402,0
9 L brevis 1,69 1,79 2,48 0,80 1,76 1,89 91,8 138,4 156,5
10 L sakei 1,46 2,30 1,76 0,94 1,83 1,69 87,1 190,8 156,0
Phương pháp tách chiết bằng nhiệt cho sản
phẩm sau tách chiết có tỷ lệ A260/A280, A260/A230 và
hàm lượng DNA thấp nhất; trong khi 2 phương
pháp tách chiết theo quy trình A (thay đổi từ
quy trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự (1))
và tách chiết bằng bộ kit Wizard® Genomic
DNA Purification (Promega, Mỹ) cho các tỷ lệ
xấp xủ bằng nhau
Khảo sát độ đặc hiệu của mồi
Để phát hiện các loài Lactobacillus khác nhau,
cho các loài vi khuẩn này(2,4) Tham khảo nhiều công bố trước, dựa trên kết quả kiểm tra bằng chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), chúng tôi lựa chọn 9 cặp mồi cho 9 loài vi khuẩn
Lactobacillus, với trình tự được liệt kê trong Bảng
2 Cặp mồi này giúp khuếch đại gen mục tiêu
khác nhau, bao gồm vùng trình tự giữa gen mã hóa cho 16S RNA và 23S RNA (gọi là 16S-23S ISR), hoặc các gen giữ nhà (“house-keeping
gene”) như recA, polA Khi tiến hành phản ứng
Trang 6quả cho thấy các cặp mồi này chỉ cho kết quả đặc
hiệu cho vi khuẩn mục tiêu, đồng thời không
cho sản phẩm trên chủng không mục tiêu Hình
1 là kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ
đặc hiệu mồi phát hiện L fermentum (Hình 1)
Hình 1: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi Lfer-F và Lfer-F phát hiện L fermentum
Giếng 1: L acidophilus; 2: L bulgaricus; 3: L casei; 4: L fermentum; 5: L brevis; 6: L pentosus; 7: L plantarum; 8: L reuteri; 9: L rhamnosus; 10: L sakei; 11: L paracasei; 12: Lc lactis; 13: E coli; 14: S aureus; 15: B cereus; 16: B subtilis; 17:
S Typhimurium; 18: Shi sonnei; 19: P aeruginosa; 20: En faecalis; 21: S thermophilus; 22: B animalis; 23: B lactis; 24: B breve; 25: B bifidum; 26: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp
Tối ưu hóa quy trình phát hiện L reuteri
Khi áp dụng quy trình phát hiện vi khuẩn
L reuteri, chúng tôi nhận thấy xuất hiện vạch
sản phẩm phụ trên gel điện di bên cạnh sản
phẩm chính (305 bp) Vì vậy, để phương pháp
đạt được hiệu quả tốt, chúng tôi tiến hành tối ưu
hóa phản ứng PCR này Phương pháp Hot-start
PCR có thể ngăn chặn sự kéo dài của DNA
polymerase ở nhiệt độ thấp hơn, giảm các sản
phẩm phụ không mong muốn Thay đổi nồng
độ magie cũng là một trong những cách thức
đơn giản nhất để tối ưu hóa điều kiện phản ứng
do tác động dễ thấy nhất lên tính nghiêm ngặt
của phản ứng PCR
Hình 2: Kết quả thay đổi nồng độ MgCl 2 để tối ưu
hóa điều kiện phản ứng phát hiện L reuteri NC:
chứng âm, số ghi trên mỗi giếng là nồng độ MgCl 2
(tăng dần từ 1,5 - 5,5 mM) Lad: thang DNA 100bp
Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng phương pháp Hot start PCR với nồng độ magie
thay đổi từ 1,5 mM đến 5,5 mM để phát hiện L
reuteri với sản phẩm có kích thước 305bp thì
lượng sản phẩm phụ giảm dần (Hình 2) Phản
ứng đạt điều kiện tối ưu ở 4,5mM Mg2+ với bộ kit Hot start PCR (Takara) Kết quả PCR khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp của phản ứng này không cho thấy có sự khác biệt
Khảo sát một số thông số của quy trình
Mức phát hiện
Bảng 4: Kết quả xác định mức phát hiện LOD 50 của phương pháp trên nền mẫu thực phẩm chức năng (Đơn vị: CFU/ g hoặc mL)
STT Vi khuẩn Thực phẩm chức
năng dạng lỏng
Thực phẩm chức năng dạng bột
Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của phương pháp chúng tôi nghiên cứu trên 9 loài
vi khuẩn Lactobacillus khác nhau được thể hiện
500 bp
500 bp
191 bp
b)
500bp
Trang 7trong Bảng 4
Xác định độ chọn lọc
Hình 3 Kết quả kiểm tra độ chọn lọc của quy trình
phát hiện L plantarum
Giếng 1: L acidophilus; 2: L bulgaricus; 3: L casei; 4: L
fermentum; 5: L brevis; 6: L pentosus; 7: L plantarum; 8:
L reuteri; 9: L rhamnosus; 10: L sakei; 11: L paracasei;
12: Lc lactis; 13: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp
Phương pháp được kiểm tra khả năng phát
hiện chọn lọc các chủng vi khuẩn mục tiêu và
không phát hiện đối với các chủng vi khuẩn không mục tiêu Theo đó, các quy trình đều cho thấy có độ chọn lọc tốt: chỉ cho kết quả dương tính trên chủng vi khuẩn mục tiêu và âm tính
trên chủng vi khuẩn không mục tiêu (Hình 3)
Ứng dụng quy trình trên mẫu thực tế
Chúng tôi thu thập ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức năng có bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus để phân tích bằng quy trình xây
dựng Kết quả cho thấy trong tổng số 20 mẫu phân tích, có 5 sản phẩm không bổ sung loài vi
khuẩn đúng như thông tin ghi trên bao bì (Bảng
5) Phần lớn các sản phẩm đều ghi nhãn có bổ
sung vi khuẩn L acidophilus (17/20 mẫu); tuy
nhiên, theo kết quả phân tích, chỉ có 15/17 mẫu
có phát hiện L acidophilus và 2/17 mẫu không
phát hiện vi khuẩn này (M6, M17) Bên cạnh đó,
2 mẫu (M2, M11) được nhà sản xuất công bố có
chứa 3 loài vi khuẩn Lactobacillus khác nhau, tuy
nhiên kết quả chỉ phát hiện 1 loài duy nhất
Bảng 5: Kết quả phân tích mẫu thực phẩm chức năng trên thực tế
STT Mã số
mẫu
Thông tin ghi trên bao bì Kết quả phân tích
L acidophilus L plantarum L rhamnosus L casei L reuteri
2 M2 L rhamnosus, L plantarum, L acidophilus + - -
BÀN LUẬN
Tách chiết DNA là một bước quan trọng
đến thành công của một phản ứng PCR Kết quả
so sánh các thông số của sản phẩm sau tách chiết
500 bp
248 bp
Trang 83 cho thấy phương pháp tách bằng nhiệt cho
thấy hiệu quả thấp nhất Bên cạnh đó, quy trình
A cho kết quả tương đương với phương pháp
tách bằng bộ kit thương mại về 2 chỉ số: tỷ lệ
A260/A280, A260/A230 nhưng có khả năng thu được
DNA với hàm lượng cao nhất Tỷ lệ hấp thụ ở
260 nm và 280 nm được sử dụng để đánh giá độ
tinh khiết của DNA và RNA Nucleic acid có độ
hấp thụ cực đại ở 260 nm Một tỷ lệ A260/A280 xấp
xỉ 1,8 thường được chấp nhận cho DNA tinh
sạch Khi tỷ lệ này thấp hơn đáng kể có nghĩa là
trong dịch sau tách chiết có thể có sự hiện diện
của protein, phenol hoặc các chất tạp nhiễm khác
có độ hấp thụ mạnh ở hoặc gần bước sóng 280
nm Trong khi đó, tỷ lệ A260/A230 cũng được sử
dụng như một thước đo thứ cấp về độ tinh sạch
của acid nucleic Giá trị A260/A230 mong muốn
thường nằm trong khoảng 1,8 - 2,2(13) Dịch DNA
sau tách chiết bằng quy trình A và kit có độ tinh
sạch tốt hơn so với phương pháp tách chiết bằng
nhiệt vì có tỷ lệ A260/A280 vàtỷ lệ A260/A230 đều lớn
hơn 1,9 – điều này có thể do 2 phương pháp này
có trải qua các bước phân hủy và loại bỏ protein
Hàm lượng DNA thu được từ 3 phương pháp
tách chiết mặc dù đều đạt mức để sử dụng cho
phản ứng PCR nhưng trong 3 phương pháp
nghiên cứu thì quy trình A cho thấy khả năng
thu được DNA với hàm lượng cao nhất Trong
quy trình A, chính việc sử dụng lysozyme đồng
thời với EDTA và Triton X-100 giúp tăng hiệu
quả trong việc phá vỡ các tế bào vi khuẩn (1) Việc
loại bỏ bước sử dụng RNase A trong quá trình
tách chiết không làm thay đổi hiệu quả của quá
trình tách DNA So sánh về mặt kinh tế, quy
trình A là phương pháp thích hợp có thể đưa
vào ứng dụng tại phòng thí nghiệm
PCR là phương pháp được sử dụng rất phổ
biến để phát hiện nhiều đối tượng, do tính đặc
hiệu và đơn giản của chúng Để bắt đầu phản
ứng kéo dài khuếch đại đoạn trình tự DNA mục
tiêu của enzyme Taq polymerase, PCR cần phải
có các cặp mồi đặc hiệu Thành công của phản
ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào cặp mồi này Có
9 cặp mồi lựa chọn đưa vào trong nghiên cứu
này đã được kiểm tra đạt độ đặc hiệu với chủng
vi sinh vật mục tiêu Các thông số của quy trình PCR được khảo sát có khả năng cho phản ứng PCR tốt Tuy nhiên, trước khi đưa vào áp dụng phương pháp để xác định 9 loài vi khuẩn
Lactobacillus trong thực phẩm chức năng tại
phòng thí nghiệm, cần thiết phải đánh giá khả năng áp dụng phương pháp trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm với 2 thông số: mức phát hiện và độ chọn lọc Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện
các vi khuẩn Lactobacillus trong nền mẫu thực
phẩm chức năng dạng lỏng với mật độ khá thấp: LOD50 đều dưới 5 CFU/g, trong đó thấp nhất là
Lb acidophilus (0,7 CFU/g) và cao nhất là Lb sakei
(2,5 CFU/g) LOD50 của phương pháp phát hiện 9
loài vi khuẩn Lactobacillus trên mẫu thực phẩm chức năng dạng bột dao động từ 0,8 CFU/ g (L
reuteri) - 2,7 CFU/ g (L sakei) Thông qua bước
tăng sinh trong canh thang MRS sau 48 giờ ở điều kiện kỵ khí, vi khuẩn có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR chỉ với một số lượng thấp của vi khuẩn ban đầu trong mẫu Phương pháp cũng thể hiện độ chọn lọc tốt khi chỉ phát hiện vi sinh vật mục tiêu và không cho phản ứng dương tính giả trên các chủng vi sinh vật không mục tiêu
Khi áp dụng phương pháp để phân tích ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức năng có bổ
sung vi khuẩn Lactobacillus, kết quả cho thấy có
một số mẫu được ghi thông tin trên bao gì không đúng với thực tế (xem bảng 5) Như vậy cho thấy, trên thị trường thực phẩm chức năng,
có một tỷ lệ không nhỏ các sản phẩm được ghi nhãn sai thực tế - thể hiện nhu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh được gian lận thương mại
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng phương pháp phát hiện 9 loài vi khuẩn
Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức
năng với mức phát hiện: LOD50 đều dưới 3 CFU/g đối với cả 2 dạng thực phẩm chức năng khác nhau Phương pháp cũng đồng thời có độ chọn lọc tốt, không cho kết quả dương tính giả
Trang 9trên các chủng vi khuẩn không mục tiêu Như
vậy, quy trình có thể đưa vào ứng dụng tại
phòng thí nghiệm vi sinh vật – Trung tâm Kiểm
nghiệm an toàn thực phẩm khu vực phía Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Alimolaei M, Golchin M (2016) An Efficient DNA Extraction
Method for Lactobacillus casei, a Difficult-to-Lyse Bacterium Int J
Enteric Pathog, doi:10.17795/ijep32472
2 Amin M, Jorfi M, Khosravi AD, Samarbafzadeh AR, Sheikh AF
(2009) Isolation and Identification of Lactobacillus casei and
Lactobacillus plantarum from Plants by PCR and Detection of
their Antibacterial Activity J Biol Sci, 9(8):810–814
3 Belfiore C, Raya RR, Vignolo GM (2013) Identification,
technological and safety characterization of Lactobacillus sakei
and Lactobacillus curvatus isolated from Argentinean anchovies
(Engraulis anchoita) Springerplus, 2(1):1–8
4 Bottari B, et al (2017) Effective identification of Lactobacillus casei
group species: genome-based selection of the gene mutL as the
target of a novel multiplex PCR assay Microbiology, 163:950–960
5 Cai H, Rodríguez BT, Zhang W, Broadbent JR, Steele JL (2007)
Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei
strains isolated from different ecological niches suggests
frequent recombination and niche specificity Microbiology,
153(8):2655–2665
6 FAO (2001) Probiotics in food - Health and nutritional
properties and guidelines for evaluation Jt FAO/WHO Expert
Consult Eval Heal Nutr Prop Probiotics Food Incl Powder Milk
with Live Lact Acid Bact, 1-4:2
7 FAO, WHO (2002) Guidelines for the Evaluation of Probiotics
in Food URL: https://www.who.int/foodsafety/fs_management/en
8 Karapetsas A, Vavoulidis E, Galanis A, Sandaltzopoulos R, Kourkoutas Y (2010) Rapid Detection and Identification only by
Probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by Multiplex PCR J Mol
Microbiol Biotechnol, 18:156–161
9 NMKL (2009) Protocol for the validation of alternative
microbiological methods NMKL, pp.5-12
10 Prosekov A, Babich O, Bespomestnih K (2013) Identification of
Industrially Important Lactic Acid Bacteria in Foodstuffs Foods
Raw Mater, 1(2):42–45
11 Song Y, et al (2000) Rapid identication of 11 human intestinal
Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and
species-specific primers derived from the 16S - 23S rRNA
intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA FEMS
Microbiol Lett, 187:167–173
12 Statista (2014) Probiotic functional foods: global retail sales
www.statista.com/statistics/252941/probiotic-products-sales-worldwide-by-region/
13 Thermo-Fisher-Scientific T042-TECHNICAL Bull NanoDrop
Spectrophotometers - Thermo Fish Sci URL:
doi:10.1002/jobm.19770170116
14 Torriani S, Felis GE, Dellaglio F (2001) Differentiation of
Lactobacillus plantarum, L pentosus, and L paraplantarum by recA
gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers Appl Environ Microbiol, 67(8):3450–3454
Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019