ảnh hưởng của thời gian ủ noãn trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ương BTĐN : Buồng trứng đa nang CCs : Corona cells: Tế bào vành tia CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THU HẰNG

¶NH H¦ëNG CñA THêI GIAN ñ NO·N TR¦íC ICSI

§ÕN KÕT QU¶ THô TINH Vµ CHÊT L¦îNG PH¤I

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

ĐẶNG THU HẰNG

¶NH H¦ëNG CñA THêI GIAN ñ NO·N TR¦íC ICSI

§ÕN KÕT QU¶ THô TINH Vµ CHÊT L¦îNG PH¤I

Chuyên ngành: Mô - Phôi thai học

Mã số: 60720102

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa hoc:

PGS TS Nguyễn Khang Sơn

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Đảng ủy, ban giám hiệu, phòng quản lý đào tạo sau đại học, Bộ môn

Mô phôi thai học trường đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường và bộ môn

- Đảng ủy, ban giám đốc, phòng Nghiên cứu khoa học, Trung tâm Hỗ

trợ sinh sản Quốc gia - bệnh viện Phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện để tôi

thực hiện luận văn này

- Tập thể lãnh đạo, cán bộ, nhân viện Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc

gia - bệnh viện Phụ sản Trung ương đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ cho tôi

trong quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Khang Sơn,

là người Thầy đã truyền đạt kiến thức, niềm say mê học tập, sát sao và tận

tình chỉ bảo tôi trong toàn bộ quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Hội đồng bảo vệ đề cương

và Hội đồng chấm luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến vô cùng quý báu trong

quá trình thực hiện luận văn này

Đặc biệt tôi xin kính trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ba mẹ tôi,

chồng và các con tôi, và những người thân trong gia đình đã luôn ủng hộ, động

viên tôi học tập, phấn đấu và trưởng thành trong cuộc sống và sự nghiệp

Xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2016

Đặng Thu Hằng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Đặng Thu Hằng học viên lớp Cao học khóa XXIII, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Mô phôi thai học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Khang Sơn

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2015

Đặng Thu Hằng

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BVPSTƯ : Bệnh viện Phụ sản Trung ương

BTĐN : Buồng trứng đa nang

CCs : Corona cells: Tế bào vành tia

CLG : Centrally located granular: Đám hạt ở trung tâm bào tương COC : Cumulus Oocyte Complex: Phức hợp noãn - tế bào nang FSH : Follicle-stimulating Hormone: Hormone kích thích nang noãn GCs : Granulosa cells: Tế bào hạt

GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone

(Hormone giải phóng gonadotropin)

Gran : Granularity: Độ mịn của bào tương

GV : Germinal Vesicle: Nang mầm

GVBD : Germinal Vesicle Break Down: Nang mầm tiêu biến

hCG : Human Chorionic Gonadotropin: Hormone rau thai người ICM : Inner Cell Mass: Khối tế bào nội phôi

ICSI : Intra-cytoplasmic Sperm Injection:

(Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn)

Incls : Inclusion hay refractile body: Thể vùi

IVF : In-vitro Fertillization: Thụ tinh trong ống nghiệm

KTBT : Kích thích buồng trứng

LH : Luteinizing Hormone: Hormone hoàng thể hóa

LNMTC : Lạc nội mạc tử cung

MI : Metaphase I: Kỳ giữa giảm phân I

MII : Metaphase II: Kỳ giữa giảm phân II

NP : Non – progressive Motility: Di động không tiến tới

NPB : Nucleolar Precursor Body: Thể hạt nhân

NST : Nhiễm sắc thể

PB : Polar Body: Thể cực

PM : Post mature: Quá trưởng thành

PN : Pro Nuclear: Tiền nhân

PR : Progressive motility: Di động tiến tới

PVP : Polyvinyl Pyrolidone

PVS : Perivitelline Space: Khoang quanh noãn

SER : Smooth Endoplasmic Reticulum: Lưới nội bào

TB : Tế bào

TE : Trophectoderm: Nguyên bào lá nuôi

TTTON : Thụ tinh trong ống nghiệm

VS : Vô sinh

VAC : Vacuole: Không bào

ZP : Zona pellucida: Màng trong suốt

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI 3

1.1.1 Sự hình thành của noãn 3

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn 5

1.2 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Các bước tiến hành trong TTTON 7

1.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN 9

1.3.1 Đánh giá phức hợp noãn - tế bào nang 9

1.3.2 Đánh giá chất lượng noãn 10

1.4 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ TTTON 16

1.4.1 Đánh giá hợp tử 16

1.4.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 19

1.5 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN 19

1.5.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI 19

1.5.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn 20

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI 20

1.5.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 24

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 25

2.2.3 Quy trình thực hiện 26

2.3 CÁC CHỈ SỐ, BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU 33

2.3.1 Các chỉ số về đặc điểm mẫu nghiên cứu 33

2.3.2 Các chỉ số về chất lượng noãn, kết quả thụ tinh và phân loại phôi 34 2.4 KHỐNG CHẾ SAI SỐ TRONG NGHIÊN CỨU 34

2.5 CÁC TIÊU CHUẨN CỦA NGHIÊN CỨU 35

2.5.1 Các chỉ số tinh dịch đồ bình thường 35

2.5.2 Đánh giá chất lượng của noãn 35

2.5.3 Đánh giá thụ tinh và hợp tử 37

2.5.4 Đánh giá chất lượng phôi 37

2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 38

2.7 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 38

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 39

3.1.2 Đặc điểm về tinh dịch đồ 40

3.1.3 Thời điểm chọc hút noãn 40

3.1.4 Số noãn thu được sau tách noãn 41

3.1.5 Mức độ trưởng thành noãn 41

3.1.6 Đặc điểm hình thái noãn 42

3.1.7 Kết quả thụ tinh 44

3.1.8 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phôi 44

3.2 SO SÁNH CHẤT LƯỢNG NOÃN CỦA BA NHÓM NGHIÊN CỨU 45 3.2.1 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 45

3.2.2 Đặc điểm hình dạng và kích thước noãn 47

3.2.3 Đặc điểm về hình thái noãn 49

3.3 SO SÁNH KẾT QUẢ THỤ TINH CỦA BA NHÓM NGHIÊN CỨU 59

3.3.1 Kết quả thụ tinh 59

3.3.2 Phân loại hợp tử 60

3.4 SO SÁNH CHẤT LƯỢNG PHÔI CỦA 3 NHÓM NGHIÊN CỨU 63

3.4.1 Tỷ lệ tạo phôi 63

3.4.2 Chất lượng phôi 64

Chương 4: BÀN LUẬN 68

4.1 BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 68

4.2 BÀN LUẬN VỀ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 70

4.2.1 Tuổi vợ 70

4.2.2 Đặc điểm về tinh dịch đồ 71

4.2.3 Thời điểm chọc hút noãn 71

4.2.4 Số noãn được nghiên cứu 71

4.2.5 Tỷ lệ noãn trưởng thành và một số yếu tố liên quan 72

4.3 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN CHẤT LƯỢNG NOÃN 74

4.3.1 Mức độ trưởng thành noãn 74

4.3.2 Đặc điểm hình thái của noãn 76

4.4 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN KHẢ NĂNG THỤ TINH 80

4.4.1 Kết quả thụ tinh chung 80

4.4.2 Kết quả thụ tinh theo nhóm 81

4.5 BÀN LUẬN VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN Ủ NOÃN TRƯỚC ICSI ĐẾN CHẤT LƯỢNG PHÔI 84

KẾT LUẬN 88

KHUYẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tiêu chuẩn tinh dịch đồ theo WHO 2010 35

Bảng 2.2 Tiêu chuẩn phân loại noãn 36

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá thụ tinh 37

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi 39

Bảng 3.2 Tinh dịch đồ 40

Bảng 3.3 Thời điểm chọc hút noãn (OR) sau tiêm hCG 40

Bảng 3.4 Số noãn thu được sau tách noãn 41

Bảng 3.5 Mức độ trưởng thành noãn 41

Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái noãn 42

Bảng 3.7 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 45

Bảng 3.8 Đặc điểm về hình dạng và kích thước của noãn 47

Bảng 3.9 Đặc điểm về hình thái noãn theo nhóm 49

Bảng 3.10 Đặc điểm độ mịn bào tương theo nhóm 57

Bảng 3.11 Đặc điểm khoang quanh noãn hẹp theo nhóm 58

Bảng 3.12 Đặc điểm thể cực thứ nhất phân mảnh theo nhóm 58

Bảng 3.13 Kết quả thụ tinh theo nhóm 59

Bảng 3.14 Phân loại hợp tử Z1-Z4 theo nhóm 60

Bảng 3.15 Tỷ lệ tạo phôi theo nhóm 63

Bảng 3.16 Chất lượng phôi theo nhóm 64

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Kết quả thụ tinh chung 44

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ tạo phôi 44

Biểu đồ 3.3 Phân loại phôi 45

Biểu đồ 4.1 Mức độ trưởng thành noãn theo nhóm 75

Biểu đồ 4.2 Kết quả thụ tinh theo nhóm 81

Biểu đồ 4.3 Kết quả thụ tinh và chất lượng phôi theo nhóm 85

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn 4

Hình 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm 8

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn 10

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau 11

Hình 1.5 Hình dạng noãn 11

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương 12

Hình 1.7 Không bào 13

Hình 1.8 Lưới nội bào 14

Hình 1.9 Thể vùi 14

Hình 1.10 Thể cực 15

Hình 1.11 Màng trong suốt 16

Hình 1.12 Hợp tử 16

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score 18

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score 18

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 2.2 Đĩa tách noãn 28

Hình 2.3 Đĩa test 29

Hình 2.4 Đĩa ICSI 29

Hình 2.5 Trắc vi vật kính 32

Hình 3.1 Hình ảnh noãn GV, MI, MII của bệnh nhân nghiên cứu 46

Hình 3.2 Noãn của BN Nguyễn Thị T, x250 47

Hình 3.3 Noãn bầu dục của BN Phạm Thị G, x250 48

Hình 3.4 Noãn khổng lồ của BN Đỗ Thị Thủy, x250 48

Hình 3.5 Noãn của BN Nguyễn Thị T, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 51

Hình 3.6 Noãn của BN Nguyễn Thị D, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 52

Hình 3.7 Noãn của BN Đỗ Thị Kim Q, ủ 2,5 giờ trước ICSI, x250 52

Hình 3.8 Noãn của BN Dương Thị B, ủ 2,5 giờ trước ICSI, x250 53

Hình 3.9 Noãn của BN Lê Thị H, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 53

Hình 3.10 Noãn của BN Lê Thị Trà M, ủ 4,5 giờ trước ICSI, x250 54

Hình 3.11 Noãn của BN Nguyễn Thị Đ, ủ 2,5 giờ trước ICSI, x250 54

Hình 3.12 Noãn của BN Trương Thị N, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 55

Hình 3.13 Noãn của BN Trương Thị N, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 55

Hình 3.14 Noãn của BN Lê Thị Tra M, ủ 3,5 giờ trước ICSI, x250 56

Hình 3.15 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Lê Thị H, ủ noãn 2,5 giờ trước ICSI, x250 61

Hình 3.16 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Nguyễn Thị N, ủ noãn 2,5 giờ và 3,5 giờ trước ICSI, x250 62

Hình 3.17 Noãn thụ tinh của bệnh nhân Dương Thị A, ủ noãn 2,5 giờ trước ICSI, x250 62 Hình 3.18 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 2,5h, x120 65 Hình 3.19 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 3,5h, x120 66 Hình 3.20 Phôi ngày 2 của BN Hồ Thị T, ủ noãn trước ICSI 4,5h, x120 67

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vô sinh là một vấn đề mang tính thời sự hiện nay Các dữ liệu thu được cho thấy khoảng 30-40% các trường hợp vô sinh do nguyên nhân nam giới đơn thuần, 40% do nữ giới, 10% do nguyên nhân kết hợp cả nam và nữ và 10% là không rõ nguyên nhân [1]

Hơn 30 năm qua, thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) đã gặt hái rất nhiều thành công trong điều trị vô sinh Tuy nhiên, tỷ lệ thành công của TTTON với nguyên nhân do chồng thấp hơn so với trường hợp tinh trùng chồng bình thường Nhiều cố gắng nhằm cải thiện tỷ lệ thụ tinh cho những trường hợp tinh trùng yếu đã được thử nghiệm Kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) đã ra đời vào những năm đầu thập niên 90 Với kỹ thuật này, các nhà khoa học có thể tạo ra phôi mà chỉ cần một noãn trưởng thành với duy nhất một tinh trùng được lựa chọn tốt nhất về mặt hình thái cũng như khả năng di động ICSI đã mang lại niềm hy vọng và cơ hội lớn cho các cặp vợ chồng vô sinh mà nguyên nhân như chất lượng tinh trùng kém, thậm chí không xuất tinh được, kháng thể kháng tinh trùng, hoặc số lượng noãn ít, chất lượng kém, hay IVF thất bại mặc dù kết quả tinh dịch đồ bình thường Cho đến nay kỹ thuật ICSI đã không ngừng được cải tiến và chiếm tỷ

lệ cao trong các chu kỳ hỗ trợ sinh sản

ICSI là kỹ thuật vi thao tác được thực hiện trong phòng nuôi cấy đã được chuẩn hóa hoàn toàn tuy nhiên không có tiêu chuẩn chung về thời gian ủ noãn trước khi thực hiện kỹ thuật ICSI Trong kỹ thuật IVF cổ điển các nhà nghiên cứu đã chứng minh được rằng thời gian ủ noãn từ 2-6 giờ trước khi IVF làm cải thiện kết quả thụ tinh và tỷ lệ có thai lâm sàng [2],[3],[4],[5] Trên thế giới, đã có 9 nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của thời gian làm ICSI lên kết quả thụ tinh ống nghiệm đã được báo cáo với những kết luận

không giống nhau Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này được thực hiện Mặc dù các nghiên cứu đã chứng minh rằng thời gian ủ noãn trong

tủ cấy sau khi chọc hút trứng đến khi làm ICSI làm cải thiện tỷ lệ noãn trưởng thành [10],[11], tỷ lệ thụ tinh [6],[11],[12],[13],[14], và chất lượng phôi [6],[11] Thời gian này kéo dài 9-11h trước khi ICSI được cho là có ảnh hưởng xấu đến chất lượng phôi [7] Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lại cho rằng không có sự khác biệt về tỷ lệ thụ tinh [7],[8],[9],[10] cũng như kết quả có thai [7],[11]

Về lý thuyết, một số vấn đề có thể liên quan đến thời gian làm ICSI Trong qui trình TTTON, trứng được chọc hút ra trước khi phóng noãn Theo một số báo cáo, noãn trước khi phóng noãn không hoàn toàn trưởng thành mặc

dù đã xuất hiện thể cực đầu tiên, nó được gọi là bào tương chưa trưởng thành [15],[16] Trong các chu kỳ kích thích buồng trứng thì sự trưởng thành của bào tương không đồng đều với sự trưởng thành của nhân [17],[18] Vì vậy thời gian

ủ noãn trước khi ICSI có thể giúp bào tương trưởng thành từ đó có thể làm tăng

tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phôi tốt cũng như tỷ lệ có thai lâm sàng Hơn nữa, Balakier

và các cộng sự [16] đã kết luận rằng noãn người không ngừng trưởng thành và hoàn thiện khả năng hoạt hóa trong giai đoạn nghỉ ở MII Hiện nay các trung tâm hỗ trợ sinh sản trong nước thực hiện kỹ thuật ICSI tại các thời điểm khác nhau và chưa có bằng chứng cụ thể chứng minh thời điểm nào là tối ưu Chính

vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Ảnh hưởng của thời gian ủ noãn

trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi” trên những bệnh nhân

thụ tinh trong ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia – Bệnh viện Phụ sản Trung Ương với mục tiêu:

Đánh giá mối liên quan giữa thời gian ủ noãn trước ICSI đến kết quả thụ tinh và chất lượng phôi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NOÃN NGƯỜI

Sự phát triển của noãn là một từ dùng để diễn tả sự hình thành, sự lớn lên và sự trưởng thành của noãn

1.1.1 Sự hình thành của noãn

Là quá trình diễn ra từ lúc bắt đầu hình thành noãn nguyên bào tới khi hình thành noãn bào 1 Quá trình hình thành noãn kết thúc khi trẻ ra đời, sau khi kết thúc không một noãn nào được tạo thêm nữa, đây là điểm khác biệt với quá trình tạo tinh trùng được tạo ra trong suốt cuộc đời người đàn ông

 Noãn nguyên bào

Noãn nguyên bào là tế bào đầu dòng của dòng noãn, phát sinh từ những

tế bào sinh dục nguyên thủy Sau khi hình thành, một số noãn nguyên bào biệt hóa thành noãn bào 1 Ở buồng trứng thai 7 tháng, đại đa số noãn nguyên bào biến mất do thoái triển hoặc biệt hóa thành noãn bào 1 Khi trẻ ra đời, những noãn nguyên bào hoàn toàn không thấy trong buồng trứng, chỉ có noãn bào 1

 Noãn bào 1

Từ tháng thứ 3- 5 của thai kỳ, noãn nguyên bào bắt đầu quá trình giảm phân, nhưng dừng lại ở cuối kỳ đầu của lần phân chia thứ nhất, tạo thành noãn bào 1, còn gọi là noãn sơ cấp giai đoạn GV (Germinal Vesicle) chứa bộ NST 2n kép, màng nhân vẫn còn Từ khi sinh ra tới trước khi dậy thì, buồng trứng

bé gái chỉ chứa toàn noãn GV Tới khi có đỉnh LH đầu tiên lúc bắt đầu dậy thì, noãn bào 1 mới tiếp tục quá trình phân chia để tạo thành noãn bào 2

Quá trình giảm phân trong noãn rất dài, gồm có hai pha (giảm phân 1

và giảm phân 2) và có hai giai đoạn nghỉ Giai đoạn nghỉ thứ nhất dài hay

ngắn tùy từng noãn bào 1, ngắn nhất là đến tuổi dậy thì và dài nhất là tới khi mãn kinh Giai đoạn nghỉ thứ 2 từ khi hình thành noãn bào 2 đến khi noãn đƣợc thụ tinh [19],[20]

Hình 1.1 Sự hình thành và phát triển của noãn

(nguồn: http://www.huecrei.com)

1.1.2 Sự trưởng thành của noãn

Cùng với sự phát triển của nang noãn, noãn bào 1 tăng trưởng về kích thước, cho tới giai đoạn nang noãn có hốc điển hình, noãn bào 1 đạt kích thước 120µm thì ngừng tăng trưởng Cơ sở cho sự tăng trưởng là hoạt động tổng hợp tích cực ARN, protein của nhân, sự tích lũy các bào quan như: hạt

vỏ, ty thể, ribosome…nhằm chuẩn bị cho noãn có khả năng thụ tinh và sự phát triển làm tổ của phôi sau này

Sau khi có đỉnh LH, noãn bào 1 chứa trong nang noãn chín (nang de Graff) mới bắt đầu quá trình trưởng thành, bao gồm sự trưởng thành về nhân và bào tương noãn Sự trưởng thành về nhân và bào tương phải diễn ra đồng bộ mới đảm bảo khả năng thụ tinh của noãn, cũng như phát triển của phôi sau này

 Sự trưởng thành của nhân

Sự trưởng thành của nhân khởi động quá trình giảm phân tiếp tục của noãn bào 1 Các sự kiện chính diễn ra trong quá trình trưởng thành của nhân bao gồm: sự vỡ màng nhân GV giải phóng bộ NST vào bào tương, tạo thành thoi vô sắc, sự tập hợp và phân ly của NST, phân chia không đồng đều của bào tương

Noãn bào 1 hoàn thành lần phân chia thứ nhất của quá trình giảm phân,

bộ NST được chia đôi, kết quả sinh ra 2 tế bào chứa bộ NST đơn bội: 1 tế bào lớn chứa phần lớn bào tương và toàn bộ bào quan có chức năng sinh dục, được gọi là noãn bào 2 hay noãn MII; 1 tế bào nhỏ gọi là thể cực thứ nhất, còn gọi là cực cầu 1 Noãn bào 2 tiếp tục quá trình phân bào giảm nhiễm nhưng dừng lại ở biến kỳ 2 cho đến khi được thụ tinh, quá trình giảm phân mới hoàn thành, giải phóng ra cực cầu thứ 2 [21],[22]

 Sự trưởng thành về bào tương

Sự trưởng thành của bào tương thể hiện trong việc thay đổi và sắp xếp lại của một số bào quan trong bào tương noãn như: bộ khung tế bào, lớp hạt

vỏ, lưới nội bào; tổng hợp và điều chỉnh protein và ARN thông tin, tái hoạt hóa các phản ứng hóa sinh và phản ứng phân tử nhằm cung cấp chất liệu cần thiết cho thụ tinh, sự phát triển và làm tổ của phôi

Các sự kiện diễn ra trong nhân trong quá trình giảm phân phụ thuộc vào tính toàn vẹn và sự thay đổi mạnh mẽ của khung xương tế bào (cytoskeleton) Trong quá trình phân bào, các ống siêu vi rời khỏi vỏ tế bào, ngắn lại tạo thành thoi vô sắc Thoi vô sắc tạo thành trong quá trình phân chia của noãn có hình thái khác so với thoi vô sắc hình thành trong các quá trình phân chia khác, nó không kéo tới đầu xa của tế bào tạo thành sự định vị lệch tâm của thoi vô sắc, kết quả dẫn đến sự phân chia không đồng đều của bào tương [21],[22]

Trong quá trình trưởng thành, các hạt vỏ (cortical granules) được tích lũy, di chuyển đến dưới vỏ noãn bào, và ở tại vị trí này cho đến khi quá trình thụ tinh xảy ra Các hạt vỏ có vai trò quan trọng trong việc ngăn cản hiện tượng đa thụ tinh nhờ việc làm thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi có một tinh trùng xâm nhập được qua màng Sự di chuyển của các hạt vỏ là một trong các sự kiện lớn nhất của quá trình trưởng thành của noãn Một số nghiên cứu chỉ ra việc phân tích độ phân tán của các hạt vỏ có thể đánh giá được chất lượng noãn, ví dụ như những noãn có bất thường thoi vô sắc đều không thấy

sự di chuyển cuả các hạt vỏ như những noãn MII bình thường khác [21],[23]

Hình thái, số lượng và kích thước các ty thể khác nhau qua các giai đoạn phát triển của noãn Ty thể chứa DNA khác với DNA ở nhân, đồng thời sản xuất năng lượng cho hoạt động của tế bào Ở giai đoạn noãn GV, ty thể có số lượng ít, nhỏ hơn các giai đoạn khác, và thường có hình tròn Ở noãn trưởng thành, ty thể tăng số lượng, kéo dài, tập trung ở vùng trung tâm của tế bào [23]

Lưới nội bào trong tế bào cũng có sự biến đổi lớn Sự thay đổi về cấu trúc, kích thước và phân bố của hệ lưới nội bào có liên quan đến khả năng giải phóng ion canxi nhằm hoạt hóa noãn trong quá trình thụ tinh Noãn ở giai

đoạn GV chủ yếu chỉ quan sát thấy số lượng ít lưới nội bào có hình túi nhỏ, trong khi đến giai đoạn sau tăng về số lượng và hình thái, thấy cả những lưới nội bào hình ống, lưới nội bào phồng lên ở vùng chu vi của noãn [23]

 Vai trò của nang trứng và trưởng thành của noãn

Sự trưởng thành của noãn có liên quan chặt chẽ với sự phát triển của nang trứng chứa nó Noãn tăng kích thước cùng với sự phát triển của nang noãn, nhưng chỉ những noãn chứa trong nang noãn chín mới có thể tiếp tục quá trình giảm phân

Dịch nang chứa các yếu tố vi môi trường cung cấp cho quá trình tăng trưởng của noãn Tế bào hạt đáp ứng với các kích thích hormone được biệt hóa về hình thái và chức năng, qua đó có vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của noãn Tế bào hạt bao quanh noãn thông qua các liên kết khe cung cấp cho noãn các chất dinh dưỡng, truyền tín hiệu hóa học và phân tử điều chỉnh quá trình trưởng thành của noãn: một là duy trì tình trạng ngừng phân bào của noãn trong suốt thời kỳ phát triển của nang noãn, hai là khởi động quá trình phân bào giảm nhiễm của noãn ở nang noãn chín, ba là hỗ trợ cho sự trưởng thành của các bào quan trong noãn [22],[24],[25]

1.2 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1.2.1 Định nghĩa

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF – In vitro fertilization): là chọc hút một hay nhiều noãn đã trưởng thành từ buồng trứng, cho thụ tinh với tinh trùng (đã được lọc rửa) trong ống nghiệm Sau khi noãn thụ tinh phát triển thành phôi, chuyển phôi tốt vào buồng tử cung để phôi làm tổ và phát triển thành thai nhi [26],[27]

1.2.2 Các bước tiến hành trong TTTON

Một chu kỳ TTTON bao gồm: Kích thích buồng trứng, chọc hút lấy trứng ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấy thành phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung

Có 3 phác đồ kích thích buồng trứng thường được sử dụng: Phác đồ dài, phác đồ ngắn và phác đồ sử dụng GnRH đối vận (GnRH antagonist)

Từ ngày thứ 8 - 13 của FSH, chỉ định cho thuốc phóng noãn (thường dùng hCG) khi siêu âm có ≥ 1 nang 18 mm hoặc ≥ 3 nang noãn kích thước ≥ 16 mm

Hình 1.2 Quy trình thụ tinh ống nghiệm

(Nguồn http://ivfvietnam.net)

Chọc hút nang noãn qua đường âm đạo dưới hướng dẫn của siêu âm sau tiêm hCG 34-36 giờ Thu lượm noãn và đánh giá chất lượng noãn trong labo Noãn thu được sẽ ủ ấm trong tủ cấy CO2, 37ºC trước khi được cấy với tinh trùng đã được lọc rửa hoặc cho thụ tinh bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

Đánh giá thụ tinh được tiến hành 16 – 18 giờ sau cấy với tinh trùng trong kỹ thuật IVF cổ điển hoặc sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn Đánh giá thụ tinh bình thường khi quan sát thấy hai tiền nhân Sau khi đánh giá thụ tinh, phôi sẽ được nuôi cấy tiếp và theo dõi, đánh giá chất lượng phôi

ở giai đoạn phôi phân chia sớm hoặc giai đoạn phôi nang

Đánh giá chất lượng phôi chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chia của phôi Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2, 3) dựa vào các chỉ tiêu chính là số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào và

tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) Các chỉ tiêu phụ gồm có mật độ hạt trong bào tương - độ chiết quang, số lượng hạt nhân, tỷ lệ không bào trong phôi bào Đánh giá hình thái phôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi, hình thái của khối tế bào nội phôi (ICM) và nguyên bào lá nuôi (TE)

Các phôi tốt nhất sẽ được chọn để chuyển phôi Chuyển 2 - 3 phôi ngày

3 hoặc chuyển 1 - 2 phôi ngày 5, số phôi còn lại được trữ lạnh

Định lượng βhCG huyết thanh sau chuyển phôi 14 ngày Nếu kết quả

≥ 25 UI/l là có thai sinh hóa

Siêu âm đầu dò âm đạo sau chuyển phôi 28 ngày Kết quả có thai lâm sàng khi siêu âm thấy túi ối và tim thai

1.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NOÃN

1.3.1 Đánh giá phức hợp noãn - tế bào nang (COC - cumulus oocyte complex)

Ở các chu kỳ kích thích buồng trứng, phức hợp COC thường được thu nhận sau 34 -36 giờ tiêm thuốc phóng noãn, trạng thái điển hình của khối COC được mô tả bởi lớp tế bào hạt và tế bào vành tia bao quanh một cách lỏng lẻo Phần lớn khối COC nở rộng thường là noãn trưởng thành ở giai đoạn MII (metaphase II), tuy nhiên một số noãn thu được vẫn ở giai đoạn GV (Germinal Vesicle) hoặc MI (metaphase I) [28]

Theo đồng thuận của tổ chức Alpha – ESHRE, hiện nay chưa đủ cơ sở

để khẳng định mối tương quan giữa hình thái khối COC với khả năng phát triển phôi, nhưng vẫn có thể sử dụng thang điểm nhị phân (0 hoặc 1) để đánh giá Điểm số 1 cho phức hợp COC được xem là tốt khi lớp tế bào hạt (GCs – granulosa cells) và tế bào vành tia (CCs - corona cells) giãn rộng (Alpha Scientist in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011) [29] (Hình 1.3)

(a) COC chưa trưởng thành (b) COC trưởng thành

Hình 1.3 Phức hợp tế bào noãn

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)

1.3.2 Đánh giá chất lượng noãn

* Đặc điểm noãn trưởng thành [30],[31],[32]:

- Noãn trưởng thành cả về nhân và tế bào chất

- Hình cầu

- Kích thước 100 – 150 µm

- Màng trong suốt đồng nhất, đều màu, sáng

- Khoang quanh noãn chứa thể cực thứ nhất

ở giai đoạn GV (germinal vesicle): trạng thái nhân vẫn còn ở dạng túi hình

Tế bào vành tia

Tế bào hạt

Tế bào hạt và tế bào

vành tia nén chặt

cầu có chứa 1 hạt nhân to Noãn MI: không có sự hiện diện của túi nhân (GV)

và chưa xuất hiện thể cực đầu tiên Noãn trưởng thành MII khi có thể cực đầu tiên (PB I) xuất hiện trong khoang quanh noãn (PVS)

Noãn GV với túi mầm Noãn MI Noãn MII với PBI ở 7h

Hình 1.4 Noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[28]

- Trưởng thành bào tương: Noãn được xem là trưởng thành về bào tương thường sẽ không xuất hiện các bất thường trong bào tương noãn

* Hình dạng và kích thước noãn

- Hình dạng: Noãn bình thường có hình cầu Noãn có hình dạng bất thường như hình trứng (oval) hay bị kéo dài (elongation) (Hình 1.5), Ebner và cộng sự (2008) cho rằng không có mối tương quan nào giữa tỷ lệ thụ tinh

cũng như chất lượng phôi với hình dạng bất thường của noãn [33]

- Kích thước: Noãn khổng lồ (giant oocyte) có kích thước noãn khi đo

cả màng zona từ 200µm Noãn khổng lồ là noãn thường có thêm một bộ nhiễm sắc thể do sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quá trình nguyên phân của các noãn nguyên bào Noãn khổng lồ cho kết hợp với tinh trùng cũng có khả năng thụ tinh tạo hợp tử đa bội và vẫn có thể phân chia thành phôi, thậm chí đạt đến giai đoạn phôi nang Vì vậy, noãn khổng lồ được khuyến cáo không sử dụng để ICSI [34]

* Chất lượng bào tương

- Độ mịn của bào tương (granularity) được đánh giá thông qua đám hạt tập trung ở trung tâm bào tương (CLG – centrally located granular) về kích thước, độ sẫm màu, chia noãn thành 4 độ [35].(Hình 1.6)

Gran 1: Bào tương mịn và sáng màu (a)

Gran 2: Có hạt hơi thô và sáng màu (b)

Gran 3: Quầng hạt thô, sẫm màu (c)

Gran 4: Quầng hạt thô chiếm từ ¾ diện tích bề mặt trở lên, tập trung ở vùng trung tâm noãn va các dạng bất thường khác (d)

Hình 1.6 Độ mịn của bào tương

(Nguồn: Atlas of Human Embryology) [28]

- Không bào (vacuole) (Hình 1.7): Không bào là một dạng thể vùi của bào tương có màng bao quanh, ở dạng túi hình cầu chứa đầy chất dịch cặn bã

Tỷ lệ thụ tinh ở noãn có không bảo giảm (40%) so với noãn bình thường

(69,6%) trong ICSI [36] Khi noãn có một không bào lớn hay nhiều không bào sẽ gây bất lợi cho noãn vì cấu trúc bộ xương tế bào không thể thực hiện chức năng, ví dụ như vi ống Các không bào lớn làm thay đổi vị trí thoi vô sắc

so với thể cực của noãn làm tăng nguy cơ gây tổn thương thoi vô sắc khi ICSI [37] Noãn không thụ tinh khi đường kính không bào trên 14 µm [38]

VAC 1: noãn không có không bào (a)

VAC 2: noãn có 1 không bào nhỏ (5-10 µm) (b)

VAC 3: noãn có 1 không bào trung bình (10-14 µm) (c)

VAC 4: noãn có 1 không bào lớn (>14 µm) hay nhiều không bào nhỏ hoặc trung bình (d)

Hình 1.7 Không bào

(Nguồn: Thomas ebner, 2008) [33]

- Lưới nội bào (SER – smooth endoplasmic reticulum) (Hình 1.8): Noãn bào có sự hiện diện của SER thường cho tỷ lệ thụ tinh thấp, đặc biệt là

tỷ lệ sảy thai rất cao, cũng như chết non và nhẹ cân nếu chuyển phôi có nguồn

gốc từ các noãn này [33] Hạn chế hoặc tránh chọn phôi chuyển có nguồn gốc

từ noãn mang SER [39]

SER 1: noãn không có SER (a)

SER 2: noãn có 1 SER nhỏ (b)

SER 3: noãn có nhiều hơn 1 SER hoặc 1 SER trung bình (c)

SER 4: noãn có nhiều SER trung bình hoặc 1 SER lớn (d)

(a) (b) (c) (d)

Hình 1.8 Lưới nội bào

(Nguồn: Atlas of Human Embryology)[28]

- Thể vùi (inclusion hay refractile body) (Hình 1.9): Sự hiện diện của

thể vùi thường đi đôi với việc giảm tỷ lệ thụ tinh cũng như sự hình thành phát

triển của phôi [40] Thể vùi còn được gọi là thể khúc xạ, chứa chủ yếu các

lipid và các hạt vật chất dày đặc, có đường kính nhỏ (<10µm) Thể vùi ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ phát triển của phôi [41]

Incls 1: Không hiện diện thể vùi trong bào tương (a)

Incls 2: Bào tương có 1 thể vùi nhỏ (≤ 2-3µm) (b)

Incls 3: Bào tương có 1 thể vùi to hoặc nhiều thể vùi nhỏ (>5µm) (c)

Incls 4: Bào tương có từ 2 thể vùi to trở lên và dạng phức tạp (mắt bò) (d)

* Khoang quanh noãn (PVS – Perivitelline Space: Theo Vutyavanich (2003),

Veeck (1999), Xia P (1997) và Hassan - Ali H (1998) thì noãn có khoảng quanh noãn rộng đi kèm với các thể hạt sẽ làm tỷ lệ thụ tinh giảm đáng kể

[42],[43],[41],[44]

PVS 1: bình thường, độ rộng vừa phải, không có hạt (a)

PVS 2: rộng ở 1 phần quanh noãn, không có hạt (b)

PVS 3: rộng hết toàn bộ chu vi quanh noãn (c)

PVS 4: rộng và xuất hiện hạt trong khoang PVS (d)

* Thể cực (PB – polar body) (Hình 1.10): Sự xuất hiện của thể cực thứ nhất ở

khoang quanh noãn là dấu hiệu cho thấy noãn trưởng thành về nhân Thể cực thứ nhất là kết quả của sự phân chia không đồng đều về tế bào chất trong quá trình giảm phân tạo noãn Noãn có thể cực nhỏ hoặc dẹt có xu hương tạo phôi tam bội vì phần nhiễm sắc thể có lẽ không được trục xuất ra ngoài mà bị giữ lại trong tế bào chất trong quá trình giảm phân [42],[43] Thể cực phân mảnh

là một trong những biểu hiện noãn quá trưởng thành, thường có tỷ lệ thụ tinh thấp, chất lượng phôi và tỷ lệ làm tổ thấp [43]

PB 1: dạng tròn hoặc oval, bề mặt trơn láng (a)

PB 2: dạng tròn hoặc bầu dục, bề mặt nhăn (b)

* Màng trong suốt (ZP – Zona pellucia) (Hình 1.11)

Một số hình dạng hay gặp ở ZP là dạng màng hình bầu dục

ZP 1: độ dày và màu sắc bình thường (13-15µm) (a)

ZP 2: màng trong suốt mỏng (b)

ZP 3: dày, hai lớp hoặc dày mỏng không đều (c)

ZP 4: dày hoặc sậm màu hoặc bất thường (d)

* Đặc điểm noãn thụ tinh: noãn thường có hình cầu, với 2 thể cực và 2 tiền nhân

có màng bao riêng biệt, kích thước bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trung tâm của noãn Mỗi tiền nhân có số lượng và kích thước của các thể hạt nhân tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của màng 2 PN [35] (Hình 1.12)

Hình 1.12 Hợp tử

(Nguồn: IVFAS)

* Đánh giá số lượng tiền nhân (ProNuclear – PN)

- Không có tiền nhân: không thụ tinh hoặc noãn thụ tinh nhưng đã chuyển sang giai đoạn syngamy (màng của các tiền nhân biến mất, 2 tiền nhân hòa vào nhau)

- Một tiền nhân:

+ Do nhân tinh trùng đã xâm nhập vào noãn nhưng không được giải phóng

+ Hoặc do noãn tự hoạt hóa, xuất hiện không đồng thời tiền nhân của

noãn và tinh trùng, sự hòa nhập tiền nhân của tinh trùng và tiền nhân của noãn vào một tiền nhân lớn

- Hai tiền nhân: noãn thụ tinh bình thường

- Ba hoặc nhiều tiền nhân: do nhiều tinh trùng xâm nhập hoặc do noãn hay tinh trùng là thể đa bội

* Đánh giá kích thước, vị trí của tiền nhân

- Bình thường: kích thước hai tiền nhân bằng nhau, nằm đối diện, sát nhau ở giữa noãn

- Kích thước hai tiền nhân không bằng nhau thường mang bất thường

về di truyền [45], các tiền nhân có kích thước quá khác biệt nhau mang bất thường NST [46]

- Kích thước tiền nhân quá nhỏ hoặc bị phân mảnh: thường mang bất thường NST hoặc phát triển chậm [29]

- Vị trí: tiền nhân không nằm đối diện có thể dẫn đến không hòa nhập tiền nhân hoặc bất thường trong quá trình thụ tinh Nếu tiền nhân nằm ở vùng ngoại biên của noãn ở phần bán cầu không chứa thể cực thì được đánh giá là bất thường [46]

Hình 1.13 Sơ đồ phân loại PN theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Textbook of ART, 2009)

- Z1: Những hợp tử có 2 PN có kích thước và số lượng các NPB tương đương nhau (3-7 NPB), các NPB xếp thẳng hàng ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN (Hình 1.14a)

- Z2: Những hợp tử có 2 PN có kích thước và số lượng các NPB tương đương nhau (3-7 NPB), nhưng các NPB không xếp thẳng hàng ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN mà phân bố rải rác trong mỗi PN (Hình 1.14b)

-Z3: Những hợp tử không đồng đều nhau về kích thước, số lượng của các NPB ở mỗi PN hoặc các NPB ở mỗi PN không đồng thời xếp thẳng hàng

ở vùng tiếp giáp giữa 2 PN (Hình 1.14c)

- Z4: Những hợp tử bất thường, xuất hiện với 2 PN có kích thước khác biệt nhau rõ rệt, 2 PN không tiến sát nhau (Hình 1.14d)

Hình 1.14 Đánh giá noãn thụ tinh theo hệ thống Z-score

(Nguồn: Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong HTSS)[35]

1.4.2 Đánh giá phôi giai đoạn phân chia ngày 2 -3 (Early cleavage)

Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phân cắt Tuy nhiên, nguyên tắc chung để đánh giá chất lượng phôi giai đoạn phân cắt là dựa trên tốc độ phân chia của phôi, độ đồng đều của các phôi bào và tỷ

lệ mảnh vỡ bào tương là những chỉ tiêu chính Chỉ tiêu phụ như mật độ hạt trong bào tương, sự phân chia đồng bộ của phôi bào, tỷ lệ phôi bào đa nhân,

sự có mặt của không bào, lưới nội bào… cũng được xem xét

Phôi tốt là phôi có tốc độ phân chia phù hợp, các phôi bào đồng đều,

có ít hoặc không phân mảnh Cụ thể, các phôi tốt có 4 đến 6 phôi bào vào ngày 2 và ít nhất 7 phôi bào vào ngày 3 sau thụ tinh, các phôi bào đồng đều, đơn nhân, tỷ lệ phân mảnh không quá 10% thể tích phôi Do đó, phôi thường được đánh giá vào thời điểm 42- 44 giờ (ngày 2) hoặc 66-68 giờ (ngày 3) sau ICSI Phôi được phân loại thành các nhóm dựa trên các thông số về hình thái (số phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương) vào thời điểm đánh giá

1.5 KỸ THUẬT TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG NOÃN

1.5.1 Sự ra đời của kỹ thuật ICSI

Kể từ khi Louis Brown – đứa bé đầu tiên từ kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm – ra đời năm 1978, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã không ngừng phát triển Tuy nhiên kỹ thuật IVF cổ điển còn một số mặt hạn chế như đòi hỏi chất lượng tinh trùng của chồng phải tương đối tốt, bất thường nhẹ hay trung bình Do vậy, những bệnh nhân nam có chất lượng tinh trùng kém, rất kém, hoặc bất thường nặng hay thậm chí không có tinh trùng thì cơ hội có con gần như không có Một loạt các kỹ thuật hỗ trợ thụ tinh đã được báo cáo, đầu tiên

là kỹ thuật vi thao tác phẫu tích một phần màng trong suốt (PZD – partial zona dissection), sau đó là kỹ thuật tiêm tinh trùng vào dưới màng trong suốt (SUZI – subzonal sperm injection) nhưng kết quả đều không khả quan và ngày nay không còn được thực hiện

Đến năm 1992, trường hợp đầu tiên ra đời từ kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI) được báo cáo đã mở ra một kỷ nguyên mới của điều trị vô sinh Từ đó đến nay kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi tại các trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới Chỉ định của kỹ thuật này cũng được

mở rộng nhiều [48], [49]

Theo báo cáo của Nyboe và cộng sự (2009), số chu kỳ thực hiện ICSI vào năm 2006 chiếm trên 60% tổng chu kỳ hỗ trợ sinh sản của toàn bộ châu Âu [50] Hiện nay tại các trung tâm IVF lớn trên thế giới số chu kỳ thực hiện ICSI chiếm

tỷ lệ trên 70%, có những trung tâm thực hiện 100% kỹ thuật ICSI [51]

1.5.2 Chỉ định các trường hợp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

- Vô sinh do chồng: các trường hợp tinh trùng ít, tinh trùng bất thường hay tinh trùng di động trong mẫu tinh trùng ít

- Tinh trùng lấy từ mào tinh, tinh hoàn

- Các trường hợp xuất tinh ngược dòng có thể lấy nước tiểu sau khi xuất tinh, ly tâm để lọc lấy tinh trùng

- Các trường hợp chu kỳ IVF trước đó tỷ lệ thụ tinh thấp

- Các trường hợp vợ lớn tuổi

- Các trường hợp vô sinh không rõ nguyên nhân

1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ICSI

* Yếu tố chất lượng tinh trùng

Trong thời gian đầu phát triển, một nghiên cứu được thực hiện ở 996 chu kỳ

bởi Nagy và cộng sự (1995) về mối liên quan giữa ba thông số cơ bản của tinh trùng (số lượng tinh trùng, khả năng di động và hình thái học của tinh trùng) với kết quả của ICSI cho thấy rằng chỉ cần có sự hiện diện ít nhất một tinh trùng di động thu được sau lọc rửa tinh trùng để đảm bảo thành công của kỹ thuật ICSI [52]

Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại x400, khó có thể tiên đoán tinh trùng bình thường về cấu trúc di truyền hay không, bao gồm

bất thường số lượng nhiễm sắc thể hay tổn thương ADN Chỉ định chính của ICSI là cho những trường hợp có bất thường tinh trùng nặng, với những trường hợp này, bất thường về hình dạng thường đi kèm với bất thường về di truyền [53] Ngoài ra, Nars-Esfahani và cộng sự (2005) cũng cho thấy có mối liên hệ giữa bất thường hình dạng tinh trùng và tỷ lệ ADN phân mảnh [54]

Do đó, việc lựa chọn được tinh trùng trưởng thành, có khả năng thụ tinh cao

và không bất thường về di truyền đóng vai trò quan trọng trong ICSI

* Chất lượng noãn

Tỷ lệ noãn trưởng thành thu được sau khi kích thích buồng trứng vào khoảng 80% Tuy nhiên có khoảng 8 - 9% các chu kỳ có <50% noãn trưởng thành sau chọc hút Trong nghiên cứu của Palermo và cộng sự (2012) tác giả

đã chia làm 3 nhóm với tỷ lệ noãn trưởng thành giảm dần lần lượt là 67–99%,

34 – 66%, 0 – 33% Kết quả là tỷ lệ thụ tinh thấp nhất ở nhóm 3 với tỷ lệ noãn trưởng thành là 0–33% [49] Kết quả nghiên cứu cho thấy rõ ràng tỷ lệ noãn chưa trưởng thành có tác động xấu đến kết quả của một chu kỳ ICSI

Noãn trưởng thành khi trưởng thành cả về nhân cũng như trưởng thành

về bào tương Trưởng thành về nhân khi có sự hiện diện của thể cực thứ nhất trong khoang quanh noãn Sự trưởng thành về bào tương thường đi kèm với việc không xuất hiện các hình thái bất thường trong bào tương noãn

1.5.4 Các nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI

Từ 1998 đến 2012 đã có 9 nghiên cứu về thời gian ủ trứng trước ICSI được xuất bản với những kết luận khác nhau

Các nghiên cứu cho thấy giai đoạn ủ noãn sau khi chọc hút đến khi làm ICSI lên kết quả ICSIlàm cải thiện tỷ lệ noãn trưởng thành [10],[11], tỷ lệ thụ tinh [6],[11],[12],[13],[14] và chất lượng phôi [6],[11] Thời gian ủ noãn có thể làm tăng tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi nhưng không nhất thiết phải tăng số lượng noãn trưởng thành

Các nghiên cứu cũng đưa ra các khoảng thời gian ủ noãn tối ưu như 1-9 giờ [7], 2–4 giờ [11] và 5–6 giờ [13], tuy nhiên chỉ có 2 nghiên cứu đưa ra chính xác thời gian mang lại kết quả tốt nhất sau 3 giờ ủ noãn [12],[14]

Thời gian ủ noãn trước ICSI không nên vượt quá một giới hạn hợp lý nhất định Theo J.Y.Ho và cộng sự (2013) thời gian này dưới 2,5 giờ sẽ làm giảm tỷ lệ noãn trưởng thành [10] còn A Isiklar và cộng sự (2004) thấy nếu tiến hành ICSI ngay sau khi chọc hút noãn sẽ làm giảm tỷ lệ noãn trưởng thành, tỷ lệ thụ tinh cũng như chất lượng phôi [11] Như vậy dựa trên những khoảng hay mốc thời gian của các nghiên cứu đưa ra thì noãn nên được ủ trong tủ cấy ít nhất là 2,5 giờ từ sau khi chọc hút đến khi làm ICSI

Trong một số nghiên cứu, noãn được tiêm ICSI sau chọc hút lên đến 11 giờ [6],[7] hay thậm chí 12 giờ [13] đã ảnh hưởng xấu đến kết quả ICSI Nghiên cứu của K.Yanagida và cộng sự (1998) khi ủ noãn từ 9-11 giờ sẽ làm giảm chất lượng phôi, giảm tỷ lệ có thai [7], không những vậy còn làm giảm

tỷ lệ thụ tinh trong nghiên cứu của P Falcone (2008) với thời gian ủ noãn 6 -

12 giờ [13] Với những ảnh hưởng tiêu cực này, thời gian ủ noãn không nên vượt quá 6 giờ sau chọc hút

Trong số 7 nghiên cứu về thời gian ủ noãn, không có nghiên cứu nào phân tích tác động của cả hai khoảng thời gian từ khi chọc hút noãn đến khi tách bỏ tế bào hạt và từ khi tách bỏ tế bào hạt đến khi tiêm ICSI [6],[7],[9], [10],[11],[12],[13] Hầu hết các tác giả cho rằng noãn nên được bao bọc bởi lớp tế bào hạt và tế bào vành tia khi ủ trong tủ cấy [5],[7],[11],[12] nhưng không đưa ra số liệu chứng minh Chỉ có H Van de Velde và cộng sự (1998)

đã chia 2 nhóm noãn và ủ noãn ở hai điều kiện, một là giữ nguyên phức hợp

tế bào hạt, hai là tách bỏ hoàn toàn và thực hiện ICSI ở 2 thời điểm sớm (1-2 giờ sau lấy noãn) và muộn (5-6 giờ) [8] Kết quả cho thấy sự khác biệt không

có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ thụ tinh cũng như sự phân chia của phôi Để nghiên cứu sâu hơn về vấn đề này, Catherine Patrat và cộng sự (2012) đã

phân biệt 2 khoảng thời gian T1 và T2 (T1: thời gian từ khi chọc hút noãn đến khi tách bỏ tế bào hạt và T2 là thời gian từ khi tách bỏ tế bào hạt đến khi tiêm ICSI) Kết quả đưa ra là noãn nên ủ ít nhất 2-3 giờ sau khi chọc hút noãn (T1: 2–3 giờ) và ICSI nên được thực hiện ngay sau khi tách bỏ tế bào hạt [14]

Nghiên cứu của Catherine (2012) cho thấy không có bất kỳ ảnh hưởng nào của T1 hay T2 lên tỷ lệ noãn trưởng thành, mà tỷ lệ thụ tinh tăng có ý nghĩa thống kê khi T1 tăng, tăng cao nhất ở thời điểm T1=3 giờ [14] Điều này cho thấy thời gian ủ noãn không phải làm tăng số lượng noãn trưởng thành mà cần thiết để làm trưởng thành bào tương Trưởng thành về nhân có thể dễ dàng được đánh giá trước khi ICSI khi có mặt thể cực đầu tiên ở khoang quanh noãn nhưng sự trưởng thành của bào tương lại khó nhận biết Trong chu kỳ kích thích buồng trứng, sự trưởng thành của bào tương không đồng thời với sự trưởng thành của nhân [17],[18] Do đó một số noãn được lấy ra sau chọc hút mặc dù ở giai đoạn MII có thể vẫn chưa trưởng thành bào tương Điều này có thể lý giải thời gian T1 ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ thụ tinh liên quan chặt chẽ đến sự trưởng thành của noãn cả về nhân và bào tương

Các nghiên cứu đều thực hiện chọc hút noãn tại thời điểm 36-37 giờ sau mũi tiêm hCG Có duy nhất một nghiên cứu của D Dozortsev và cộng sự (2004) là dựa trên thời điểm tiêm hCG cho tỷ lệ thụ tinh tăng liên tục theo thời gian sau mũi tiêm hCG, tới đỉnh điểm là 84% khi ICSI được làm hơn 41 giờ sau mũi tiêm hCG Tuy nhiên, tỷ lệ làm tổ cao nhất (24%) đạt được khi làm ICSI 37 - 41 giờ sau mũi tiêm hCG [12]

Qua các nghiên cứu trên cho thấy giới hạn hợp lý của thời gian ủ noãn trước ICSI là 2,5 giờ – 6 giờ sau khi chọc hút noãn (thời điểm chọc hút noãn 36 -

37 giờ sau mũi tiêm hCG), giữ lại tế bào hạt bao quanh noãn khi ủ noãn là cần thiết và ICSI được thực hiện ngay sau tách bỏ tế bào hạt Dựa trên kết quả của các nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn những mốc thời gian ủ noãn là 2,5 giờ, 3,5 giờ

và 4,5 giờ để khảo sát kết quả thụ tinh và chất lượng phôi trong IVF/ICSI Những nghiên cứu tương tự, chúng tôi chưa đọc được trong y văn hiện có

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là noãn MII được thụ tinh với tinh trùng bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn và nuôi cấy tạo thành phôi của bệnh nhân được điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia - Bệnh viện Phụ sản Trung ương trong thời gian 6 tháng từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2016

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Toàn bộ noãn trưởng thành MII của các cặp vợ chồng điều trị bằng thụ tinh trong ống nghiệm thỏa mãn các điều kiện sau:

+ Tuổi vợ ≤ 35 tuổi

+ Vợ được kích thích buồng trứng bằng phác đồ Antagonist

+ Số lượng noãn sau chọc hút từ 10 - 15 noãn

+ Được chỉ định tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

+ Thời gian chọc hút trứng 36 giờ ± 15 phút sau tiêm hCG

- Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

- Những trường hợp vô sinh do chồng:

+ Bất thường tinh dịch đồ nặng

+ Tinh trùng được chọc hút từ mào tinh, tinh hoàn

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc gia – Bệnh viện Phụ Sản Trung ương trong thời gian 6 tháng từ tháng 4 đến tháng

10 năm 2016

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu: Tiến cứu, so sánh ngẫu nhiên có đối chứng

Số noãn của mỗi bệnh nhân sau khi chọc hút noãn được phân ngẫu nhiên vào

ba nhóm (Hình 2.1):

+ Nhóm 1: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 2,5 giờ trước khi tách noãn + Nhóm 2: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 3,5 giờ trước khi tách noãn

+ Nhóm 3: Thời gian ủ noãn trong tủ cấy là 4,5 giờ trước khi tách noãn

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên 514 noãn của 30 chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm của 30 bệnh nhân làm thụ tinh ống nghiệm tại Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc gia – Bệnh viện Phụ sản Trung ương

2.2.3 Quy trình thực hiện

2.2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Mẫu tinh dịch

BN IVF đƣợc kích thích buồng trứng

đủ tiêu chuẩn lựa chọn

Chọc hút noãn sau mũi tiêm hCG khoảng 36 giờ

Lựa chọn ngẫu nhiên

Tách noãn & đánh giá chất lƣợng noãn

Tinh trùng

đã đƣợc lọc rửa ICSI ngay sau khi tách noãn

Kiểm tra thụ tinh & đánh giá hợp tử (16 – 18 giờ sau ICSI)

Kiểm tra phôi & đánh giá chất lƣợng phôi ngày 2 (42 – 44 giờ sau ICSI)

Xử lý số liệu, phân tích kết quả theo

mục tiêu 3 nhóm

2.2.3.2 Kích thích buồng trứng

- Bệnh nhân được kích thích buồng trứng bằng phác đồ Antagonist

2.2.3.3 Chuẩn bị mẫu tinh trùng

- Mẫu tinh dịch được thu nhận bằng thủ dâm và để ly giải trong tủ ấm 37ºC

- Tinh trùng được lọc rửa bước 1 theo phương pháp thang nồng độ, bước 2 theo phương pháp swim up vào ngày chọc hút noãn

2.2.3.4 Chọc hút noãn

- Sau mũi tiêm hCG khoảng 36 giờ (36 giờ ± 15 phút)

- Chọc hút qua đường âm đạo dưới hướng dẫn của siêu âm

2.2.3.5 Thu lượm noãn trong labo

- Bơm trực tiếp bơm tiêm 10 ml chứa dịch nang noãn ra đĩa petri 90x20mm và tìm phức hợp noãn - tế bào nang dưới kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại 10X và được rửa nhiều lần trong môi trường nuôi cấy

- Noãn sau khi chọc hút sẽ được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm và đánh giá chất lượng phức hợp tế bào noãn

- Ghi lại thời gian trước khi ủ noãn

- Noãn được ủ trong môi trường G-IVF (Vitrolife) trong tủ cấy CO2

5%, 37ºC trước khi tách bỏ tế bào hạt với thời gian:

+ Nhóm 1: 2,5 giờ

+ Nhóm 2: 3,5 giờ

+ Nhóm 3: 4,5 giờ

2.2.3.6 Tách noãn

- Noãn sau thời gian ủ theo từng nhóm sẽ được tách bỏ tế bào hạt

- Chuẩn bị đĩa tách noãn:

+ Pha loãng môi trường Hyase (Vitrolife) với môi trường G-Gamete theo tỉ lệ 1:9