NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN, nuôi cấy mô, lai tế bào, công nghệ sinh học, công nghệ sinh học động vật

NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP

 2.1 Môi trường nuôi cấy

 2.2 Điều kiện nuôi cấy

 2.3 Mật độ nuôi cấy

 2.4 Ứng dụng của tế bào trần

 III Dung hợp tế bào trần.

 3.1 Các phương pháp dung hợp.

 3.1.1 Dung hợp tự phát (spontaneuouso

fusion).

 3.1.2 Dung hợp cảm ứng (inducd fusion)

 3.2 Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần.

 3.3 Lựa chọn sản phẩm dung hợp.

Mở đầu

Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1

xử lý enzyme Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ

thống thực vật)

Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào

đã dung hợp

Vì sao lại chọn lai tế bào trần?

Lai hữu tính là phương pháp lai cỏ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử

-Tuy nhiên lai hữu tính chỉ thực hiện được giữa các

cá thể trong 1 loài hay các loài có quan hệ thân thuộc Lai giữu các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguần biến dị di truyền cần thiết cho việc cải thiện cây trồng

- Nuôi cấy tế bào trần có ích lợi:

+ Giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ

+Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp, ít tốn kém, nhanh và

I Nuôi cấy tế bào trần

1.1 Tách tế bào trần

1.1.1 Chọn nguyên liệu

- Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt Vì lá cây là nguần nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do

nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương

đối đồng nhất Cũng có thể tách tế bào trần từ mô

sẹo, bao phấn

- Lấy lá ở ngoài tự nhiên thì phải từ những cây không bị

xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ

- Những lá được tạo ra trong môi trường nuôi cấy invitro

là vật liệu lý tưởng cung cấp 1 lượng lớn tế bào khoẻ

mạnh

1.1.2 Phương pháp tách:

Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần

được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả

năng thẩm thấu tế bào Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất

+Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản

1.1.2.2.Phương pháp tách bằng enzyme:

Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase Để

phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoạc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào

- Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần

-Các bước tiến hành như sau:

+Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá

+ Ngâm trong dung dịch thẩm thấu phù hợp

+Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các

enzym

+ Xử lý hỗn hợp enzym

+Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần

+Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy

thích hợp

1.1.2.3 Phương pháp hỗn hợp:

-Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng

để tách thu được tế bào trần Thành tế bào cấu tạo gồm

cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là

protein và lipit Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại

enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau

-Một số loại enzym thường dùng:

cellulose hemicellulose PectinazaPectinaza

Onozuka Rhozym HP-150 Maceraza

Cellulysin Hemicellulose Macerozym R-10

1.1.3 Xác định chất lượng của tế bào trần

Các tế bào trần đều có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi

-Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không?

Dùng calcofour để xác định Calcofour bám vào các phân

tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu

xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím

Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển

vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể

-Bước 2: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần

Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này

nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống.

Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ

- Bước 3: Xác định sức sống của tế bào trần:

+Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với

nhuộm xanh evan

Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần

Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút,

+Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang

Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào

có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được

+Kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào trần:

Sử dụng fluorescein diacetat (FDA) ở thể tích 0,8ml dung dịch với 20ml môi trường chứa tế bào trần

Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần

có màng sinh cất bị phá huỷ sẽ có màu sẫm hoặc màu tối

1.1.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào trần

Các tế bào trần sau khi được tách từ mẫu thực vật sẽ

được làm loãng trong môi trường lỏng

-Xác định mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu

+ Mật độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào trần là104 -106 tế bào/ml môi trường

+Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp thành tế bào mới được tái tạo sau khoảng 48-96 giờ nuôi cấy.sau đó các tế bào sẽ bắt đầu phân chia và hình thành mô sẹo.khi được chuyển sang một môi trường mới các tế bào mô sẹo sẽ

phát sinh phôi(sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy) rồi phát

triển thành cây hoàn chỉnh

-Ưu điểm: Nuôi cấy trong môi trường lỏng được sử

dụng nhiều do có thể điều chỉnh được mật độ tế bào và áp suất thẩm thấu.một số loài thực vật tế bào trần không thể phân chia trên môi trường đặc

II Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng

và phát triển của tế bào trần

2.1 Môi trường nuôi cấy

- Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các tế bào trần cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu để tránh hiện tượng ưu trương hoặc nhược trương dẫn đến tình trạng tế bào trần bị vỡ hoặc teo lại

-Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy tế bào trần và trong hỗn hợp enzyme là: sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose

Các tế bào trần sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong dung dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu

- Để tránh gây độc và thúc đẩy sự phân bào thì nồng độ

nitratamon = ¼- ½ hàm lượng nuôi cấy mô của tế bào bình thường

Các môi trường nuôi mô và cơ quan bình thường có

nồng độ Ca từ 0,5-0,3mM và ở những nồng độ thấp này, các tế bào trần bị ngưng kết và hoá nâu nhanh chóng

Hàm lượng Ca phải tăng lên 14-40mM sẽ thúc đẩy

phân bào sớm, tăng tính đồng bộ tế bào sẽ làm giảm sự ngưng kết và hoá nâu của tế bào trần trong giai đoạn

sớm của nuôi cấy

Thành phần Ca cung cấp trong môi trương MS ở dạng CaCl2.2H2O, Ca(H2PO4)2

-Thành phần hữa cơ như inositol, a.nicotinic, biotin,

pyridoxy, thiamin, glyxin, axit folic, được bổ sung vào

môi trường nuôi cấy

Trong đó cazein thuỷ phân,D-Ca pantothenat, cholin,

chlorit,xystein, a.malic, axit ascobic, adenin sulfat …

thường được đưa vào môi trường nuôi cấy 0.01 -10mg/l

để đẩy nhanh sự sinh tổng hợp và thúc đẩy sự phân bào,

để đẩy nhanh sự sinh tổng hợp và thúc đẩy sự phân bào,

Đa số các thành phần này không được sử dụng sau khi tế bào trần đã được tái tạo thành tế bào mới và phân chia

-Đường cung cấp là nguồn C và chất ổn định áp suất

thẩm thấu như manitol,sorbitol (0.3-0.7M) trong khi

sacarozo và glucozo là nguồn C ở hàm lượng từ

0.2-0.6M Nồng độ đường được giảm dần sau khi các tế bào bắt đầu phân chia

- Các chất điều hoà sinh trưởng là rất cần thiết cho trong nuôi cấy tế bào trần Loại và nồng độ sử dụng là khác nhau giữa các loài và kiểu tái sinh NAA 2,4-D có nồng

độ từ 0,45 – 10,7um, trong khi cytokinin như zeatin và benzyl amino purin được dùng từ 2-5um

VD:Đối với các tế bào trần thịt lá của ở ngũ cốc và

đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại

thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy

mạch (brome grass) và sắn Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu.

2.2 Điều kiện nuôi cấy

Khi chưa hình thành thành tế bào rất nhạy cảm với ánh sáng vì vậy chúng được nuôi cấy trong tối hoặc ánh sáng yếu cho đến khi tổng hợp xong thành tế bào sau đó

chuyển dần ra nuôi ở mức ánh sáng cao hơn Ánh sáng trắng và xanh thì tốt hơn so với ánh sáng đỏ trong nuôi cấy tế bào trần Giai đoạn hình thành mô sẹo thì đưa ra ánh sáng bình thường

Quá trình nuôi cấy tế bào trần được duy trì ở nhiệt độ

từ 20-250C

2.3 Mật độ nuôi cấy

Mật độ nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần

VD: Nuôi cấy thuốc lá ở mật độ 5.104 tb/ml cho hiệu quả tốt nhất Khi giảm còn 5.105 tb/ml tế bào trần không phân chia

1.3.Ứng dụng của tế bào trần

-Chọn dòng tế bào

-Dung hợp protoplast để lai vô tính tế bào thực vật

-Biến nạp di truyền, đưa các cơ quan tử, virut, DNA

ngoại lai vào tế bào thực vật

-Là hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp

thành tế bào

1.3.1.Ưu điểm

-Thao tác thực hiện thuận lợi

-có thể thao tác đột biến và tách quần thể tế bào thực vật,

-Có thể chuyển gen được dễ dàng hơn vào hệ gen nhân

hoặc vào các bào quan

-Tạo ra những sinh vật mới biến đổi gen ,tạo thể lai tế bào chất hoặc thể lai gen

-Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền

có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn

indica vẫn khó tái sinh thành công và trong số cây tái sinh được tỷ lệ bất thụ thường rất cao

-Cách dung hợp có thể tạo được giống mới do sự kết hợp những tính trạng tốt của hai loài tuy nhiên cách dung hợp này thường có sự loại bơt NST trong phân bào và không

1.4 Thí nghiệm tách và nuôi cấy tế bào trần

thuốc lá

1.4.1 Nguyên liệu thực vật

Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên

liệu tách tế bào trần Sử dụng các lá được tách trong ngày

1.4.2 Chuẩn bị môi trường

Dung dịch enzyme tách protoplast:

1.4.3 Tiến hành

* Ngày thứ nhất: Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại

bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh vô trùng

Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 dung dịch

enzyme tách protoplast Bọc cốc đong bằng giấy

parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc

ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút)

* Ngày thứ hai: Dùng micropipette chuyển dịch tế bào trần lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65μm) đặt trong cốc loại

50 ml Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10%

mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của bước trên Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa

để rửa tế bào trần hết khỏi lưới lọc Chuyển hỗn hợp

tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g trong 10 phút.

+Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể

bằng 10ml dung dịch tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và tế bào trần sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo

thành hai pha (nhỏ từ từ dung dịch rửa bên thành tube tránh

bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g trong 10

phút

Các tế bào trần sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch +Dùng micropipette hút lớp tế bào trần màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại, tế bào trần sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên

+Rửa tế bào trần thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa

+ Loại bỏ phần nổi trên mặt và tái huyền phù tế bào trần trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần (PC) Đặt một giọt tế bào trần trên buồng đếm hồng cầu

và ước lượng mật độ tế bào trần (số lượng tế bào/số ô

đếm ×10.000)

Nuôi cấy tế bào trần bằng cách pha loãng 50.000 tế

bào/ml môi trường nuôi cấy tế bào trần và chuyển sang một đĩa petri vô trùng Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 280C

* Ngày thứ ba:

Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20

μmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vảithưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2 ngày

* Ngày thứ năm:

Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 μmol/sec/m2) trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra

* Ngày thứ bảy Ghi lại kết quả của bài học nuôi cấy tế bào trần,

số tế bào phân chia từ tổng số tế bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 tế bào trần nuôi cấy Có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không

Các bước nuôi cấy tế bào trần

III Dung hợp tế bào trần và lai tế bào xoma

Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của các nhân

tố bên ngoài Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành 1 và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ

Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo

ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực

sự gọi là thể dị nhân Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải,

nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid)

3.1 Các phương pháp dung hợp

lên Chất nguyên sinh và các

cơ quan từ hai hay nhiều tế bào có thể liên thông sang với nhau hình thành thể dung hợp

- Sự dung hợp tự phát chỉ xảy ra trong phạm vi 1 loài tức là những tế bào cùng loài ở cùng nhau trong quá

trình tách Hiện tượng này hiếm gặp do có sự tích điện

âm trên bề mặt màng tế bào trần làm cho các tế bào đẩy nhau ra Đây là nguyên nhân ngăn cản các tế bào trần tự kết hợp với nhau

3.1.2 Dung hợp cảm ứng

3.1.2.1 Xử lý bằng NaNO3

Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M)

kích thích dung hợp hai protoplast Carlson và cs (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên

(Nicotiana glauca × N langsdorffii) Tuy nhiên, phương

pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như tế bào trần từ nhu mô lá

3.1.2.2 Xử lý bằng PEG

-Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylen glycol)

+Khoảng 0,6 ml dung dịch PEG (hòa tan 1 g PEG mol wt 1500 trong 2 ml glucose 0,1 M, CaCl2 10 mM, và KH2PO4 0,7 mM) làm

thành một giọt protoplast và chuyển lên đĩa petri.

+Sau khi đậy nắp, tế bào trần trong dung dịch PEG được nuôi ở

nhiệt độ phòng trong 40 phút, pha loãng dung dịch PEG bằng cách bổ sung 0,5-1 ml môi trường nuôi cấy tế bào trần sau mỗi 10 phút.

+ Rửa tế bào trần với dung dịch không có tác nhân dung hợp bằng cách ly tâm và các tế bào trần được treo trở lại trong môi trường nuôi cấy.

-Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG