Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein a20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua tt

Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể toll-like toll-like receptor - TLR khác nhau, do đó đóng vai trò khác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thu Thủy

NGHIÊN CỨU VAI TRÕ ĐIỀU HOÀ

CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 94 20 20 1

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2020

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: TS Nguyễn Thị Xuân – Viện nghiên cứu hệ gen Người hướng dẫn khoa học 2: TS Hoàng Văn Tổng – Học viện quân y

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Protein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 (tumor necrosis factor α-induced protein 3 - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm và điều hòa ngược hoạt động sinh lý của tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn sự phosphoryl hóa một số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) và tín hiệu STAT (signal transducer and activator of transcription) Các nghiên cứu di truyền

cho thấy đột biến gen A20 làm thay đổi chức năng sinh học của

protein A20 và là một trong những nguyên nhân gây ra các loại bệnh

lý như bệnh tự miễn, viêm nhiễm và ung thư Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu hiện tình trạng suy nhược, mắc các bệnh tự miễn, viêm toàn bộ các cơ quan, bộ phận cơ thể và không sống sót được quá 2 tuần tuổi Ở người, bất hoạt gen A20 đã được ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn và ung thư như các loại bệnh ung thư máu Tuy nhiên ảnh hưởng của protein A20 đến cơ chế bệnh sinh của các bệnh này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ

Tế bào tua (TBT) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho các tế bào lympho, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch Chỉ có các TBT mới có khả năng kích thích hình thành phản ứng miễn dịch ở tế bào lympho T trong trạng thái không hoạt động TBT cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho

B và giúp duy trì trí nhớ miễn dịch của các tế bào này TBT sản xuất các cytokine và các yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B Các tế bào tua có mặt trong hầu hết các cơ quan lympho như lách và hạch bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa và ống hô hấp, chính vì thế chúng dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên

ngoại sinh TBT được chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC)

và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức

độ biểu hiện các loại thụ thể toll-like (toll-like receptor - TLR) khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác với mầm bệnh

Một số nghiên cứu trước đây trên tế bào tua đã chỉ ra rằng protein A20 có khả năng ức chế khả năng sản xuất một số các cytokine Tuy nhiên đến nay, chưa có công bố khoa học nào về vai trò, cơ chế phân tử của gen A20 trong điều hòa các chức năng sinh lý TBT khi phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh trùng

và ảnh hưởng của protein A20 đến hoạt động apoptosis của TBT khi

bị kích thích bởi một số cytokine Do đó, các thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu vai trò điều hoà của protein A20 đối với TBT khi được kích hoạt bởi một số kháng nguyên như profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) và một số cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

1 Đánh giá vai trò của gen A20 đối với điều hoà 4 chức năng sinh lý

gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và apoptosis của TBT

2 Đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với điều hòa 3 tín hiệu phân

tử NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý TBT

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1 Nghiên cứu vai trò của gen A20 trong việc điều hoà các chức năng

sinh lý TBT:

1.1 Biệt hóa TBT bằng FLT3 để thu được 3 tập hợp TBT là pDC, CD8+DC và CD11b+DC Xử lý 3 nhóm TBT này với profilin, quan sát và so sánh các chức năng trưởng thành, di cư, tiết cytokine và

apoptosis giữa nhóm TBT bất hoạt A20 và nhóm không bất hoạt

1.2 Biệt hóa TBT bằng GM-CSF để thu được nhóm tế bào CD11b+DC Phơi nhiễm nhóm TBT này với LPS để quan sát vai trò của protein A20 đối với các chức năng sinh lý trên

2 Nghiên cứu vai trò của gen A20 điều hòa các quá trình sinh lý trên

thông qua một số dòng tín hiệu phân tử liên quan trong TBT, bao gồm sự photphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Protein A20

Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor a-induced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3)

là protein ức chế phản ứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm Protien A20 có chiều dài 790 acid amin và khối lượng phân tử 89,6 kDa Protein A20 đóng vai trò là chất điều hoà của phản ứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear factor kappa B - NF-κB)

Protein A20 được mã hóa bởi gen A20, gen này được đặt tên

theo số bản sao cDNA, được xác định là gen cảm ứng với TNF trong

các tế bào nội mô Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm 9 exon và 8

intron Trong đó, exon 1, đầu 5’ của exon 2 và đầu 3’ của exon 9 không mã hoá protein Độ dài của mRNA là 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến 2439

Các nghiên cứu trước đây về chức năng protein A20 đã chỉ ra rằng A20 ngăn chặn phản ứng viêm thông qua ức chế tín hiệu phân

tử NF-κB Nghiên cứu in vivo về vai trò của protein A20 cho thấy chuột bị knock-out A20 quá mẫn cảm với TNF, chết sớm do viêm đa

cơ quan nghiêm trọng và chứng suy nhược do tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn cộng sinh

Protein A20 có vai trò rất quan trọng trong điều hoà hệ thống miễn dịch thông qua tác động đến các tế bào miễn dịch khác nhau như TBT, tế bào B, tế bào T và các đại thực bào Vì vậy, bất hoạt gen

A20 có thể là một chiến lược để nâng cao hiệu quả phòng và điều trị

bệnh dựa trên TBT đối với bệnh ung thư và các bệnh truyền nhiễm Trên thực tế, TBT thiếu hụt protein A20 tạo ra đáp ứng miễn dịch kháng thể đặc biệt tốt hơn so với các TBT kiểu hoang dại

Gen A20 như là một locus nhạy cảm đối với các bệnh lý tự

miễn, bao gồm: viêm khớp dạng thấp, viêm khớp tự phát, ban đỏ lupus, viêm đại tràng, bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đường tuýp I, và bệnh

đa xơ cứng Hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và quy định của gen

A20 có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của phương pháp trị liệu kháng

viêm mới

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra A20 là protein điều hòa ngược hoạt động và sự biệt hóa của tế TBT thông qua các tín hiệu phân tử như NF-кB, STATs Sự gắn kết giữa thụ thể toll-like receptors TLRs trên bề mặt tế bào với các phối tử đặc hiệu của chúng bao gồm các kháng nguyên xuất phát từ vi khuẩn, các cytokine gây viêm, các yếu tố phóng xạ… kích hoạt tín hiệu phân tử này Bất

thường về di truyền của gen A20 xảy ra trong những bệnh nhân ung

thư máu như đột biến gen hoặc mất đoạn gen hoặc bất hoạt gen

1.2 Tế bào tua (TBT)

Tế bào tua (Dendritic cells - TBT) là các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (antigen-presenting cells - APCs) để

tạo ra các phản ứng miễn dịch Các TBT kết hợp và truyền thông tin

từ môi trường bên ngoài đến các tế bào của hệ thống miễn dịch TBT không chỉ quan trọng trong việc tạo ra các phản ứng miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch tập nhiễm mà còn điều chỉnh các loại đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T Gần đây, y học hiện đại đã áp dụng các phương pháp trị liệu miễn dịch dựa trên TBT để chống lại ung thư và các bệnh truyền nhiễm

Các TBT dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh do TBT có mặt trong các cơ quan lympho như: lách và hạch bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa, hô hấp và trong dịch kẽ của hầu hết các cơ quan nhu mô Đặc điểm hình thái quan trọng của TBT

là sự hiện diện của lớp màng được trải ra từ thân tế bào chính, tương

tự như các tua (dendrites) trên nơ-ron nên được đặt tên là dendritic

cells, bắt nguồn từ chữ “Dendron” trong tiếng Hy Lạp, nghĩa là cây

TBT được chia làm hai nhóm bao gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC) và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể TLR khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác với mầm bệnh

TBT có hai chức năng chính là trình diện kháng nguyên và điều hoà miễn dịch Các quá trình sinh lý TBT đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống miễn dịch, bao gồm biệt hoá, trưởng thành, di cư, thực bào, tiết cytokine và apoptosis

Có rất nhiều loại tín hiệu phân tử tham gia kích hoạt TBT như: PI3K, MAPK, NF-кB và STAT Trong đó, NF-кB và STAT có liên quan chặt chẽ đến hoạt động viêm trong bệnh tự miễn và ung thư Hiện nay, trong y học người ta đã nghiên cứu và ứng dụng các loại

thuốc ức chế NF-кB và STAT để phục vụ điều trị các loại bệnh mãn tính và ác tính, vì gen A20 tham gia điều hòa hoạt động, mức độ thuần thục và sự biệt hóa của tế bào thông qua hoạt động của các tín hiệu phân tử như NF-кB và STAT

Trên thế giới, liệu pháp vắc xin TBT đã được thử nghiệm điều trị cho nhiều bệnh nhân ung thư hắc tố, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thận Ở Việt Nam, phòng thí nghiệm tế bào gốc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia HCM đã và đang triển khai nghiên cứu sử dụng liệu pháp TBT trong điều trị ung thư vú Tuy nhiên, đây chỉ là bước thử nghiệm trong PTN, chưa thể áp dụng vào thực tế chữa bệnh trên bệnh nhân Những tiến bộ đáng kể trong sự hiểu biết

về sinh học TBT đã mở ra con đường cho sự phát triển của các phác

đồ điều trị bệnh trong y học Vì vậy, có thể hy vọng rằng đây sẽ là liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào tua được phân lập và nuôi cấy từ tế bào tủy xương ở chuột BALB/c Chuột BALB/c được cung cấp bởi công ty Taconic Farms (Hudson, New York, USA) Chuột được nuôi theo đúng quy trình thí nghiệm, thực hiện theo luật pháp Việt Nam về động vật và được phê duyệt bởi Hội đồng đạo đức của Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tế bào tủy xương ở chuột BALB/c được sử dụng hóc môn sinh trưởng GM-CSF để biệt hóa thành tế bào CD11b+

DC hoặc FLT3 để biệt hóa thành 3 quần thể tế bào tua là CD8+DC, CD11b+DC và pDC tùy thuộc mục đích của thí nghiệm Các TBT được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn tại Viện nghiên cứu hệ gen

2.2 Các hoá chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm TRIzol™ Plus RNA Purification Kit; Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent; IL-6, IL-10, IL-12p70, TNF-α, INF- γ Mouse ELISA Kit; kháng thể mouse IgG isotype control, anti-mouse CD11c, anti-mouse CD86, anti-mouse CD40 và anti-mouse I-A/I-E đều là các hóa chất đạt tiêu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi các hãng có uy tín như: Thermo, Sigma, Invitrogen, Gibco,…

2.3 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị được sử dụng cho nghiên cứu bao gồm tủ an toàn sinh học cấp 2, kính hiển vi huỳnh quang, máy phân tích tế bào học dòng chảy Flow cytometry, bộ dụng cụ Western blot, máy đọc ELISA

và các thiết bị chuyên dụng khác tại Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam và Học viện Quân Y

2.4 Phương pháp nghiên cứu

 Nuôi cấy và biệt hoá TBT: Tế bào tủy xương được phân lập từ xương khớp đùi của chuột BALB/c Sử dụng hóc môn GM-CSF (35 ng/ml) vào ngày thứ 3 và thứ 6 để biệt hoá thành CD11b+

DC (hoặc ngày thứ 8 bổ sung FLT3 (200 ng/ml) để biệt hoá thành 3 loại TBT

Phương pháp đưa phân tử siRNA đặc hiệu gen đích A20 vào trong các TBT nhằm bất hoạt gen A20

 Kỹ thuật Western blot đánh giá sự phosphoryl hoá phân tử tín hiệu κBα, STAT-1 (727), và p-STAT-3 dựa vào việc phát hiện phức hợp kháng thể đặc hiệu - protein được gắng trên màng

 Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine IL-6, IL-10, IL-12p40, TNF-α và IFN-γ tiết ra bởi TBT của nhóm chứng và nhóm bất hoạt

A20 và so sánh sự khác biệt giữa 2 nhóm này

Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (Flow cytometry) đo biểu hiện các marker trưởng thành MHC II, CD86 và CD40 và phân tích quá trình apoptosis thông qua Annexin V, 7-AAD và Caspase-3

 Phương pháp xác định sự di cư tế bào để xác định tỉ lệ TBT di cư

và so sánh giữa nhóm bất hoạt A20 và nhóm chứng

Phân tích số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu vai trò của gen A20 trong việc điều hoà các chức

năng sinh lý TBT

3.1.1 Kết quả bất hoạt gen A20 trong TBT

Sau khi bất hoạt gen A20 trong TBT, tiến hành kiểm tra và so

sánh mức độ biểu hiện của protein A20 trong tế bào bất hoạt và tế

bào nhóm chứng bằng Western blot, kết quả như hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào

tế bào tua Kết quả trên hình ảnh Western blot cho thấy sau khi đưa phân

tử A20-siRNA vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt gần như

hoàn toàn so với nhóm chứng (control siRNA) Các băng chứng (GAPDH) đều bắt màu đậm rõ nét, có kích thước tương đồng nhau ở

các giếng Kết quả này đã khẳng định rằng sau khi đưa A20-siRNA

vào TBT, biểu hiện protein A20 đã bị bất hoạt

3.1.2 Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành TBT

Từ TBT tuỷ xương chuột, sau khi nuôi cấy và biệt hoá bởi FLT3 tạo thành 3 tập hợp là CD8+DC, CD11b+DC và pDC Mỗi tập

hợp này được thiết kế thành nhóm bất hoạt A20 bằng siRNA-A20 và

nhóm chứng không bất hoạt Kết quả so sánh biểu hiện các marker bề

mặt MHC II, CD86 và CD40 giữa nhóm bất hoạt gen A20 và nhóm

chứng của CD8+DC và CD11b+DC đều không có sự khác biệt Như

vậy, A20 không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của CD8+DC và CD11b+DC, tuy nhiên, protein A20 ức chế sự trưởng thành của pDC

Hình 3.2 Ảnh hưởng của A20 đối với sự trưởng thành của pDC

Khi tế bào thiếu hụt protein A20, biểu hiện của MHC II và CD40 trên các tế bào pDC trưởng thành được xử lý với TgPRF tăng hơn nữa, nhưng biểu hiện của CD86 thì không tăng Biểu đồ FACS

chỉ ra rằng gen A20 chống lại biểu hiện của marker bề mặt MHC II

và CD40 trên tế bào pDC Như vậy, protein A20 đã ức chế nột phần

sự trưởng thành của pDC thông qua ức chế biểu hiện của MHC II và CD40 Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Pepper và cộng sự chỉ ra rằng pDC là một tập hợp TBT nổi bật, liên quan đến

giai đoạn đầu của nhiễm trùng T gondii, khả năng trình diện các

kháng nguyên ký sinh trùng và sản xuất các cytokine đóng vai trò rất quan trọng để kiểm soát nhiễm trùng

Trong nghiên cứu về vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của TBT, nhóm của tác giả Nguyễn Thị Xuân và cộng sự đã tiến hành biệt hoá với GM-CSF để thu được TBT là CD11b+DC Sau khi phơi nhiễm với LPS và so sánh kết quả giữa nhóm TBT bất hoạt A20 và nhóm chứng, biểu hiện của các marker MHC II, CD86 và

CD40 đều tăng cường rõ rệt ở nhóm bất hoạt gen A20 Như vậy, thí

nghiệm này đã chỉ ra rằng protein A20 đóng vai trò ức chế sự trưởng thành ở nhóm tế bào tua CD11b+DC Tuy nhiên, trong nghiên cứu của luận án này, sau khi biệt hoá TBT với FLT3 để thu được CD8+DC, CD11b+DC và pDC rồi phơi nhiễm 3 nhóm TBT với profilin thì protein A20 chỉ ức chế sự trưởng thành của pDC nhưng không ảnh hưởng đến sự trưởng thành của nhóm tế bào CD8+DC và CD11b+DC Như vậy, khi phơi nhiễm TBT với các kháng nguyên khác nhau thì vai trò điều hoà của protein A20 đối với sự biểu hiện các marker trưởng thành là khác nhau

3.1.3 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT

3.1.3.1 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT khi biệt hóa TBT bằng FLT3 và kích hoạt bằng profilin

Bất hoạt gen A20 ảnh hưởng đến sự tiết cytokine của nhóm

CD11b+DC và pDC nhưng không ảnh hưởng đến nhóm CD8+

DC

Hình 3.3 Ảnh hưởng của A20 lên sự tiết cytokine của CD11b+ DC

khi phơi nhiễm với profilin

Kết quả trên cho thấy protein A20 có vai trò ức chế sự sản xuất cytokine IL-6 và TNF-α của nhóm tế bào CD11b+DC

Hình 3.4 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của pDC

khi phơi nhiễm profilin Protein A20 ức chế sự tiết các cytokine IL-6, IL-12p40, TNF-α

và IFN-γ khi xử lý với profilin Bằng chứng này đã chỉ ra rằng A20

ức chế phản ứng viêm ở pDC và một phần phản ứng viêm của CD11b+DC Điều này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu gần đây của nhóm Cohen và cộng sự đã công bố rằng cytokine IL-12p40 và IFN-γ không được sản xuất bởi CD11b+DC khi nhiễm T gondii 3.1.3.2 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của TBT khi biệt hóa TBT bằng GM-CSF và kích hoạt bằng LPS

Hình 3.5 Ảnh hưởng của A20 lên sự tiết cytokine của CD11b+

DC

khi phơi nhiễm LPS