Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm tt

Tuy nhiên, việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới được bắt đầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene từ một số chủng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN CẨM HÀ

NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG

SHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƯỚNG LÀM NGUYÊN

LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE,

MỸ PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 9 42 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2020

Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: GS TS Đặng Diễm Hồng

Viện Công nghệ Sinh học

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: …

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …, ngày … tháng … năm 202…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ (09 bài)

1 Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng, Đánh

giá mức độ an toàn và tác dụng của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đến sự tăng cholesterol của lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở động vật thực nghiệm

Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48

2 Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham

Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different

fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for

exploitation of squalene and omega-3 fatty acids Journal of Phycology, 2018, 54 (4),

550-556 (SCI, Q1; IF-3,0)

3 Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol của

squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 Báo cáo toàn văn tại Hội thảo

Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018 tại Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội

26.10.2018, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ; 2018, 589-594

4 Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang

Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by

heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei Academia Journal of

Biology, 2017, 39(3), 449-458

5 Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene

promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of

liver X receptor (LXR) α and β Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2;

IF-1,7)

6 Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hoàng Thị Lan Anh,

Ngô Thị Hoài Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam: Biodiesel và

tận thu các sản phẩm phụ (acid béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs, glycerol và

squalene) trong quá trình sản xuất biodiesel Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60

7 Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi

Lan Anh and Dang Diem Hong, Extraction of squalene from Vietnam heterotrophic marine microalga Proceeding of The 4 the Academic conference on natural Science for

Yong Scientists, Master & PhD Student from Asian Countries 15-18 December, 2015 -

Bangkok, Thailand, 2016, 46-56

8 Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Optimization of

culture conditions and squalene enrichment from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 for squalene production Research Journal of

Biotechnology, 2016, 14 (2), 337-346 (SCI-E)

9 Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nghiên cứu tác

dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp trên tế

bào Hep G2 Tạp chí Dược liệu, 2016, 21 (4), 270 -274

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt đới rất đa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược Vi tảo với ưu điểm chính là giàu dinh dưỡng, kích thước nhỏ (< 10 µm), dễ tiêu hóa, không độc, có tốc độ sinh trưởng

và sức chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường, được coi là mắt xích đầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn ở hệ sinh thái dưới nước Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người và động vật như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, các acid béo không bão hòa đa nối đôi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) đặc biệt là squalene

Squalene- một tripterpene tự nhiên là tiền chất steroid của động, thực vật thường được sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm và y học Squalene được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

mỹ phẩm với tác dụng chống khô da và làm mềm da, bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng và tia UV gây ra Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm Squalene cũng là một chất chống oxy hoá tự nhiên, bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm đáng kể bệnh tim mạch và ung thư Vì vậy, chúng cũng được dùng phổ biến trong dược phẩm

Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các loại dầu động, thực vật Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng đến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn đến nguồn khai thác squalene đang bị giảm sút Trong khi đó, hiện nay nhu cầu về squalene trong các ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô lớn Gần đây, một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng

để sản xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene Tuy nhiên, việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới được bắt đầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có được các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có được điều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có được quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo đảm an toàn cho

sử dụng theo định hướng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam Chính vì vậy, với mục tiêu lớn là cung cấp được các sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên

thiên nhiên sẵn có trong nước trong đó có vi tảo, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu squalene từ vi

tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ

phẩm và dược phẩm”

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

- Sàng lọc và xác định được điều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytirum mangrovei PQ6 của

Việt Nam tiềm năng lựa chọn được cho sản xuất squalene

- Xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S mangrovei PQ6 lựa

chọn được; đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết được theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

- Sàng lọc được chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam

- Tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu được sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa chọn được ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít

- Tối ưu điều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn được; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác định độ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết được

- Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm độc tính cấp và bán trường diễn, tác dụng sinh dược trên mô

hình in vivo (mô hình động vật thực nghiệm)

- Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên mô hình in vitro (mô hình tế

bào)

Chương 1 Tổng quan

Squalene (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa 2,6,10,14,18,22 -hexane) là một hydrocacbon hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroid Squalene đóng vai trò quan trọng trong hoạt động miễn dịch, chống oxy hóa, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch và giải độc gan, làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm hỗ trợ bảo vệ sức khỏe hay được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp mỹ phẩm như là một chất có tác dụng giữ ẩm và làm mềm da Ngoài ra,

nó còn có hiệu quả cao trong việc điều trị bệnh và ứng dụng tốt trong dược phẩm như hoạt tính chống phát triển khối u rất rõ rệt trên các mô hình động vật thực nghiệm

Các nghiên cứu gần đây cho thấy vi tảo là nguồn thay thế tiềm năng cho việc sản xuất squalene Trong tất

cả các nhóm vi tảo, VTBDD Schizochytrium được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất

có giá trị cao trong đó có squalene Theo công bố mới nhất của Martins và cộng sự (2018) cho thấy loài

Aurantiochytrium sp sau 48 h nuôi cấy dưới điều kiện độ mặn 1,5%, nồng độ glucose ban đầu 3%, ở 26°C đã cho

sản lượng squalene cao nhất là 7,3 g/100 g

Ở Việt Nam, chủng VTBDD S mangrovei PQ6 được phân lập tại huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ

2006-2008 là một chủng vi tảo tiềm năng, dễ nuôi trồng trong các hệ thống bình lên men có thể tích 5, 10, 30 và

150 lít, lượng sinh khối tươi (SKT) đạt 70-100 g/L tương đương với sinh khối khô (SKK) là 20-30 g/L, hàm lượng lipid có thể lên tới 50-70 % SKK Vì vậy, loài vi tảo biển này được xem là tiềm năng cho sản xuất sinh khối và các chất chuyển hóa như là PUFAs và squalene trên quy mô lớn

Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu vật

- 40 chủng VTBDD trong đó có 31 chủng thuộc chi Schizochytrium, 8 chủng thuộc chi Thraustochytrium

phân lập từ các vùng bờ biển và rừng ngập mặn ở Hải Phòng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An và

Bình Định năm 2013-2014, chủng S mangrovei PQ6 phân lập ở Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm

2006-2008 được sử dụng cho nghiên cứu

2.1.2 Các bộ kit sinh phẩm: Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Genjet Purification, Thermo ScientificTM (EU)), kit tách chiết ARN tổng số RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA -Thermo Fisher Scientific Inc., Singapore) đã được sử dụng trong nghiên cứu Trình tự các cặp mồi nhân các gen (CYP7A1, LDL-R, ABCA-1, LXRα, ABCA-1, ABCG-1, ApoE, LXRß GADPH) do Phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học thiết kế

2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, chuột nhắt trắng do Ban động vật thí nghiệm - Học Viện Quân Y

cung cấp

2.1.4 Các dòng tế bào: Dòng tế bào gan người HepG2 và tế bào đại thực bào từ chuột RAW264.7 có nguồn gốc từ

ngân hàng Tế bào sống, trường Đại Học Seoul, Hàn Quốc và do GS TS Sung-Joon Lee, Trường Đại học Korea, Hàn Quốc tặng

2.1.5 Hóa chất: Các hóa chất sử dụng là các hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần

thiết cho các nghiên cứu

2.1.6 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Sử dụng các máy móc và thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm 2.1.7 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường giữ giống và cấy chuyển chi Schizochytrium: ký hiệu GPY bao gồm glucose (2 g/L),

polypepton (1 g/L), cao nấm men (0,5 g/L), muối biển nhân tạo (17,5 g/L), agar (15 g/L)

- Các chủng tảo thuộc chi Schizochytrium được nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi

trường M1, chế độ lắc 200 vòng/phút ở 25-28o

C

- Chủng tảo thuộc chi Thraustochytrium được nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến, chế độ lắc 200 vòng/

phút ở 25-28oC

- Môi trường nuôi trồng Schizochytrium spp trong bình lên men 30L gồm Môi trường M12 cho lên men

theo mẻ (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L); Môi trường sử dụng để nhân giống cấp 1 (CNT1), giống cấp 2 (CNT2), cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung cơ chất gồm: Môi trường CNT1 (%): glucose - 3, cao nấm men -0,4, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4 - 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01, NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) và vi lượng - 0,8; Môi trường CNT2 (%) gồm: glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 - 0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp vitamin - 0,14, và vi lượng - 0,2; Môi trường CNT3 (%) gồm: glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 0,25, KH2PO4- 0,96, MgSO4- 1,2, CaCl2- 0,12, NaHCO3- 0,12, KCl-0,08, hỗn hợp vitamin

- 0,4

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nhóm phương pháp xác định chủng/loài; đặc điểm sinh học; điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản xuất squalene cao

2.2.1.1 Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh khối khô: sử dụng buồng đếm Burker - Turk

(Đức), sấy sinh khối tảo ở 105o

C đến khối lượng không đổi (Dang Diem Hong và cs, 2011)

2.2.1.2 Phương pháp chụp ảnh hình thái: chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 của Nhật Bản dưới kính

hiển vi quang học Olympus CX21

2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối tảo: theo phương pháp của Bligh và Dyer (1959) với một số cải tiến

2.2.1.4 Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red (Doan và Obbard, 2010)

2.2.1.5 Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA: theo Miller (1959)

2.2.1.6 Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene: định lượng squalene bằng phương pháp so màu

(Rothblat và cs, 1962)

2.2.1.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao

Cấp độ bình tam giác

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ cao nấm men, nồng độ glucose ban đầu, nồng độ terbinafie (TBNF): sử dụng bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày để nghiên

cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy (15oC, 20oC, 25oC, 30oC), nồng độ glucose ban đầu (15, 30, 40, 60 và 90 g/L), cao nấm men (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4%); và TBNF (0, 0,1, 1, 10, 100, 150, 200 µg/mL) trong khi các thành phần khác vẫn giữ nguyên như trong môi trường cơ bản

Nghiên cứu ảnh hưởng của hỗn hợp vitamin (B 1 , B 6 , B 12 ): Tảo nuôi trong bình tam giác 250 mL chứa 100

mL môi trường CNT3 có bổ sung 0; 0,2; 0,4; 0,6% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45 g/L, vitamin B6- 45 g/L và

B12- 0,25 g/L) Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h nuôi, tiến hành thu, đếm mật độ tế bào (MĐTB), xác định sinh khối tươi (SKT), SKK, và squalene

Cấp độ bình lên men 30 L

Nghiên cứu ảnh hưởng của glucose:

- Giống cấp 1: S mangrovei PQ6 được nuôi cấy trên môi trường thạch GPY, sau đó được cấy chuyển sang

các bình nuôi 1 L có chứa 300 mL môi trường M1, lắc ở 200 v/p, nhiệt độ nuôi 28C trong thời gian 96 h

- 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nồng độ glucose thay đổi từ 3, 6, 9, 12, 22% Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng lipid và squalene

Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi

trường M12 với nguồn nitơ là 1% cao nấm men hoặc kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) và 6,42% monosodium glutamate (YM) Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene

Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch):

- Giống cấp 1: Khuẩn lạc S mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi

trường CNT1, nuôi lắc ở 28o

C, 200 v/p trong 24 h

- Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, nuôi lắc

ở 28o

C, 200 v/p trong 24 h

- 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 Tại thời điểm 48 h,

bổ sung glucose đến nồng độ 22% Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 h, thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene

Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất

- Giống cấp 1: Khuẩn lạc S mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi

trường CNT1, nuôi lắc ở 28o

C, 200 v/p trong 24 h

- Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, có hoặc không có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h

- 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 có hoặc không có bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin Sau 12, 24, 36, 48 h xác định hàm lượng đường dư trong môi trường nuôi Khi hàm lượng đường dư nhỏ hơn 2% thì bổ sung glucose để đạt nồng độ 22% Sau khi bổ sung glucose 12, 24, 36, 48, 60,

72, 84, 96, và 108 h tiến hành thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene

2.2.2 Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S mangrovei PQ6

2.2.2.1 Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S mangrovei PQ6

- Phương pháp tách chiết lipid không xà phòng hóa (KXPH) từ lipid tổng số: theo phương pháp của Lewis và cs (2001) Lipid KXPH được sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Tối ưu điều kiện tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S mangrovei PQ6: nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi

khác nhau (n-hexane, chloroform, petroleum ether; nhiệt độ (0, 30, 50 và 80C); thời gian phản ứng (1, 3, 4, 5 giờ); điều kiện khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn liên tục, gián đoạn); số lần chiết (1, 2, 3 lần); tỷ lệ sinh khối/dung môi (1:8, 1:10, 1:12), nhiệt độ sấy sinh khối (60, 70, 80, 90C) và độ ẩm sinh khối 3, 30, 50, 80%)

- Tối ưu điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 và 5:1 trong khi các bước còn lại trong quy trình vẫn được giữ nguyên

- Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi như mô tả trong báo cáo của Choo và cộng sự (2005)

2.2.2.2 Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S mangrovei PQ6

- Tách chiết squalene thô từ sinh khối tế bào theo phương pháp của Lu và cộng sự (2003) Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi (ethanol và methanol), độ ẩm sinh khối (20% đến 100%) lên tách chiết và hàm lượng squalene

- Tách chiết squalene thô từ dịch tế bào theo công bố của Pora và cộng sự (2015), tinh sạch squalene thô bằng sắc ký cột

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của squalene bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

(HPLC) (Định Thị Ngọc và cs., 2013)

2.2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc của squalene: bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy

Bruker Avance-500 MHz spectrometer (Poucher và cộng sự, 1993)

2.2.3 Nhóm phương pháp xác định các chỉ tiêu chất lượng của squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6

Phương pháp xác định chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 2627-1993

Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm theo TCVN 6120:2007; trị số acid, xà phòng hóa, peroxyt, Iod theo TCVN 6127:2010; TCVN 6126:2007; TCVN 6121:2010 và TCVN 6122: 2010, tương ứng

Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật

Phương pháp xác định chỉ tiêu kim loại

2.2.4 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 trên động vật thực nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)

2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý của squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 trên mô hình in vivo

- Nghiên cứu độc tính cấp của squalene theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2014), quy định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và Tổ chức Y tế thế giới (2000)

- Đánh giá độc tính bán trường diễn: qui định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và Tổ chức Y tế thế giới (2000)

- Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên chuột nhắt trắng được tiến hành đánh giá theo phương pháp được

mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự (Đỗ Trung Đàm, 2006)

2.2.4.2 Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ

S mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro

- Tế bào HepG2 và RAW264.7 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2

- Độc tính của squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 trên tế bào HepG2 được phân tích theo phương pháp MTT

- Nhuộm lipid bằng Oil red O (ORO) theo phương pháp của Hoang và cộng sự (2012)

- Tách chiết lipid nội bào

- Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào được xác định bằng phương pháp enzyme

- Tách chiết RNA tổng số (theo kit RNAiso PlusTakara - Tokyo, Nhật Bản), tổng hợp cDNA (theo kit RevertAid First Strand cDNA - Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore) Các cDNA sau đó được sử dụng như khuôn mẫu cho phản ứng qPCR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được sử dụng để chuẩn hóa số liệu

2.2.5 Thống kê phân tích số liệu

Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn Sự sai khác được coi là có ý nghĩa thống kê ở

mức P <0,05, số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp Student’s t-test, so sánh bằng Anova test sử dụng phần

mềm SPSS 16.0

2.2.6 Địa điểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dưỡng có tiềm năng sản xuất squalene

Dựa trên khả năng sinh trưởng, tích lũy lipid và squalene, đã lựa chọn được chủng S mangrovei PQ6 từ 40 chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipid và squalene của

chủng PQ6 đạt cao nhất tương ứng là (12,38 ± 0,72) g/L, (39,61 ± 0,12)% SKK, (102,01 ± 1,04) mg/g SKK Trong các nghiên cứu trước đây, chủng PQ6 đã được nghiên cứu khá kỹ về đặc điểm sinh học và khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn Đây cũng là chủng tiềm năng để sản xuất các PUFAs trong đó có DHA (Đinh Thị Ngọc Mai và cs, 2013; Hoang và cs, 2014)

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi trồng S mangrovei PQ6 lên sinh trưởng và hàm lượng squalene

3.2.1 Tối ưu điều kiện nuôi trồng S mangrovei PQ6 cho sản xuất squalene ở cấp độ bình tam giác

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác

Trong dải nhiệt độ từ 15-35oC, chủng PQ6 đã cho thấy sinh trưởng và hàm lượng squalene đạt cao nhất khi nuôi ở 28oC là (13,47 ± 0,53) g/L và (61,42 ± 1,24) mg/g SKK sau 4 và 5 ngày nuôi, tương ứng Khi so sánh với công bố của Lewis và cs (2001), Nakazawa và cs (2012), nhiệt độ thích hợp cho chủng PQ6 sinh trưởng và tổng hợp squalene có cao hơn Đặc điểm của chủng, điều kiện tự nhiên và khí hậu có thể là nguyên nhân dẫn đến sự sai khác này

3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác

Trong khoảng nồng độ cao nấm men từ 0,5-4%, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt gần tương đương ở nồng độ 1 và 1,5% Ở nồng độ này, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 tương ứng đạt (13,56 ± 0,28) mg/g SKK và (61,02 ± 1,36) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2010) trên chủng

Aurantiochytrium sp đã cho thấy, sinh trưởng của chủng này tăng khi tăng nồng độ cao nấm men từ 0,5 đến 3 g/L

Hàm lượng và sản lượng squalene cao nhất đạt 0,21 mg/g và 1,62 mg/L sau 36 h nuôi khi sử dụng 6 g/L cao nấm men Như vậy, hàm lượng squalene của chủng PQ6 cao hơn so với công bố của tác giả trên

3.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác

Khi tăng nồng độ glucose từ 1,5- 9%, sinh trưởng của chủng này đạt cực đại ở nồng độ glucose 4% sau 5 ngày nuôi cấy là (13,06 ± 0,39) g/L Hàm lượng lipid, hàm lượng và sản lượng squalene cao nhất đạt được ở 9%

glucose sau 6 và 5 ngày nuôi tương ứng là (51,02 ± 1,54% SKK), (62,89 ± 2,59) mg/g SKK và (640,94 ±10,04) mg/L Khi chủng này được nuôi trồng trong bình tam giác ở điều kiện tối ưu, hàm lượng squalene chiếm 6,3% SKK đã được xác định bằng phương pháp TLC và HPLC Giá trị này cao hơn hàng trăm lần so với các chủng thraustochytrids đã được thông báo trước đây (0,002-0,150% SKK) (Jiang và cs, 2004; Li và cs, 2009; Chen và cs, 2010; Lewis và cs, 2001; Fan và cs, 2010)

3.2.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ terbinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác

TBNF là một chất ức chế enzyme squalene monooxygenase trong con đường sinh tổng hợp sterol Enzyme này có vai trò xúc tác quá trình oxy hóa squalene thành 2,3 oxidosqualene trong sự có mặt của phân tử ôxy và NADH (Ono 2002; Ryder và cs, 1992) Việc bổ sung TBNF từ 0,1 lên 200 µg/mL vào môi trường làm giảm đáng

kể MĐTB và lượng SKK sau 5 ngày nuôi Tuy nhiên, hàm lượng lipid và squalene lại tăng lên đáng kể Hàm lượng squalene thay đổi không đáng kể khi tăng nồng độ TBNF lên 10 lần (0,1-1 µg/mL) Khi tăng nồng độ TBNF lên

1000 lần (100 g/mL), hàm lượng squalene đạt cực đại (97,34 ± 1,97) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi

3.2.1.5 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác

Nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014) cho thấy các vitamin như B1, B6 và B12 có tác dụng làm tăng sản

xuất squalene trong nuôi cấy tảo Schizochytrium.Khi nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các vitamin này với nồng độ 0-0,6% lên quá trình tổng hợp squalene của chủng PQ6 đã cho thấy, sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng này đạt cao nhất khi bổ sung tổ hợp vitamin ở nồng độ 0,4 và 0,6% Do không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nồng

độ này, nên nồng độ 0,4% được lựa chọn cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo Sau 6 ngày nuôi cấy, SKK và hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao nhất khi bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin tương ứng là (39,98 ±

0,35) g/L và (76, 16 ± 2,34) mg/g SKK (tăng 34,43% so với đối chứng không bổ sung vitamin)

3.2.2 Tối ưu điều kiện nuôi trồng chủng S mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít để thu sinh khối tảo giàu squalene

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S mangrovei PQ6 nuôi

trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 L

Nồng độ glucose ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của loài A mangrovei (tên trước đây là S mangrovei) đã được chứng minh trong các nghiên cứu của Fan và cs (2010),

Nakazawa và cộng sự (2012) Kết quả đạt được khi nuôi chủng PQ6 ở bình lên men 30 L với nồng độ glucose từ 3-22% đã cho thấy MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 tăng mạnh khi nồng độ glucose tăng từ 3 đến 9% Với nồng độ glucose ban đầu là 9% cho lượng SKK và lượng squalene đạt giá trị cao nhất Lượng SKK và squalene đạt giá trị cực đại tương ứng là (35,5 ± 0,1) g/L và (1,1 ± 0,1) g/L Kích thước tế bào đồng đều ở nồng độ 6% - 9% glucose và lớn hơn so với nồng độ cao là 12% và 22% glucose Do vậy, nồng độ glucose ban đầu là 9% được lựa chọn để nuôi trồng chủng PQ6 bằng hệ thống lên men 30 L theo mẻ

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S mangrovei PQ6 nuôi trồng

theo mẻ trong hệ thống lên men 30 L

Khi kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, MĐTB, SKK và sản lượng squalene đạt cực đại, tương ứng là (3,3 x 108

) tế bào/mL, 46,7 g/L và 1,6 g/L sau 72 h nuôi cấy Hàm lượng squalene không có sự thay đổi đáng kể khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men hoặc kết hợp cả cao nấm men và monosodium glutamate Tuy nhiên, khi kết hợp hai nguồn nitơ nói trên thì sản lượng squalene đạt giá trị cao nhất sau 72 h (1605,5 mg/L), trong khi đó sử dụng cao nấm men chỉ đạt 1195,2 mg/L Điều này có thể là do tăng lượng sinh khối trong môi trường khi kết hợp cả hai nguồn nitơ Vì vậy, nguồn nitơ trong thí nghiệm của chúng tôi chỉ có tác dụng làm tăng tốc độ sinh trưởng của tảo dẫn đến tăng sản lượng squalene chứ không làm tăng sự tích lũy squalene Điều này cũng tương tự như mô tả của Chen và cộng sự (2010)

3.2.2.3 Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S mangrovei PQ6

Pora và cộng sự (2014) đã thông báo hàm lượng squalene của một số loài thraustochytrid có thể tăng từ

5-10 lần khi nuôi cấy theo mẻ có bổ sung cơ chất là glucose lên tới 22% (fed-batch) Đối với chủng PQ6, nuôi theo kiểu fed-batch cũng làm tăng sinh trưởng và tích lũy squalene MĐTB và SKK đạt cực đại tại thời điểm 108 h sau khi bổ sung glucose (392,53 ± 1,91) × 106 TB/mL và (100,41 ± 1,43) g/L, tương ứng Sản lượng squalene cao nhất đạt được là (4592,53 ± 0,3) mg/L ở 84 h, tăng 2-3 lần so với lên men theo mẻ

3.2.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S mangrovei PQ6

Việc bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin vào môi trường nuôi cũng đã làm tăng sinh khối và hàm lượng squalene của chủng PQ6 khi nuôi theo kiểu fed-batch SKK cao nhất đạt (105,25 ± 0,75) g/L sau 96 h Hàm lượng và sản lượng squalene đạt cực đại tương ứng là (91,53  2,45) mg/g SKK và (6928,6  14,6) mg/L sau 48 h, cao gấp 2-3 lần so với kiểu fed-batch không bổ sung vitamin và cao gấp 4-6 lần so với lên men theo mẻ Sản lượng squalene

của chủng PQ6 đạt được cao hơn so với các chủng Schizochytrium sp., Schizochytrium sp ATCC 20888 và Aurantiochytrium sp ATCC PRA 276 trong nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014)

Nile Red là thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các hạt lipid trung tính trong tế bào nhân

sơ và tế bào nhân chuẩn (Cooksey và cs, 1987) Vì squalene nằm trong phần lipid không xà phòng hóa nên có thể quan sát định tính sự tích lũy squalene thông qua nhuộm Nile Red (Hình 3.13)

3.3 Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S mangrovei PQ6

3.3.1 Tối ưu điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S mangrovei PQ6

3.3.1.1 Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S mangrovei PQ6

Các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số của S mangrovei PQ6 là sinh khối ban đầu

sấy ở 80oC đến độ ẩm 3%, sử dụng dung môi n-hexane, nhiệt độ tách chiết 70-75o

C, khuấy liên tục trong thời gian

4 giờ, chiết 1 lần với tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 (w/v)

3.3.1.2 Tách chiết lipid không xà phòng hóa- lipid KXPH từ lipid tổng số

Trong các tỷ lệ khảo sát của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1, hàm lượng squalene trong lipid KXPH ở tỷ lệ 2:1 đạt cao nhất là (8,1 ± 0,14)%

3.3.1.3 Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký mỏng và sắc kỷ lỏng cao áp

Kết quả chỉ ra trên Hình 3.15 A cho thấy mẫu lipid KXPH tách chiết từ chủng PQ6 xuất hiện băng tương đồng với squalene chuẩn Định lượng bằng HPLC, hàm lượng squalene khoảng (50,10 ± 0,03) mg/g SKK

Squalene tách chiết được có độ tinh sạch cao (98,6%) (Hình 3.15 B) Hàm lượng squalene thu được bằng

phương pháp này cao hơn Aurantiochytrium limacinum 9F-4a (0,6 mg/g SKK), 4W-1b (0,5 mg/g SKK), Schizochytrium limacinum SR21 (0,2 mg/g) nhưng lại thấp hơn A limacinum SR21 (171,1 mg/g SKK) (Nakazawa

và cộng sự (2012)

Hình 3.13 Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai đoạn nuôi cấy của quá trình lên men fed-batch A- Trước thời điểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ sung glucose lên 22% (a) Kính hiển vi quang học; (b) Nile red; (c) Kính hiển vi điện tử truyền qua L- thể lipid; Mi- ty thể; N- nhân; V- không bào Thanh kích thước: a-b=10  m; c=2  m

Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc kí

đồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B)

( A: giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7: lipid KXPH tách từ

sinh khối chủng PQ6)