Nghiên cứu phát triển sinh phẩm hỗ trợ công nghệ lên men tạo khí sinh học trong các điều kiện môi trường đặc biệt đề tài NCKH QG 11 27

Đinh Thuý Hằng Viện Vi sinh vật và Cône nghệ sinh học - ĐHQGHNĐiện thoại: 0437547488; Fax: 0437547407 Email: dthang@ vnu.edu.vn; hangdinh_cbhn@ yahoo.com N ội dung nghiên cứu: - Tạo các

B Á O C Á O K É T Q U Ả T H Ụ C HI ỆN Đ Ẻ TÀI K H C N N H Ó M B C Á P Đ H Q G H N

B Á O C Á O T Ó M T Ắ T

1 T ên đê tài: Nghiên cứu phát triến sinh phâm hô trợ công nghệ lên men tạo khí sinh

h ọ c t r o n g c á c đ iề u k iệ n m ô i t r ư ờ n g đ ặ c b iệ t.

2 M ã số: QG 11.27

3 T h ò i gian th ự c hiện: 24 tháng (8/2011 - 8/2013)

4 Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà N ội

5 C hủ trì đề tài: TS Đinh Thuý Hằng

Viện Vi sinh vật và Cône nghệ sinh học - ĐHQGHNĐiện thoại: 0437547488; Fax: 0437547407

Email: dthang@ vnu.edu.vn; hangdinh_cbhn@ yahoo.com

N ội dung nghiên cứu:

- Tạo các quần thể vi sinh vật sinh methane ưa mặn bằng phương pháp làm giàu trong điều kiện môi trường nước lợ, nước mặn sử dụng các nguồn cơ chất thích hợp như methanol, acetate, rong biển

- Xác định thành phần loài trong quần thể thông qua phân tích gen 16S rDNA bằng phương pháp PCR-D G G E

- Phân lập các chủng methanogen thuần khiết bằng phương pháp ống thạch bán lỏng

kỵ khí Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá, phân loại của chủng thuần khiết Bảo quản các chủng đã phân lập cũne như các mẫu quần thể trong điều kiện

kỵ khí tại 4 ° c

- L ự a chọn các tổ hợp methanogen có mức sinh trưởng cao và thử nghiệm hoạt tính cua chúng ở qui m ô 2 lít trong phòng thí nghiệm đối với bùn từ ao nuôi tôm trong

n ư ớ c l ợ v à r o n g b i ể n t r o n g n ư ớ c m ặ n

- Nghiên cứu qui trình nhân giống methanogen trong điều kiện nước lợ và nước mặn

ở qui 1Ĩ1Ô 1 0 - 2 0 lít Nghiên cứu phương pháp bảo quản ở dạne chế phâm sinh học

8 Các kết quả đạt đ ư ọ c

8.1 K ết quả nghiên cứu

- M ethanogen từ trầm tích biển Việt Nam (Cát Bà và N ha T r a n g ) được làm giàu thành công với các nguồn cơ chất là methanol và N a-acetate trong điều kiện môi trường nước lợ (17 g N aCl/L) và nước biển (26,4 g NaCl/L) Phân tích quần thể cổ khuẩn trong các m ẫu làm giàu bằne phương pháp PCR-D G G E cho thấy

M e t ì u m o s a r c in a s p p v à M e t h a n o lo b u s s p p c h i ế m ư u t h ế ở đ â y

- Tổng số 10 c h ủ n g m ethanogen đã được phân lập từ các mẫu làm giàu dựa trên các đặc điểm hình thái khác nhau của khuẩn lạc và tế bào Phân tích PCR-DGGE và giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy 7 chủng thuộc chi Methanosarcina (theo 3 nhóm gần gũi với 3 loài khác nhau là M semesiae, M vacuolata và M.siciỉiae) và

3 chủng thuộc chi Methanolobus (gần gũi với loài M profundii), là những chi

m ethanogen chiếm sổ đông trong các mầu làm giàu Bốn chủng đại diện được giải trình tự gen 16S rD N A và đăng ký mã trên GenBank, gồm Methanosarcina sp M21 (K C571195), Methanosarcina sp M 25a (KC571194), Methanosarcina sp M37 (KC951109) và Methanolobus sp M23b (KC571 193)

- C h ủ n g M37 thể hiện khả năng sinh m e t h a n e cao nhất trong số các chủng phân lập,

có khả năng sinh trưởng tốt trong phổ rộng hàm lượng muối, tối ưu ở mức nước biển 26 - 33 g/L, do vậy chủng này được lựa chọn để tạo neuồn methanogen bổ sung vào các hệ thống xử lý kỵ khí trong điều kiện nước mặn Dựa trên so sánh trình tự gen 16S rD N A , chủng M3 7 được xếp vào chi Methanosarcina với tên khoa học là Methanosarcina sp M37, loài gần gũi nhất là M siciliae (98% tương đồng)

- Quy trình tạo nguồn m ethanogen BMS từ c h ủ n g M37 sử dụng nước biển nhân tạo

và cám gạo đã được thiết lập, cho nguồn methanogen có hoạt tính cao (35 Ịimol

C H 4/m l/ngày), mật độ methanogen 1,1 X 109 TB/ml (theo phân tích bằng MPN)

T hử nghiệm bổ sung BM S vào hỗn hợp lên men kỵ khí ở điều kiện nước lợ và nước biển cho thấy tác động hỗ trợ rõ rệt trong việc rút ngắn thời gian khởi động

C á c m ô h ì n h x ử l ý c h ấ t t h ả i h ữ u c ơ ( g ồ m r o n g b i ể n U l v a s p , b ù n đ á y đ ầ m n u ô i

t ô m v à c h ấ t t h ả i c h ă n n u ô i ) t r o n g b ể l ê n m e n k ỵ k h í s i n h m e t h a n e ở đ i ề u k i ệ n n ư ớ c mặn (nước lợ và nước biển) đã được thiết lập trong phòng thí nghiệm với ne,uồn

m e t h a n o g e n M 3 7 đ ư ợ c b o s u n s đ ể t ă n g t ố c k h ở i đ ộ n g Q u á t r ì n h p h â n h ủ y d i ễ n r a tích cực nhất ở mô hình có hàm lượng muối 17 g/L, cơ chất là hồn họp rong, bùn

và chất thải chăn nuôi với N a-m olypđate được bổ sung (1 mM ) để ức chế SRB Kết quả 64,4% COD đã bị loại sau 60 ngày và trên 98% sau 90 ngày, tương ứng

tỷ lệ CH4 trong biogas đạt được là 40% và 81,8% M ethanosarcina sp M 37 được

tìm thấy chiếm ưu thế trong mô hình này

8.2 Công trình khoa học đã công bố

- N guyễn T hu H o à i, N g u y ễn T h ị T uyền, Đ in h T h ú y H ằng Làm giàu và phân

lập m ethanogen từ trầm tích biển Việt Nam Tạp chí CN SH , đang chờ in

- N guyễn T hu H oài, N g u y ễn T h ị H ải, D ư o n g C hí C ô n g , Đ in h T h ú y H ằng.

Phân lập cô khuân sinh m ethane ưa m ặn Methanosarcina sp M 37 từ trâm tích

biển Cát Bà, Việt Nam Tạp chí C N SH , đang chờ in.

8.3 Đào tạo sau đụi Itọc

Hỗ trợ đào tạo 01 tiến sỹ: N guyễn Thu Hoài

Tên luận án: “Nghiên cứu vi sinh vật ứng dụng cho sản xuất biogas làm tăng hiệu suất trong điều kiện nước lợ và nước m ặn”

- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 180.000.000 VNĐ

- Tông kinh phí của đề tài đã chi: 180.000.000 VNĐ, bao gồm các mục:

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 70.000.000

+ V ă n p h ò n g p h ẩ m : 1 0 0 0 0 0 0

+ Chi khác (lệ phí của đơn vị DT): 3.000.000

+ Viết báo cáo tổng quan tài liệu: 3.000.000

+ Thù lao chủ trì đề tài: 12.000.000

+ Nghiệm thu:

+ Viết báo cáo:

+ Xây dựne; đề cương:

1.1.3 Một số công nghệ phổ biến vận hành theo nguyên lý phân hủy kỵ khí 3

1.1.3.3 U A S B (U p flo w A n a e r o b ic S lu d g e B la n k e t) 6 1.1.3.4 M à n g lọ c k ỵ k h í (A n a e r o b ic F ilte r ) 7

1.3 Các yểu tố ảnh hưởng sinh trưởng của vi sinh vật trong các hệ thống phân hủy 11

kỵ khí

1.4 N ghiên cứu và ứng dụng công nghệ phân hủy kỵ khí ở Việt Nam 13

II N G U Y Ê N V Ậ T L IỆ U V À P H Ư Ơ N G PH Á P N G H IÊ N CỨtJ

3.1 Làm giàu m ethanogen từ trầm tích biển Cát Bà và N ha Trang 21

3.4 Lựa chọn chủng thích hợp để phát triển chế phẩm 27

3.4.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng M 37 283.5 Tạo nguồn m ethanogen để bổ sung vào các mô hình phân hủy kỵ khí 313.6 Xác định khả năng hồ trợ quá trình lên men kỵ khí của BMS 343.7 Thử nghiệm vận hành mô hình bể lên m en kỵ khí để xử lý chất thải hữu cơ ở 34điều kiện nước mặn

3.7.1 Thiết lập mô hình bể lên m en kỵ khí trong phòng thí nghiệm 34

16S rDNA 16S ribosomal DNA

FISH Fluorscent in situ Hybridization

F420 Coenzym e F420

HDPE H igh Density Polyethylene

PC R Polym erase Chain Reaction

SRB Sulfate Reducing Bacteria

T A E Tris-acetate-ED TA buffer

TC D Therm al Conductivity Detector

UASB U pflow A naerobic Sludge Blanket

V FA Volatile Fatty Acid

DANH M Ụ C C Á C B Ả N G

Báng 3.1 Các chủng methanogen phân lập từ các mẫu làm giàu khác nhau 23Bảng 3.2 Khả năng sinh khí biogas và mức độ phát sáng của tế bào dưới 27kính hiển vi huỳnh quang ghi nhận ở các chủng methanogen phân lập được

Báng 3.3 Công thức thiết lập các mô hình lên men kỵ khí đã thực hiện 34

Hình 3.1 Làm giàu methanogen từ các mẫu trầm tích biển N ha Trang và 21

Cát Bà trong môi trường nước biển

Hình 3.2 Làm giàu methanogen từ các mẫu trầm tích biển N ha Trang và 22

Cát Bà trong môi trường nước lợ

Hình 3.3 Tính đa dạng và độ tinh sạch của các chủng m ethanogen phân lập 24

được thể hiện qua phương pháp phân tích PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA

H ình 3 4 P h â n t í c h q u ầ n x ã m e t h a n o g e n t r o n g c á c m ẫ u l à m g i à u v ớ i t r ầ m

tích từ biển N ha Trang và Cát Bà bằng phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA

H ình 3.5 Cây phân loại neibourgh joining dựa trên trình tự đoạn gen 16S

rD N A của các chủng m ethanogen đại diện

H ình 3.6 Hình thái tế bào và vị trí phân loại của chủng m ethanogen M37

H ình 3.7 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến mức tăng

trưởng và sinh methane ở chủng M37

H ình 3.8 Sinh trưởng và sinh methane ở chủng M37 trên các nguồn cơ chất

khác nhau

H ình 3.9 Quy t r ì n h tạo nguồn methanogen từ c h ủ n g M37

H ình 3.10 Sinh trưởng tạo methane của methaogen M37 trên môi trường

khoáng và cám gạo (1,5%) lên men

H ình 3.11 N guồn methanogen từ chủng M37 nuôi trên cám gạo trong môi

trường nước biển sau 15 ngày quan sát dưới kính hiển vi huỳnh

quang

H ình 3.12 Lên men sinh methane trong điều kiện nước lợ và nước mặn khi

bổ sung hay không bổ sung BMS

H ình 3.13 M ô hình bể lên men kỵ khí xử lý rong biển và bùn thải đầm tôm

ở điều kiện nước mặn

H ình 3.14 C huyển hóa COD và tạo m ethane trong các mô hình thí nghiệm

lên men kỵ khí rong biển

H ình 3.15 Phân tích thành phần m ethanogen trong các mô hình thí nghiệm

bằng phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA

25

26

2829

30

3132

dụ như ở Trung quốc 1,2% (China biogas, 2008); Mỹ 100 tỷ kW h (Cuellar et al.,

2008), ở Đức 2,86% (Biopact, 2007) Phân hủy kỵ khí do vậy được ứng dụng ngày

c à n g r ộ n g r ã i n h ờ g i ả i q u y ế t đ ồ n g t h ờ i h a i v ấ n đ ề , ( i ) x ử l ý t r i ệ t đ ể v à h i ệ u q u ả nguồn thải hữu cơ và (ii) tận thu năng lượng từ nguồn thải này ở dạng biogas

So với quá trình phân hủy hiếu khí, quá trình kỵ khí có nhiều ưu điểm như sau (Lettinga, 1995;B itton, 1999):

- Phân hủy kỵ khí sử dụng C 0 2 sẵn có trong môi trường làm chất nhận điện tử, không có nhu cầu về oxy từ bên ngoài, do vậy làm giảm giá thành xử lý nước/chất thải m ột cách đáng kể

- Lượng bùn tạo ra trong phân hủy kỵ khí thấp hơn nhiều so với hiếu khí (3 -

20 lần) do sinh khối tạo ra ít (hiệu suất sinh năng lượng từ vi khuẩn kỵ khí thấp) (Hình 1.1)

Effluent (111 to 30%)

Hình 1.1 Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí (A) và kỵ khí (B)

(Lettinga, 1995)

1

N ếu như trong hô hấp hiếu khí, 50% cacbon hữu cơ được chuyển thành sinh khối thì trong hô hấp kỵ khí chỉ có 5%, theo đó với 1 tấn CO D bị phân hủy thì có 20 - 100 kg sinh khối tế bào được tạo thành trong phân hủy kỵ khí, so với 500 - 600 kg tạo thành trong phân hủy hiếu khí.

- Phân hủy kỵ khí tạo sản phẩm cuối cùng là methane, là khí có nhiệt năng cao, có thể sử dụng làm nhiên liệu đốt sinh nhiệt hay chuyển thành điện năng Chỉ có khoảng 3 - 5 % cơ chất bị thất thoát dưới dạng nhiệt

- Phân hủy kỵ khí thích họp với các loại nguồn thải có hàm lượng hữu cơ rất cao và có thể vận hành với tải trọng hữu cơ lớn

- Vi sinh vật kỵ khí trong hệ thống tồn tại theo tổ họp ở dạng hạt bùn, có độ bền cao về hoạt tính và m ức sống sót, thậm chí khi hệ thống xử lý ngừng hoạt động trong thời gian dài

- Bên cạnh đó, các quá trình phân hủy kỵ khí còn có thể loại được nhiều chất độc khó phân hủy như hydrocacbon mạch thẳng chứa clo (ví dụ trichloroethylene, trihalom ethane), lignin

Với những ưu điểm kể trên, các công nghệ xử lý chất thải dựa theo nguyên lý phân hủy kỵ khí ngày càng được ứng dụng rộng rãi Tuy nhiên, bên cạnh những ưu thế này, phân hủy kỵ khí còn bộc lộ một số nhược điểm như sau:

- Quá trình phân hủy kỵ khí diễn ra chậm hơn so với hiếu khí và thường mẫn cảm với nhiều yếu tố độc hại trong môi trường như nhiệt độ, pH, axit hữu cơ bay hơi (V FA ), các kim loại nặng

- Bước khởi động của toàn bộ quá trình thường kéo dài, do vậy nguồn vi sinh

vật có hoạt tính cao (như bùn bể tự hoại, bùn hoạt tính hay chế phẩm vi sinh) thường được sử dụng để rút ngắn quá trình này

N hững nhược điểm trên của phân hủy kỵ khí có thể được khắc phục thông qua việc tối ưu quy t ì n h công nghệ Các bể phản ứng lên men kỵ khí thường được thiết kế phức tạp hơn so với bể hiếu khí thông thường, có các thiết bị hỗ trợ như cánh khuấy, hệ thống ống dẫn hướng dòng chảy, bộ phận châm xút để chỉnh pH khi cần thiết, bộ phận thu và xử lý khí biogas tạo th à n h

1.1.2 B ản chất sin h học của phân hủ y kỵ khí

Tổ họp vi sinh vật với thành phần chủ yếu là vi khuẩn tham gia vào quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ cao phân tử thành methane M ối quan hệ mật thiết

giữa các nhóm vi sinh vật thực hiện từng bước chuyển hóa quyết định toàn bộ quá trình phân hủy theo phương trình phản ứng như sau:

Chất hữu cơ -> C H 4 + C 0 2 + H 2 + N H 3 + H 2S (Polpraset, 1989)

Vi khuẩn là nhóm chiếm ưu thế trong bể lên m en kỵ khí Các nhóm vi khuẩn

kỵ khí tùy tiện và kỵ khí bắt buộc có mặt với số lượng lớn ở đây, ảnh hưởng tương

hỗ với nhau để thực hiện quá trình phân hủy Toàn bộ quá trình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ cao phân tử thành methane diễn ra theo bốn bước (Hình 1.2) gồm (i) thủy phân và (ii) lên m en sinh axit để tạo thành các axit hữu cơ m ạch ngắn, (iii) chuyển hóa H 2 v à axit hữu cơ thành acetat nhờ nhóm acetogen và (iiii) tạo CH 4 từ acetat nhờ nhóm m ethanogen

ị Sinh acetate (VK Acetogen)

Acetate, H 2, C O z

ị Sinh m ethane (VK Methanogen)

M ethane C H ,

Hình 1.2 Các bước của quá trình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ tạo khí sinh học

1.1.3 M ột số c ô n g n gh ệ phổ biến vận hành theo ngu yên lý p hân hủy kỵ khí

N hờ đặc tính hữu hiệu trong việc xử lý chất thải dạng rắn và lỏng, đồng thời tạo ra nguồn “năng lượng xanh” là khí methane, công nghệ khí sinh học hiện đang được áp dụng tại nhiều nơi trên thế giới Theo cách truyền thống, công nghệ này được triển khai ở qui mô nhỏ như hộ và nhóm hộ gia đình với nguồn thải chuồng trại kết hợp phế thải nông nghiệp, thường gặp ở các nước đang trong giai đoạn phát

3

triển ở châu Á và châu Phi như Trung quốc, Á n độ, Việt Nam, Ethiopia, Senegal (chương trình phát triển công nghệ biogas của chính phủ Hà Lan) Ở các nước phát triển, biogas được sản xuất ở qui mô công nghiệp trong các bể phản ứng vận hành ở nbiệt độ ấm (m esophilic, 37°C) hay nhiệt độ cao (thermophilic, 50 - 55°C), đạt qui

mô lớn (tới 5000 m 3) và có thể sử dụng các nguồn thải phong phú, bao gồm rác sinh hoạt, bùn thải, chất thải lỏng từ các nhà máy chế biến thực phẩm hay lò giết mổ hay rong rác gây ô nhiễm ở biển v.v (Bitton, 1999; W eiland et ai, 2003; Nofima, http://w w w nofim a.no/en)

Bể phản ứng kỵ khí (H ình 1.3) được thiết kế dạng hình trụ (cho thể tích chứa lớn nhất trên cùng m ột đơn vị diện tích), có cửa tiếp nhận nguyên liệu ở một đầu và chất thải ra ở đầu khác Đ ối với chế độ lên men nóng (50 - 55°C), bể được gắn với

hệ thống gia nhiệt và khuấy để duy trì nhiệt độ ổn định So với lên m en ấm (37°C) thì lên men nóng có hiệu suất sinh khí và tốc độ phân hủy cao hơn, tuy nhiên quy trình công nghệ và vận hành cũng phức tạp hơn (Lettinga, 1995)

H ình 1.3 Bể phân hủy kỵ khí (anaerobic digester) hoạt động ở chế độ lên men ấm (A) và

lên men nóng (B) (Metcalf & Eddy, 1991)

Bùn trong bể lên m en kỵ khí chia làm hai lóp, ở đáy là bùn chín đã hoạt động kém (stabilized sludge), sẽ được đưa ra ngoài theo van xả và có thể được xử lý tiếp tục để sử dụng cho các m ục đích khác, phổ biến nhất là làm phân vi sinh Lớp trên

là bùn non có hoạt tính cao (active sludge) gồm vi sinh vật kỵ khí đang hoạt động tích cực, tạo thành các hạt bùn có kích thước nhỏ hơn, chiụ trách nhiệm chính cho quá trình phân hủy Thời gian lưu điển hình của nước/chất thải trong bể biogas là 30 ngày Phần nước trong ở trên cùng (supernatant) sẽ được chuyển ra ngoài theo đường thoát, thường được đưa vào hệ thống xử lý tiếp theo nhằm loại nitơ, phospho

và lắng chất lơ lửng trước khi đưa ra ngoài môi trường (Bitton, 1999)

Công nghệ bể lên men kỵ khí thường được áp dụng với chất thải có hàm lượng hữu cơ rất cao, COD có thể lên tới 30000 mg/L (Bitton, 1999; Lettinga, 1995), theo đó quá trình lên men sinh axit có thể dẫn tới pH trong bể bị giảm mạnh tới 4 - 5 và làm dừng toàn bộ quá trình phân hủy Đe khắc phục tình trạng này người ta sử dụng hệ thống lên men hai cấp (H ình 1.4), trong đó quá trình lên men sinh axit được tiến hành trong bể riêng (có thể áp dụng các biện pháp tiền xử lý như

bổ sung enzym e thủy phân ngoại bào), cơ chất sau lên m en được chuyển dần vào bể methane để tránh gây thay đổi đột ngột trong môi trường ở đây

Hình 1.4 Bể lên men kỵ khí hai cấp (Metcalf & Eddy, 1991)Nguyên liệu đầu vào cho bể biogas đã được đa dạng hóa cao N ếu như trước kia chất thải gia súc và phế thải nông nghiệp là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất biogas thì hiện nay rất nhiều loại nguồn thải giàu hữu cơ được sử dụng cho mục đích này, ví dụ như bùn cống, rác thải hữu cơ, bùn cặn từ nuôi trồng thủy sản, chất thải từ các nhà m áy chế biến thực phẩm và các lò giết m ổ v.v Đạt được điều này là nhờ những cải tiến đáng kể trong thiết kế bể biogas (có thiết bị khuấy, ổn định về nhiệt, đảm bảo m ức oxy thấp ) cùng với những hiểu biết sâu hơn về nhóm

m ethanogen (về đặc tính sinh lý, sinh hóa và di truyền), nhờ đó chủ động được về nguồn vi sinh vật này cho quá trình phân hủy, không phụ thuộc vào các nguồn tự nhiên truyền thống là phân trâu bò (Corti, Lombardi, 2007)

Bên cạnh đó, các công nghệ phụ trợ sử dụng khí methane sinh ra m ột cách hiệu quả cũng đa dạng hơn trước H iện nay m ethane không chỉ được dùng để cấp nhiệt (đốt trực tiếp) m à còn được chuyển thành các dạng năng lượng khác như điện,

m ethanol hay hóa lỏng để chạy động cơ (Biopact, 2007)

Supernatant

Thickened sludge Mechanical

Digested sludge

5

Bể tự hoại là hệ thống phân hủy kỵ khí được ứng dụng rộng rãi nhất và được biết đến sớm nhất (từ thế kỷ 19) Phần lớn nước thải sinh hoạt từ các hộ gia đình được xử lý theo công nghệ này c ấ u trúc điển hình của m ột bể tự hoại hai ngăn được trình bày ở hình 1.5 Bể tự hoại được đặt ngầm, tiếp nhận nước thải (nước xám

và nước đen) từ hộ gia đình và lưu trong thời gian từ 24 - 72 h Ở khí hậu nhiệt đới,

bể tự hoại có thể loại được 90% BOD trong nước thải, ở khí hậu ôn đới thì hiệu suất đạt mức 70 - 80% (Lettinga et ai, 1997)

V iệt Nam hiện nay bùn bể tự hoại chủ yếu được thu gom và xử lý bằng phơi và chôn lấp, gây ảnh hưởng tới môi trường tại các khu vực xử lý (Nguyễn V iệt Anh, 2007) M ột số nghiên cứu đang tiến hành tại trường Đại học Xây dựng H à Nội đề cập đến việc xử lý bùn bể tự hoại và bùn cống theo công nghệ lên men kỵ khí ở nhiệt độ cao và đã có kết quả khả quan (Dự án SEMIS AN, 2012)

ỉ 1.3.3 UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket)

Be UASB được đưa vào áp dụng từ đầu thế kỷ 20 N guyên lý vận hành của

bể UASB là dòng nước thải được đưa vào từ đáy bể thông qua m ột lớp bùn có hoạt

tính phân hủy cao (H ình 1.6) N ước thải qua xử lý được lắng trong ở phần trên của

bể và dưa ra ngoài

U P F LO W ANAEROBIC SLUDGE BLANKET R EA C TO RHình 1.6 Cấu t ạ o và n g u y ê n lý h o ạ t đ ộ n g của bể UASB ( L e t t i n g a , 1995)

Bể UASB hoạt động với nước thải có hàm lượng hữu cơ COD thấp hơn so với bể biogas, ở m ức <5000 mg/L Thời gian lưu của nước thải trong ƯASB từ 12 -

36 h, cho phép loại tới trên 90% COD, thậm chí ở điều kiện nhiệt độ khoảng 10°c (Pipyn etal., 1979; Rebac et al., 1995)

Hiện nay trên thế giới nói chung và ở Việt N am nói riêng, công nghệ UASB được ứng dụng nhiều trong xử lý nước thải tập trung tại các khu công nghiệp, các nhà máy chế biến thực phẩm và đồ uống, nước thải sinh hoạt ở các khu dân c ư

1.1.3.4 Màng lọc kỵ khỉ (Anaerobic Filter)

Công nghệ m àng lọc kỵ khí đầu tiên được đưa vào từ đầu thế kỷ 20 nhưng mới thực sự ứng dụng năm 1969 (Young, M cCarty) M àng lọc này gồm có vật liệu làm giá thể (đá, sỏi, nhựa) với cấu trúc rỗng (tới 50% thể tích) làm chỗ bám cho vi sinh vật (Jewell, 1987) và các tế bào vi sinh vật có hoạt tính phân hủy sinh trưởng bám dính trên giá thể, tạo màng sinh học dày tới 1 - 3 mm (Bitton, 1999) Đa dạng các loại vật liệu phù hợp cho việc làm giá thể cho vi sinh vật ngày càng tăng, hỗ trợ đáng kể cho hiệu quả xử lý của công nghệ Dòng nước thải đưa từ đáy lên khi đi qua màng lọc sẽ được loại bỏ các chất ô nhiễm (Hình 1.7) Công nghệ này cho phép loại chất rắn lơ lửng YỚi hiệu quả cao, tuy nhiên hiệu quả loại B O D lại thấp hơn so với bể biogas hay ƯASB Hiệu suất loại BOD, chuyển hóa thành methane chỉ đạt mức 20% (Bam es, Fitzgerald, 1987)

7

Blog as

H ì n h 1 7 C ấ u t ạ o v à n g u y ê n l ý h o ạ t đ ộ n g c ủ a m à n g l ọ c k ỵ k h í ( J e w e l l , 1 9 8 7 )

1.2 Vi sinh vật th am gia quá trình phân hủy kỵ khí

Như đã trình bày ở trên, phân hủy kỵ khí là quá trình chuyển hóa sinh học trong điều kiện không có oxy với sự tham gia của nhiều nhóm vi sinh vật có quan

hệ mật thiết với nhau theo hình thức chuỗi thức ăn, đảm bảo phân hủy chất hữu cơ cao phân tử thành m ethane và C 0 2 (Hình 1.2) Bốn nhóm vi khuẩn chính tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí gồm có nhóm thủy phân, nhóm lên men sinh axit, nhóm sinh acetate và nhóm sinh methane Các nhóm vi khuẩn này hoạt động dựa trên mối quan hệ cộng sinh phụ thuộc vào hoạt tính sinh học cũng như sản phẩm trao đổi chất của nhau (Archer, Kirsop, 1991)

1.2.1 N hóm 1 - V i k h u ẩ n có h oạt tính thủy phân

Nhóm này bao gồm các vi khuẩn kỵ khí và kỵ khí tùy tiện thực hiện chức năna bẻ gãy các phân tử hữu cơ phức hợp (như protein, cellulose, lignin, lipid) thành các đơn phân tan trong nước như axit amin, glucose, axit béo và glycerol, tạo nguồn cơ chất cho nhóm vi khuẩn tiếp theo tham gia quá trình phân hủy (Bitton,1999) Thủy phân các hợp chất hữu cơ cao phân tử được thực hiện nhờ các enzyme thủy phân ngoại bào như cellulase, protease và lipase Giai đoạn này có thể kéo dài, tùy thuộc thành phần nguồn thải cần xử lý Để tăng tốc và rút ngắn thời gian cho quá trình phân hủy kỵ khí, trong một số trường hợp xử lý nhiệt hay hỗn hợp enzyme được áp dụng trên nguồn thải đầu vào, tuy nhiên như vậy lại làm tăng giá thành của quá trình x ử lý (A m ania e t a i , 2010)

1.2.2 N hóm 2 - V i khuẩn lên m en sinh axit

Vi khuẩn lên m en sinh axit (ví dụ như Clostridium) chuyển hóa đường, axit

am in và axit béo thành các axit hữu cơ (như axit acetic, propionic, form ic, butyric hay succinic), rượu và keton (như ethanol, m ethanol, glycerol, acetone), acetate,

C 02 và H2 (A m ania et al., 2010) A cetate là sản phẩm chính được tạo ra trong quá trình lên m en các họp chất carbohydrat Sản phẩm lên m en thay đổi phụ thuộc vào loài vi khuẩn cũng như điều kiện lý hóa (nhiệt độ, pH, thế oxy hóa khử) trong bể phản ứng (A m ania et al., 2010)

1.2.3 N hóm 3 - V i k h u ẩn sinh a ceta te (a ceto g en s)

Vi khuẩn acetogen (vi khuẩn sinh acetate và H2) như Syntrobacter và

propionic, butyric) v à rượu thành acetate, H2 và C 0 2 Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn acetogen là nguồn cơ chất trực tiếp cho nhóm sinh m ethane hoạt động Để có thể chuyển hóa được các axit béo, vi khuẩn acetogen cần có điều kiện áp suất cục

bộ của H 2 trong môi trường ở m ức rất thấp, do vậy quan hệ cộng sinh chặt chẽ với các vi sinh vật sinh m ethane là nhằm duy trì điều kiện này (H ình 1.8) (Bitton, 1999;

Am ania et al., 2010) Ethanol, axit propionic và butyric được vi khuẩn acetogen chuyến hóa thành axit acetic theo các phương trình phản ứng như sau:

CH3C H 2OH (ethanol) + H20 —> C H3CO O H (acid acetic) + 2H2

CH3CH2CO O H (acid propionic) + 2H 20 - » C H3CO O H (acid acetic) + CO2 + 2H2

CH3CH2C O O H (acid butyric) + 2H 20 - » 2C H3C O O H (acid acetic) + 2H2

Hình 1.8 Vi khuẩn acetogen (tế bào nhỏ) và cổ khuẩn methanogen (tế bào lớn) trong bùn

từ bể biogas (Madigan et al., 2009)

Vi khuẩn acetogen sinh trưởng nhanh hơn nhiều so với m ethanogen (khoảng

25 lần), tuy nhiên m ethanogen lại sử dụng cơ chất với hiệu suất thấp (sinh ra ít năng lượng từ m ột đơn vị cơ chất), do vậy có thể giúp duy trì nồng độ sản phẩm trao đổi

9

chất do acetogen sinh ra (đặc biệt là H2) ở mức thấp và tạo điều kiện cho acetogen tiếp tục sinh trưởng (Ham m er, 1986).

1.2.4 N hóm 4 - V i sinh vật sinh m eth an e (m eth an ogen )

Vi sinh vật sinh m ethane có m ặt ở nhiều dạng môi trường sinh thái khác nhau, đặc biệt là các lóp bùn đáy sâu của các thủy vực và trong hệ đường ruột của động vật nhai lại (W hitm an et a i, 2000) Trong hệ xử lý nước thải các vi sinh vật này sinh trưởng với tốc độ chậm với thời gian nhân đôi tế bào khoảng 3 ngày ở điều kiện nhiệt độ 3 5 ° c (so với E coli là khoảng 15 phút) hay tới 50 ngày ở điều kiện bất lợi 10°c Vi sinh vật sinh m ethane được chia thành hai nhóm lớn:

1 2 4 1 M e t h a n o g e n s ử d ụ n g h y d r o ( h y d r o g e n o t r o p h ic )

Các loài thuộc nhóm này chuyển hóa H2 và C 02 thành CH4 theo phản ứng:

C 02 + 4H2 - » C H4 + 2H20 Nhóm vi sinh vật này thực hiện chức năng duy trì áp suất cục bộ của hydro trong hệ xử lý ở mức thấp phù hợp cho vi khuẩn acetogen hoạt động, đảm bảo các acid béo và rượu được chuyển thành acetate Các chi thường gặp thuộc nhóm này gồm có Methanobacterium, Methanobrevibacter,

M ethanogen thuộc nhóm này huyển hóa acetate thành CH4 và C O2 theo phản ứng C H3CO O H —> CH4 + C 0 2 Đây là nhóm chính chiếm ưu thể trong bể phân hủy kỵ khí, tạo ra ~ 2/3 lượng m ethane trong bể, chỉ có 1/3 còn lại có nguồn gốc từ

H2 và CO2 (M ackie, Bryant, 1981)

Trong bể xử lý kỵ khí hai chi thường gặp thuộc nhóm này là Methanosarcina

và Methanothrix (H ình 1.9) Trong các bể kỵ khí lên men nóng (55°C) xử lý các nguồn thải thực v ật (lignocellulose), Methanosarcina chiếm vị trí chủ đạo ở giai đoạn đầu, sau đó dần dần xuất hiện Methanothrix do ái lực với cơ chất acetate (giá trị Ks) của Methanosarcina cao hon Methanothrix (W hitm an et al., 2000)

Hình 1.9 Methanosarcina sp (A) và Methanothrix sp (B) (Madigan et al., 2009).

v ề vị trí phân loại trong sinh giới, methanogen được xếp vào nhóm cổ khuẩn (A rchaea), có nhiều đặc điểm khác biệt so với vi khuân (Bacteria) như cấu trúc thành tế bào, bộ m áy tổng hợp protein (ribosome), một số coenzym e đặc hiệu như F420 (Hình 1.10), coenzym e M (W hitman et al., 2000).

Hình 1.10 Methanogen trong bùn kỵ khí dưới kính hiển vi huỳnh quang; tự phát

D o đóng vai trò then chốt trong toàn bộ quá trình xử lý kỵ khí, methanogen trong các bể phản ứng thường được kiểm soát chặt chẽ Hiện nay các phương pháp xác định số lượng và hoạt tính của m ethanogen trong các bể phản ứng cũng được tối

ưu dần, bao gồm nuôi cấy (điều kiện kỵ khí hoàn toàn) đến các phương pháp sinh học phân tử dựa trên DNA và RNA như điện di biến tính (DGGE), lai trực tiếp bằng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu (FISH) (Am ann, 1995)

1.3 C ác yếu tố ản h h ư ở n g sinh trư ở n g của v i sinh v ậ t tro n g các hệ th ốn g

phân hủy ky kh í

Phân hủy kỵ khí thực tế được đặt dưới kiểm soát chặt chẽ của các điều kiện môi trường do quá trình này đòi hỏi sự phối hợp nhịp nhàng giữa các nhóm vi sinh vật, đặc biệt là m ethanogen vì chúng rẩt nhạy cảm (Speece et al., 1983)

1.3.1 C ân bằng d in h d ư ỡ n g

Đe quá trình xử lý sinh học có thể thành công, chất dinh dưỡng vô cơ thiết vếu cho vi sinh vật cần phải được cung cấp đầy đủ và cần phải được cân bằng để đạt

tỷ lệ tối ưu Các chất thiết yếu cho hoạt động của vi sinh vật (theo mức độ giảm dần

về tầm quan trọng) gồm nitơ, sulfur, phosphor, sắt, cobalt, nikel, molipden, selen, riboflavin, vitamin B12

• N itơ là nguồn dinh dưỡng được tiêu thụ với lượng lớn cho sự phát triển của

vi sinh vật Trong điều kiện kỵ khí, am m onia và nitơ hữu cơ là nguồn nitơ

sáng nhờ coenzyme F420 (Madigan et al., 2009)

11

chính dành cho vi sinh vật phát triển Trong bể biogas, tỷ lệ nitơ/carbon phải đạt 130:5 đối với các nguồn thải giàu hydrat carbon và 330:5 đối với các nguồn thải giàu lipid và protein (Lettinga et al., 1997).

• L ư ợ n g phospho được vi sinh vật tiêu thụ trong hệ xử lý kỵ khí được xác

định vào khoảng 1/5 đến 1/7 nhu cầu về nitơ Phần lớn vi sinh vật đều có khả năng sử dụng phospho vô cơ, hấp thụ vào các tế bào đang sinh trưởng nhờ enzyme phosphatase (Amania et a i, 2010)

• S u lfu r cần thiết cho việc tổng hợp protein trong tế bào và trong môi trường

kỵ khí, sulfide (H2S) và cystein là nguồn sulfur chủ yếu cho vi sinh vật phát triển Tuy nhiên H 2S có tác động ức chế đối với nhiều nhóm vi sinh vật, bao gồm cả m ethanogen (ở nồng độ > 200 ppm), do vậy sự có m ặt của hợp chất này trong bể biogas phải được kiểm soát ở mức thấp (Bitton, 1999)

1.3.2 C ác yếu tố lý hóa và sinh học

• N h iệt độ: Trong các hệ xử lý kỵ khí, quá trình sinh m ethane được thực hiện

ở nhiệt độ ấm (25 - 4 0 °c , tối ưu ở 35°C) hay nhiệt độ cao (50 - 6 5 °c , tối ưu

ở 55°C), tùy thuộc vào loại công nghệ áp dụng Do có tốc độ sinh trưởng chậm, m ethanogen rất nhạy cảm với những thay đổi nhỏ về nhiệt độ trong môi trường (M arta-A lvarez et al., 2000)

• T h ò i gian lư u: Phụ thuộc vào đặc điểm của nguồn thải và điều kiện môi

trường, thời gian lưu cần được kéo dài ở m ức độ thích hợp, thường trong khoảng 1 0 - 6 0 ngày (Polprasert, 1989) Thời gian lưu có thể được rút ngắn tùy thuộc vào các điều kiện hỗ trợ công nghệ, ví dụ như xử lý sơ bộ nguồn thải ban đầu hay bổ sung nguồn vi sinh vật đã được thích nghi với nguồn thải đầu vào (Sterritt, Lester, 1988)

• Độ pH : Đ iều kiện tối ưu cho bể biogas là pH = 7,0 - 7,2, quá trình bị dừng khi pH ở m ức gần 6,0 Các vi khuẩn sinh axit tạo axit hữu cơ và là nguyên nhân làm giảm độ pH trong hệ xử lý Trong trường hợp pH của hệ xử lý giảm xuống dưới mức cho phép cần có biện pháp hỗ trợ để pH có thể phục hồi bằng cách bổ sung một số hóa chất có tính kiềm cao như thạch cao (lime), am m onium khan, NaOH, N a H C 0 3, N a2C 03 (Bitton, 1999)

• T h à n h phần hóa học của nguồn th ải: N guồn nguyên liệu thải cần được cân

bằng về dinh dưỡng (carbon, nitơ, phospho, lưu huỳnh ) để có thể duy trì được hệ xử lý kỵ khí ở mức hiệu suất cao Theo một số nghiên cứu, tỷ lệ C/N

cho sinh khí tối ưu là 25 - 30:1 (Polprasert, 1989) Các nguyên tố vi lượng như sat, cobalt, m olypden và nickel cũng có vai trò rất quan trọng (Speece et al., 1983).

• C ạn h t r a n h giữa m eth an o g en và vi k h u ẩ n k h ử su lfate (SRB): do có cùng phổ cơ chất để sinh trưởng với methanogen nên SRB có thể cạnh tranh đáng

kể với m ethanogen khi trong nguồn thải có mặt sulfate ở nồng độ cao (tỷ lệ

CO D /SO4 <2) (Choi, Rim, 1991)

• Độ m ặn : Đ ộ mặn có ảnh hưởng lớn tới quá trình phân hủy trong hệ xử lý kỵ khí T rong các môi trường nước lợ và nước mặn quá trình phân hủy kỵ khí

do vậy m à thường không hiệu quả hoặc tốc độ chậm (M arta-Alvarez et a i,

2000) T uy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy m ethanogen có mặt với số lượng đáng kể trong môi trường có ảnh hưởng nước biển (rừng ngập mặn, đáy biển), do vậy việc đưa những loài đã thích nghi với nước mặn này vào bể biogas sẽ có tác dụng tích cực tới tốc độ phân hủy (M arta-A lvarez et al.,

2 0 0 0 )

• C ác yếu tố ức chế khác: oxy hòa tan, am m onia (nồng độ > 3000 mg/L), các

hợp chat hydrocarbon chứa halogen (như chloroform ), các hợp chất thơm (như benzene, toluene, phenol, pentachlorophenol), form aldehyde (nồng độ >

100 m g/L), axit béo bay hơi (volatile fatty acid, như butyric, propionic), kim loại nặng (m ức độc hại đối với m ethanogen theo thứ tự Ni > Cu > Cd > Cr > Pb), m ột số chất độc khác như cyanide, sulfide, tannin và ức chế ngược do sản phẩm trao đổi chất (như H2 hay axit béo bay hơi) (Bitton, 1999)

1.4 N gh iên c ứ u và ứ ng dụng công nghệ phân h ủ y kỵ khí ở V iệt N am

Phân hủy kỵ khí với hiệu quả loại chất hữu cơ cao được quan tâm nghiên cứu

và ứng dụng khá rộng rãi ở Việt Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu đã tiến hành cho đến nay m ới chỉ tập trung vào triển khai, cải tiến và tối ưu công nghệ, hầu như chưa

có nghiên cứu n ào đề cập đến các nhóm vi sinh vật tham gia quá trình phân hủy Nguyên nhân chính là do việc phân lập và nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí trong phòng thí nghiệm đòi h ỏ i kỹ năng chuyên sâu mà hiện ít phòng thí nghiệm trong nước có điều kiện tiến hành

Công nghệ áp dụng nguyên lý phân hủy kỵ khí điển hình nhất là bể tự hoại Đại bộ phận các đô thị ở Việt Nam sử dụng công nghệ này để xử lý nước thải sinh hoạt Tuy nhiên, theo đánh giá của các nhà công nghệ môi trường V iệt Nam thì hầu hết các bể tự hoại xây dựng sau năm 1960 tới nay đều chưa đúng quy cách, cặn lắng

13

tro n g bể không được nạo vét định kỳ nên nước thải ra tò bể tự hoại còn chứa chất lơ

lử n g và chất hữu cơ ở nồng độ khá cao (Nguyễn Việt Anh, 2007) Bùn thu gom từ

c á c bê tự hoại cũng chưa được xử lý triệt đế nên còn là nguồn ô nhiễm cần quan tâm

x ử lý

Tiếp theo, công nghệ biogas đã được triển khai ở nhiều vùng nông thôn khác

n h au , bao gồm cả m iền núi và đồng bàng nhờ chương trình phát triển công nghệ

b io g as do chính phủ Hà Lan tài trợ (Biogas Vietnam) M ột đặc điểm nổi bật của

ch ương trình này là công nghệ mới được triển khai ở qui mô nhỏ (< 10 m 3) sử dụng

n g u ồ n thải truyền thống là phân trâu bò và phế thải nông nghiệp Sản xuất biogas ở

q ui m ô lớn cũng đã được triển khai ở m ột số điểm, sử dụng nguồn thải ban đầu từ

c á c nhà máy chế biến thực phẩm (nhà máy rượu Hà Nội, nhà máy bia Hà Nội, nhà

m áy chế biến tinh bột sắn ở Quảng N gãi là một số ví dụ) (Hình 1.11) Tuy nhiên,

đ iém chung của các hệ thống biogas ở nước ta hiện nay là cho hiệu suất thấp và

kh ông ổn định, do vậy khí biogas tạo ra cũng chưa được sử dụng triệt để, mới chỉ

d ừ n g ờ m ức làm nhiên liệu đốt và m ột phần nhỏ được chuyển thành điện năng

HTinh 1.11 Bể biogas bằng vật liệu HDPE dung tích 30 000 m3 tại nhà máy rượu Hà Nội

(khu công nghiệp Yên Phong, Bắc Ninh)

X ử lý nước thải theo nguyên lý công nghệ UASB và m àng lọc kỵ khí (AF)

c ũ n g khá phổ biến, áp dụng cho các cơ sở sản xuất có nước thải hữu cơ và các khu

c ô n g nghiệp So với bể tự hoại hay bể biogas, hai dạng công nghệ này đòi hỏi thiết

kế, vận hành phức tạp hơn Mặc dù được áp dụng để xử lý các loại nước thải có

h àm lượng hữu cơ ở mức trung bình (CO D 1000 - 5000 mg/L) nhưng các bể UASB

và AF cũng không tránh khỏi vướng m ắc trong giai đoạn khởi động với thời gian thuiờng kéo dài 6 tháng hoặc hơn

So với hiện trạng hoạt động của các hệ thống xử lý kỵ khí trong môi trường nước ngọt, các hệ thống hoạt động trong môi trường nước mặn (nước lợ và nước

b i ế n ) c ò n k é m h i ệ u q u ả h ơ n n h i ề u N g u y ê n n h â n l à d o q u á t r ì n h p h â n h ủ y v ậ t c h ấ t (cả hiếu khí và kỵ khí) ở điều kiện nước mặn thường chậm Trong khi tình hình ô nhiễm (đặc biệt là ô nhiễm chất thải hữu cơ từ sinh hoạt và công nghiệp nuôi trồng thủy sản) ở các vùng ven biển đang ngày càng trở nên trầm trọng, gây ảnh hưởng đến môi trường sống và da lịch, thì các công nghệ xử lý nước thải và chất thải ở đây như bể tự hoại, UASB, bể biogas, AF lại kém hiệu quả và không đáp ứng được nhu cầu thực tế Bên cạnh ảnh hưởng ức chế của hàm lượng muối cao, sự cạnh tranh của

vi khuấn khử sulfate (SRB) cũng là yếu tố quan trọng làm giảm hiệu suất của quá

t r ì n h l ê n m e n k ỵ k h í ở n ư ớ c l ợ v à n ư ớ c b i ể n ( R a b u s e t a i , 2 0 0 0 ) N ế u n h ư p h â n t r â u

bò, bùn cone và bùn hoạt tính từ các hệ thống xử lý nước thải được sử dụng làm nguồn methanogen bổ sung ban đầu vào các hệ thống xử lý kỵ khí ở môi trường nước ngọt thì trong m ôi trường nước mặn lại chưa có các nguồn vi sinh tương ứng

Đe góp phần khắc phục tình trạng hoạt động kém hiệu quả của các hệ thống

xử lý kỵ khí ở môi trường nước mặn, chúng tôi đã được giao thực hiện đề tài

“ N g h iê n c ử u p h á t triển s in h p h ẩ m h o t r ợ c ô n g n g h ệ lê n m e n tạ o k h í s in h h ọ c t r o n g

c á c đ iề u k iệ n m ô i t r ư ờ n g đ ặ c b iệ t ” v ớ i s ả n p h ẩ m c ô n g n g h ệ h ư ớ n g t ớ i l à n g u ồ n

m ethanogen hỗ trợ m ột cách chủ động cho các hệ thống xử lý kỵ khí vận hành ở

đ i ề u k i ệ n n ư ớ c l ợ v à n ư ớ c b i ể n

15

II N G U Y Ê N V Ậ T L IỆ U VÀ PH Ư Ơ N G PH Á P N G H IÊ N c ử u

2.2 P h ư ơ n g p h á p

2.2.1 C ác p h ư o n g p h á p vi sinh v ậ t học

Làm giàu và phân lập methanogen

Môi trường khoáng cơ bản (W iddel, Bak, 1992) để làm giàu và phân lập

m ethanogen gồm 26,4 g NaCl (đối với môi trường nước lợ: 13,7 g NaCl); 11,4 g

M gCl2.6H20 ; 1,47 g CaC l2.2H20 ; 0,66 g KC1; 0,09 g KBr; 0,25 g N H4C1; 0,2 g

KH2P 0 4; trong 1 lít nước cất

Môi trường sau khi khử trùng 20 phút ở 121°c được để nguội xuống 80°c, sục khí N2/C O2 (90:10, v/v) trong 5 phút, rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước máy Các chất bổ sung sau đó cho 1 lít môi trường gồm 30 ml 1 M N aH C 0 3;

1 ml hồn hợp vitam in; 1 ml hỗn hợp vi lượng (W iddel, Bak, 1992); 1 ml 1 M N a2S;

10 ml l M cơ chất (N a-acetate hoặc methanol) Trong khi bổ sung các chất, dòng khí N2/C O2 vẫn được duy trì sục qua môi trường để loại oxy pH của môi trường được chỉnh đến 7,2-7,4 bằng các dung dịch 1 M N a2C 03 hoặc 1 M HC1 Môi trường sau đó được san vào các bình serum thể tích 100 ml, đóng kín bằng nắp cao su và sử dụng để nuôi m ethanogen

Trong thí nghiệm làm giàu, mẫu trầm tích biển được đưa vào các bình serum (theo tỷ lệ 10% thể tích môi trường, w/v) chứa môi trường khoáng kỵ khí và một cơ chất N a-acetate hoặc methanol, nuôi ở 3 0 °c Sinh trưởng của m ethanogen trong các bình nuôi cấy được đánh giá thông qua thể tích khí tạo thành sau mỗi 7 ngày (đo thể tích cột nước) và quan sát m ật độ tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang (nhờ tính tự phát sáng của coenzym e F420 ở methanogen) Sau 4 tuần, dịch nuôi được cấy truyền

sang môi trường tươi Quá trình làm giàu được thực hiện qua 3 lần cấy truyền, m ẫu

ở lần cuối cùng được sử dụng để phân lập chủng methanogen thuần khiết

M ethanogen được phân lập trong dãy ống thạch bán lỏng chứa môi trường khoáng cơ bản như trên bổ sung 10 g/1 thạch và cơ chất tương ứng với mẫu làm giàu (Widdel, Bak, 1992) Khuẩn lạc methanogen được tách bằng đầu pipet Pasteur kéo dài và chuyển sang môi trường kỵ khí dịch thể Quá trình tinh sạch trên môi trườngthạch bán lỏng được lặp lại với mỗi chủng phân lập từ 2-3 lần

Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Tế bào ở pha sinh trưởng của methanogen được đưa lên phiến kính phủ thạch

và chụp ảnh trên kính hiển vi phản pha ở độ phóng đại lOOx Để quan sát khả năng

tự phát sáng của tế bào (nhờ coenzyme F420), tế bào được đưa lên màng nitrocellulose (M illipore) và quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang với kính lọc cho bước sóng trong khoảng 358 - 461 nm (Dolfing, M ulder, 1985)

Nghiên cứu đặc điểm sinh lý

Các thí nghiệm nghiên cứu đặc tính sinh học được thực hiện trong các bình serum hoặc ống nghiệm có nút cao su chứa môi trường dịch thể kỵ khí với cácthành phần m uối hay cơ chất được bổ sung như sau:

- Nồng dộ m uối NaCl: 1; 5; 10; 17; 20; 26; 33; 40; 50; 60 g-L~' bằng cách bổsung dung dịch m uối 5 M (NaCl 286,4 g; M gC l2-6H20 44,7 g; CaCl2-2H202,2 g, nước cất dẫn tới 1000 ml) vào các bình hoặc ống nghiệm nuôi

m ethanogen để được nồng độ mong muốn

và hàm lượng C H4 theo thời gian qua phân tích trên thiết bị sắc ký khí A gilent 7890A

17

ị í ' Ạ ỉ H O C Q U u C G IA H a n o i I

I TRUNG TẦM T H Ô N G TÍN THƯ V IỆ N ị

1 ơ ĩ í ũ 6 Ữ Ĩ T D 'Ậ % _

- Bảo quản tại 4°C: các c h ủ n g methanogen được nuôi trong môi t r ư ờ n g kỵ khí dịch thể thích hợp trong các ống nghiệm nút xoáy Khi các chủng sinh trưởng đạt mật độ tế bào cao (sau 5 - 7 ngày), chuyển các ống nghiệm này bảo quản tại

4 ° c Cứ sau 12 tuần, các chủng này được cấy truyền sang ống m ôi trường kỵ khí dịch thể mới

- Bảo quản tại -20°C : methanogen được nuôi trong môi trường khoáng kỵ khí thích hợp trong thời gian 5 - 7 ngày trong các ống nghiệm nhỏ có nút cao su và nắp xoáy bằng nhựa Sau đó dịch nuôi được ly tâm (sử dụng ngay ống nuôi để tránh tiếp xúc của tể bào với không khí) ở 4000 - 5000 vòng/phút trong thời gian từ 10 -

20 phút Te bào sau đó được tạo huyền phù trong môi trường khoáng kỵ khí tươi và

bổ sung chất chống đông (nồng độ cuối cùng DMSO 5%) rồi đưa vào điều kiện bảo quản lạnh sâu -2 0 Sau 10 ngày, lấy 1 ống giống ra kiểm tra bằng cách cấy truyền sang môi trường dịch thể thích hợp

Thiết lập m ô hình b ể biogas với các nguồn cơ chất khác nhau

M ô hình lên men kỵ khí được thiết lập trong bình Scott 2 lít chứa 800 ml môi trường khoáng nước lợ hoặc nước biển và rong biển (Ulva sp.) làm nguồn hữu cơ

N guồn vi sinh vật sinh m ethane là dịch nuôi bùn trầm tích từ Cát B à với Na-acetate làm chất cho điện tử Bình được đậy kín bàng nút cao su, có nối với bộ phận đo lượng khí sinh ra theo phương pháp cột nước và đường lấy mẫu để phân tích (hình 1A) M ầu khí được lấy trực tiếp bằng xilanh có khóa (Agilent) qua nắp cao su và đưa lên máy sắc ký để xác định hàm lượng CH 4

2.2.2 C ác p h ư ơ n g pháp sinh học phân tử

Tách DNA tổng số và nhãn đoạn gen 16S rDNA

DNA tổng số từ các mẫu làm giàu methanogen được tách chiết theo phương pháp

do Zhou et al. (1996) mô tả Để phân tích cấu trúc quần thể m ethanogen trong các mẫu làm giàu, đoạn gen 16S rDNA (350 bp) được khuếch đại PC R sử dụng cặp mồi đặc hiệu 348Af- TCCA G G CCCTA CG G G và 6 9 1R-GGATTACARGATTTCAC (W anatabe et al., 2004) Để ổn định mức di chuyển của các sản phẩm PCR trên gel điện di biến tính, kẹp GC (M uezer et a l, 1993) được gắn vào đầu 5’ của đoạn mồi 0348aF PCR được thực hiện với chế độ nhiệt: 94°C/3', 40 chu kỳ của 9 4 ° c /l',

4 9 ° c /l' và 72°C/2'; 72°C/8' Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1% agarose, đệm TAE, 110 V, 15 phút

Bảo quản

Điện di biến tính (DGGE - Denaturing G radient Gel Electrophoresis) được thực hiện trên gel 8% polyacrylamide trong đệm lx T A E với độ biến tính của gel (urea/formamide) từ 25 đến 60%, chế độ điện di là 200 V ở 6Ơ°C trong 3,5 giờ Gel điện di được nhuộm với edithidium brom ide (5 mg/ml) trong 15 phút, rửa bằng nước cất trong 5 phút và quan sát dưới đèn u v trên máy soi gel G elDoc (Biorad, USA).

Cắt băng, thôi g e ỉ và g iả i trình tự

Băng điện di được cắt và thôi trong nước cất vô trùng ở 4 ° c qua đêm Dịch thôi gel sau đó được sử dụng làm khuôn để khuyểch đại đoạn gen 350 bp với cặp mồi 348F và 6 9 1R (không có kẹp GC) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng PCR purìication Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự với mồi 348F

Phân tích trình tự 16 S rDNA của các chủng methanogen thuần khiết

Các chủng m ethanogen thuần khiết được nuôi trên môi trường dịch thể, sau

đó ly tâm thu sinh khối để tách DNA tổng số theo phương pháp của M arm ur (1961) Đoạn gen 16S rD N A của các chủng này được khuyếch đại với cặp mồi đặc hiệu

A 109 f-ACKGCT c A G T AAC ACGT và A934b-G TG CTCCCCCG CCA A TTCCT (Groskopí' et al., 1998) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng K it (Bioneer, Hàn Quốc), và sử dụng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Term inator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant

A ppied Biosystem s Trình tự gen được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan trên GenBank sử dụng Blast Search Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985)

2.2.3 C ác p h ư o n g p h áp phân tích hóa học

COD (Chem ical Oxygen Dem and): được xác định theo TC V N 6491:1999

Phân tích tổng lư ợ n g k h í sinh ra

Tổng lượng khí sinh ra được xác định theo phương pháp cột nước (Hình 2.1)

Đ i ệ n d i b i ế n t í n h

19

Hình 2.1 Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định lượng khí sinh ra từ bể lên men

kỵ khí (Lettinga, 1995)

Phân tích hàm lượng m ethane trong biogas

Thành phân khí m ethane trong các mẫu nuôi hay bể mô hình được xác định bằng sắc ký khí trên thiết bị A gilent 7890A sử dụng khí mang heli và đầu dò cảm ứng nhiệt TCD

Xác định hoạt tính của methanogen trong bùn nuôi

1 ml m ẫu từ các bình nuôi methanogen được chuyển vào bình serum chứa môi trường khoáng kỵ khí với N a-acetate (20 mM) làm chất cho điện tử Lượng

m ethane sinh ra trong bình nuôi được xác định mỗi giờ m ột lần và hoạt tính của

m ethanogen được tính theo lượng methane sinh ra (mmol) do 1 ml bùn trong 1 giờ

III K É T Q U Ả V À T H Ả O L U Ậ N

3.1 Làm giàu m eth an ogen từ trầm tích biển C át Bà và N ha T ra n g

Cát Bà và N h a Trang là hai vùng biển tiêu biểu của miền Bắc và miền Trung Việt N am được lựa chọn để thu mẫu trầm tích làm nguồn vi sinh vật ban đầu cho thí nghiệm làm giàu m ethanogen Đối với mỗi mẫu trầm tích, cả hai m ôi trường nước ]ợ và nước m ặn được sử dụng, cùng với nguồn cơ chất là m ethanol hoặc acetate (Hình 3.1)

Hình 3.1 Làm giàu methanogen từ các mẫu trầm tích biển Nha Trang (A, B) và Cát Bà (C,

D) trong môi trường nước biển với methanol (A, C) và acetate (B, D)

Ở m ôi trường nước mặn, các mẫu làm giàu với cả hai loại cơ chất đều sinh khí tốt, lượng khí sinh ra tăng đều theo thời gian (Hình 3.1) Tuy nhiên, hiện tượng tăng dần của khí sinh ra không quan sát được khi so sánh giữa các lần cấy truyền với nhau Đổi với m ẫu trầm tích từ N ha Trang thì tổng lượng khí sinh ra trong các lần cấy truyền sau giảm so với các lần cấy truyền trước (Hình 3.1A, 1B), trong khi

đó đối với m ẫu trầm tích từ Cát B à thì tổng lượng khí tăng sau lần cấy truyền đầu

21

tiên, sau đó tương đối ổn định qua các lần làm giàu 2 và 3 (Hình 3.1C, 1D) Nguyên nhân có thể do ảnh hưởng của nồng độ muối trong môi trường nước mặn đến số lượng và hoạt tính của methanogen có mặt trong mẫu trầm tích biển Nha Trang.Kết quả tương tự cũng thu được trong thí nghiệm làm giàu ở điều kiện môi trường nước lợ Tổng lượng khí sinh ra trong các mẫu làm giàu tăng đều theo thời gian, không phân biệt loại cơ chất sử dụng (Hình 3.2).

1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần

Thời gian (tuân)

70,0

ĩ 60,0 Ì" 50,0

í 40,0

- 30,0

- 20,0 o>

,o 10,0 0,0

70.060.0

Ị H 20,0

10,0 0,0

J=L

I tuần 2 tuần 3 tuần

Thời gian (tuẩn)

4 tuần

B

1 tuần 2 tuần 3 tuần

Thời gian (tuàn)

Hình 3.2 Làm giàu methanogen từ các mẫu trầm tích biển Nha Trang (A, B) và Cát Bà

(C,D) trong môi trường nước lợ với methanol (A, C) và acetate (B, D)

So sánh giữa các thí nghiệm làm giàu với nhau cho thấy dịch làm giàu với mẫu Nha Trang lại có tính ổn định hơn, lượng khí sinh ra tăng đều ở các lần cấy truyền sau (Hình 3.2A, 2B) Trong khi đó ở thí nghiệm làm giàu với mẫu Cát Bà, tổng lượng khí sinh ra ở lần làm giàu 3 giảm đáng kể so với trước đó (Hình 3.2C, 2D).Ben cạnh việc sử dụng môi trường có thành phần xác định để làm giàu methanogen, môi trường có thành phần không xác định gồm có nước biến và rong (20% thể tích) cũng được dùng để làm giàu (Hình 3.2) Tuy nhiên khi sử dụng môi

trường là nước biển tự nhiên và rong Ulva sp làm nguồn cơ chất duy nhất thì không

có sự tạo khí và giảm COD sau 60 ngày theo dõi Qua hai thí nghiệm làm giàu có thể nhận thấy m ethanogen có mặt trong m ẫu trầm tích biển N ha Trang sinh trưởng tốt hơn trong môi trường nước lợ trong khi đó methanogen từ trầm tích biển Cát Bà lại thích họp hơn với môi trường nước mặn Điều này phản ánh mức độ ảnh hưởng của nguồn nước từ đất liền tới khu vực ven biển N ha Trang lớn hơn so với tại đảo Cát Bà

3.2 Phân lập m eth a n o g en từ các m ẫu làm giàu

Tổng số 10 chủng m ethanogen thuần khiết đã được phân lập từ các mẫu làm giàu sử dụng ống thạch bán lỏng với cơ chất là hỗn hợp N a-acetate, methanol và trimethylam ine (10 mM mỗi loại) để đảm bảo phát hiện đa dạng cao nhất Nguồn gốc và đặc điểm hình thái sơ bộ của các chủng phân lập được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Các ch ủ n g m eth an ogen phân lập từ các m ẫu làm giàu khác nhau

TT Ký hiệu

chủng

Nguồn gốc

Hình dạng khuân lạc trong cột thạch bán lỏng

Hình dạng té bào trong môi trường dịch thể

Loài gần gũi nhất (% tương đồng trong 16S rDNA)

Trang

Khuẩn lạc tròn, bông, trắng, 0 0,5

mm

Te bào hình cầu nhỏ, tạo cặp,

k h ô n g c h u y ể n động

M e th a n o s a r c in a

5 M23a Cát Bà Khuẩn lạc trắng

đ ụ c n g ả v à n g , 0 3 mm

Tế bào hình oval, chuyển động chậm

M e th a n o ỉo b u sprofunda

(96 %)

7 M24 Cát Bà Khuẩn lạc tráng

bông, 0 2 mm

Tế bào hình oval, chuyển động chậm

M e th a n o lo b u sprofunda

(96%)

23

8 M25a Nha

Trang

Khuẩn lạc trắng đục, 0 1 mm

Tế bào hình cầu, kích thước không đều, không chuyển động

Te bào hình cầu, kích thước không đêu, không chuyển động

Methanosarcina siciliae (98%)

Các chủng phân lập đều thể hiện khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện môi trường nước có hàm lượng m uối cao như nước lợ (17 g/L) và nước biển (nước mặn,

26 - 33 g/L) và có thể còn cao hơn N hư vậy các chủng này hoàn toàn có nguồn gốc

từ biển và có nhu cầu về m uối (ít nhất là 5 - 10 g/L) để sinh trưởng

Để đánh giá mức độ tinh sạch của các chủng phân lập và đánh giá sơ bộ mối liên quan về vị trí phân loại của chúng, m ột lần nữa đoạn gen 16S rDNA được khuếch đại từ DNA genom e của các chủng này sử dụng cặp mồi 0348aF-GC và

06 9 1 R, và được phân tích bằng D G G E (Hình 3.3)

7 18 20 21 23a 23b 24 25a 25b

Hỉnh 3.3 Tính đa dạng và độ tinh sạch của các chủng methanogen phân lập được thế hiện

qua phương pháp phân tích PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNACác chủng m ethanogen đã phân lập chỉ cho 1 băng trên gel điện di, chứng tỏ chúng đã được tinh sạch thuần khiết Trong thí nghiệm này chủng M 37 được phân lập và tinh sạch sau nên không có mặt Dựa trên vị trí phân tách của các băng trên gel điện di, 9 chủng m ethanogen đã phân lập (trừ chủng M37) có thể được xếp vào

3 nhóm , trong đó nhóm 1 gồm ba chủng M7, M20, M21; nhóm II gồm ba chủng M23a, M23b, M 24 và nhóm III gồm ba chủng 18, 25a, 25b

Ba chủng đại diện cho mồi nhóm là M21, M 23b và M 25a và chủng M37 chưa có mặt trong thí nghiệm phân tích DGGE ở trên được giải trình tự gen 16S

rDNA và xác định vị trí phân loại Đoạn gen 16S rDNA dài -8 0 0 bp ở các chủng

n à y đ ư ợ c k h u ế c h đ ạ i n h ờ s ử d ụ n g c ặ p m ồ i A 1 0 9 f v à A 9 3 4 b đ ặ c h i ệ u đ ố i v ớ i c ổ khuẩn So sánh với các trình tự ở GenBank, chủng M21 có độ tương đồng cao nhất

v ớ i M e t h a n o s a r c in a s e m e is ia e ( 9 7 % ) , c h ủ n g M 2 3 b v ớ i Methanolobus profundi

( 9 6 % ) v à c h ủ n g M 2 5 a v ớ i M e t h a n o s a r c in a v a c u o la t a ( 9 6 % ) , c h ủ n g M 3 7 v ớ i Methanosarcina s i c i l i a e (98%) Trình tự gen 16S rDNA của các chủng này được lun trên ngân hàng dữ liệu GenBank với các mã số như sau: M 21- KC571195,

M 23b - K C 571193, M 25a - K C 571194 và M37 - K C 951109

3.3 Q uần xã m eth an ogen trong các m ẫu làm giàu

Các m ẫu làm giàu m ethanogen với cả hai loại cơ chất và môi trường nước lợ hoặc nước m ặn sau 3 lần cấy truyền đều thể hiện khả năng sinh khí cao và mật độ tế bào ôn định Đe đánh giá được hiệu quả của thí nghiệm làm giàu, đồng thời xác định các nhóm m ethanogen thích ứng cao nhất với điều kiện làm giàu, quần xã

m ethanogen trong các m ẫu làm giàu lần thứ 1 và 3 đã được phân tích thông qua phương pháp DGGE đối với đoạn gen 16S rDNA (~ 350 bp) khuếch đại từ DNA tổng số của các mẫu làm giàu với cặp mồi đặc hiệu cho nhóm cổ khuẩn là 0348aF-

GC và 0 6 9 1R (Hình 3.4)

H ì n h 3 4 P h â n t í c h q u ầ n x ã m e t h a n o g e n t r o n g c á c m ẫ u l à m g i à u v ớ i t r ầ m t í c h t ừ b i ể n N h a Trang và Cát Bà bằng phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA A - Các mẫu làm giàu lần 1 (.1); B - Các mẫu làm giàu lần 3 (.3); Tên mẫu: 2 - Nha Trang/nước lợ/methanol; 3 - Nha Trang/nước mặn/acetate; 4 - Nha Trang/nước mặn/methanol; 5 - Cát Bà/nước lợ/acetate; 6 - Cát Bà/nước lợ/methanol; 8 - Cát Bà/nước mặn/methanol

N hư vậy qua 3 bước làm giàu, các quần xã m ethanogen đã được thiết lập và

có mức đa dạng tương đối cao Có thể thấy quá trình làm giàu đã tạo điều kiện cho

m ột số nhóm m ethanogen có tính thích nghi cao nhất được duy trì và tích lũy trở thành nhóm chiếm đa số trong quần xã (các băng điện di b l và b2) Không có sự khác biệt rồ ràng giữa các m ẫu làm giàu từ trầm tích biến N ha Trang (2, 3, 4) và Cát

Bà (5, 6, 8) hay giữa điều kiện nước lợ (2, 5, 6) và nước m ặn (3, 4, 8)

Mối liên quan khá rõ có thể thấy được giữa điều kiện làm giàu và quần xã

m ethanogen thu được là mối liên hệ giữa nguồn cơ chất làm giàu và nhóm chiếm ưu thể Cụ thể, với cơ chất m ethanol (mẫu 2, 6, 8) nhóm đại diện băng b l chiếm ưu thế, trong khi đó với cơ chất acetate (mẫu 3, 5) thì nhóm đại diện băng b2 chiếm ưu thế Các nhóm này đã có m ặt trong m ẫu làm giàu lần 1 nhưng với số lượng thấp (băng điện di mờ) và được tăng thêm về số lượng sau 3 bước làm giàu (băng điện di đậm nét) Trường hợp ngoại lệ là m ẫu 4, tại thời điểm ban đầu có băng b l (đường gel số4.1, hình 3.4A) nhưng sau quá trình làm giàu với nguồn cơ chất là methanol băng này biến mất, thay vào đó là băng b2 xuất hiện Hai băng b l và b2 được cắt, thôi gel

và giải trình tự K ết quả so sánh với GenBank cho thấy băng b l và b2 tương ứng đại diện cho các loài Methanolobus sp và Methanosarcina sp

So sánh với các băng chính trên gel điện di DGGE của quần xã methanogen làm giàu, có thể thấy chủng M21 có nguồn gốc từ nhóm methanogen tương ứng với băng điện di b2 (Methanosarcina spp), trong khi đó chủng 23a xuất phát từ nhóm

m ethanogen tương ứng với băng điện di b l (Methanolobus spp.) (H ình 3.5)

e t a l , 2 0 0 0 ) , thì các l o à i M e t h a n o ỉo b u s đ ư ợ c p h â n l ậ p đ ề u t h u ộ c n h ó m s ử d ụ n g c á c

h ợ p c h ấ t c ó n h ó m m e t h y l ( n h ư m e t h a n o l h a y m e t h y l a m i n e ) l à m c ơ c h ấ t đ ể s i n h methane (4CH3OH —» 3C H4 + CO2 + 2H20 ) (M ochimaru et al., 2009; D oerfert et

3.4.1 Lựa chọn chủ n g có hoạt tính cao

M ười chủng m ethanogen đã phân lập và tinh sạch được so sánh về khả năng tạo methane trong môi trường kỵ khí với chất cho điện tử là hỗn hợp N a-acetate, methanol và trim ethylam ine (Bảng 3.2) Bên cạnh đó, mật độ tế bào có phát sáng trong dịch nuôi khi quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cũng là một tiêu chí đánh giá mức độ hoạt động tích cực của m ethanogen (Dolfing, M ulder, 1985)

B ảng 3.2 K hả năng sin h khí biogas và m ức độ p h át sán g của tế bào dưới kính hiển vi huỳnh q u a n g ghi nhận ở các ch ủn g m eth an ogen phân lập được

chủn g

Nồng độ muối sinh trưởng tối ưu (NaCl g/L)

T ôn g thê tích khí tạo ra (m l)*

27

Có thể thấy cả 10 chủng m ethanogen phân lập được đều có khả năng sinh khí trong điều kiện kỵ khí với hồn hợp cơ chất là methanol, acetate và trim ethylam ine Lượng khí sinh ra và mức độ phát sáng của m ẫu dịch tế bào khi quan sát dưới kính hiên vi huỳnh quang có liên hệ cơ hữu, chủng tạo nhiêu khí thì cũng có mức độ phát sáng cao hơn Trong số 10 chủng, M37 nổi trội hơn cả trong thí nghiệm này, tạo được 25 ml khí sau 18 ngày nuôi, vượt xa chủng kế tiếp có hoạt tính cao là M7 (19,5 ml) Bên cạnh đó, chủng 37 có khả năng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao hơn các chủng còn lại (33 g/L) Với những lý do trên, chủng M37 được lựa chọn để phát triển nguồn m ethanogen bổ sung cho các hệ thống xử lý kỵ khí hoạt động trong điều kiện nước mặn.

3.4.2 N ghiên cứu đ ặc điếm sinh học của chủ n g M 37

Đặc điểm hình thái. Chủng M3 7 có tế bào h ì n h cầu k h ô n g c h u ẩ n , k í c h thước t h a y đổi theo thời gian sinh trưởng, có hiện tượng tế bào cụm thành nhóm đôi, ba hoặc nhiều hơn (hình 3.6A) Trên kính hiển vi huỳnh quang, tế bào của chủng M37 có phát sáng nhưng không mạnh (hình 3.6B) Phân tích so sánh trình tự gen 16S rDNA

A letlumosarcma sicil iae (FR~ 3 3 6 9 8 11

- M 3 7 (KC 951109)

Hình 3.6 Hình thái tế bào và vị trí phân loại của chủng M37 A, B - Hình thái tế bào của chủng M37 dưới kính hiển vi phản pha và kính huỳnh quang, bar = 5 |am; c - Vị trí phân loại của chủng M37 so với các loài có quan hệ gần gũi dựa trên so sánh trình tự gen 16S

rDNA

Đặc điểm sinh /ỷ. Đặc điểm sinh lý của chủng M37 được đánh giá thông qua giá trị

đo mật độ quang của dịch nuôi và lượng m ethane sinh ra (Hình 3.7)

p H

0.6 0.5

s 0.4

VO

o 0 I

0.2 0.1

Kết quả cho thấy chủng này thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm và có khả năng chịu nhiệt (H ình 3.7A) Chủng M37 sinh trưởng tăng sinh cũng như tạo methane tốt nhất ở nhiệt độ 3 7 °c Sinh trưởng và tạo methane vẫn tiếp tục ở nhiệt độ 4 5 °c nhưng ở mức thấp hơn, trong khi đó ở 3 0 °c thì chỉ có sinh trưởng nhưng ít tạo methane, còn ở 2 0 °c thì phát triển rất kém Điều này cũng phù hợp với những kết

29

quả đã công bổ trước đây đổi với các chủng khác cũng thuộc loài M siciliae (Ni, Boone, 1991; Elberson, Sowers, 1997).

Chủng M37 có khả năng sinh trưởng và tạo m ethane trong khoảng pH rộng,

từ 5,5 -8 Sinh trưởng tối ưu tại pH 7,5 (Hình 3.7B), nhưng sinh m ethane tối ưu ở

pH >8 ở pH 7 và 8 chủng này thể hiện mức sinh trưởng tương đương nhau, nhưng hoạt tính sinh methane ở pH 7 thấp hơn đáng kể so với pH 8 Ở pH < 7 chủng M37

có mức sinh trưởng cũng như hoạt tính sinh methane thấp

Môi trường có hàm lượng muối từ 1 7 - 4 0 g/L là môi trường thích hợp nhất cho chủng M37 sinh trưởng, quá trình sinh m ethane giảm đáng kể ở độ muối > 40 g/L (Hình 3.7C) Chủng M37 hầu như không sinh trưởng ở môi trường không bố sung muối Như vậy có thể kết luận chủng này thuộc nhóm ưa mặn nhẹ, tương tự như các chủng cùng loài M siciliae là C2J, HI350 và T4/M đã công bố trước đây (Ni, Boone, 1991; Elberson, Sowers, 1997)

Trong số các nguồn cơ chất thử nghiệm, chủng M37 sinh trưởng tốt nhất với trim ethylam ine, nhưng lại sinh methane tốt nhất với acetate (Hình 3.8) Hydro và methanol cũng được sử dụng để tăng sinh (Hình 3.8A) nhưng không được chuyển hóa thành methane (Hình 3.8B) Trong số ba chủng M siciliae đã công bố thì chỉ có chủng C2J phân lập từ trầm tích biển Canyon có khả năng sử dụng acetate làm cơ chất để sinh trưởng và tạo m ethane (Elberson, Sowers, 1997) N hư vậy về đặc tính sinh học chủng M37 phân lập trong nghiên cứu này gần với chủng C2J hơn so với hai chủng còn lại

H ì n h 3.8 Sinh trưởng và sinh methane ở chủng M37 trên các nguồn cơ chất khác nhau A

- T h a y đ ổ i g i á t r ị mật độ q u a n g O D óoo ; B - CH4s i n h ra t r o n g qưá t r ì n h s i n h trưởng.Trong quá trình lên men kỵ khí chất hữu cơ sinh biogas, l ư ợ n g methane sinh

r a c h ủ y ế u d o n h ó m m e t h a n o g e n s ử d ụ n g a c e t a t e ( t r ê n 7 0 % ) , c h ỉ c ó m ộ t p h ầ n n h ỏ

do nhóm m ethanogen sử dụng hydro (Lettinga, 1995; Bitton, 1999; W hitman et al.,

2000) Chủng M37 được chuyên biệt hóa tạo m ethane từ acetate và có khả năng