Tìm hiểu về hợp chất tự nhiên của cây mù u (Calophyllum Inophyllum)

Tìm hiểu về hợp chất tự nhiên của cây mù u (Calophyllum Inophyllum)

Đại học Quốc gia TpHCM Trường Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ Thuật Hóa Học

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Tiểu luận

Công Nghệ Tế Bào

chủ đề: Tìm hiểu về hợp chất tự nhiên của

Tên Việt Nam gọi là cây Mù U ng H ng

Tên ti ng nh gọi là Ballnut, Alexandrian Laurel

Tên khoa học: Calophyllum inophyllum L., loài C.inophyllum thuộc chi

Calophyllum, họ Calophyllaceae, bộ Malpighiales giới Plantae

1.2 Phân bố

c tr ng rộng r i ở v ng nhiệt ới trên th giới M u c bi t n từ hàng ngàn năm tr ớc tại quần ảo Tahiti M u có nhiều chủng loại trong ó loại Calophyllum inophyllum c chú ý nhiều nhất quả nhỏ cho hạt gọi là tamanu chứa chất dầu màu xanh lục có m i thơm

Loài của Ấn ộ Thái Lan Lào ampuchia Việt Nam Nam Trung Quốc Malaixia In ônêxia n châu ại D ơng Ở n ớc ta có gặp từ Hải Phòng vào

n v ng bờ biển Bà Rịa - Vũng Tàu

ây mọc hoang dọc theo các sông rạch v ng ng bằng ven biển ũng th ờng

c tr ng làm cây bóng mát dọc ờng phố nh ở Quảng Ninh (Quảng Yên) và Hải Phòng (Ki n n)… và cây lấy dầu ở nhiều nơi

1.3 T nh ng b o n

Là loài cây a tác dụng biên ộ sinh thái rộng

1.4 Đặc điểm sinh học

ây a sáng mọc khá nhanh ây có tốc ộ tăng tr ởng trung b nh nơi thích

h p cây 13 tuổi có thể cao 8 m ờng kính 8 cm Hàng năm cây ra hoa k t quả 2 lần lần ầu ra hoa tháng 5-8 quả chín tháng 9-11; lần sau ra hoa tháng 11-1 quả chín tháng 3-4 ây a sáng lúc nhỏ cần che bóng nhẹ thích h p với nơi nhiệt ộ

b nh quân năm 24-28o l ng m a hàng năm 900-2800mm ây sống c trên nhiều loại ất kể cả ất mặn ven biển và ất á vôi ây chịu hạn tốt nh ng không chịu c s ơng giá

1.5 Đặc điểm h nh h i

1.5.1 Rể

Hệ rễ hỗn h p rễ cọc và rễ bên ều phát triển mạnh

Lá lớn lá ơn mọc ối h nh trái xoan, thon dài, ầu và uôi t ôi khi hơi

l m ở ầu dài 8-18cm rộng 4-9cm Lá dầy bóng Gân bên thô nhiều gân phụ nhiều nhỏ song song và gần nh thẳng góc với gân chính nổi r cả hai mặt Cuống lá dày và bẹt

1.5.4 Hoa

H nh 3:Hoa Calophyllum inophyllum L

ụm hoa ch m ở nách lá hay ở ngọn cành g m 5 - 16 hoa th ờng là 9 lá cuống hoa dai 1-4cm Hoa màu trắng hay vàng cam có 4 lá dài 4 cánh hoa nhiều nhị x p thành 4 - 6 bó bầu một lá no n với 1 no n ính gốc 1 vòi nhụy nhị dài bằng vòi nhụy

- 3 -

1.5.5 Quả- hạt

Quả hạch h nh cầu hay h nh trứng ờng kính 2,5-3cm Khi quả mới

h nh thành có màu xanh lá vỏ quả mịn Khi chín màu vàng nhạt vỏ quả nhăn chứa một hạt có vỏ dày và một lá mầm lớn dần dần Thời gian ngủ dài t lệ nảy mầm thấp

M a quả chín tháng 10 - 12

Hạt m u chứa 26 - 51% dầu riêng nhân hạt chứa 50 2 - 73% dầu; dầu này

g m 71 5 - 90 3% dầu béo và 9 7 - 28 5% nhựa

Quả chín rụng r i khô vỏ sẽ cho nhiều dầu nhất Nên thu từ tháng 10 n tháng 2 năm sau Hạt d ng t ơi hay ép lấy dầu Thu hái quả tốt nhất vào lúc cây có 7-10 năm tuổi

Dầu M u chứa 3 nhóm lipid căn bản: lipid trung tính glycolipid và

phospholipid; Một acid béo gọi là calophyllic acid; Một chất kháng sinh mang vòng lactone và một chất kháng viêm không steroid gọi là calophyllolide Ngoài

ra còn có chất kháng viêm coumarine tạo nên những hoạt tính bảo vệ sức khỏe V th dầu M u có tác dụng kháng khuẩn kháng viêm và giảm au ặc tính làm liền sẹo và giảm au ch a c giải thích trong y văn d c công nhận Trong dầu còn có acid linoleic và acid oleic (70%) có nhóm epoxy…

Lá chứa saponin và acid hydrocyanic Lá ộc với cá

H nh 4: Quả còn non H nh 5:Hạch nhân cứng

- 5 -

2.2 Cây:

ây có tán ẹp có thể tr ng làm cảnh tr ng rừng phòng hộ v ng ven biển Mù

u còn là cây chống gió và chống cát bay ở v ng ven biển

2.3 h

Nhựa thu quanh năm phơi khô tán bột

Nhựa M u có màu trắng vị mặn tính rất lạnh; có tác dụng gây nôn giải các loại ngộ ộc bụng tr ớng ầy Nhựa m u d ng bôi làm tan các chỗ s ng tấy chữa họng s ng không nuốt c cam răng tẩu m thối loét và các mụn tràng nhạc không tiêu các mụn nhọt v t loét nhiễm tr ng tai có mủ

Mủ d ng ngoài ể làm lành sẹo nhất là ể trị bỏng

H nh 8: Nhựa cây

H nh 7: ây c tr ng chắn gió che bóng mát

Dầu m u c thu nhận từ các bộ phận của cây ặc biệt là từ quả hạch

ó nhiều ứng dụng trong y học m phẩm năng l ng và các ngành công nghiệp khác…

3) C t t

- Vỏ cây : chứa 11 9% tannin acid hữu cơ saponin triterpen hytosterol tinh dầu coumarin vàexudes

- Nhân hạt : chứa 50 2-73% tinh chất dầu

- Lá : chứa saponin acid cyanhydric, friedelin và triterpenes của nhóm friedelin, cụ thể là canophyllal, canophyllol và canophyllic acid, và từ các xanthones gỗ nh mesuaxanthone B và thu c calophyllin B

- Vỏ hạt : chứa các ion Leucocyanidin

H nh 9: Vỏ cây m u

- 7 -

- Dầu trong quả có một phần không tan trong c n g m các glycerid và phần tan trong c n chứa tinh dầu nhựa và các lacton phức h p (dẫn xuất coumarin): calophyllolid mophyllolid acid calophyllic hất calophyllolide có tính chất

chống ông máu nh các coumarin khác

II APONIN T M U

1) G t u v s o

- Saponin là một glicozit tự nhiên th ờng gặp trong nhiều loài thực vật Saponin

có tính chất chung là khi hoà tan vào n ớc có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt có tính chất phá huy t ộc ối với ộng vật máu lạnh nhất là

ối với cá tạo thành phức với cholesterol có vị hắc và làm hắt hơi mạnh Một vài ộng vật cũng có saponin nh các loài hải sâm, cá sao

- ác saponin ều là các chất hoạt quang Th ờng các steroit saponin th tả truyền còn triterpenoit saponin th hữu truyền iểm nóng chảy của các sapogenin

th ờng rất cao

- D ới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axít loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần g m genin gọi là sapogenin và phần ờng g m một hoặc nhiều phân tử ờng ác ờng phổ bi n là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axít galactunoic, axít D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan

nh sapogeninsteroi hoặc sapogenintritecpen dạng β-amirin (axít olenoic) dạng amirin (axít asiatic) dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng

α Dựa vào cấu trúc thành phần hóa học của saponin ng ời ta chia saponin ra làm

 Lá : chứa saponin và acid cyanhydric

 Có hể iế xuấ s ponon ừ câ mù u

ắn saponin

M u th ờng c nhân giống bằng hạt trong v ờn ơm Hạt nảy mầm không

ều trong môi tr ờng phát triển thích h p Hạt t ơi có t lệ nảy mầm cao khoảng 90% Hạt có thể c bảo quản trong iều kiện lạnh, khô trong vài tháng

H nh 10: Hạt giống c gieo trên môi

tr ờng phát triển thích h p cho nẩy mầm

- 10 -

Tr ớc khi tr ng, quả chín (có vỏ màu vàng hoặc nâu có n p nhăn ) có thể

c làm sạch bằng cách ngâm qua T lệ nảy mầm c nâng cao n u vỏ bị nứt với kìm hoặc mallet tr ớc khi gieo (Wilkinson và Elevitch 2004)

Trong một nghiên cứu nảy mầm trung bình là 3 tuần loại hoàn toàn vỏ hạt giống nh ng 5 tuần cho hạt nứt vỏ và 8 tuần n u quả ch a bóc vỏ (Parras) Còn non cây thích bóng râm nh ng cần c phát triển d ới ánh mặt trời ầy ủ sau 1-2 tháng ây giống phải mất n 6 tháng trong v ờn ơm tr ớc khi ạt

n một chiều cao là 25-30cm khi ó có thể em ra tr ng (Wilkinson và

Elevitch 2004 )

Việc nhân giống trong v ờn ơm mất rất nhiều thời gian mà hiệu quả không

ng ều cây giống có tính chất không ng nhất V vậy việc lựa chọn nhân

giống invitro vẫn c sử dụng với nhiều u iểm hơn

5) V â ây Calophyllum Inophyllum

a c đ ch nhân giống

- Nhân giống nhanh giải quy t vấn ề về thời gian ngủ dài và t lệ nảy mầm thấp của hạt

- Thu nhận h p chất saponin

H nh 11: ây con c chuyển

ra bầu thuận l i cho vận chuyển

- 12 -

H nh 12: a: Cây Calophyllum Inophyllum.Linn, tại Harne (cây ngoài tự nhiên)

b: trái cây h nh quả hạch c: hạt giống sau khi phá vỡ vỏ quả trong, rất cứng d: hạt giống nảy mầm trong ống nghiệm trên WPM ầy ủ sức mạnh (45 ngày sau khi cấy)

e: phổ bi n của nhiều ch i từ một oạn ơn nốt thân cây giống sau 7 tuần lễ nuôi cấy trên WPM môi tr ờng có 0,91 μM TDZ f: dài, nhiều ch i có kích th ớc> 4,0 cm

g: cây con tốt, bắt ngu n từ tr ớc chuyển vào hỗn h p bầu

h: c di thực cây tr ng 3 tuần sau khi chuyển giao cho nhà kính i: nhân giống trong ống nghiệm cây con 4 tháng sau khi chuyển vào các chậu

ối với việc nảy mầm trong ống nghiệm nguyên liệu c sử dụng là trái cây tr ởng thành c d ng những thi t bị ể loại bỏ các vỏ quả trong cứng nh á và sử dụng hạt giống (H nh 12c) Sau ó chúng c rửa k bằng chất tẩy rửa giải pháp (Labolene 0 1% v / v; Qualigens Ấn ộ) nh là n ớc

bề mặt trong 5 phút và sau ó rửa sạch với vòi n ớc (× 5) ti p theo là rửa bằng chất khử tr ng (10% Savlon,v / v; Johnson và Johnson Ltd Ấn ộ) Các hạt này sau ó rửa k bằng n ớc cất hai -ba lần (DDW) (× 3) và c xử lý bằng polyvinylpyrrolidone không hòa tan (0 1% w / v; Sigma M ) trong 30 phút và sau ó là chống nấm ại lý (Bavistin w 1% / v; B SF Ấn ộ) trong

30 phút Hạt giống c rửa sạch lại với DDW (× 5) Tất cả thao tác xử lý

c thực hiện trong iều kiện vô tr ng trong tủ cấy

- 13 -

ác hạt giống c rửa trong c n (70% v/v; Merck Ấn ộ) từ 15-20giây,

r i rửa sạch với n ớc cất vô tr ng (Shin Dong Wook) (× 3) ti p theo là thủy ngân clorua (0,1% w/v; Qualigens Ấn ộ) trong 5 phút và cuối c ng rửa k với Shin Dong Wook (× 7) Hạt giống c tiền ngâm trong Shin Dong Wook và / hoặc acid gibberellic (G 3; 0 058 μM) và / hoặc un nóng ở 35° và sau ó ngâm trong G 3 (0 058 μM) trong 24 giờ tr ớc khi tiêm ối với tỷ lệ nảy mầm bốn loại môi tr ờng c thử nghiệm tức là môi tr ờng hormone thực vật tự do (WPM) và / hoặc bổ sung với 6-benzyl-aminopurine (B P; 2 22 μM)

và một nửa sức mạnh và môi tr ờng giàu dinh d ỡng Murashige và Skoog (MS)

mà không có bất k chất iều hòa tăng tr ởng Tất cả các môi tr ờng c bổ sung với sucrose (2% w/v) và ộ pH c iều ch nh ể 5 6-5,8 với dung dịch NaOH (0,1N) Tất cả các môi tr ờng c ông tụ với thạch 0 80% (w/v, Qualigens) iều ch nh tăng tr ởng c tích h p vào các môi tr ờng

tr ớc khi hấp

Các môi tr ờng nuôi cấy c hấp trong autolaved ở 1 05 kg.cm-2 và 121°C cho 20 phút tr ớc khi sử dụng Một hạt giống c cho vào mỗi chai

mô sẹo thủy tinh (Laxbro Ấn ộ) với 50 hạt /lần xử lý Các mô sẹo c ủ

ở 25 ± 1° d ới ánh sáng trắng huỳnh quang (16/8 giờ photoperiod,

35 μmol.m-2

.s-1; Philips Ấn ộ) ác tần số của hạt giống nảy mầm c ghi

c sau 25 ngày kể từ ngày nuôi cấy, dựa trên năm lần lặp lại cho mỗi thử nghiệm

ác cây giống nảy mầm trong ống nghiệm c lấy ra từ chai mô sẹo trong iều kiện vô tr ng ở tủ cấy vô tr ng Lấy oạn thân c thực hiện bằng cách sử dụng l ỡi dao phẫu thuật vô tr ng Việc cắt oạn thân cây giống (một cho mỗi chai mô sẹo) sau ó c cho vào hormone WPM tự do và / hoặc WPM có bổ sung BAP (2,22-44 00 μM) hoặc thidiazuron (TDZ; 0 91-

4,54μM) Các mô sẹo iều kiện t ơng tự với các thử nghiệm nảy mầm

ó nhiều ch i xuất hiện sau hơn 20 ngày kể từ ngày nuôi cấy n giai

oạn 60 ngày Việc cấy trên tất cả các môi tr ờng k t h p c cấy chuyền hai lần trong giai oạn này tại thời iểm 20 ngày ác ch i ra nhiều trên B P (2,22- 8 90 μM) và TDZ (0 91-4 54 μM) cũng kéo dài trên cùng trung

bình Các ch i còi cọc xuất hiện trên n ng ộ cao hơn của B P (13 30-44,00 μM) và một số từ TDZ (0,91-4 54 μM) c kéo dài trên môi tr ờng WPM không có bất kỳ iều hòa sinh tr ởng ác ch i kéo dài c chuyển n một nửa và WPM ầy ủ dinh d ỡng hoặc bổ sung với axit indole-3-butyric (IBA; 2,46-24 60 μM) một m nh hoặc k t h p với 2 22 μM B P cho cảm ứng gốc ối với tất cả các ph ơng pháp nuôi cấy tối thiểu là 50 ch i với ba lần lập lại c duy tr Việc bén rể từ ch i c thích nghi với môi tr ờng hỗn h p ất khử tr ng, ca cao than bùn và cát (1: 2: 1) trong iều kiện nhà kính cho bốn tuần và sau ó chuyển giao cho ất chậu cho thêm tăng tr ởng

và phát triển trong v ờn ơm Những vi nhân giống cây c tr ng sau 3-5 tháng trong v ờn ơm

Phân tích ph ơng sai (ANOVA) c thực hiện bằng các khối ngẫu nhiên hoàn ch nh bằng cách sử dụng phần mềm Agrobase 99 cho tất cả các thí nghiệm và giá trị các góc cạnh c chuyển ổi dựa trên Snedecor và

Cochran19 Nảy mầm của hạt c quan sát sau 10-15 ngày nuôi

cấy trên tất cả các tổ h p môi tr ờng N u không có hormon thực vật, hạt

giống nảy mầm trên môi tr ờng MS cơ bản là ng ời nghèo chất dinh d ỡng (24-42%) và chậm so với môi tr ờng WPM cơ bản có hoặc không có

hormone, trong ó cho thấy tốt hơn và nhanh hơn nảy mầm (36-78%)

tr ớc khi cấy vào môi tr ờng WPM mà không cần bất cứ kích thích tố tăng

tr ởng (H nh 12d) Tuy nhiên n u thời gian ngâm lên n 36-48h tỷ lệ nảy mầm không tăng thêm mà làm cho mẫu sẹo dễ bi nhiễm Do ó iều kiện ngâm 24h là tối u cho hạt nảy mầm Trung b nh tất cả các hạt giống ều nảy mầm trong 10-15 ngày, cây tăng tr ởng và mất khoảng 25-30 ngày ể phát triển thành cây con hoàn ch nh cao khoảng 5-8cm Khi cây con nảy mầm có kích th ớc lớn hơn 5 cm sử dụng oạn thân nuôi cấy trong môi tr ờng

hormone tự do WPM và/hoặc môi tr ờng WPM bổ sung BAP (2,22-44,00μM) hoặc TDZ (0,91-4,54 mM) cảm ứng cho ch i nhiều Sự cảm ứng ch i c quan sát cẩn thận trong 10-15 ngày sau khi cấy ác k t quả quan sát c ghi nhận từ ngày thứ 20 n ngày thứ 60 của giai oạn nuôi cấy (Bảng 1)

Ch i c tạo ra trong nuôi cấy với n ng ộ (2,22; 22,19 và 44,00 μM) BAP nhiều hơn so với n ng ộ (4,40; 8,90 và 13,30 mM) N ng ộ thấp

TDZ(0,91μM), ch i c tạo ra bằng với số l ng các ch i ở các n ng ộ cao của BAP (44,0 mM) sau 20 ngày kể từ ngày nuôi cấy Sau 60 ngày kể từ ngày nuôi cấy, quan sát thấy số l ng tối a ch i là 20,9 mỗi cấy với TDZ

(0,91 mM; hình12e) Tất cả các n ng ộ BAP tạo ra ch i 6,4-13,3 mỗi mẫu cấy ANOVA cho thấy rằng BAP (2,22, 22,19 và 44,00 μM)

và TDZ (4,54 μM) áng chú ý ở mức 5%, trong khi TDZ (0,91 và 2,27μM)

c t m thấy là có ý nghĩa ở mức 1% Trên cơ sở thống kê phân TDZ tỏ ra tốt hơn so với B P trong nuôi cấy ch i non v TDZ tạo ra số l ng ch i non lớn hơn nhiều ở n ng ộ thấp hơn hẳn Mặc d nhiều ch i cần phát triển ở n ng ộ

B P cao nh ng các ch i ều có kích th ớc lớn hơn 4.0 (h nh 12f) khi c nuôi cấy trong môi tr ờng n ng ộ B P thấp (2,22 và 4,40 mM)

Nói chung các ch i dài c tạo ra tại n ng ộ B P thấp Tuy nhiên TDZ ngay cả ở n ng ộ rất thấp ch khoảng (0 91 mM) vẫn tạo ra c nhiều ch i Ngoài ra tỷ lệ kéo dài các ch i ể có kích th ớc> 4 0cm cao hơn áng kể (4,9-7 2 mỗi cấy) so với B P (Bảng 2) Lý do có thể là auxin và cytokinin hoạt hóa Số l ng các mẫu cấy có chiều dài lớn nhất 8 7 trên mẫu cấy (có ý nghĩa ở P = 0 01) c chú ý trên WPM có bổ sung B P (2 22 mM)

ộ WPM có bổ sung 2 46μM IB

Các cây con ra rể c chuyển vào nuôi trong môi tr ờng hỗn h p của ất than b n và cát khử tr ng (1: 2: 1) và c làm thích nghi trong iều kiện nhà kính với các iều kiện nhiệt ộ là 25 ± 2° ộ ẩm t ơng ối 80% tỷ lệ sống sót là 77% sau năm tuần (H nh 12h) Những cây phát triển tốt và khỏe sau 8 tuần c chuyển sang ất chậu có chứa một hỗn h p của ất v ờn và â t trô ng trọt có phân bón theo t lệ (1: 1) nhằm giúp cây phát triển hơn nữa (Hình12 i) và cuối c ng cây tr ng ngoài tự nhiên ông việc nhân giống C inophyll trong ống ngiệm nhằm bảo t n inophyllum Linn một loài cây

d c liệu với rất nhiều ứng dụng quan trọng ( ặc biệt là trong iều trị bệnh AIDS) tr ớc những mối e dọa