Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein a20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

MỞ ĐẦUProtein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 tumor necrosisfactor α-induced protein 3 - TNFAIP3 có đặc tính chống viêm và điều hòa ngượchoạt động sinh lý của tế bào mi

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NCS Nguyễn Thu Thuỷ

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ

THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-NCS Nguyễn Thu Thuỷ

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

hệ gen

2 TS Hoàng Văn Tổng - Học viện quân y

Hà Nội – Năm 2020

Tôi xin cam đoan:

Luận án là công trình nghiên cứu của tôi là chủ yếu Nghiên cứu được thực

hiện trong khuôn khổ đ ề tài Nafosted mã số 108.06-2017.16, “Nghiên cứu vai trò điều hòa của gen mã hóa cho protein A20 với bệnh bạch cầu cấp tính và các cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào”, thời gian thực hiện 2017-2019

do TS Nguyễn Thị Xuân làm chủ nhiệm đề tài

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đãđược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế với sựđồng ý và cho phép c ủa đ ồng tác giả Những kết quả còn lại trong luận án chưađược tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm

2020

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Thuỷ

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân, Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án Đó là nền tảng, hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Văn Tổng, Phòng An toàn sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, thầy không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đ ắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô, các anh chị ở Viện đã luôn hướng dẫn tận tình cho tôi trong các môn học cũng như phương pháp thực nghiệm và trình bày kết quả Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, đã luôn đ ộng viên và dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong trong suốt thời gian qua Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn trong Phòng Hệ gen học miễn dịch đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ nhiệt tình để tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh chị ở phòng Đào tạo nói riêng và Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam nói chung, đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo các cấp và đồng nghiệp ở Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, đã tạo điều kiện

và động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình.

Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo đi ều kiện và chia sẻ khó khăn trong suốt thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này.

Nghiên cứu sinh

DISCELISAFLT3GM-CSFIL

IFNIκB-α

LPSMHC

NF-κB

NK cellpDCSTAT

TBT

T gondii

Th1T-regTLRTNFAIP3

TNF

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tếbào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tếbào pDC khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tếbào CD8+DC sau khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tếbào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tếbào pDC sau khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tếbào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của các nhóm tếbào tua sau khi phơi nhiễm profilin

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bàoCD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bàoCD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine,khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Annexin

V, âm tính với 7-AAD

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilinẢnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1

86

899092

Hình 1.1 Cấu trúc gen

TNFR1

-1R/TLR4

FLT3 và phơi nhiễm với profilin

GM-CSF và phơi nhiễm với LPS

bào tua

bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin

CD11bDC khi phơi nhiễm profilin

bào pDC khi phơi nhiễm profilin

CD8+DC khi phơi nhiễm profilin

Hình 3.7 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào

pDC khi phơi nhiễm profilin

CD11b

bào tua khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin

CD11b

lượng tế bào CD11b

và âm tính với 7-AAD

tế bào CD11b

STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b profilin

STAT1 và STAT3 ở tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin

STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b

thành của tế bào pDC thông qua con đường tín hiệu IκB-α vàSTAT1

pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1

thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1

bào CD11b

Hình 4.1Hình 4.2Hình 4.3Hình 4.4Hình 4.5Hình 4.6Hình 4.7Hình 4.8

Hình dot blot của những tế bào tua được nhuộm cùng khángthể FITC-Annexin V và PE-CD11c

Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang

Hình dot blot của những TBT được nhuộm cùng kháng thểFITC-CD11c và PE-CD86/ MHC II/ CD40

Nồng độ TNF -α trong dịch huyền phù CD11bDC xác địnhbằng ELISA

Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác độngcủa cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ

Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 dưới tác độngcủa cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ

Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 trong tế bào CD11b+DCkhi phơi nhiễm với IL-10

Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 trong CD11b +DC khiphơi nhiễm với IL-10

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Protein A20 3

1.1.1 Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20 3

1.1.2 Cấu trúc gen A20 và protein A20 3

1.1.3 Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch 5

1.1.2.1 Vai trò của protein A20 trong tế bào T 6

1.1.2.2 Vai trò của protein A20 trong tế bào B 6

1.1.2.3 Vai trò của protein A20 trong tế bào tua 7

1.1.4 Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis 7

1.1.5 Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20 8

1.1.6 Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20 9

1.1.6.1 Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB 9

1.1.6.2 Protein A20 điều hoà tín hiệu STATs 11

1.1.7 Vai trò của protein A20 đối với một số bệnh tự miễn và ung thư 13

1.1.8 Tình hình nghiên cứu về protein A20 trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.2 Tế bào tua 16

1.2.1 Khái niệm và lịch sử phát hiện tế bào tua 16

1.2.2 Đặc điểm sinh học của tế bào tua 16

1.2.3 Chức năng tế bào tua 19

1.2.4 Phân loại tế bào tua 20

1.2.5 Các quá trình sinh lý tế bào tua 22

1.2.5.1 Sự biệt hoá của tế bào tua 22

1.2.5.2 Sự trưởng thành của tế bào tua 23

1.2.5.3 Sự di cư của tế bào tua 24

1.2.5.4 Sự thực bào của tế bào tua 25

1.2.5.5 Sự tiết cytokine của tế bào tua 26

1.2.5.6 Sự chết theo chương trình của tế bào tua 26

1.2.6 Một số thụ thể Toll - like receptors kích hoạt hoạt động tế bào tua 29

1.2.7 Một số nghiên cứu ứng dụng về tế bào tua trong điều trị ung thư 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Vật liệu nguyên liệu 34

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.1.2 Các hoá chất 34

2.2 Thiết bị nghiên cứu 35

2.3 Sơ đồ thí nghiệm 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 40

2.4.1 Phương pháp nuôi cấy và biệt hoá tế bào tua 40

2.4.2 Phương pháp đưa phân tử siRNA vào trong các tế bào tua 41

2.4.3 Kỹ thuật Western blot đo mức độ biểu hiện protein 41

2.4.4 Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine tiết ra bởi tế bào tua 44

2.4.5 Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry analysis) 47

2.4.6 Phương pháp xác định sự di cư tế bào (transwell migration assay) 48

2.4.7 Phương pháp phân tích số liệu 49

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 50

3.1 Vai trò của protein A20 điều hoà các chức năng sinh lý tế bào tua 50

3.1.1 Kết quả bất hoạt gen A20 trong tế bào tua 50

3.1.2 Vai trò của protein A20 điều hòa sự trưởng thành tế bào tua 51

3.1.3 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua 59

3.1.3.1 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 59

3.1.3.2 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng GM-CSF 65

3.1.4 Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua 67

3.1.4.1 Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi biệt hóa tế bào tua bằng FLT3 67

3.1.4.2 Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi phơi niễm với GM-CSF và phơi nhiễm LPS 69

3.1.5 Vai trò của protein A20 đối quá trình apoptosis của tế bào tua 70

3.2.1 Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong

tế bào tua nhóm CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin 77

3.2.2 Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong tế bào tua pDC khi phơi nhiễm với profilin 79

3.2.3 Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào tua nhóm CD11b+DC khi xử lý với LPS 81

3.2.4 Vai trò của protein A20 đối với một số chức năng sinh lý của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 83

3.2.4.1 Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 84

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin 84

3.2.4.2 Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 86

3.2.4.3.Vai trò của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 89

3.2.5 Vai trò của protein A20 đối với chức năng của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 90

3.2.5.1 Vai trò của protein A20 đối với quá trình sản xuất cytokine của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 90

3.2.5.2 Vai trò của protein A20 trong điều hoà sự di chuyển của tế bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 92

BÀN LUẬN 94

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO 111

PHỤ LỤC 125

Phụ lục 1: Kết quả nuôi cấy tế bào tua 125

Phụ lục 1.3 Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm bởi Lipopolysaccharide 127Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α của tế bào tua 129Phụ lục 3: Ảnh hưởng của một số cytokine đối với quá trình apoptosis của tế bàoCD11b+DC 131Phụ lục 3.1 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động củacytokine IL-10, IL-2, TNF-α và INF-γ 131Phụ lục 3.2 Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động củacytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ 132Phụ lục 4: Vai trò điều hòa của IL-10 đối với sự phosphoryl hóa STAT1 vàSTAT3 trong tế bào tua 133Phụ lục 4.1 Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT1 133Phụ lục 4.2 Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT3 134

MỞ ĐẦU

Protein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 (tumor necrosisfactor α-induced protein 3 - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm và điều hòa ngượchoạt động sinh lý của tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn sự phosphoryl hóamột số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB và tín hiệu STAT (signaltransducer and activator of transcription) Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột

biến gen A20 làm thay đổi chức năng sinh học của protein A20 và là một trong

những nguyên nhân gây ra các loại bệnh lý như bệnh tự miễn, viêm nhiễm và ung

thư Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu hiện tình trạng suy nhược, mắc các bệnh

tự miễn, viêm toàn bộ các cơ quan, bộ phận cơ thể và không sống sót được quá 2

tuần tuổi Ở người, bất hoạt gen A20 đã được ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn

và ung thư như các loại bệnh ung thư máu Tuy nhiên ảnh hưởng của protein A20đến cơ chế bệnh sinh của các bệnh này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ

Tế bào tua (TBT) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho các tếbào lympho, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch Chỉ có các TBT mới cókhả năng kích thích hình thành phản ứng miễn dịch ở tế bào lympho T trong trạngthái không hoạt động TBT cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho

B và giúp duy trì trí nhớ miễn dịch của các tế bào này TBT sản xuất các cytokine vàcác yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B

Các tế bào tua có mặt trong hầu hết các cơ quan lympho như lách và hạchbạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa và ống hô hấp, chính vì thế chúng dễ dàngtiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh TBT được chia làm hai nhóm baogồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC)

và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC) Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thànhhai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể toll-like (toll-like receptor - TLR) khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khảnăng tương tác với mầm bệnh

Một số nghiên cứu trước đây trên tế bào tua đã chỉ ra rằng protein A20 cókhả năng ức chế khả năng sản xuất một số các cytokine Tuy nhiên đến nay, chưa có

công bố khoa học nào về vai trò, cơ chế phân tử của gen A20 trong điều hòa các

chức năng sinh lý TBT khi phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinhtrùng và ảnh hưởng của protein A20 đến hoạt động apoptosis của TBT khi bị kíchthích bởi một số cytokine Do đó, các thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu vaitrò điều hoà của protein A20 đối với TBT khi được kích hoạt bởi một số kháng

nguyên như profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) và một số

cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20

và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua”.

Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Đánh giá vai trò của gen A20 đối với việc điều hoà bốn chức năng sinh lý

gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình apoptosis của tế bào tua

2 Đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với việc điều hòa ba tín hiệu phân tử

NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Protein A20

1.1.1 Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20

Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor induced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) là protein ức chế phảnứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm Protein A20 có chiều dài 790 axit amin

alpha-và khối lượng phân tử 89,6 kDa Protein này đóng vai trò là chất điều hoà của phảnứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclearfactor kappa B - NF-κB) [1]

Các nghiên cứu ban đầu cho thấy, A20 là một protein bảo vệ các tế bào khỏiquá trình apoptosis do TNF gây ra Đến nay, A20 đã được công nhận rộng rãi là mộtprotein kháng viêm, nó không chỉ chất ức chế con đường tín hiệu NF-κB phụ thuộcTNF, mà còn ức chế kích hoạt NF-κB để đáp ứng với Interleukin 1 (IL-1), CD40 vàtín hiệu thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition receptors - PRRs)

và kích hoạt thụ thể kháng nguyên tế bào T và tế bào B [2]

Nghiên cứu in vivo đầu tiên về vai trò của protein A20 trong sinh lý mô là nghiên cứu trên mô hình chuột thiếu hụt A20 [3] Chuột bị bất hoạt gen A20 biểu

hiện quá mẫn cảm với TNF, chết sớm do viêm đa cơ quan nghiêm trọng và suynhược cơ thể do tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn bội nhiễm [4] Ngoài

ra, protein A20 đã được chứng minh là có vai trò điều hòa các dòng tín hiệu tế bàokhác, như con đường tín hiệu Wnt, con đường điều hòa interferon (interferonregulatory factor - IRF) và phản ứng tự miễn [5-7]

1.1.2 Cấu trúc gen A20 và protein A20

Protein A20 được mã hóa bởi gen A20, gen này được đặt tên theo số bản sao

cDNA, và được xác định là gen cảm ứng với TNF trong các tế bào nội mô [8] Gen

A20 nằm tại vị trí 6q23.3 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 6 (forward strand) (Hình 1.1.A) Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm 9 exon và 8 intron (Hình 1.1.B) Trong

đó, exon 1, đầu 5’ của exon 2 và đầu 3’ của exon 9 không mã hoá protein Độ dài

của mRNA là 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến

2439 mRNA của A20 được biểu hiện ở mức cao trong các hạch bạch huyết, ống

tiêu hoá, đường hô hấp, thanh quản, khí quản và thận [2]

Hình 1.1 Cấu trúc gen A20 và protein A20 [9]

A Vị trí gen A20 trên vai dài của NST số 6

B Cấu trúc gen A20 gồm 8 exon và 9 intron

C Cấu trúc protein A20 gồm 1 miền OTU đầu N và 7 vùng ZnF đầu

C D Cấu trúc 3D của protein A20

Protein A20 có chiều dài 790 acid amin và khối lượng phân tử là 89.614 Da.A20 là protein zinc finger, cấu trúc của nó bao gồm 7 vùng E3 ubiquitin ligase(ZnF) trong đầu C của nó và 1 termed ovarian tumor ( OTU) domain trong đầu Ncủa nó (Hình 1.1.C) Protein A20 thuộc họ C64 peptidase và tồn tại trong tế bào chất

và nhân tế bào [9]

1.1.3 Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch

Protein A20 có vai trò rất quan trọng trong điều hoà hệ thống miễn dịchthông qua tác động đến các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào T vàcác đại thực bào (Hình 1.2)

Hình 1.2 Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch [10]

Khi phơi nhiễm với một số tác nhân như LPS, Endotoxin, protein A20 thamgia điều hoà ức chế chức năng các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào

T và các đại thực bào Trong TBT, sau khi phơi nhiễm với LPS, protein A20 ức chế

sự tiết một số cytokine ví dụ như TNF-α, IL-6, IL-10, ức chế biểu hiện của markertrưởng thành CD40, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα Trong tếbào B, sau khi kích thích bởi LPS, protein A20 làm tăng cường biểu hiện kháng thểIgG1 và IgG3, ức chế biểu hiện kháng thể IgM và IgA, ức chế hiểu hiện của marker

bề mặt CD69 và CD80, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα.Tương tự như vậy, đối với tế bào T và đại thực b ào, khi phơi nhiễm với LPS,protein A20 ức chế sự phosphoryl hoá phân tử tín hiệu NF-кB và tăng cường tínhiệu IкBα

1.1.2.1 Vai trò của protein A20 trong tế bào T

Ảnh hưởng của protein A20 đối với cân bằng nội môi tế bào T đã được kiểmtra bằng cách sử dụng tế bào T trưởng thành maT-cre, để quan sát cả tế bào T CD8+

và T CD4+ Thí nghiệm đã thiết kế bất hoạt gen A20 ở hai dòng chuột A20maT và

A20CD4-KO Ở chuột A20maT-KO, khoảng 80% tế bào T CD8+ và 30% của T CD4+ bị ảnh hưởng, trong khi ở chuột A20CD4-KO, 100% tế bào T CD8+ và CD4+ đều bị ảnhhưởng Các tế bào T bị tác động từ cả hai dòng chuột đã cho thấy một kiểu hình

được kích hoạt, nhưng chỉ những con chuột A20 maT-KO bị viêm gan và phổi với tỷ lệ

tế bào T CD8+ tăng Các tế bào T CD8+ được kích thích TCR từ chuột A20 maT-KO đã

tăng cường sản xuất IL-2 và IFN-γ in vitro có tương quan với tăng mức độ IFN-γ huyết thanh in vivo Mức độ TNF-α và IL-17 trong huyết thanh cũng tăng ở chuột A20 maT-KO Vì cả IFN-γ và TNF-α đều là các yếu tố gây độc cho gan, các cytokine

này bị kiểm soát qua phản ứng viêm ở gan [11]

Sự khác biệt trong việc bất hoạt gen A20 ở tế bào T giữa hai dòng chuột có

thể chỉ ra rằng tế bào T CD8+ gây viêm ở chuột A20maT-KO trong khi tế bào T CD4+

tăng cường chức năng điều tiết ở chuột A20CD4-KO Trong tế bào T CD4+, proteinA20 kiểm soát sự hoại tử và tự thực bào Đối với các tế bào T CD8+, protein A20điều hoà sự hoại tử, sự tiết IL-2 và IFN-γ, trong đó IFN-γ có thể đã góp phần vào

một kiểu hình viêm phổi và gan không xác định ở chuột A20maT-KO [11]

1.1.2.2 Vai trò của protein A20 trong tế bào B

Cân bằng nội môi tế bào B cần sự kết hợp tổng hợp các tín hiệu có nguồn gốcthụ thể TLR, thụ thể tế bào B và CD40 để kích hoạt NF-κB bởi protein A20 Để kiểm

tra chức năng của protein A20 đối với tế bào B, phương pháp bất hoạt A20-CD19-cre ở chuột đã được sử dụng Các tế bào B bất hoạt gen A20 được kích hoạt in vitro rồi đánh giá thông qua biểu hiện của marker CD80 và CD95 và sự tiết IL-6 Kết quả cho thấy số lượng tế bào B ở chuột bất hoạt gen A20 được tăng lên Ở chuột A20CD19-KO 6 tuần tuổi, số lượng các tế bào B và tế bào plasma tăng lên ở lách và các hạch bạch huyết ngoại vi Chuột A20CD19-KO tăng cường các loại kháng thể tự miễn, bao gồm kháng thểkháng dsDNA và immunoglobulin cầu thận Tuy nhiên, không có khối u ác tính nào

phát triển trên chuột A20CD19-KO, vì vậy có thể A20 cũng

có chức năng như một gen ức chế khối u trong u lympho tế bào B [12] Tóm lại,protein A20 trong các tế bào B kiểm soát biểu hiện phân tử đồng kích thích sản xuấtIL-6 và biểu hiện protein sống sót Bcl-x.

1.1.2.3 Vai trò của protein A20 trong tế bào tua

Các tế bào tua bao gồm TBT dòng tủy (hay còn gọi là cDC bao gồmCD8+DC và CD11bDC) và TBT dòng lympho (pDC) đóng vai trò quan trọng trongcân bằng nội môi miễn dịch Khi được kích hoạt, các TBT dòng tủy tạo ra các phảnứng miễn dịch thích nghi đặc hiệu với các kháng nguyên và TBT dòng lympho kiểmsoát các phản ứng chống virus Nghiên cứu tế bào trung gian CD11c-cre trên mô

hình chuột để tìm hiểu chức năng của protein A20 trong các TBT in vivo Chuột bất hoạt gen A20CD11c-KO bị rối loạn cân bằng nội môi khi các TBT dòng tủy và dòng

lympho đều giảm mạnh Việc giảm số lượng các tế bào cDC và pDC in vivo trên chuột A20CD11c-KO cho thấy protein A20 hỗ trợ sự sống sót của chúng [11]

Do vai trò rất quan trọng của gen A20 trong tế bào tua, bất hoạt gen A20 có

thể là một chiến lược để nâng cao hiệu quả phòng và điều trị bệnh dựa trên TBT đốivới bệnh ung thư và các bệnh truyền nhiễm Trên thực tế, TBT thiếu hụt protein A20tạo ra đáp ứng miễn dịch kháng thể đặc biệt tốt hơn so với các TBT không thiếu hụt

A20 [13] Ngoài ra, sự điều chỉnh làm giảm biểu hiện gen A20 trong TBT thông qua

siRNA đã cho thấy tăng cường khả năng kích thích tế bào T hiệu quả và ức chế hoạtđộng của tế bào T điều hòa làm tăng cường phản ứng miễn dịch tế bào chống lại cáctác nhân gây bệnh

1.1.4 Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis

Ngoài vai trò điều hòa tín hiệu NF-кB, protein A20 hoạt động như mộtprotein chống lại quá trình apotosis trong một số loại tế bào [14] Chức năng nàyphụ thuộc vào hoạt động của chuỗi ubiquitin Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu vềchức năng của protein A20 trong quá trình apoptosis Các thụ thể kích hoạt mộtchuỗi các tín hiệu cho quá trình chết theo chương trình bằng cách thu hút cácadaptor tạo thành một chuỗi phản ứng báo hiệu gây chết (death-inducing signalingcomplex - DISC) Protein A20 đã được xác định là một phần của DISC, là nơi

tương tác với Caspase-8 [15] Quá trình apoptosis được kích hoạt bởi sự tương táccủa các thụ thể chết (death receptor) với các phối tử của nó như TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) và Caspase-8 [14].

Các nghiên cứu chỉ ra rằng protein A20 đảo ngư ợc quá trình ubiquitin hóaqua trung gian là protein cullin-3 của Caspase-8 và ngăn chặn sự gia tăng hoạt độngcủa Caspase-8 Điều này cho thấy, A20 ức chế tín hiệu apoptosis thông qua sự nhậndiện và ức chế Caspase-8 [15] A20 làm tăng sự ubiquitin hóa liên kết với K63 củaRIP1 thông qua một cơ chế phụ thuộc vào ZnF4 Điều này cho phép RIP1 liên kếtvới vùng protease của Caspase-8, ức chế sự dimer hóa, phân tách Caspase-8, vàngăn chặn apoptosis gây ra bởi TRAIL [16] Protein A20 ngăn cản apoptosis doTNF gây ra thông qua quá trình bất hoạt c-Jun N-terminal kinase (JNK) trong tếbào Chứng tỏ tác động của protein A20 tới quá trình apotosis phụ thuộc rất lớn vàoloại tế bào như đại thực bào, tế bào B và TBT [14]

1.1.5 Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20

Biểu hiện và hoạt động của protein A20 tuân theo những quy luật chặt chẽtrong các quá trình phiên mã, hậu phiên mã và hậu dịch mã [17] Các yếu tố phiên

mã khác nhau phối hợp với nhau để điều hoà biểu hiện của protein A20 và cường độcủa tín hiệu NF-κB Trong điều kiện bình thường, ở hầu hết các tế bào (ngoại trừ tếbào lympho), protein A20 chỉ xuất hiện với lượng thấp vừa đủ Khi kích hoạt tínhiệu NF-κB thì biểu hiện protein A20 tăng lên nhanh chóng do có vị trí gắn kết với

NF-κB trong vùng promoter của gen A20 Tuy nhiên, trong tế bào lympho thì A20

được sinh ra ở mức cao Kích thích thụ thể khá ng nguyên dẫn đến giảm nhanhchóng và protein A20 xuất hiện lại sau đó Điều này cho thấy việc loại bỏ A20 dẫnđến kích hoạt NF-κB [18, 19]

Vai trò điều hoà hoạt động của protein A20 thông qua microRNA (miRs)

nhắm đích vào mục tiêu là gen A20 Trong u lympho tế bào B lớn khuếch tán

(diffuse large B cell lymphoma - DLBCL), miR-125a và miR-125b được biểu hiệnquá mức dẫn đến ngăn chặn biểu hiện A20 và tăng cường tín hiệu NF-κB Ngoài ra,miR-125b là mục tiêu phiên mã trực tiếp của NF-κB Sự mất chức năng của A20gây ra bởi miR-125 dẫn đến củng cố và kéo dài hoạt động của NF-κB miR-19b và

miR-29c cũng đã được chứng minh là nhắm vào mục tiêu gen A20, làm tăng cường

tín hiệu NF-κB và kích thích quá trình apoptosis [20]

Hoạt động của protein A20 còn được điều hòa bởi quá trình phosphoryl hóa.Sau khi kích thích bằng TNF hoặc LPS, A20 bị phosphoryl hóa, làm tăng thêm khảnăng ức chế tín hiệu của NF-κB [21] Tế bào cơ trơn được nuôi cấy trong điều kiệnglucose cao, nồng độ A20 phụ thuộc vào quá trình O-glycosylate hậu dịch mã [22]

Protein A20 còn có vai trò kháng viêm bởi chính khả năng kết hợp của chất

ức chế liên kết A20 của NF-κB (A20-binding inhibitor of NF-κB - ABIN) Tax1(Tax1-binding protein 1 - TAX1BP1) là protein kết hợp với polyubiquitin nhằm liênkết A20 với cơ chất của nó, từ đó thực hiện chức năng điều chỉnh hoạt động củaprotein A20 [23]

1.1.6 Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20

Có rất nhiều tín hiệu phân tử tham gia kích hoạt tế bào tua như: PI3K,MAPK, NF-кB và STAT Trong đó, NF-кB và STAT có liên quan chặt chẽ đến hoạtđộng viêm trong bệnh tự miễn và ung thư Hiện nay, trong y học người ta đã nghiêncứu và ứng dụng các loại thuốc ức chế NF-кB và STAT để phục vụ điều trị các loại

bệnh mạn tính và ác tính, vì gen A20 tham gia điều hòa hoạt động, mức độ thuần

thục và sự biệt hóa của tế bào thông qua hoạt động của các tín hiệu phân tử như

NF-кB và STAT

1.1.6.1 Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB

Yếu tố phiên mã NF-кB gồm một họ các nhân tố phiên mã quan trọng đốivới tín hiệu viêm, miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thứ cấp NF-кB có vai trò quantrọng trong kiểm soát sự biểu hiện của các gen chống apoptosis đối với sự tồn tạicủa tế bào Ngoài ra, NF-кB còn có vai trò đa dạng trong sự phát triển, tăng sinh,biệt hoá và trao đổi chất Hoạt động của NF -кB có ảnh hưởng đến nhiều quá trìnhtrong tế bào Do đó, sự điều hòa các con đường tín hiệu NF -кB là một yếu tố rấtquan trọng giúp duy trì sự cân bằng nội môi [24] Một số cơ chế điều hoà tín hiệuNF-κB để duy trì cân bằng nội mô đã được nghiên cứu tìm hiểu Trong đó, A20 đượcbiết đến là một protein đóng vai trò chính trong việc chấm dứt tín hiệu NF-κB [24]

Việc điều hòa tín hiệu NF-κB là một bước quan trọng trong việc kiểm soát vàchấm dứt phản ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng Các dòng tín hiệu NF-κB được kiểm soát chặt chẽ bởi quá trình ubiquitin hóa, ngoài ra có một số protein khác gồm protein A20 gây trở ngại cho các quá trình này [25] Protein A20 thực hiện vai trò là một enzyme chỉnh sửa quá trình ubiquitin hóa có hoạt tính loại

bỏ chuỗi ubiquitin ở đầu amino [26] Cơ chất đầu tiên xác định cho hoạt động deubiquitinase của A20 là protein tương tác với thụ thể RIP1 (kinases receptor-interacting protein 1) Khi thụ thể của TNF được kích hoạt thì RIP1 được

polyubiquitin hóa ở vị trí lysine 63 (K63) bởi ubiquitin E3 kết nối protein ức chế tế bào apoptosis (cIAP) 1 và 2 (cellular inhibitor apoptosis protein) [27] Protein A20 loại bỏ các chuỗi polyubiquitin liên kết với K63, ngăn chặn sự tương tác của RIP1 với yếu tố điều hoà NF -κB Sau đó, A20 thêm chuỗi polyubiquitin liên kết với K48 vào RIP1, dẫn đến quá trì nh thoái hóa [26] Bằng cách này, A20 ức chế tín hiệu NF-

κB do TNF gây ra bởi sự phân giải tuần tự và sự thoái hóa RIP1 qua trung gian ubiquitin

Protein A20 ức chế hoạt động của NF -κB khi được kích hoạt bởi cáccytokine như TNF (Hình 1.3) hoặc IL-1 hoặc LPS (thụ thể của TLR4) (Hình 1.4)bằng cách loại bỏ ubiquitin của các yếu tố liên quan đến thụ thể của TNF, thụ thểcủa IL-1 hay thụ thể của TLR4 [28]

Hình 1.3 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong con đường tín hiệu TNFR1 [28]

IKK là IκB kinase; RNF11 là ring finger protein 11; TAX1BP1 là protein liên kết với Tax1; TNFR 1 là thụ thể TNF 1).

A20 được cảm ứng bởi NF-κB trong con đường TNFR1 và điều hoà ngược

con đường tín hiệu này Phân tử protein chuyển đổi A20 là TAX1BP1 được

phosphoryl hóa tại vị trí Ser593 và Ser624 bởi IKKα tạo ra phức hợp chỉnh sửa ubiquitin A20 và cần thiết cho các tương tác giữa TAX1BP1, Itch, RNF11 và A20 Phức hợp chỉnh sửa ubiquitin A20 ức chế quá trình gắn chuỗi ubiquitin với RIP1 để chấm dứt dòng tín hiệu NF-κB phía sau của TNFR1

Hình 1.4 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong các đường hiệu IL-1R/TLR4 [28]

Gen A20 được cảm ứng bởi dòng tín hiệu NF -κB của IL-1R/TLR4.

TAX1BP1 kết hợp với A20 để phá vỡ sự tương tác giữa E3 ligase TRAF6 và cácenzyme E2 Ubc13 và UbcH5c khi kích thích IL-1R/TLR4 Sau đó, protein A20 liênkết các chuỗi polyubiquitin thông qua liên kết với K48 trên các enzyme E2 để kíchhoạt sự phân hủy các enzyme này (TAX1BP1 là protein liên kết với Tax1)

1.1.6.2 Protein A20 điều hoà tín hiệu STATs

Các nhân tố chuyển đổi và hoạt hóa tín hiệu phi ên mã - STATs (SignalTransducer and Activator of Transcription) là họ các protein phiên mã nội bào điềuhoà nhiều chức năng khác nhau của tế bào như: sự tăng sinh, biệt hoá và chết theo

chương trình Chúng được kích hoạt bởi các enzyme Janus kinase (JAK) liên kết vớithụ thể màng Có bảy thành viên trong họ protein STAT đã được xác định bao gồmphân tử tín hiệu STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5 (STAT5A và STAT5B) vàSTAT6 [29].

Hoạt động của các tín hiệu phân tử STAT tác động tới quá trình phiên mã và

di chuyển của các gen chức năng từ tế bào chất vào nhân để điều hòa các q uá trìnhsinh lý của tế bào Tín hiệu hoạt động của phân tử STATs được chỉ ra có liên quanđến quá trình tăng sinh, thuần thục, biệt hóa và chết theo chương trình apoptosis của

tế bào [30, 31] Như vậy, STATs có vai trò rất quan trọng ảnh hưởng đến toàn bộ các

tổ chức cơ thể, và liên quan đến nhiều chuỗi phản ứng truyền tín hiệu tế bào STAT1

và STAT2 ức chế ảnh hưởng của IFN -g, trong khi STAT4 và STAT6 điều hoà hoạtđộng của IL -2 và IL-4 Nghiên cứu trên chuột thiếu hụt STAT1 hay STAT2 cho thấychúng nhạy cảm với các vi khuẩn gây bệnh Đột biến trên gen STAT1 ở người dẫntới giảm khả năng chống chịu với các bệnh nhiễm trùng do nấm hay vi khuẩn [32].Ngoài ra, STAT còn tham gia kiểm soát quá trình sinh trưởng phát triển của tế bào.Trong tế bào ung thư, con đường tín hiệu tế bào diễn ra một cách khác thường.Chuột thiếu STAT1 thường nhạy cảm hơn với các tác nhân hoá học tạo khối u vàkích thích khối u phát triển Các tế bào ung thư ở người thường mất phản ứng củaSTAT đối với IFN-g dẫn đến ngăn cản sự phát triển [33]

Sự mất kiểm soát của con đường tín hiệu này thường gặp ở các khối u

nguyên phát làm tăng cường khả năng sống sót của khối u và ức chế miễn dịch Các

nghiên cứu bất hoạt gen STAT đã cho thấy các protein STAT có liên quan đến chức

năng của hệ miễn dịch và đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì khả năng miễn dịch và giám sát khối u Theo Lee và cộng sự, cơ chế gây bệnh viêm khớp ở

chuột bất hoạt A20 trên tế bào myeloid (chuột A20myelKO) cho thấy các tổn thương viêm suất hiện sớm [33]

Trong các tế bào tuỷ myeloid, protein A20 ức chế STAT1 nhưng không điềuhoà STAT3, cả trong điều ki ện không được kích thích và được kích thích IFN-γ

hoặc IL-6 Sự tăng cường phiên mã gen STAT1 khi không có gen A20 được chứng

minh là có phụ thuộc vào con đường tín hiệu JAK-STAT Hơn nữa, ức chế JAK

trong in vivo dẫn đến giảm đáng kể tình trạng viêm, cả về lâm sàng và mô bệnh học.

Những dữ liệu này cho thấy một sự tương tác quan trọng giữa các tế bào myeloid và

các tế bào cư trú tại các vị trí cố định được quy định bởi A20 Trong trường hợp không có gen A20, STAT1 tăng cường biểu hiện nhưng không biểu hiện STAT3, dẫn

đến tăng cường viêm phụ thuộc STAT1 Do đó, protein A20 hoạt động như một chấtđiều hòa nội sinh mới của STAT1 giúp ngăn ngừa sự khởi phát của quá trình viêm[34] Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn về cơ chế A20 ảnhhưởng đến các quá trình sinh lý tế bào thông qua con đường tín hiệu STAT

1.1.7 Vai trò của protein A20 đối với một số bệnh tự miễn và ung thư

Gen A20 đã được biết đến như là một locus nhạy cảm đối với các bệnh lý tự

miễn như viêm khớp dạng thấp, viêm khớp tự phát, ban đỏ lupus, viêm đại tràng,bệnh vẩy nến, bệnh tiểu đường tuýp I, và bệnh đa xơ cứng Các điểm đa hình tr ên

gen A20 có ảnh hưởng đến các yếu tố điều tiết sự biểu hiện protein A20 [35] Các đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism - SNP) trên gen A20 dẫn đến

giảm biểu hiện gen và có liên quan đến tăng nguy cơ mắc bệnh mạch vành ở bệnh

nhân tiểu đường tuýp II Ngoài ra, nhiều đa hình ở vùng gen A20 có liên quan với

một số bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp, bệnh lupus ban đỏ hệ thống và bệnh

Crohn Do vậy, gen A20 có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các phản ứng viêm

và là yếu tố quyết định quan trọng đối với nhiều bệnh tự miễn Hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt

động và quy định của gen A20 có thể tạo cơ sở cho sự phát triển của các phương pháp trị

liệu kháng viêm mới [36]

Trong các loại tế bào miễn dịch, gen A20 còn được ghi nhận liên quan đến

các bệnh ung thư do chúng có khả năng chống lại quá trình apoptosis Các nghiên

cứu di truyền đã xác định được các đột biến điểm và đột biến mất đoạn trên gen A20

ở tế bào lymphoma B, bao gồm lymphoma MALT, u lympho Hodgkin và u lympho nang Bất thường di truyền này làm thay đổi cấu trúc phân tử của A20 và ảnh hưởngđến chức năng hoạt hóa con đường NF-кB [37] Protein A20 biểu hiện rất mạnh trong tế bào gốc glioma, sự thiếu hụt A20 làm giảm sự sống của tế bào gốc glioma

và liên qu an đến sự phát triển của các khối u Protein A20 cũng biểu hiện rất cao trong các dòng tế bào ung thư vú [38] Ở các loại tế bào và giai đoạn phát triển khácnhau của các khối u mà A20 có thể

hoạt động như một chất ức chế hoặc tăng cường sự phát triển của các khối u Nhưvậy, protein A20 có vai trò khác nhau trong các loại tế bào khác nhau Để tìm hiểu

rõ hơn về các chức năng sinh lý khác nhau của A20 thì mô hình nghiên cứu trênđộng vật là rất cần thiết

Trong nhiều trường hợp ung thư, các loại tế bào trình diện kháng nguyênkhông phát huy được chức năng chủ đạo của nó, vì thế kháng nguyên ung thư khôngđược trình diện tới các tế bào lympho T và lympho B Điều này gây ra ức chế đápứng miễn dịch và dẫn tới sự phân chia không kiểm soát của các tế bào ung thư.Ngày nay đã sử dụng liệu pháp tế bào NK, TBT, đại thực bào và một số tế bào miễndịch khác trong điều trị ung thư Mặc dù vậy, liệu pháp TBT vẫn chiếm ưu thế hơntrong điều trị ung thư vì một ưu điểm nổi trội mà các tế bào trình diện kháng nguyênkhác không có, đó là TBT là tế bào có khả năng trình diện kháng nguyên mạnh nhấttới tế bào lympho T Các TBT khi thuần thục có khả năng giải phóng các cytokine

và chemokine gây viêm để thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho T và lympho B thành tếbào trưởng thành Khác với đại thực bào hay tế bào B, TBT có khả năng di chuyểnlên tuyến yên để tiêu diệt các tế bào ung thư Vì vậy, nghiên cứu về vai trò của gen

A20 để bất hoạt hoặc tăng cường chức năng của gen này và đưa vào TBT trư ởng

thành là một liệu pháp điều trị ung thư hứa hẹn nhiều thành công

1.1.8 Tình hình nghiên cứu về protein A20 trên thế giới và ở Việt Nam

Các nghiên cứu trên thế giới

Protein A20 không những được nghiên cứu trên chuột mô hình mà còn đượctìm hiểu trên các loại tế bào miễn dịch trên bệnh nhân ung thư và bệnh tự miễn

Chuột thiếu A20 trong các tế bào myeloid của chúng (A20Myel-KO) biểu hiện bệnhviêm đa khớp tự phát với nhiều đặc điểm giống với bệnh viêm khớp dạng thấp ởngười Các đại thực bào từ những con chuột này cho thấy hoạt hóa bền vững củaNF-κB khi đáp ứng với LPS, điều này phù hợp với vai trò của A20 như là một chất

ức chế tín hiệu NF-κB Các đại thực bào thiếu protein A20 cũng biểu hiện mức độ

cao hơn của các gen phụ thuộc STAT1 Ức chế tín hiệu JAK-STAT in vivo với chất

ức chế JAK tofacitinib đã được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn tình trạngviêm nhiễm ở chuột A20Myel-KO Đáng chú ý là, sự thiếu hụt A20 của các tế bào có

nguồn gốc tủy xương cũng được chứng minh là thúc đẩy quá trình tạo xươ ng, chothấy vai trò của A20 trong việc điều chỉnh chất kích hoạt thụ thể của phân tử tín hiệuNF-κB [20].

A20 điều hòa ngược hoạt động và sự biệt hóa của TBT thông qua các tín hiệuphân tử như NF-кB và STATs [39] Sự gắn kết giữa thụ thể TLRs trên bề mặt tế bàovới các phối tử đặc hiệu của chúng gồm các kháng nguyên có nguồn gốc từ

vikhuẩn, các cytokine gây viêm, các yếu tố phóng xạ kích hoạt tín hiệu phân tử này

[40] Đột biến gen, mất đoạn gen hoặc bất hoạt gen A20 xảy ra trong những bệnh

nhân ung thư máu như ung thư bạch cầu tủy, ung thư bạch cầu dòng lympho và ung

thư hạch [41] Bên cạnh đó, A20 góp phần ngăn cản sự phát triển và khả năng di căn của một số loại ung thư, như ung thư đại tràng [5] và ung thư gan [42] Gen A20

tham gia điều hòa sự phát triển của bệnh bạch cầu ác tính dòng lympho tế bào T (T

-lineage Acute Lymphoblastic Leukaemia, T-ALL) Khi sự biểu hiện gen A20 giảm

dẫn đến tình trạng nghiêm trọng của bệnh ở các bệnh nhân bị T-ALL [41] Các tínhiệu phân tử tham gia điều hòa quá trình bệnh sinh của T-ALL bao gồm phân tửSTAT3 và NF-κB Ngược lại, một số khảo sát trên mô hình động vật cho thấy những

con chuột mang khối ung thư khi bị bất hoạt gen A20 bằng cách sử dụng siRNA, kết

quả là khối u không phát triển do các tế bào ung thư bị tăng cường quá trìnhapoptosis [43]

Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam đ ến nay, chưa có nhiều nghiên cứu phân tích vai trò của gen

A20 đối với các con đường tín hiệu và hoạt động sinh lý tế bào Năm 2015, nhóm nghiên cứu của TS Nguyễn Thị Xuân đã tiến hành nghiên cứu biểu hiện gen A20 trên mô hình chuột thí nghiệm khi xử lý bằng LPS Kết quả cho thấy, gen A20 tham

gia ức chế biểu hiện phân tử đồng kích thích MHC II và ức chế sự giải phóng ra cáccytokine gây viêm cũng như ngăn chặn hoạt động và biệt hóa của các tế bào lympho

T Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chuột đã bất hoạt gen A20 trong TBT bị viêm nhiễm

ở nhiều cơ quan trong cơ thể [40] Bên cạnh đó, gen A20 còn tham gia ngăn chặn

bệnh viêm đa dây thần kinh huỷ myelin trong não thông qua hoạt động tự miễn Cơ

chế phân tử đã được chỉ ra là gen A20 ức chế các protein như: NF-κB, MAPK, Wnt, NFAT và STAT [39, 40] Nhiều nghiên cứu khác cho thấy ảnh hưởng của gen A20

ức chế phản ứng viêm và ức chế sự phát triển của

ung thư, nhưng có ít nghiên cứu về vai trò của gen A20 và các cơ chế phân tử liên

quan điều hòa các quá trình sinh lý tế bào như sự di cư, thực bào và apoptosis.Những hoạt động sinh lý này cũng ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển và khả năng

di căn của ung thư

1.2 Tế bào tua

1.2.1 Khái niệm và lịch sử phát hiện tế bào tua

Tế bào tua (Dendritic cells - TBT) là các tế bào trình diện kháng nguyênchuyên nghiệp (antigen-presenting cells - APCs) để tạo ra các phản ứng miễn dịch.Các TBT kết hợp và truyền thông tin từ môi trường bên ngoài đến các tế bào của hệthống miễn dịch Tế bào tua không chỉ quan trọng trong việc tạo ra các phản ứngmiễn dịch bẩm sinh, miễn dịch tập nhiễm mà còn điều chỉnh các loại đáp ứng miễndịch qua trung gian tế bào T Gần đây, y học hiện đại đã áp dụng các phương pháptrị liệu miễn dịch dựa trên TBT để chống lại ung thư và các bệnh truyền nhiễm [44]

Tế bào tua được mô tả lần đầu tiên vào năm 1970 bởi Ralph Steinman là các

tế bào có hình đuôi gai tập trung trong lá lách Do số lượng không nhiều của cácTBT, nên các nghiên cứu về TBT rất khó khăn Năm 1980, TBT được định nghĩađầy đủ là tế bào trình diện kháng nguyên APCs chuyên nghiệp Sau đó, các nhànghiên cứu đã tìm ra cách tạo ra số lượng lớn TBT từ tế bào tiền tủy xương CD34+hoặc từ bạch cầu đơn nhân CD14 + trong ống nghiệm Với khả năng nhân lên củaTBT trưởng thành trong ống nghiệm, các nghiên cứu về cơ chế tương tác của TBTvới hệ thống miễn dịch dần được sáng tỏ Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng bắt đầuthử nghiệm các phương pháp trị liệu TBT trong điều trị bệnh [44]

1.2.2 Đặc điểm sinh học của tế bào tua

Các tế bào tua dễ dàng tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh doTBT có mặt trong các cơ quan lympho như lách và hạch bạch huyết, biểu mô da,ống tiêu hóa, ống hô hấp và trong dịch kẽ của hầu hết các cơ quan nhu mô Ở các cơquan chứa TBT, sau khi được kích hoạt TBT xử lý kháng nguyên thông qua khảnăng thực bào và trình diện các kháng nguyên thông qua các phân tử MHC (major

histocompatipility complex) MHC là phân tử phức hợp hòa hợp mô chủ yếu nằmtrên bề mặt tế bào Tế bào tua tăng giải phóng các cytokine và các chemokine gâyviêm để thu hút các lympho T [44] Đặc điểm hình thái quan trọng của TBT là sựhiện diện của lớp màng được trải r a từ thân tế bào chính (Hình 1.5), tương tự nhưcác tua trên tế bào thần kinh nên được đặt tên là “dendritic cell”, bắt nguồn từ

“dendron” trong tiếng Hi Lạp, nghĩa là cây [45]

Hình 1.5 Tế bào tua chuột phân lập từ lách [46]

Các tế bào tua là các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp nhất bởi

vì chúng là những tế bào có khả năng tạo ra các phản ứng miễn dịch chính cho cơthể, do đó cho phép thiế t lập trí nhớ miễn dịch Hình 1.6 phác hoạ bốn giai đoạnphát triển của TBT bao gồm: (a) tiền thân tủy xương; (b) các TBT tiền thân ở máu

và bạch huyết cũng như các mô bạch huyết, và khi nhận ra mầm bệnh, giải phóngmột lượng lớn cytokine, ví dụ: IFN -α, do đó hạn chế sự lây lan của mầm bệnh; (c)TBT chưa trưởng thành cư trú trong mô, có khả năng nội bào và thực bào cho phépbắt giữ kháng nguyên; và (d) TBT trưởng thành, hiện diện trong các cơ quan bạchhuyết thứ cấp, biểu hiện mức độ cao của các phân tử đồng kích thích cho phép trìnhdiện kháng nguyên Các TBT tạo thành một hệ thống các tế bào phức tạp, trong cácđiều kiện môi trường vi mô khác nhau, có thể tạo ra các trạng thái tương phản như

là đáp ứng miễn dịch và đối kháng [44]

Hình 1.6 Vòng đời của các tế bào tua [44]

Tế bào tua xâm nhập vào các mô dưới dạng TBT chưa trưởng thành Chúng

có thể bị kích hoạt trực tiếp (ví dụ như bởi virus) và tiết các cytokine (ví dụ nhưIFN), từ đó có thể kích hoạt bạch cầu ái toan, đại thực bào và tế bào NK Sau khi bắtgiữ kháng nguyên, các TBT chưa trưởng thành di chuyển đến các cơ quan của hệbạch huyết Khi trưởng thành, TBT trình diện các phức hợp phù hợp tổ chức MHC

để lựa chọn các tế bào lympho đặc hiệu kháng nguyên Các tế bào T được kích hoạt

sẽ giúp các TBT trong quá trình trưởng thành cuối cùng, cho phép tăng sinh và biệthóa tế bào lympho Các tế bào lympho T sau khi được kích hoạt sẽ di chuyển đếncác mô bị tổn thương và hỗ trợ tiết ra các cytokine, cho phép kích hoạt các đại thựcbào, tế bào NK và bạch cầu ái toan Cuối cùng các tế bào T tiến hành ly giải các tếbào bị nhiễm trùng hoặc các tế bào ung thư Các tế bào B được kích hoạt sau khitiếp xúc với các tế bào T và TBT sẽ di chuyển đến các khu vực nơi chúng phát triểnthành các tế bào plasma và sản xuất ra các kháng thể trung hòa mầm bệnh Sau khitương tác với các tế bào lympho và thực hiện chức năng miễn dịch, TBT được chorằng sẽ chết thông qua quá trình apoptosis [44]

1.2.3 Chức năng tế bào tua

Tế bào tua có hai chức năng chính là trình diện kháng nguyên và điều hoà miễn dịch

Trình diện kháng nguyên

Chức năng quan trọng nhất của tế bào tua là khả năng trình diện khángnguyên và được coi là “các APC chuyên nghiệp” Tế bào tua đóng vai trò hoạt hóađáp ứng miễn dịch bẩm sinh và tạo ra đáp ứng miễn dịch thứ cấp cũng như ghi nhớmiễn dịch thông qua khả năng trình diện kháng nguyên tới tế bào T và sự giải phóng

ra các cytokine gây viêm [44, 47] Do đó, các TBT không chỉ quan trọng trong cácphản ứng miễn dịch bẩm sinh, mà còn có ý nghĩa quan trọng đối với việc

tạo ra khả năng miễn dịch thứ cấp, cũng như điều hòa các phản ứng miễn dịch tế bào T

Điều hoà miễn dịch

Tế bào tua cũng là nhân tố quyết định điều hòa miễn dịch nếu chúng nhậndiện và xử lý kháng nguyên như protein nội sinh hoặc ngoại sinh Tương tự như xử

lý kháng nguyên ngoại sinh, các TBT tiếp xúc với kháng nguyên thông qua khảnăng thực bào và mất đi khả năng kết dính Tuy nhiên, sự biểu hiện của TBT thuầnthục khi kết hợp với protein nội sinh hoặc ngoại sinh là hoàn toàn khác nhau [44]

Khi tiếp xúc với kháng nguyên ngoại sinh, tế bào tua trưởng thành có các đặcđiểm như sau: tăng biểu hiện các dấu ấn bề mặt như các phân tử MHC, các phân tửđồng kích thích như CD80, CD86, CD40 và CD54; tăng giải phóng các cytokine vàcác chemokine gây viêm như interleukin (IL-12, IL-6), tumor necrosis factor alpha(TNF-α) và C-C chemokine receptor type 7 (CCR-7) Sau đó, TBT trưởng thành dichuyển đến các cơ quan lympho ngoại vi để trình diện kháng nguyên tới tế bào T vàthúc đẩy quá trình hoạt hóa tế bào lympho T và B thành các tế bào hoạt động đápứng miễn dịch [44]

Các tế bào tua khi phơi nhiễm với kháng nguyên nội sinh dẫn đến tăng cườnggiải phóng các cytokine kháng viêm (IL-10 và transforming growth factor beta -TGF-β), thúc đẩy hoạt hóa tế bào T điều hòa (T regulatory - Treg) gây hiệu ứngmiễn dịch đối kháng Các tế bào ung thư sử dụng một trong những cách này

làm ức chế sự đáp ứng miễn dịch để lẩn tránh hệ thống miễn dịch và phân chia nhanh trong cơ thể [48].

Hình 1.7 Tế bào tua và chức năng điều hòa miễn dịch [46]

Khi cơ thể không bị viêm nhiễm hoặc không có các tín hiệu nguy hiểm khác, thì TBT ở trạng thái ổn định, chúng biểu hiện MHC lớp I và II, và loại bỏ các tế bào

T điều hoà Khi bị viêm nhiễm hoặc cơ thể bị tổn thương thì TBT được kích hoạt, tăng số lượng và di cư vào mô bạch huyết (lymphoid), nơi chúng truyền tín hiệu chocác tế bào T đặc hiệu kháng nguyên do các TBT trình diện để bắt đầu phản ứng miễn dịch [46]

1.2.4 Phân loại tế bào tua

Tế bào tua được phân loại thành 2 nhóm chính là TBT điển hình (classicalDCs) và TBT không điển hình (non-classical DCs) Hai nhóm này biểu hiện các thụthể TLR khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả năng tương tác v ới cácmầm bệnh [49]

Tế bào tua điển hình (classical DC - cDC)

Các tế bào tua điển hình (hay còn gọi là TBT dòng tuỷ) có thể được tìm thấytrong các cơ quan như mô bạch huyết (lách và hạch bạch huyết) và mô không phải

bạch huyết Tế bào tua điển hình được chia thành 2 n hóm được đặc trưng bởi sự biểu hiện của CD8a và CD103 hoặc CD11b [50].

CD8a+ và CD103+ cDCs: được phát hiện và mô tả đầu tiên bởi Shortman vàSteinman ở các cơ quan bạch huyết của chuột Tế bào tua có biểu hiện CD103 cũngtồn tại trong các mô ngoài lympho và không biểu hiện CD8+ [51] Tế bào tua cóbiểu hiện CD8a+ và CD103+ là nhóm TBT có đặc điểm tốt nhất về kiểu hình và biểuhiện gen, chúng được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa [52]

CD11b+ cDCs: là những TBT điển hình, được tìm thấy nhiều nhất trong các

cơ quan bạch huyết và mô ngoài lympho (ngoại trừ tuyến ức) Trái ngược vớiCD8a+ và CD103+cDCs, mật độ CD11b + cDC được xác định là không đồng nhất,nên dễ nhầm với các loại tế bào khác như đại thực bào hay tế bào đa nhân trungtính Các nghiên cứu cho thấy, CD11b+ cDC có thể được phân tách thêm như CD4

và các phân tử bám dính tế bào nội mô (Endothelial cell-selective adhesionmolecule - ESAM) [50]

Tế bào tua không điển hình (non-classical DC)

Nhóm tế bào tua không điển hình tiếp tục phân chia thành nhóm nhỏ hơn làTBT có nguồn gốc từ tế bào mono (Monocyte-derived DCs - moDCs), TBTplasmacytoid (plasmacytoid DCs - pDC) và tế bào Langerhans

Tế bào tua nguồn gốc từ tế bào mono: Do viêm hoặc nhiễm trùng, các cơquan lympho (lymphoid) và không phải lympho (nonlymphoid) có thể chứa TBTbắt nguồn từ tế bào mono xâm nhập và được gọi là các TBT có nguồn tế bào monohoặc các TBT viêm (inflammatory DCs - iDCs) Các moDCs rất khó phân biệt kiểuhình với các cDCs vì chúng có chung các kiểu biểu hiện tương tự như MHC II,CD11b và CD11c Đến nay, đã xác định được moDC biểu hiện CD64, thụ thể Fc-gamma 1 (FcgRI) [53]

Tế bào tua plasmacytoid (pDC): Các TBT dòng lympho chủ yếu có mặt ở các

cơ quan bạch huyết và rất ít ở các cơ quan khác TBT plasmacytoid được tìm thấytrong máu và các cơ quan lympho ngoại vi pDC có hình thái bề mặt đặc trưng,trong đó có khoang tiết phát triển cao [54] Khi các cơ quan bị viêm, pDC sẽ đượctập trung và di chuyển đến những nơi bị viêm và thực hiện chức năng của mình Tếbào pDC được xác định lần đầu tiên ở người năm 1999 và ở chuột năm

2001 Đến nay, vai trò của các TBT dòng lympho với chức năng chính là trình diệnkháng nguyên và thúc đẩy hoạt hóa tế bào T tạo ra đáp ứng miễn dịch vẫn đangđược nghiên cứu [50].

Tế bào Langerhans (Langerhan cells - LCs): là một quần thể TBT duy nhấtcủa các thực bào đơn nhân bị hạn chế ở lớp da biểu bì Được xác định vào thế kỷ

19, các tế bào này đã thu hút sự chú ý, đặc biệt sau khi phát hiện ra TBT lách [44]

Các tế bào CD11c+cDC thể hiện sự nhận diện kháng nguyên, sản xuấtcytokine và trình diện kháng nguyên ở mức cao hơn so với các pDC và chúng là tácnhân mạnh mẽ của tế bào T trong phản ứng nhiễm trùng Trong khi, pDC có xuhướng trung gian dung nạp miễn dịch hơn là miễn dịch [50] Tế bào pDC có nguồngốc từ tiền tế bào bạch huyết , là các tế bào biểu hiện CD11clow B220high và là nơisản xuất chính của interferon loại I (IFN) để đáp ứng với mầm bệnh Ngoài ra, cáccDC thể hiện khả năng thực bào cao, trong khi pDC thực bào kém và không cótrong các mô ngoại biên trong điều kiện không viêm [55] Sự tập hợp thêm pDCthường thấy trong nhiễm virus và một số bệnh tự miễn như bệnh lupus ban đỏ hệthống [50]

1.2.5 Các quá trình sinh lý tế bào tua

1.2.5.1 Sự biệt hoá của tế bào tua

Các loại tế bào mono hoặc tế bào tủy xương có thể biệt hóa thành các loạiTBT khác nhau khi tiếp xúc với các cytokine khác nhau Các TBT trưởng thành từ

sự tiếp xúc với các loại kháng nguyên khác nhau thì có các chức năng khác nhau,dẫn đến các đáp ứng miễn dịch khác nhau (Hình 1.8) [44]

Hình 1.8 mô tả từ tế bào monocyte/ tế bào tuỷ xương chuột, khi được biệthóa bởi GM-CSF sẽ tạo thành tế bào tua dòng CD11b+DC, hoặc là khi biệt hoá bởiFLT3, các tế bào này biệt hóa thành các quần thể TBT như CD11b+DC, CD8+DChay pDC Khi các nhóm TBT này gặp các phối tử TLR (ví dụ như LPS) hoặc cáccytokine (như IL-4, IFN-α, TNF hay IL-15), các tế bào này sẽ chuyển thành cácTBT trưởng thành để kích hoạt tế bào T và thực hiện chức năng của mình

Hình 1.8 Sự biệt hóa đa dạng của tế bào tua [44]

1.2.5.2 Sự trưởng thành của tế bào tua

Sự trưởng thành của tế bào tua là một quá trình liên tục được bắt đầu ở tế bàongoại vi và trưởng thành trong quá trình tương tác của TBT và tế bào T Nhiều yếu

tố tác động vào sự điều hòa trưởng thành của TBT trong quá trình chuyển đổi từ các

tế bào chưa trưởng thành sang TBT trình diện kháng nguyên trưởng thành như: (a)các phân tử liên quan đến mầm bệnh như LPS, DNA của vi khuẩn và RNA chuỗikép; (b) sự cân bằng giữa các tín hiệu tiền viêm và chống viêm trong vi môi trường,bao gồm TNF, IL-1, IL-6, IL-10, TGF-b và prostaglandin; và (c) Tín hiệu xuất phát

từ tế bào T [44]

Quá trình trưởng thành của tế bào tua còn bị ảnh hưởng bởi các yếu tố nhưsau: (a) mất các thụ thể nội tiết/thực bào; (b) điều hòa lại các phân tử CD40, CD58,CD80 và CD86; (c) thay đổi hình thái; (d) thay đổi trong các khoang lysosome với

sự điều hòa của CD68 và điều chỉnh lại protein màng liên kết lysosome của TBT; và(e) thay đổi trong các phân tử MHC II Những thay đổi về hình thái trong sự trưởngthành của TBT như mất cấu trúc gắn kết, tái cấu trúc bộ khung tế bào và tính linhđộng của tế bào cao [44]

Như vậy, sự trưởng thành của tế bào tua được đánh giá bởi khả năng biểu

hiện các phân tử chỉ thị bề mặt như MHC II, CD40 và CD86 Phức hợp tương thích

mô chính là các protein trình diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào, đóng vai tròquan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như những cơ chế tương tácgiữa các tế bào Các MHC lớp I trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho T CD8;MHC lớp II cho tế bào lympho T CD4 Tuy khác nhau về đối tượng hoạt động,nhưng hai lớp phân tử MHC có cấu trúc phân tử gần giống nhau (đều là các loạiglycoprotein màng) Các phân tử MHC lớp II chỉ có trên một số loại tế bào của hệmiễn dịch, như các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp gồm TBT và đạithực bào hoặc các tế bào lympho B đã hoạt hoá Các tế bào này thực bào các khángnguyên, biến đổi chúng thành các đoạn peptide trước khi gắn với MHC II rồi trìnhdiện trên bề mặt tế bào [56]

CD86 là phân tử điều hoà quan trọng có trên bề mặt của các loại tế bàolympho T khác nhau và các tế bào trình diện kháng nguyên như TBT CD40 là phân

tử tương tác với phối tử của CD40 trên bề mặt tế bào T hỗ trợ (T-helper) Mối tươngtác giữa hai phân tử này có vai trò thiết yếu trong việc tồn tại của các tế bào lympho

B trưởng thành mang trí nhớ miễn dịch [57] Do đó, để nghiên cứu ảnh hưởng củaprotein A20 đối với sự trưởng thành của TBT thì cần tiến hành đánh giá so sánhmức độ biểu hiện của các marker bề mặt như: MHC II, CD40 và CD86

1.2.5.3 Sự di cư của tế bào tua

Sự di cư của tế bào là một quá trình quan trọng quyết định sự phát triển vàtồn tại của các cơ thể đa bào Trong tất cả các giai đoạn hình thành và phát triển củacác mô cũng như trong các phản ứng miễn dịch, đều cần đến sự di chuyển chính xáccủa tế bào theo một hướng nhất định đến một nơi cố định thông qua các tín hiệu hoáhọc đặc trưng [58] Các lỗi xảy ra trong quá trình này dẫn đến các hậu quả nghiêmtrọng mang tính bệnh lý như là các bệnh về máu hay hình thành khối u Sự hiểu biết

về cơ chế di cư tế bào có thể dẫn đến việc phát triển các chiến lược trị liệu mới trongkiểm soát các tế bào khối u xâm lấn [58]

Trong quá trình phát triển phôi cũng như sau sinh, các TBT nguyên thuỷ tậptrung ở da, bề mặt niêm mạc và ở hầu hết các tổ chức cơ quan của cơ thể, do đóTBT chưa trưởng thành là một nguồn dự phòng của hệ miễn dịch Các TBT chưa