Vì vậy, việc định hướng chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào dòng bố, kết hợp với dòng mẹ sẵn có để nâng cao năng suất và tính kháng bạc lá trên nền tổ hợp lúa lai LC212 là hết sức cần thiết
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Trang 2Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Nguyễn Văn Hoan
2 PGS.TS Vũ Thị Thu Hiền
Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Trâm
Hội Giống cây trồng Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thế Hưng
Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên
Phản biện 3: TS Nguyễn Trọng Khanh
Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng Đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2020
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Lương Định Của - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Trang 3PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong sản xuất lúa gạo thì lúa lai là một trong những thành tựu khoa học nông nghiệp lớn nhất của thế kỷ XX Lúa lai có năng suất cao hơn lúa thuần từ 15-20%, do
đó lúa lai được coi là cây xóa đói của nhiều Quốc gia châu Á Tuy nhiên, thực tế các giống lúa lai hay bị bệnh bạc lá gây hại, đặc biệt khi gieo cấy trong vụ Mùa và trong điều kiện thâm canh
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv Orzae gây ra, là một trong
những bệnh gây hại đến nhiều vùng trồng lúa trên thế giới, ở mức độ nhẹ chúng làm cho lá lúa bị trắng do mất diệp lục dẫn đến lá khô và chết làm giảm khả năng quang hợp; ở mức độ nặng khi gây hại vào giai đoạn lúa trỗ bông và chín sữa bộ lá bị cháy làm mất khả năng quang hợp Đặc biệt, chúng gây hại ở cổ bông sẽ làm chết các bó mạch dẫn truyền chất dinh dưỡng về hạt, bệnh nặng có thể không cho thu hoạch
Đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được 45 gen kháng bệnh khác
nhau trên thế giới được ký hiệu từ Xa1 đến Xa46 (chưa có Xa37) Nhiều nghiên cứu
cho thấy gen kháng bệnh bạc lá lúa hiệu quả cho các tỉnh phía Bắc Việt Nam là các
gen xa5, Xa7 và Xa21 Trong đó gen Xa21 đã được Học viện Nông nghiệp Việt Nam
chuyển thành công vào dòng mẹ 103S (ký hiệu là 103BB21S)
LC212 là giống lúa lai hai dòng do Trung tâm Giống Nông lâm nghiệp Lào Cai chọn tạo từ dòng mẹ 103S và dòng bố R212 LC212 có thời gian sinh trưởng trung bình, cứng cây, đẻ khỏe, hạt xếp xít, năng suất cao, thích ứng rộng với các vùng sinh thái Tuy nhiên, giống lúa lai LC212 không kháng được bệnh bạc lá nên đã hạn chế trong việc mở rộng diện tích ra các tỉnh phía Bắc và có nguy cơ rủi ro trong gieo cấy
Vì vậy, việc định hướng chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào dòng bố, kết hợp với dòng mẹ sẵn có để nâng cao năng suất và tính kháng bạc lá trên nền tổ hợp lúa lai LC212 là hết sức cần thiết trong điều kiện sản xuất hiện nay Đồng thời sử dụng các dòng lúa bố cải tiến làm vật liệu khởi đầu cho chọn tạo các tổ hợp lúa lai mới là hướng
đi đúng cho các nhà chọn tạo giống lúa
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Chọn tạo được dòng R212 chứa gen Xa7, trên cơ sở lai chuyển gen Xa7 vào dòng
R212 tạo ra dòng R212BB7, kết hợp với dòng mẹ 103S và 103BB21S tạo ra giống lúa lai hai dòng mới kháng được các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam
1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Dòng R212 là dòng bố của giống lúa lai hai dòng LC212; Dòng TGMS 103S,
TGMS 103BB21S; Dòng IRBB7 chứa gen Xa7
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tập trung vào lai chuyển gen Xa7 vào dòng R212, đánh giá đặc điểm
nông sinh học và tính kháng bệnh bạc lá của các dòng R212BB7 cải tiến Tổ chức đánh giá hiệu quả nhân dòng lúa bố, mẹ Tiến hành lai tạo các tổ hợp giữa dòng R212BB7 với dòng mẹ 103S và 103BB21S, đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học, năng
Trang 4suất và khả năng kháng bệnh bạc lá của các tổ hợp mới chọn tạo và tổ chức khảo
nghiệm sản xuất các tổ hợp lúa lai hai dòng mới chứa gen Xa7 và Xa21
1.3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng Việt Nam - Nhật Bản, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm giống Nông lâm nghiệp tỉnh Lào Cai và các điểm khảo nghiệm tại Sóc Trăng, Lào Cai, Nam Định, Vĩnh Phúc, Thanh Hóa Thời gian nghiên cứu: Vụ Xuân 2011 đến 2016
1.4 TÍNH MỚI VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả nghiên cứu của đề tài là minh chứng cho sự thành công của phương pháp lai chuyển gen mục tiêu (gen kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá) vào dòng cho phấn, kết quả lai tạo và chọn lọc được 2 dòng bố cải tiến là R212BB7-632-2-4-2 và
R212BB7-575-1-1-4 chứa gen Xa7 kháng được 3 nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ
biến ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam
Nghiên cứu đã lai tạo và chọn lọc được 2 giống lúa lai LC632 và LC575 chứa 2
gen kháng bệnh bạc lá Xa7, Xa21 kháng được 3 nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến
ở các tỉnh phía Bắc, những tổ hợp lúa lai cải tiến này vẫn mang được những đặc tính
cơ bản có lợi của tổ hợp lúa lai ban đầu LC212
1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài
Cung cấp thông tin, dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho chọn tạo hoặc cải
tạo giống lúa lai hai dòng kháng bạc lá, thông qua chuyển gen trội Xa7 vào dòng bố Việc lai chuyển gen Xa7 thành công vào dòng lúa bố tạo ra được nguồn vật liệu mới, đồng thời
giúp duy trì dòng mang gen mục tiêu dễ dàng hơn so với việc duy trì gen mục tiêu ở dòng
mẹ TGMS
Việc tái tổ hợp chọn tạo được 2 giống lúa lai LC632, LC575 mang hai gen kháng
Xa7 và Xa21 kháng được 3 nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá là minh chứng cho việc phối hợp
hai gen để tạo nên tính kháng cao và bền vững với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
Đề tài cũng là cơ sở cho việc nghiên cứu chuyển nhiều gen mục tiêu khác trong chọn tạo giống lúa lai, góp phần phát triển lúa lai ở Việt Nam
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Sản phẩm của đề tài đã tạo ra được các dòng lúa bố R212 cải tiến mang gen Xa7 kháng cao với 3 nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá phổ biến ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam Các dòng R212 cải tiến được sử dụng làm vật liệu để nghiên cứu chọn tạo giống lúa lai kháng bệnh bạc lá
Nghiên cứu đã chọn tạo được 2 tổ hợp lúa lai hai dòng LC632 và LC575 trên cơ
sở sử dụng dòng mẹ 103BB21S và dòng bố mới chọn tạo Hai tổ hợp lúa lai mới có ưu điểm về tính kháng bệnh bạc lá và có tiềm năng năng suất cao hơn với tổ hợp lúa lai ban đầu LC212 Các giống lúa mới có thể phát triển phục vụ trực tiếp cho sản xuất, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất lúa ở các tỉnh phía Bắc Đặc biệt là giảm sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, hạ giá thành sản xuất và hạn chế ô nhiễm môi trường
Trang 5PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA LAI
2.1.1 Nghiên cứu và phát triển lúa lai trên thế giới
Các nước trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu và phát triển lúa lai, trong đó Trung Quốc là nước nghiên cứu và phát triển lúa lai ứng dụng mạnh nhất thế giới Đến năm 2016 Trung Quốc công nhận và thương mại hóa 156 giống siêu lúa lai Năm 2014, Ấn Độ đã chọn được 70 tổ hợp lai trong đó có 31 tổ hợp lai do các đơn
vị nhà nước chọn tạo và 39 tổ hợp lai do các công ty tư nhân chọn tạo
Năm 2008, tỷ lệ trồng lúa lai của Philippines là 10,2% diện tích đứng thứ 2 thế giới sau Trung Quốc Năm 2013, Phillipine có 53 giống lúa lai được công nhận Năm 2004, diện tích lúa lai của Bangladesh mới đạt 6.147 ha, chỉ chiếm 0,5% tổng diện tích trồng lúa, đến năm 2008 tăng lên 735.000 ha (gấp 122,5 lần so với 2004), cao hơn Việt Nam tới 90.000 ha
Indonesia và Thái Land cũng đã nghiên cứu và chọn được một số giống lúa lai phù hợp với điều kiện của mỗi nước
2.1.2 Nghiên cứu và phát triển lúa lai ở Việt Nam
Đến nay có hơn 20 dòng TGMS mới được chọn tạo trong nước, trong đó có dòng: T1S-96, 103S, AMS-30S, T7S, 135S, TG1S được sử dụng rộng rãi Các dòng này cho con lai ngắn ngày, chất lượng gạo khá tốt, đặc biệt dễ sản xuất hạt lai (Phạm Đồng Quảng, 2005) Vũ Hồng Quảng đã sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử (MAS) chọn tạo dòng mẹ bất dục mới kết quả đã chọn được 2 dòng mẹ bất dục mang gen tương hợp rộng là: TGWCG530S và TGWCG111S Các nhà chọn giống lúa lai trong nước chọn tạo thành công dòng P5S từ tổ hợp lai T1S-96/Peiải64S Dòng P5S này hữu dục khi độ dài ngày ngắn hơn hoặc bằng 12h16' và bất dục hoàn toàn khi độ dài ngày lớn hơn 12h30' (Trần Văn Quang & Nguyễn Thị Trâm, 2006)
- Chọn tạo dòng bố: Chọn tạo được 17 dòng bố mới đưa vào sử dụng, trong đó: 10 dòng bố mang gen kháng bạc lá đã thuần đưa vào sử dụng lai tạo ra tổ hợp mới; 5 dòng bố mới ngắn ngày mang gen kháng rầy nâu và đạo ôn; 2 dòng bố thơm (Lê Hùng Phong & cs., 2016)
- Chọn tạo giống lúa lai: Bộ Nông nghiệp & PTNT công nhận nhiều tổ hợp lúa lai hai dòng, ba dòng như HYT100, Việt lai 20, Việt lai 24, TH3-3, TH3-4, TH3-5, TH7-
2, CT16, LC25, LC212, LC270,…
- Duy trì và sản xuất hạt giống bố, mẹ: Giai đoạn 2015-2017 sản xuất 135,5 ha hạt giống bố mẹ, sản lượng 260 tấn hạt giống dòng lúa mẹ, 55 tấn hạt giống dòng bố Chất lượng đảm bảo, giá thành giảm 30-40% so với giá nhập khẩu
2.1.3 Diện tích và năng suất và sản xuất lúa lai Việt Nam
Năm 1995, diện tích lúa lai gieo cấy 73,503 ha (chiếm 1,08%) diện tích lúa cả
Trang 6nước Đến năm 2008 diện tích lúa lai tăng lên 620.000 ha Năm 2010, diện tích lúa lai đạt 709.816 ha, đây cũng là năm có diện tích lúa lai đạt cao nhất chiếm 9,54% diện tích gieo trồng lúa (Nguyễn Thị Trâm, 2011) Năm 2014 diện tích lúa lai của Việt Nam dao động xung quanh 700.000 ha Năm 2016 diện tích lúa lai có xu thế giảm do nhiều
lý do, trong đó có nguyên nhân do sâu bệnh Diện tích lúa lai năm 2016 cả nước đạt 650.000 ha; năm 2017 chỉ đạt xấp xỉ 600.000 ha
Năng suất bình quân lúa lai (61,4 tạ/ha) từ năm 1995-2010 cao hơn năng suất lúa bình quân cả nước từ 24,28% đến 66,39% Năng suất lúa lai tăng dần theo từng giai đoạn, giai đoạn năm 2003 đến năm 2010 năng suất lúa lai đạt trên 63,0 tạ/ha
Năm 1992, diện tích sản xuất hạt F1 chỉ có 173 ha, năm 2000 là 620 ha, năm 2007 diện tích sản xuất hạt lai cao nhất 1.900 ha, vùng sản xuất hạt giống lúa lai F1 tại Quảng Nam, Nghệ An, Thanh Hóa, Lào Cai, Bắc Giang, Đắc Lắc,…
Sản xuất hạt giống lúa lai trong nước, năm 1994 chỉ đáp ứng được 3,27% nhu cầu, giai đoạn 2006-2017 sản xuất đáp ứng được 25,87%-28,5% nhu cầu Do vậy, việc đẩy mạnh nghiên cứu lúa lai sản xuất trong nước đang là nhu cầu cần thiết trong tình hình sản xuất lúa lai hiện nay của nước ta
2.1.4 Những hạn chế trong nghiên cứu và phát triển lúa lai ở Việt Nam
Việt Nam chưa có nhiều dòng bố mẹ có khả năng kết hợp và ưu thế lai cao, dòng
mẹ có khả năng nhận phấn tốt, bất dục không ổn định Nên chưa có nhiều tổ hợp lai có hàm lượng amiloza thấp, có mùi thơm, đặc biệt còn thiếu các tổ hợp lai chống chịu sâu bệnh như rầy nâu, đạo ôn, bạc lá và chống lại được các điều kiện bất thuận
2.1.5 Những định hướng trong nghiên cứu và phát triển lúa lai
Chọn tạo các dòng mẹ có khả năng nhận phấn cao, đậu hạt tốt;
Lai chuyển gen, quy tụ gen có mục đích vào các dòng lúa bố, mẹ;
Chọn tạo các giống lúa siêu năng suất
2.2 DI TRUYỀN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ Ở LÚA
2.2.1 Nghiên cứu về vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa và nhóm nòi
2.2.1.1 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra nên rất khó phòng trừ, hơn nữa vi khuẩn Xoo gây bệnh ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng
2.2.1.2 Các chủng vi khuẩn và đặc tính gây bệnh
Khi kí sinh gây bệnh vi khuẩn Xoo đã hình thành các axit MTTA, MTPA và PAA
gây ra triệu chứng héo điển hình của lá lúa sau xâm nhiễm của vi khuẩn (Anh Chuong Quoc, 2007) Ở Việt Nam, Lê Lương Tề (1987) nghiên cứu thành phần chủng vi khuẩn được phân thành 10 nhóm,cho thấy thành phần chủng gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam rất đa dạng Về đặc tính gây bệnh của vi khuẩn, các nghiên cứu đã chỉ ra có liên
quan đến 3 nhóm gen: hrp, avr và hrpX
Trang 72.2.2 Mối quan hệ ký sinh - ký chủ, thuyết "gen đối gen"
Trong hệ gen của giống cây trồng chứa những gen có chức năng mã hóa tạo ra những phân tử tiếp nhận giúp cho ký chủ nhận biết được ký sinh tấn công vào, từ đó phát động các phản ứng tự vệ khác nhau để chống lại ký sinh; giống cây trồng đó chứa
gen kháng (R) Chủng ký sinh nào gây hại trên một giống cây ký chủ có gen kháng R thì trong hệ genome của chủng đó phải có ít nhất một gen độc a có thể vượt qua được gen R, khi đó gen độc a được coi là gen độc tương ứng với gen kháng R (Flor, 1971)
2.2.3 Nghiên cứu về nhóm nòi
Trường Đại học Kyushu Nhật Bản và Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã xác định được ở miền Bắc Việt Nam có ít nhất 4 nhóm nòi, phổ biến bao gồm: nòi 1 (HAU 01043), nòi 2 (HAU 02009-2), nòi 3 (HAU 02034-6) và nòi 4 (HAU 02037-1)
2.2.4 Đặc điểm của các dòng lúa đẳng gen làm chỉ thị và nghiên cứu tính kháng bệnh trên lúa dại
2.2.4.1 Đặc điểm của các dòng lúa đẳng gen làm chỉ thị
Trong bộ 12 dòng lúa chuẩn của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế đã xác định các
nhóm nòi vi khuẩn Xoo, trong đó có giống IR24 không chứa gen kháng bạc lá, nó được
sử dụng làm giống đối chứng chuẩn nhiễm
2.2.4.2 Nghiên cứu tính kháng bệnh trên lúa dại
Các nhà khoa học đánh giá 18 loài lúa dại tại IRRI và đã xác định được 2 chủng kháng bệnh bạc lá
2.2.5 Nghiên cứu các gen kháng bệnh bạc lá lúa
Hiện các nhà khoa học đã xác định được 45 gen kháng bệnh khác nhau trên thế giới, tương ứng với mỗi gen kháng bệnh tồn tại nhiều chủng bệnh khác nhau tùy từng vùng sinh thái trồng lúa, có gen kháng được chủng này nhưng lại nhiễm bởi chủng khác, hoặc mỗi gen có thể bị nhiễm hoặc kháng được nhiều chủng Tuy nhiên theo
nghiên cứu của các nhà khoa học thì gen Xa7, Xa21 kháng được các chủng vi khuẩn gây
bệnh bạc lá lúa chủ yếu ở miền Bắc Việt Nam
Các gen kháng bạc lá này được xác định nằm trên 10 nhiễm sắc thể ở lúa Trong
số các gen kháng phần lớn là gen trội (30 gen trội), 14 gen lặn (gồm xa5, xa8, xa11,
xa13, xa15, xa19, xa20, xa24, xa28, xa34, xa41, xa42, xa44, xa45) và gen Xa27 thể
hiện trội không hoàn toàn
2.2.6 Chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh bạc lá lúa
Trong 45 gen kháng thì có 33 gen xác định trên các NST và có chỉ thị liên kết, có
6 gen kháng bạc lá được lập bản đồ vật lý, phân lập và tách dòng trên cơ sở bản đồ Đó
là các gen: Xa21, Xa1, Xa26, xa5, Xa27, xa13
Trang 8Đến nay các gen kháng bệnh bạc lá đã được lập bản đồ ở mức phân tử, việc này giúp cho việc chọn giống nhờ chỉ thị phân tử hiệu quả hơn
2.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA LAI KHÁNG BỆNH BẠC LÁ
2.3.1 Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới
Joan thành công trong việc đưa gen kháng vào 3 giống lúa lai Mestizo 1, Mestizo 2,
Mestizo 3 các gen Xa4, Xa7 và Xa21 vào dòng IR58025B và đã tạo ra 17 dòng B có gen kháng bệnh bạc lá Trung Quốc đã phát hiện được gen kháng bệnh bạc lá Xa26(t) trên
giống Minghui 63 nằm trên nhiễm sắc thể số 11.Wang & cs (2009) sử dụng MAS trong
chọn tạo giống lúa và đã quy tụ được các gen kháng chủ yếu như xa5, Xa7 và Xa21,
vào cùng một giống Loida đã quy tụ thành công 3 gen kháng trội vào dòng mẹ TGMS1
Anil và cộng sự sử dụng chỉ thị phân tử đã xác định được các gen Xa2, Xa4 và xa5 trong các giống lúa dại ở địa phương Ấn Độ mới đây đưa thành công gen Xa38 vào giống lúa Samba Mahsuri (ISM) cải tiến mang 3 gen kháng Xa21, xa13 và xa5 để tăng phổ
kháng bệnh bạc lá
2.3.2 Một số kết quả nghiên cứu ở Việt Nam
Các nhà khoa học đã chuyển gen kháng trội Xa21 vào dòng mẹ TGMS 103S bằng
phương pháp lai lại kết hợp với MAS đã tạo ra được dòng mẹ 103BB21S Nguyễn Văn Hoan & Vũ Hồng Quảng (2005) đã chọn tạo được giống lúa lai Việt Lai 24 mang gen
Xa21 kháng bệnh bạc lá Giống lúa lai hai dòng Việt Lai 24 được tạo ra từ tổ hợp
103S/R24, trong đó R24 được chọn lọc từ quần thể IRBB21 Sử dụng gen kháng bệnh
bạc lá Xa4/Xa7 chuyển vào dòng bố R253 và lai tạo ra Bắc ưu 253 kháng bệnh bạc lá
2.4 CÁC KẾT LUẬN RÚT RA TỪ NGHIÊN CỨU TỔNG QUAN
Từ các nghiên cứu của các tác giả trong nước và trên thế giới cho thấy lúa lai là một trong những thành tựu khoa học của thế kỷ XX, việc lai chuyển các gen kháng bệnh vào các giống lúa đang là xu thế chung của các nhà nghiên cứu lúa Thành phần các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá trên thế giới rất đa dạng và phong phú trong đó
các gen xa5, Xa7 và Xa21 là kháng được hầu hết các chủng gây bệnh bạc lá ở miền
Bắc Việt Nam Các giống lúa mang từ 2 gen kháng trở lên sẽ cho khả năng kháng cao
và có phổ rộng hơn với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá
Do đó để cải tiến dòng phục hồi hạt phấn R212 bằng cách lai chuyển gen Xa7 vào
dòng bố R212 được dòng R212BB7, từ đó kết hợp với dòng TGMS 103BB21S để tạo
ra các tổ hợp lúa lai hai dòng mang gen Xa7 và Xa21 kháng bệnh bạc lá là việc làm hết
sức có ý nghĩa
Trang 9PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1 Các mẫu giống lúa sử dụng làm vật liệu
Dòng cho phấn R212; dòng TGMS 103S; 103BB21S; dòng đẳng gen IRBB7 là dòng cho gen Xa7
Đối chứng R212; dòng IRRBB7 dùng làm chuẩn kháng khi lây nhiễm nhân tạo; giống IR24 dùng làm chuẩn nhiễm; giống lúa LC212 được sử dụng làm đối chứng để đánh giá tổ hợp lai mới chọn tạo ra
3.1.2 Các mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh bạc lá:
Sử dụng 3 mẫu phân lập vi khuẩn Xanthomonas Oryzae gồm:
Mẫu phân lập 1 ký hiệu là MPL1: HAU 01043 (thuộc chủng DCGV-BLB1) thu thập trên giống lúa Bắc thơm số 7 tại Nam Định
Mẫu phân lập 2 ký hiệu là MPL2: HAU 02009-2 (thuộc chủng DCGV-BLB5) thu thập trên giống lúa lai LC25 tại Lào Cai
Mẫu phân lập 3 ký hiệu là MPL3: HAU 02034-6 (thuộc chủng DCGV-BLB8) thu thập trên giống lúa Khang dân 18 tại Thanh Hóa
Môi trường nôi cấy vi khuẩn: Nuôi cấy trên môi trường Wakimoto Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo ở giai đoạn đòng già, đây là giai đoạn xung yếu nhất của cây lúa
3.1.3 Chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu
Xác định gen Xa7 dùng mồi RM5509 với 2 đoạn mồi có trình tự là:
5’- TGATCCATGCTTTGGCC-3’ và 3’-ACTAGGTACGAAACCGG-3’
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Lai chuyển gen kháng bệnh bạc lá Xa7 vào dòng bố R212 và đánh giá dòng;
Chọn tạo các tổ hợp lúa lai cải tiến mang gen kháng bệnh bạc lá;
Đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng
bố cải tiến và sản xuất hạt lúa lai của các tổ hợp lai cải tiến
Đánh giá hiệu quả sản xuất của các tổ hợp lúa lai cải tiến
3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp chuyển gen Xa7 vào dòng R212
- Phương pháp lai chuyển gen: Sử dụng phương pháp lai lại (Backcross) để
chuyển gen Xa7 vào dòng R212 Lựa chọn cá thể R212 điển hình, sau đó đem lai với
IRBB7 tạo ra con lai F1 trong vụ Xuân 2011;
Vụ Mùa 2011 tiếp tục cho lai F1 thu được với R212 ta thu được BC1F1;
Vụ Xuân 2012 tiếp tục lai trở lại BC1F1 với R212 thu được BC2F1;
Vụ Mùa 2012 tiếp tục lai trở lại BC2F1 với R212 thu được BC3F1 Đồng thời lấy
1 phần BC2F1 cho tự thụ thu được BC2F2;
Trang 10Cho 2 dòng tự thụ đến BC2F5 và BC3F4 tiến hành chọn lọc có kiểu hình tương tự R212 đồng thời lựa chọn các dòng cải tiến để làm vật liệu mới
R212 x IRBB7 (Vụ Xuân 2011)
F 1 x R212 (Vụ Mùa 2011)
BC 1 F 1 x R212 (Vụ Xuân 2012)
BC 2 F 1 x R212 (Vụ Mùa 2012)
BC 2 F 2 BC 3 F 1(Vụ Đông Xuân 2012 – 2013 tại Sóc Trăng)
BC 2 F 3 BC 3 F 2 (Vụ Xuân 2013) Lây nhiễm nhân tạo
với vi khuẩn gây bạc lá
Chọn phả hệ BC 2 F 4 BC 3 F 3 (Vụ Mùa 2013) (MAS)
Chọn phả hệ BC 2 F 5 BC 3 F 4 (Vụ Xuân 2014) Lây nhiễm nhân
tạo với vi khuẩn gây bạc lá
R212BB7 R212BB7 (Vụ Mùa 2014)
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ lai chuyển gen Xa7 vào dòng R212
3.3.2 Phương pháp chỉ thị phân tử
Sử dụng phương pháp chọn lọc phả hệ (Pedigree) và MAS để chọn lọc và làm
thuần theo mục tiêu; kiểm tra sự hiện diện của gen Xa7
3.3.2.1 Phương pháp tách chiết ADN
ADN lá non của các mẫu giống lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle & cs (1987)
3.3.2.2 Kỹ thuật PCR
Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đối với cặp mồi RM5509 theo kỹ thuật của McCouch (2002)
3.3.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 4% ở 250V, I = 400 mA, thời gian
50 phút trong dung dịch đệm 0,5X TBE (Tris - Bore - EDTA) Sau đó gel được nhuộm trong ethidium bromide 0,5µg/ml và soi dưới đèn UV và chụp ảnh Các băng trên gel được xác định: xuất hiện (đánh số 1), không xuất hiện (đánh số 0)
3.3.3 Phương pháp lây nhiễm vi khuẩn bạc lá nhân tạo
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu tuần tự không nhắc lại
Đánh giá kháng bạc lá bằng phương pháp nhân tạo; sử dụng phương pháp lây
nhiễm nhân tạo bệnh bạc lá Furuya & cs (2002)
Trang 11Bảng 3.1 Bảng đánh giá mức độ nhiễm bệnh bạc lá lúa
3.3.5 Đánh giá các đặc điểm nông sinh học của con lai F1
Các tổ hợp được bố trí theo kiểu khảo sát tập đoàn không nhắc lại; Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá theo thang điểm của IRRI (2002)
3.3.6 Đánh giá khảo nghiệm sản xuất về năng suất và khả năng kháng bệnh
Các chỉ tiêu theo dõi được đánh giá theo qui chuẩn QCVN 01-55: 2011/BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và PTNT về khảo nghiệm lúa
3.3.7 Phương pháp đánh giá chất lượng gạo
Được đánh giá theo tiêu chuẩn 10 TCN 590 - 2004
3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng phần mềm IRRISTAT 5.0, sử dụng EXCEL và phân tích thống kê
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 CHUYỂN GEN Xa7 VÀO DÒNG R212
4.1.1 Lai chuyển gen Xa7 vào dòng R212 và lây nhiễm nhân tạo
Bằng phương pháp lai lại gen Xa7 từ dòng IRBB7 được chuyển vào dòng bố R212
của tổ hợp lai LC212 trong vụ Xuân 2011 Tại thế hệ BC2F1 tiến hành tự thụ và chọn lọc phả hệ, qua đánh giá các chỉ tiêu nông sinh học và khả năng kháng bệnh bạc lá thông qua lây nhiễm nhân tạo đến thế hệ BC2F5 lựa chọn được các dòng R212 chứa
gen Xa7 (gọi là dòng R212BB7)
Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các cá thể thế hệ BC2F3 với ba mẫu phân lập vi
khuẩn bạc lá trong vụ Xuân 2013 được trình bày ở bảng 4.1
Trang 12Bảng 4.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các cá thể thế hệ BC 2 F 3 và BC 3 F 2 với
ba mẫu phân lập vi khuẩn bạc lá trong vụ Xuân 2013
Chiều dài vết bệnh (cm)
Mức kháng nhiễm
Chiều dài vết bệnh (cm)
Mức kháng nhiễm
Chiều dài vết bệnh (cm)
Mức kháng nhiễm
Ghi chú: HR: Kháng cao; R: Kháng; MR: Kháng trung bình; MS: Nhiễm trung bình; S: nhiễm
Kết quả lây nhiễm nhân tạo của 136 cá thể với 3 mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh bạc lá bao gồm 88 cá thể ở thế hệ BC2F3 và 48 cá thể ở thế hệ BC3F2 đã lựa chọn được
9 cá thể, trong đó: Ở thế hệ BC2F3 chọn lọc được 7 cá thể, (gồm 6 cá thể kháng cao với
cả 3 mẫu vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa: 501; 504; 505; 520; 522 và 575) và cá thể 521 kháng cao với 2 mẫu 2 và 3 và kháng với mẫu 1 Ở thế hệ BC3F2 lựa chọn được 2 cá thể kháng cao với cả 3 mẫu vi khuẩn gây bệnh bạc lá là cá thể 610 và 632
4.1.2 Sàng lọc các cá thể R212 kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử
Vụ Mùa 2013 tiếp tục gieo cấy 10 dòng (9 dòng kháng đến kháng cao, 1 dòng bị
nhiễm) lựa chọn được 81 cá thể để kiểm tra sự có mặt của gen Xa7 bằng chỉ thị phân
tử Với ký hiệu thang L như sau: a là R212 không mang gen Xa7; b là IR24 không mang gen Xa7; c là IRBB7 mang gen đồng hợp Xa7, d là IRBB5/7 mang gen đồng hợp
xa5 và Xa7
Kiểm tra sự có mặt gen Xa7 bằng chỉ thị phân tử ở vụ Mùa 2013 của 81 cá thể
kháng đến kháng cao bệnh bạc lá thu được kết quả ở bảng 4.2 sau
Trang 13Bảng 4.2 Kết quả xác định sự có mặt của gen Xa7 bằng chỉ thị phân tử
Thế
hệ
Số cá
thể mang
gen dị
hợp
Số cá thể không mang gen
Kết hợp với đánh giá kiểu hình, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất từ 33
cá thể đã lựa chọn được 12 cá thể có kiểu hình tương tự R212, nhưng có một số chỉ tiêu về khả năng chống đổ, góc lá đòng, khả năng kháng bệnh bạc lá và tư thế truyền phấn tốt hơn R212 Từ 12 cá thể này tiếp tục đánh giá ở thế hệ BC2F5 và BC3F4 trong
Vụ Xuân và vụ Mùa 2014 từ đó làm thuần và phát triển thành các dòng
4.1.3 Đánh giá các dòng phục hồi mang gen Xa7 đã lựa chọn
4.1.3.1 Đánh giá thời gian sinh trưởng và chiều cao cây của các dòng R212BB7
Tiến hành đánh giá trong vụ Xuân và vụ Mùa 2014, cho thấy thời gian sinh trưởng của 12 dòng R212BB7 tương đối ổn định, vụ Xuân dao động từ 136-140 ngày, vụ Mùa dao động từ 98 - 102 ngày, trong khi R212 có thời gian sinh trưởng tương ứng là 140 ngày với vụ Xuân và 101 ngày đối với vụ Mùa Sự chênh lệch không lớn đều nằm trong biến động cho phép
Đánh giá về chiều cao cây cho thấy ở giai đoạn đầu các dòng nghiên cứu không thấy
sự khác biệt nhiều Song ở chiều cao cây cuối cùng của các dòng quan sát thấy các dòng cải tiến có xu thế cao hơn đối chứng (91,4 cm) dao động từ 99,3 đến 106,6 cm
4.1.3.2 Đánh giá về đặc điểm cấu trúc thân của các dòng R212BB7
Các chỉ tiêu về đặc điểm cấu trúc thân của các dòng R212BB7 tiến bộ hơn so với dạng nguyên bản R212: Đường kính lóng gốc, đường kính giữa thân, đường kính cổ bông đều to hơn Kiểu cấu trúc thân tiến bộ giúp tăng cường khả năng chống đổ, rất có ích trong việc kết hợp với các dòng mẹ
