Ảnh hưởng của vi sinh vật tới thực vật

Ảnh hưởng của vi sinh vật tới thực vật

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020”do

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn theo hướng nghiên cứu của đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt là TS Lê Thị Thu Hiền và KS Vũ Hải Chi đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Học viên

Nguyễn Thị Mai Hương

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

EtBr Ethidium bromide

RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

TAE Tris – acetate – EDTA

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

Chương 1 – TỔNG QUAN 7

1.1 Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 7

1.1.1 Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan 7

1.1.2 Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 9

1.2 Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen 10

1.2.1 Giới thiệu về nấm mốc 10

1.2.2 Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 12

1.2.3 Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A tumefaciens 17

1.2.3.1 Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A niger 17

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hóa chất 24

2.1.3 Thiết bị 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26

2.2.2 Biến nạp vào tế bào E coli và A tumefaciens 30

2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 32

2.2.4 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 33

2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ 34

2.2.6 Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 36

2.2.7 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 37

2.2.8 Phương pháp nuôi nhiễm A tumefaciens và A niger 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1.1 Lắp ghép xylB vào vector trung gian 44

3.1.2 Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph vào vector trung gian 50

3.1.3 Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian

(pKS_xylB_hph) 56

3.2 Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 57

3.2.1 Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid 57

3.2.2 Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid 58

3.3 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph 62

3.3.1 Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A tumefaciens 62

3.3.2 Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium 62

3.4 Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A niger thông qua A tumefaciens 64

3.4.1 Kết quả nuôi nhiễm 64

3.4.2 Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh 67

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

MỞ ĐẦU

Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinhvật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase Xylanase được sử dụng trongnhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29] Một trong những ứngdụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Sự

có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêuhóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13] Ngoài ra,xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làmtrắng trong công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29]

Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong

đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao

và ổn định Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và phân bố rộng trong tự nhiên Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được

quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngànhnghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từnhiều năm nay trên thế giới [9, 11]

Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuấtthức ăn chăn nuôi ngày càng tăng Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụngenzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ côngnghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31] Chuyểngen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gencủa nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũngnhư enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gencho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển genmong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22]

Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật Bởi đây là một hệ

thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản Agrobacterium đã và đang

được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9]

Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc”

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen vàPhòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator).

- Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator.

- Tạo các chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc.

- Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A niger thông qua

vi khuẩn A tumefaciens.

Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1 Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi

1.1.1 Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan

Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C.3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29] Xylanasethủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành cácxylo – oligo [30] Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nóhoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19] Xylanase được tách chiết từ vi

khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…[22]

Hình 1 1: Cấu trúc hóa học của xylan

Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật

và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28].Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thànhpha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29] Xylan cũng là mộttrong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường,chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới Với cây gỗmềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng

khô [29] Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trongthức ăn chăn nuôi [28]

Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử Xylan là polymer khôngđồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằngliên kết ß – 1,4 – glycoside Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằngacetyl 4 – 0 – methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúcpolymer không đồng nhất Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràngbởi những khó khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên màkhông bị biến đổi hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kếtcủa nó với các thành phần khác [18, 23, 29]

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vậttiết ra enzyme xylanase Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từhơn một trăm năm qua [18] Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụthuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D –xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosidnối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạtđộng của enzyme endo – xylanase Các enzyme loại mạch nhánh (debranchingenzyme) chẳng hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase vàesterase chẳng hạn như acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽloại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [29] Ở cây gỗ rắn, xylan có côngthức O – acetyl – 4 – O – methylglucuron – oxylan Arabino – 4 – O –methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trongcây cỏ và thực vật bình thường khác [13]

Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13] Xylanasetiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28] Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung

có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân

cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn(khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29]

Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ vàsinh vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển,côn trùng Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13,29] Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanasevới hàm lượng cao [13, 29] Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được táchchiết từ nấm gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thựcvật nói chung [29] Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylancũng có thể phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß –

glucosid) giữa hai enzyme celllulase và xylanase Một số loài Bacillus chỉ tiết ra

xylanase, trong khi nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạothành xylanase thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một

số loài thuộc Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29] Do đó, để ứng dụng

xylanase đạt hiệu quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động

và bền vững với nhiệt độ Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiêncứu rộng rãi trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trongnhiều ngành công nghiệp [13, 30]

1.1.2 Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Xylanase hỗ trợ quátrình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chấtđộc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong côngnghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dínhcủa bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiênliệu [20, 29]

Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sungvào thức ăn chăn nuôi Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ

nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờvậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27].Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ănchăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease vàphytase Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trêntoàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27].

Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ

sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được

tách dòng và biểu hiện thành công Đặc tính của enzyme này cũng đã được phântích [13] Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã

hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ

cho các ngành sản xuất công nghiệp

1.2 Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua

A tumefaciens

1.2.1 Giới thiệu về nấm mốc

Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên.Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài

thuộc chi Aspergillus Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và

sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]

Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ:

A niger, A oryzae Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A niger sinh bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33] A niger gây ảnh

hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho

con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A flavus, A fumigatus A niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản

xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33]

Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A niger được sử dụng phổ biến

trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản

xuất công nghiệp [10, 13] Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh,

rượu, bia Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số

chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấpgây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp

Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thựcvật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất

lượng sản phẩm [22] Chuyển gen vào A niger đã được khai phá từ những năm cuối

thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêuđược quan tâm nhất Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngànhsản xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp

bằng kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31] A niger là

loài có khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thànhvật chủ để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31]

Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và giántiếp Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethyleneglycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợinấm Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng vídụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn Tuy nhiên, các kỹthuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồngthấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; cóthể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy rahiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao[12] Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện

một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A tumefaciens Phương pháp này đã và đang

được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12]

1.2.2 Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm

1.1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens

Trong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầmmột loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức.Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giốngnhư tế bào ung thư ác tính ở động vật

Hình 1 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18]

Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u ditruyền và khối u cảm ứng Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai cótính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài

khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A tumefaciens gây nên [1].

Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất A tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng

chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để

biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng A tumefaciens sẽ

tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ởcây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18]

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay

và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18] A tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A awamori, A fumigatus, Penecillium digitatums [18, 19] Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A tumefaciens cũng đã được áp

dụng để chuyển gen vào tế bào người [26]

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng

phát sinh khối u do vi khuẩn A tumefaciens gây ra ở thực vật Trước hết là quá trình

nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương Các tế bào bị thương tiết ra những

hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên, vi

khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạnDNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gâynên trình trạng phát sinh khối u Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing)[12, 26] T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ

không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29].

1.2.2.1 Ti plasmid

Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150

kb – 200 kb Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vàogenome của tế bào chủ Đó là đoạn T – DNA [19, 26] T – DNA được xác định bởitrình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lạingoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [12, 26] Trên T – DNA có các gen tạo khối u Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gencủa tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin Đây là cáchợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [12,26] Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằngcách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các genmong muốn Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen

sẽ phát triển bình thường [1, 22] Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine

[12, 26] Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng

hợp trong tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opinechỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn [2] Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bàochủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [12, 26]

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và gen sinh tổng hợp opine Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau

cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [11] Khi xâm nhiễm vào tế bào vật

chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u

được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin Đây là các chất gây nên sựphân chia tế bào liên tục [2, 12], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình

thành các khối u Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình

thái khối u Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợpamino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậyngười ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine Trình tựnucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinhtổng hợp nopalin và octopin [1]

Agrobacterium tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương.

Thực vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ lànhững yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động Khi vi khuẩntiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp các sợicellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như

acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để cảm ứng gen vir Một

hệ thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG được hoạt hóa nhờ sự có mặt của AS Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm tăng mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide.

AS kích thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG VirG bị kích

thích sẽ tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều

khiển khung đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm

tăng mức độ biểu hiện [12, 26]

Hình 1 3: Mô hình xâm nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật [19]

VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải

của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid Ngay lập tức trình tự này

liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA

dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26] Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạtđộng cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine Hormon kích thích sự phát triển

của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên,

cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này

[26] Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ

hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tựgen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫunhiên vào hệ gen của tế bào chủ Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tươngcao với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng Tần suất tái tổ hợp

Tế bào chủ

Nhân

Vết thương thành tế bào thực vât

Vết thương thành tế bào thực vât

Phức hợp T

Phức hợp T hoàn thiện

tương đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưnghiệu quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26].

Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt

bỏ hấu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T –

DNA tối thiểu mang điểm ghép gen Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu

quả trong việc đưa DNA lạ vào tế bào vật chủ [1]

1.2.2.2 Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

* Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giảipháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn Điều này là

hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ Hệ thống

này gọi là hệ thống vector liên kết Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ởdạng T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng

sinh) Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir

cần thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững

của plasmid trong A tumefaciens.

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của

một vector thông thường khác của E coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị

trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI),

thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E coli và A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E coli, không hoạt động ở A tumefaciens Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai

có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1]

* Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêngbiệt: Ti plasmid và vector T – DNA

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A tumefaciens, loại vector nhị thể

được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi

đầu tái bản hoạt động cả ở E coli và A tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A tumefaciens, không cần khi chuyển gen

trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phảibắt buộc phải có Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thíchvận chuyển T – DNA [1, 19]

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vectorvận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen

vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải

biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vậtphát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1].Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp

thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11]

1.2.3 Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A tumefaciens

1.2.3.1 Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A niger

Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà

chuyển gen nhờ A tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào

nhiều đối tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26] Nhiều loài thực vật

chuyển gen nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông

nghiệp, chẳng hạn như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã manglại năng suất và chất lượng cao, chống chịu với sâu bệnh [3, 9] Đối với vi sinh vật,

nấm men Saccharomyces serevisiae là đối tượng được sử dụng phổ biến nhưng lại không phải là vật chủ tối ưu để chuyển gen nhờ Agrobacterium Hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và

thấp hơn so với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9]

Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15] Agrobacterium cũng được sử dụng để chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium,

Penicillium, Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A awamori, A nidulans, A niger [22].

Bảng 1 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua

awamori

Fusarium solani Fusarium graminearum Trichoderma reesei

Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides

Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A tumefaciens gồm một số

bước sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng

của A tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và

biên trái của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này;

iii) vector tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A tumefaciens có mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A niger trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn

lọc và phân biệt với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNAđược chuyển vào nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển Nấmchuyển gen tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồngen [11, 22].

Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium

không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật Đó là chúng đềucần một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạngen mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá

trình chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi

chung (nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việcchuyển màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9]

1.2.3.2 Thuận lợi và khó khăn

* Thuận lợi

Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A tumefaciens có nhiều ưu

điểm và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG,bởi các lý do sau:

 Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A tumefaciens vô cùng

đa dạng Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tửnảy mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16] Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ đượcnhững trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG Phương pháp

chuyển gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi phải có thể

nguyên sinh hình thành từ khuẩn ty Mặc dù hiệu suất chuyển gen cao, nhưng trênthực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để chuẩn bị thể nguyênsinh [18] Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh thường gặp nhiều khó khăn

và ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chẳng hạn như điều kiện sinh trưởng của bào tử nảymầm (thành phần môi trường, thời gian nuôi cấy) Ngoài ra, phương pháp chuyểngen nhờ thể nguyên sinh phải không những đòi hỏi phải tối ứu đối với các enzymedùng để chuẩn bị thể nguyên sinh [11] mà còn tốn thời gian và tiền của [17]

 Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua

Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống [9, 11, 16] Chuyển gen vào A awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất cao gấp 400 lần

so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9]; Với vật chủ là

Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacteium cao gấp 5

– 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần; Với một số vật chủ khác, chẳng hạn như

Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu suất chuyển gen nhờ Agrobacterium

tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ tế bào trần đã được tối ưu [9] Tương tự,

chuyển gen vào A fumigatus thông qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển

gen cao gấp 2 lần so với chuyển gen nhờ các hạt cầu [16]

 Chuyển được những đoạn DNA có kích thước lớn So với các phươngpháp cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA cókích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế bào

thực vật nhờ A tumefaciens có thể lên đến 150 kb [9].

 Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy

nhất, và gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bàochủ [11, 16]

 Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là

phương pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc khôngchứa các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9]

Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên

cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29]

[11] Như vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống

chuyển gen hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấmmốc [9, 11, 12, 16]

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium

Chuyển gen vào nấm thông qua A tumefaciens là phương pháp được áp dụng

phổ biến bởi tính ổn định, đơn giản và hiệu suất cao [13, 16] Tuy nhiên, hiệu suất

chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài

nấm khác nhau Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnhhưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18]

 Nguyên liệu nấm

Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

là nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng Nguyên liệu để nuôi

chung với A tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có

thể chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngangnhau Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể Một số loài

thuộc zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất

hiện thể chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài

Coccidioides immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển gen ở Agaricus bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn

so với dùng thể sợi nấm [12]

Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gianbảo quản bào tử nấm Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệuquả chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử sovới nguyên liệu mới [12]

 Agrobacterium và tế bào chủ

Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất

đa dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100 Hiệu suất chuyển gen khi sử dụngcác chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt

nhất Mỗi chủng nấm mang lại hiệu quả khác nhau với tế bào chủ khác nhau Ngoài

ra, với cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấmđược phân lập theo những cách khác nhau Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận

chủng Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12].

 Nồng độ chất cảm ứng

Trong hầu hết các nghiên cứu, AS được bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm

bởi đây là hợp chất cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T – DNA Nhưng trong quá trình nuôi cấy Agrobacterium không cần thiết bổ sung AS, nhiều trường

hợp còn dẫn đến giảm hiệu suất biến nạp, chẳng hạn như đối với vật chủ là

Fusarium oxysporum, Magnaporthe grisea [11, 12].

 Tỷ lệ nuôi nhiễm

Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi

khuẩn Agrobacterium và nấm mốc Cần xác định tỷ lệ thích hợp cho mỗi chủng nấm [11] Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển

gen Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên đều phải có những giới hạn nồng độ nhất định

Nếu bổ sung quá nhiều A tumefaciens, hiệu suất chuyển gen có thể giảm do cạnh

tranh dinh dưỡng và mật độ vi khuẩn quá dày, hơn nữa sẽ gặp khó khăn trong việc

giết chết Agrobacterium khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen.

Ngược lại, quá nhiều bào tử nấm, việc phân lập từng tế bào sau quá trình nuôinhiễm sẽ gặp nhiều khó khăn [12] Do vậy, quá trình nuôi nhiễm có thể thử nghiệmnhiều tỷ lệ khác nhau để chọn được tỷ lệ phù hợp sao cho hiệu suất cao nhất [11]

 Điều kiện cùng nuôi nhiễm

Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến hiệu suất chuyển gen Điều kiện nuôi nhiễm nấm và Agrobacterium bao gồm

thời gian, nhiệt độ và màng lọc Nhiệt độ nuôi nhiễm có thể từ 22° – 37°C, songnhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3ngày Ngoài ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose,Hybond N+ cũng sẽ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12]

Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đếnhiệu suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể doQuy trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ Do vậy, để đạt hiệu suấtchuyển gen cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12].

Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguyên liệu

 Vector và chủng giống

 Vector tách dòng pJET1.2/Blunt của hãng Fermentas; Vector pBluescript II

KS (–) của hãng Stratagene; Vector biểu hiện Vector pCAMBIA1300 Cácvector này được lưu giữ tại Phòng công nghệ ADN ứng dụng – Viện Côngnghệ sinh học Vector biểu hiện pAN7.1 – GluA do Phòng Công nghệ sinhhọc enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp

 Các chủng vi sinh vật: Agrobacterium tumefaciens CV58C1 – pGV2260 của hãng Clontech (Mỹ); E coli DH5α và E coli DH10b của hãng Gibco BRL

Life Technology (Mỹ) Các chủng giống này được lưu giữ tại Phòng Côngnghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học

 A niger VTCC – F – 017; gen mã hóa xylanase phân lập từ A niger do

Phòng công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp

 Các cặp mồi dùng trong PCR:

hph1: 5’ – TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGA T – 3’

hph2: 5’ – CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G – 3’

XylBF: 5’ – GAA GGA TCC GAA TAT GCT CAC CAA G – 3’

XylBR: 5’ – TCA GCA GGA TCC TAC TGA ACA GTG – 3’

SeqXylF: 5’ – TCCGAAGTAGGTAGAGCGAGTA – 3’

2.1.2 Hóa chất

 Enzyme giới hạn: Sma I, Hind III, Eco RI, Eco RV, Bgl II, Not I, Nco I, Kpn

I của hãng Fermentas và Biolab

1

 Các hoá chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq

polymerase); Kit tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM Gel Extraction Ki; Kittinh sạch DNA plasmid Wizard®SV của hãng Promega (Mỹ) Kit tách dòngCloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas

 Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid của các hãngAmersham Bioscience (Anh), Sigma (Mỹ), Merck (Đức)

 Các chất kháng sinh: ampicillin; kanamycin; rifamycin; cefotaxim;hygromycin B

 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

Bảng 2 1: Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật

- 0, 8 ml K2HPO4 1,25 M,

pH: 4,8

20 ml MN* buffer (30 gMgSO4 7H2O; 15 g NaCl)

1 ml CaCl2 2 H2O 1%

10 ml FeSO4 0,01%

5 ml các nguyên tố vi lượng**

** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mgMnSO4 H2O; 100 mg CuSO4 5H2O; 100 mg Na2MoO4 2H2O; bổ sung H2O đến

100 ml, khử trùng

2.1.3 Thiết bị

Tủ lạnh sâu –20°C, –70°C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, HànQuốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10–4g,Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc; Máy ly tâmEppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soiDNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad,Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen

* Chuẩn bị vector và gen mong muốn cho phản ứng nối ghép gen

– Tinh chế đoạn gen và vector: Để nối ghép gen vào một vector, trước hếtchúng phải được với cùng một enzyme cắt giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng chophản ứng nối ghép gen Ngoài ra, để phản ứng đạt hiệu suất cao cần tinh chế đoạngen hoặc vector trước khi tiến hành lai Phản ứng cắt lượng lớn để thôi gel và tinhsạch đoạn gen và vector quan tâm như sau:

DNA plasmid sau khi cắt bằng enzyme hạn chế được loại nhóm phosphat ởđầu 5' nhờ enzyme phosphatase kiềm được tách từ ruột bê (CIP = Calf IntestinalAlkaline Phosphatase) Mục đích nhằm tránh hiện tượng đóng vòng trở lại củavector.

Phương pháp:

 DNA plasmid (10 – 20 g) được ủ với enzyme giới hạn trong 1 giờ Lấykhoảng 0,3 g điện di trên gel agarose 0,8% cùng với chỉ thị phân tử là DNAplasmid chưa xử lý bằng enzyme Nếu như quá trình cắt chưa hoàn toàn, bổsung thêm enzyme giới hạn và ủ tiếp

 Khi DNA đã được cắt hoàn toàn, chiết mẫu với phenol : chloroform và tủaDNA bằng hai thể tích ethanol trong 15 phút ở 0°C Ly tâm thu DNA ở 4°C,

12000 vòng/phút (v/p) trong 10 phút Hoà cặn trong 90 l 10 mM Tris.Cl (pH8,3) Lấy khoảng 200 ng DNA điện di kiểm tra Mẫu còn lại được giữ ở –20°C

 Thêm 10 l dung dịch đệm dùng cho CIP và một lượng enzyme thích hợp, ủ ởđiều kiện tương ứng

Chú ý: Lượng enzyme cần dùng và điều kiện ủ phụ thuộc vào đoạn cắt DNAmang đầu dính hay đầu bằng

Bảng 2 1: Điều kiện khử photphat của các loại đầu dính

Lượng enzyme Điều kiện ủĐầu

dính

5'

1 unit / 100pmoles*

ở 37°C trong 30 phút

Đầu

bằng

1 unit / 2 pmoles ở 37°C trong 15 phút Sau đó thêm một lượng

enzyme và tiếp tục ủ ở 55°C trong 45 phút

* 2 g DNA mạch thẳng dài 5 kb khoản 1,4 pmoles

 Sau khi ủ, thêm vào mẫu SDS và EDTA (pH 8,0) đến nồng độ cuối cùng tươngứng là 0,5 % và 5 mM Trộn đều và thêm proteinase K 100 g/ml Ủ 30 phút ở56°C Proteinase K dùng để hoà tan CIP nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn giúp cho

quá trình gắn gen vào vector có hiệu quả CIP cũng có thể bị làm bất hoạt bằngcách ủ 1 giờ ở 65°C hoặc 75°C trong 10 phút cùng với 5 mM EDTA (pH 8,0).

 Sau đó làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng Chiết DNA một lần bằng phenol,một lần bằng phenol : chloroform Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH =5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 –

10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10 Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%.Đảo đầu ống Eppendorf vài lần Giữ ở 0°C trong 15 phút

 Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C.Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C

Phản ứng khử phosphate được tiến hành như sau:

* Tinh chế các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose

Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoàicác vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-),trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sảnphẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel

có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV Quytrình tinh sạch DNA gồm các bước sau:

Làm tan gel

 Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vàoống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được

 Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel

 Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn

Gắn DNA

 Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).

 Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

 Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection

 Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch

 Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm

12000 v/p trong 1 phút

 Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C

 Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose

* Phản ứng ghép nối

Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJETTM PCRCloning Kit của hãng Fermentas Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để táchdòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme

Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết

điểm cắt tương ứng

Quy trình nối ghép gen:

Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinhchế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau:

Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ

- Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau

khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờenzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ Đặc biệt trong nội dung

nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam

HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra

đầu dính giống nhau là GATC Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành

ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi

đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi

2.2.2 Biến nạp vào tế bào E coli và A tumefaciens

* Biến nạp vào tế bào E coli

Nguyên tắc:

Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thayđổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chuivào Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biếnnạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc

Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E coli H10b hoặc E coli DH5α:α:

 Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm

 Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng,nuôi lắc 37°C qua đêm

 Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°Ctrong 3 giờ

 Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000 v/

p, 4°C trong 10 phút để thu cặn

 Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến1.5 ml dung dịch CaCl2 (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p,4°C, 10 phút để thu cặn

 Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần

 Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl2 dùng để rửa, dùngpipet trộn đều nhẹ nhàng

 Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cấtngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C

 Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùngtrong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°

Quy trình biến nạp:

 Đặt tế bào khả biến E coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu

tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C

 Bổ sung 5l sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E coli DH10b hoặc E coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút.

 Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút

 Bổ sung 300 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ

 Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin(50mg/ml)

 Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc

* Phương pháp biến nạp vào tế bào A tumefaciens

Chuẩn bị tế bào khả biến A tumefaciens

 Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp

 Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ

 Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môitrường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1– 1,5

 Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửacặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2–ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol.

 Cặn hòa lại trong 500 – 700 l 10% glycerol

 Chia 100 l dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảoquản ở – 80°C

Quy trình biến nạp vào A tumefaciens bằng phương pháp xung điện

 Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch

là 40 – 50 ng/µl

 Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút

 Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai

 Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnhtrong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet

 Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω

 Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ

 Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặcYEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày

 Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thíchhợp

2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleicacid Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điệnmột chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trongđiện trường từ cực âm sang cực dương

Quy trình:

 Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dungdịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp Sau khoảng 30 phút,

khi gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di Đổ đệm TAE 1Xngập cách mặt gel khoảng 2 mm.

 Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vàocác giếng trên bản gel

 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòngđiện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue đểngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút)

 Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dungdịch EtBr (nồng độ 10 g/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ Sau đórửa sạch bản gel bằng nước cất

 Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại Quan sát thấyDNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng Ảnh điện di được chụp trên máy Bio –Rad với tia UV có bước sóng 320 nm

2.2.4 Nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu nhữngnăm 80 của thế 19 Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chếnguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật Nguyên tắc

của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống

nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP vàcặp mồi đặc hiệu

Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:

 Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độlên 94° – 95°C trong thời gian ngắn

 Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C Hai đoạnmới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc

bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân

 Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi Để tránh hiệntượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C

Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạnđược tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dàithực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuấtphát của hai đoạn mồi

PCR bao gồm các thành phần sau đây:

 Một đoạn DNA khuôn

 Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide

 Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt

Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%

2.2.5α: Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ

Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giaiđoạn cuối pha log Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh

có trong dung dịch I và dung dịch II DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bàođược loại ra nhờ dung dịch III DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ

ly tâm với tốc độ 12000 v/p

* Quy trình tách DNA plasmid từ E coli

 Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứakháng sinh thích hợp Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p

Lưu ý:

 Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy

 Các ống phải đậy nắp không chặt quá

 Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ

 Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong

30 giây Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào Lưu giữ những dịch nuôicấy chưa sử dụng hết ở 4°C

 Làm tan cặn tế bào trong 100 l dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex

 Bổ sung 200 l dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf Đậy nắp chặt,đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút Không được vortex

 Bổ sung 150 l dung dịch Sol III Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần vàgiữ ở 0°C trong 3 – 5 phút

 Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới

 Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform Đảo lẫn hai pha bằngcách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C Hút chuyển pha trên sangống mới

 Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98% Trộn đều bằngvortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ

 Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C

 Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70% Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong

8 phút ở 4°C

 Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ởnhiệt độ phòng

 Hoà tan DNA trong 50 l H2O khử in vô trùng (hoặc 50 l TE pH 8) chứa 20

g/ml RNase

 Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C

* Quy trình tách DNA plasmid từ Agrobacterium

 Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào

 Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf,đánh tan

 Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1mM/µl, ủ 37oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch

 Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa,

bổ sung 30 µl H2O

 Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8%

2.2.6 Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn,DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn đểkiểm tra Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạnDNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợicủa phân tử DNA Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo

đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt

theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thuđược từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhânbằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra

bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I Các dung dịch đệm

thích hợp cho từng loại enzyme như sau:

Eco RI Dung dịch đệm Eco RI Sma I Dung dịch đệm Tango

Hind III Dung dịch đệm R

Kpn I Dung dịch đệm Kpn I Bgl II Dung dịch đệm Tango

Nco I Dung dịch đệm Tango

Not I Dung dịch đệm Tango

Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần:

2.2.7 Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng

* Nguyên tắc chung

Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc củaphương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide,kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang Để tạo ra các đoạn kết thúcbằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết củaphản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …

Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinhsạch) và mồi phù hợp Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đãđược đánh dấu bằng các màu khác nhau Thành phần của phản ứng khuếch đại gen

để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tươngứng với tổng thể tích 15 µl