HÃY TRÌNH bày NHỮNG HIỂU BIẾT của bạn về TÍNH CHẤT, các CÔNG NGHỆ CHẾ tạo PHỔ BIẾN (PHƯƠNG PHÁP hóa học) và ỨNG DỤNG của các hạt NANO OXXIT sắt (fe3o4) từ TÍNH

Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe 3 O 4 : Sau khi mẫu Fe3O4 được tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X để có thể khẳng định rằng đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe3O4 và xác định được cấu

Bộ Giáo dục và Đào tạo Trường Đại học Quy Nhơn

TIỂU LUẬN BÀI THI CUỐI KỲ 1

Môn: Vật lý vật liệu nano

BẠN VỀ TÍNH CHẤT, CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO PHỔ BIẾN (PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC) VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC HẠT NANO OXXIT SẮT

(Fe3O4) TỪ TÍNH?

Tên người làm: Lê Thị Diễm Hằng

Lớp: Cao học Vật Lý-K20

Giáo viên: PGS.TS.Phạm Thành Huy

Quy Nhơn, Năm 2018

MỤC LỤC Trang

1 Một số tính chất của hạt nano từ tính Fe 3 O 4 : 1

1.1 Kết quả đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe 3 O 4 1

1.2 Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe 3 O 4 : 2

2 Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học): 4

3 Ứng dụng của các hạt nano ô xít sắt(Fe3O4) từ tính 4

3.1 Ứng dụng hạt nano từ tính Fe 3 O 4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào: 4

3.1.1 Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe 3 O 4 : 4

3.1.2 Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào 7

3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe 3 O 4 với kháng thể antiCD4 7

3.1.2.2 Gắn kết với tế bào bạch cầu: 9

1 Một số tính chất của hạt nano từ tính Fe 3 O 4 :

1.1 Kết quả đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe 3 O 4

Mục đích chính của phép đo này là xác định được cấu trúc và kích thước hạt của mẫu Fe3O4 Mẫu Fe3O4 sau khi được chế tạo thì được rửa bằng nước cất vài lần, tiếp theo được tiến hành sấy khô thành dạng bột Sau đó mẫu được đem đi ghi

xạ được so sánh với PDF 790418 với bước sóng Cu Kα1

chứa phần lớn là Fe3O4 Đồng thời các đỉnh nhiễu xạ cực đại, do đó mẫu được tạo thành ở dạng tinh thể Các đỉnh nhiễu xạ cực đại tương ứng với các đỉnh chuẩn của cấu trúc oxit sắt từ dạng nano Trong kết quả đo nhiễu xạ tia X không thấy có xuất hiện đỉnh nhiễu xạ cực đại nào lạ, chứng tỏ rằng chỉ có pha ôxit sắt từ cấu trúc tinh thể Sự mở rộng của các đỉnh nhiễu xạ nguyên nhân chính là do trạng thái cấu trúc của bản thân hạt từ gây nên

Kích thước trung bình của hạt được tính từ đỉnh nhiễu xạ có cường độ mạnh

D=

0,9λ

B cosθ (1) với D là đường kính hạt trung bình, λ là bước sóng tia X tới (λ = 1,54056 Ǻ) ,

được:

D=13,51 nm

Từ đây có thể khẳng định được rằng, chúng tôi đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe3O4 với đường kính vào khoảng cỡ vào khoảng 10-16 nm

Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4

1.2 Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe 3 O 4 :

Sau khi mẫu Fe3O4 được tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X để có thể khẳng định rằng đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe3O4 và xác định được cấu trúc và kích thước hạt dựa trên các tính toán lý thuyết thì chúng tôi tiếp tục tiến hành chụp ảnh TEM cho mẫu Fe3O4 với mong muốn có thể xác định rõ hơn về kích thước cũng như cấu trúc hạt nano từ tính Fe3O4 Trước khi đem đi chụp ảnh TEM thì mẫu Fe3O4 được rửa nhiều lần bằng nước cất và được đánh siêu âm trong vòng 15-30 phút để cho các hạt phân tán đều trong nước Bằng cảm quan chúng tôi có thể thấy rằng khi các hạt nano từ tính Fe3O4 được phân tán đều trong nước thì dung dịch đó

có màu đen, và các hạt là có từ tính bởi theo một cách đơn giản là dùng một miếng nam châm nhỏ đặt ở đáy cốc thì sau chừng 10-15 phút các hạt sẽ bị lắng xuống phía dưới đáy cốc, sau một thời gian để ở ngoài không khí thì dung dịch có chuyển sang màu hơi nâu

1.3 Tính chất từ:

Tiến hành đo đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4 dạng bột sấy khô ở nhiệt độ phòng sử dụng hệ đo là thiết bị từ kế mẫu rung Mục đích của phép đo là xác định tính chất từ và từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4 Kết quả thu được thể hiện trên hình 2:

Kết quả này cho ta thấy rằng lực kháng từ Hc=0, mặt khác có thể thấy rằng từ

độ dư Mr=0, tức là không có hiệu ứng trễ hầu như không đáng kể, vậy có thể nhận xét được rằng các hạt nano từ tính Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ Đường cong là một đường đối xứng, từ độ bão hòa (tính theo emu/g) là tương đối cao, cụ thể trên

đồ thị ta có thể thấy MS=80 emu/g, trong khi đó từ độ bão hòa của mẫu khối là 90

cao, tuy nhiên vẫn thấp hơn giá trị từ độ bão hòa của mẫu khối

2 Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học):

sắt từ Quy trình thực hiện tiến hành theo các bước cụ thể sau Sau khi rửa sạch các dụng cụ thí nghiệm thì dung dịch muối FeSO4 được pha chế bằng cách cho 17,71 g muối FeSO4 hòa với 200 ml nước cất, tương tự 10,11 KNO3 hòa vào 100 ml nước cất, và 13,81 g KOH pha với 50 ml nước cất, ba dung dịch trên được pha chế ở ba cốc thí nghiệm khác nhau, sau khi pha xong các dung dịch trên được lọc bằng giấy lọc định lượng trước khi được đưa vào tiến hành thí nghiệm

Các dung dịch đã được chuẩn bị như trên được đổ vào một bình thủy tinh 1L theo thứ tự ở trên và được khuấy bằng máy khuấy từ gia nhiệt Hỗn hợp phản ứng

hành trong môi trường khí nitơ

Sau 2h, khí nitơ được tắt và bình thủy tinh chứa hỗn hợp sau phản ứng được đưa ra khỏi máy khuấy từ và để ở nhiệt độ phòng trong một giờ

Tiếp theo, hỗn hợp này được rửa 2 lần bằng nước cất (2L), 1 lần với axit nitric 1M (1L), và cuối cùng là rửa với 2 lần nữa với nước cất (2L) Phần chất rắn màu đen được tách xuống dưới bằng cách sử dụng một miếng nam châm, sau đó loại bỏ

đi phần dung dịch ở trên, tiếp tục quá trình rửa bằng nước cất nếu thấy cần thiết cho tới khi dung dịch ở phía trên đã trở nên sạch Cuối cùng, toàn bộ sản phẩm được giữ trong 1L nước, thông thường phương pháp này cho ta 10 g sản phẩm Theo phân tích thì các hạt được tạo ra là Fe3O4 nhưng với kích thước lớn hơn

so với phương pháp đồng kết tủa và các hạt nano Fe3O4 sau khi được tạo thành rất

dễ bị kết đám lại với nhau chỉ sau thời gian ngắn

3 Ứng dụng của các hạt nano ô xít sắt(Fe3O4) từ tính

3.1 Ứng dụng hạt nano từ tính Fe 3 O 4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào: 3.1.1 Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe 3 O 4 :

Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa

bề mặt để gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme Các

nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, cacbonxyl, thiol Để có được các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo ra môt lớp polymer trên bề mặt hạt nano

Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là: X-(CH2)n-SiRn(OR’)3-n Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với các đối tượng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano

Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa Trong các ứng dụng về sinh học thì nhóm chức amino được sử dụng nhiều nhất Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm OH tự do trên bề mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững

Trong quá trình tiến hành chức năng hóa bề mặt thì điều kiện của môi trường phản ứng có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt Ví dụ như cồn thì thường làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n=2) để tạo ra nhóm chức amino trên bề mặt hạt nano Quy trình chức năng hóa bề mặt gồm các bước như sau: Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100

ml nước cất hai lần Dùng máy siêu âm để phân tán hạt và dụng dịch để được một thể huyền phù ổn định Nhỏ 1 ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù nói trên và dùng máy khuấy từ để khuấy trong vòng 8 giờ cho quá trình chức năng hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn Kết thúc quá trình này ta thu được sản phẩm, đem lọc rửa 5 lần bằng lần bằng nước cất và lọc từ sẽ thu được hạt nano từ tính Fe3O4 có bề mặt là các nhóm amino Lúc này hạt ta có thể gắn hạt nano với kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu T Kháng thể anCD4 là kháng thể có khả năng đối ứng với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào

bạch cầu CD4+ T, nhờ khả năng phát huỳnh quang của kháng thể giúp cho việc đếm tế bào bạch cầu được dễ dàng hơn với độ chính xác cao

APTS (Hạt nano sau khi được chức năng hóa bề mặt được gọi tắt là Amino-NP) Nguyên tắc của phép xác định này là dùng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) cho phản ứng với các hạt nano Fe3O4 có nhóm chức NH2 trên bề mặt, sau đó đo dung dịch sau phản ứng bằng phép đo phổ hấp thụ (UV Vis), phép đo sẽ xác định

số lượng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) ở trong dung dịch, từ đó có thể xác định được số nhóm amino trên bề mặt hạt nano Trong cấu tạo phân tử của

4-Nitrobenzaldehyde có tồn tại cấu trúc vòng benzen 6 cạnh, vì vậy khi đo phổ hấp thụ UV-Vis sẽ cho các đỉnh hấp thụ tương ứng với các nồng độ khác nhau Phổ hấp thụ cho thấy ở bước sóng 270 nm thì có các đỉnh hấp thụ như hình 3:

Hình 4: Phổ hấp thụ của dung dịch chứa 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ

khác nhau

Sau khi tiến hành đo phổ hấp thụ xong có thể xây dựng một đường miêu tả sự phụ thuộc của nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde có trong dung dịch với cường độ phổ hấp thụ và đem so sánh với một đường chuẩn của 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ tương ứng Hình dưới là đồ thị miêu tả sự so sánh đó

3.1.2 Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào

3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe 3 O 4 với kháng thể antiCD4

Quá trình gắn với kháng thể antiCD4 được thực hiện như sau: Lấy 0,4g hạt nano từ tính đã được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amino sử dụng APTS (amino-NP) đem rửa và tách từ hai lần bằng 1ml dung dịch đệm 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH bằng 6 và nồng độ là 0,1M Sau đó

amino-NP được phân tán trong 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES và 2mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ở dạng bột bằng cách khuấy đều tại nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút Tách rửa bằng từ trường hai lần trước khi nhỏ 1 µg–100 µg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen) Tách rửa từ bốn lần bằng nước cất ta thu được hạt nano gắn kháng thể antiCD4, gọi tắt là antiCD4-NP

Trong một số mẫu, chúng tôi có sử dụng 20 µl kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4, bước sóng kích thích là 480 nm, bước sóng phát xạ 520

nm của hãng Exiobio) trộn với antiCD4 có các nồng độ khác nhau Sau hai giờ các hạt nano được bọc bởi các kháng thế đơn dòng antiCD4 và *antiCD4 được tách rửa từ 3 lần bằng 1ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS)

Kết quả cuối cùng ta thu được hạt nano từ bọc bởi 2 loại kháng thể đơn dòng antiCD4: một loại thường (gọi tắt là antiCD4-NP) và loại kia phát huỳnh quang (gọi tắt là *antiCD4-NP) và chúng được bảo quản trong PBS bổ sung thêm albumin huyết thanh bò (BSA)

Hình 5: Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể antiCD4.

Phản ứng (A) Hạt nano từ tính được chức năng hóa EDC Phản ứng (B) Gắn kết kháng thể antiCD4 với hạt nano từ tính được bao phủ bởi EDC

3.1.2.2 Gắn kết với tế bào bạch cầu:

Lấy 200 µl máu người bình thường được li tâm trong ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml với tốc độ 1000 vòng / phút trong vòng 10 phút để loại bỏ huyết thanh rồi hòa vào 200 µl PBS bổ sung 1% BSA Sau đó được ủ với 0,2 mg antiCD4-NP và

*antiCD4-NP trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng Bổ sung 1,3 ml dung dịch đệm nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào

máu làm tế bào trở thành dạng ko có bào quan và bào tương hay còn gọi là tế bào ma

Lúc này các antiCD4-NP và *antiCD4-NP sẽ gắn đặc hiệu lên các tế bào

bằng từ trường, giúp loại bớt các tế bào ma Trong thí nghiệm được tiến hành để đối chứng, chúng tôi tiến hành gắn trực tiếp 20 µl kháng thể đơn dòng antiCD4

lí tiếp theo cũng được tiến hành tương tự như trên chỉ khác là không có tuyển từ Các tế bào sau khi phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể được bảo quản trong

50 µl PBS lạnh, bổ sung 1% ABS và 10% glycerol 5 µl dung dịch chứa tế bào được nhỏ lên một tấm kính (slide glass) rồi được phủ lên bằng một phiến kính mỏng (cover glass) để tiến hành quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axio Cường độ phát huỳnh quang được xử lý bằng phần mềm Scion Image

Một số hình ảnh về các tế bào được chụp từ kính hiển vi huỳnh quang

Hình 6 là ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường (6A, 6C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm và ánh sáng huỳnh quang 520nm (6B, 6D) Đối với các mẫu được chụp trên hình 3.8 chưa được tuyển từ nên dưới ánh sáng thường (6A, 6C) có thể nhìn thấy tế bào hồng cầu và nhiều loại tế bào bạch cầu Có thể nhận biết được loại tế bào dựa vào hình dạng của chúng Khi chụp dưới chế độ phát huỳnh quang (6B, 6D) thì chỉ

và các tế bào bạch cầu dạng khác Lý do là vì các kháng thể đơn dòng antiCD4 phát huỳnh quang rất đặc hiệu, chỉ gắn với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào

Hình 6: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T riêng lẻ được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C ) và dưới ánh sáng kích thích (480 nm) (B, D) sau khi chúng được gắn kết với kháng thể đơn dòng phát huỳnh quang

bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (7A, 7C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm (7B, 7D) nhưng khác so với mẫu ở hình 6 là các

tế bào này được được gắn kết với các hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 (*antiCD4-NP) và đã được tuyển từ

Không giống như hình 6 trong hình 7 không thấy xuất hiện nhiều các tế bào hồng cầu hay tế bào bạch cầu loại khác Hơn nữa tín hiệu thu được dưới chế độ ảnh chụp huỳnh quang (7B, 7D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu

thể huỳnh quang mà không có hạt nano

Hình 7: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C) và dưới ánh sáng kích thích (480nm) (B, D) sau khi được

gắn kết với hạt nano đã được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể antiCD4 phát