Quy trình này có tính lặp lại, sử dụng rất ít động vật và có thể xếp hạng các chất theo cách tương tự với các phương pháp thử nghiệm độc cấp tính tính khác OECD 420 và OECD 425.. 3 Thuật
Trang 1DỰ THẢO 2 TCVN :2019
Xuất bản lần 1
HÓA CHẤT – QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM ĐỘC CẤP TÍNH THEO ĐƯỜNG MIỆNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI ĐỘC CẤP TÍNH
Chemicals – Testing for acute oral toxicity – Acute toxic class method
HÀ NỘI – 2019
Trang 3Lời nói đầu
TCVN… :2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo tài liệu của
Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (OECD) Environmental Health
and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 423
(2001), Guideline for the testing of chemicals – Acute oral toxicity –
Acute toxic class method;
TCVN :2019 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm
quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường
Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố
Trang 4Lời giới thiệu
Phương pháp phân loại độc cấp tính [1] được nêu trong tiêu chuẩn này là quy trình từng bước, sử dụng ba động vật cùng giới tính ở mỗi bước Tùy thuộc vào tỷ lệ tử vong và/hoặc tình trạng hấp hối của động vật, có thể cần trung bình từ hai đến bốn bước để đánh giá độc cấp tính của chất thử nghiệm Quy trình này có tính lặp lại, sử dụng rất ít động vật và có thể xếp hạng các chất theo cách tương tự với các phương pháp thử nghiệm độc cấp tính tính khác (OECD 420 và OECD 425) Phương pháp phân loại độc cấp tính dựa trên các đánh giá sinh trắc học [2] [3] [4] [5] với liều cố định, tách biệt hoàn toàn để chất có thể được xếp hạng cho mục đích phân loại và đánh giá rủi ro Phương pháp đã được xác nhận rộng rãi trên cơ thể sống với dữ liệu LD50 thu được từ Tài liệu tham khảo [6] và [7] Hướng dẫn về việc lựa chọn phương pháp thử nghiệm thích hợp nhất cho một mục đích nhất định được nêu trong Tài liệu tham khảo [8] Tài liệu tham khảo [8] cũng có thông tin về cách tiến hành và diễn giải tiêu chuẩn này
Trang 5T I Ê U C H U Ẩ N Q U Ố C G I A TCVN :2019
Hóa chất – Quy trình thử nghiệm độc cấp tính theo đường miệng – Phương pháp phân loại độc cấp tính
Chemicals – Testing for acute oral toxicity – Acute toxic class method
CẢNH BÁO – Người sử dụng tiêu chuẩn này cần có kĩ năng phân tích trong phòng thử nghiệm Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thử nghiệm độc cấp tính qua đường miệng trên chuột nhắt trắng khi áp dụng chất thử nghiệm là hóa chất
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì
áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có)
3 Thuật ngữ và định nghĩa
Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:
3.1
Độc cấp tính theo đường miệng (acute oral toxicity)
Những tác dụng phụ xảy ra sau khi uống một liều duy nhất của một chất thử hoặc nhiều liều được đưa
ra trong vòng 24 h
3.2
Liều lượng/liều (dose)
Lượng chất thử được dùng
Trang 6CHÚ THÍCH: Liều được biểu thị bằng khối lượng của chất thử trên một đơn vị khối lượng của động vật thử nghiệm (ví dụ: mg/kg)
3.3
Hệ thống phân loại hài hòa toàn cầu đối với các chất và hỗn hợp hóa học (Globally Harmonised
Classification System for Chemical Substances and Mixtures)
GHS
Hoạt động chung của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế - OECD (về sức khỏe con người và môi trường), Ủy ban Liên hợp quốc các chuyên gia về vận chuyển hàng hóa nguy hiểm (về thuộc tính hóa lý), Tổ chức Lao động quốc tế - ILO (về các thông tin nguy hiểm) và được điều phối bởi Chương trình
tổ chức quản lý an toàn ( Sound Management of Chemicals ) hóa chất – IOMC.
3.4
Cái chết đến gần (impending death)
khi trạng thái hấp hối hoặc cái chết được đoán trước trước thời gian quan sát dự định tiếp theo
CHÚ THÍCH: Các dấu hiệu cho thấy tình trạng này ở loài gặm nhấm có thể bao gồm co giật, vị trí bên, sự bò rạp
và run, xem thêm Tài liệu tham khảo [9]
3.5
Liều uống trung bình có thể gây chết (median lethal oral dose)
LD50
Liều duy nhất có nguồn gốc thống kê của một chất được dự kiến có thể gây tử vong ở 50 % số động vật khi được dùng bởi đường uống
CHÚ THÍCH: Giá trị LD50 được biểu thị theo khối lượng của chất thử trên một đơn vị khối lượng của động vật thử nghiệm (mg/kg)
3.6
Liều giới hạn (limit dose)
Liều ở một giới hạn trên trong thử nghiệm (2 000 hoặc 5 000 mg/kg)
3.7
Tình trạng hấp hối (moribund status)
đang trong tình trạng sắp chết hoặc không có khả năng sống sót, ngay cả khi được điều trị
CHÚ THÍCH: Xem thêm Tài liệu tham khảo [9]
3.8
Cái chết có thể dự đoán (predictable death)
sự hiện diện của các dấu hiệu lâm sàng về biểu hiện tử vong tại một thời điểm đã biết trong tương lai trước khi kết thúc kế hoạch thử nghiệm, ví dụ: không có khả năng tiếp cận nước hoặc thực phẩm
CHÚ THÍCH: Xem thêm Tài liệu tham khảo [9]
Trang 74 Xem xét ban đầu
4.1 Không sử dụng chất thử nghiệm ở liều lượng được cho là gây ra đau đớn rõ rệt do những hoạt
động ăn mòn hoặc có những kích thích nghiêm trọng Động vật hấp hối hoặc động vật đang trong cơn đau hoặc có dấu hiệu đau nghiêm trọng và kéo dài phải bị giết vì lý do nhân đạo, và được xem xét trong việc diễn giải kết quả thử nghiệm giống như động vật đã chết khi thử nghiệm Tiêu chí đưa ra quyết định giết chết động vật hấp hối hoặc đang cực kỳ đau đớn và hướng dẫn về việc công nhận cái chết có thể dự đoán hoặc cái chết đến gần được nêu trong Tài liệu hướng dẫn [9]
4.2 Phương pháp này sử dụng liều được xác định trước và kết quả cho phép một chất được xếp
hạng và phân loại theo GHS để phân lớp hóa chất gây ngộ độc cấp tính [10]
4.3 Về nguyên tắc, phương pháp này không nhằm tính toán LD50 chính xác nhưng cho phép xác
định phạm vi, trong đó tỷ lệ chết động vật vẫn là điểm chính Đồng thời phương pháp này chỉ cho phép xác định giá trị LD50 khi ít nhất hai liều dẫn đến tỷ lệ tử vong lớn hơn 0 % và nhỏ hơn 100 % Việc sử dụng các liều được xác định trước, bất kể là chất thử nghiệm, với phân loại rõ ràng gắn liền với số lượng động vật được quan sát thấy ở các trạng thái khác nhau sẽ cải thiện cơ hội cho phòng thử nghiệm báo cáo một cách nhất quán và có trình tự
4.4 Phòng thử nghiệm cần xem xét mọi thông tin có sẵn về chất thử trước khi tiến hành nghiên cứu.
Những thông tin này sẽ bao gồm nhận diện và cấu trúc hóa học của chất; tính chất hóa lý; kết quả của
bất kỳ thử nghiệm độc tính in vivo hoặc in vitro; dữ liệu độc học về các chất liên quan đến cấu trúc; và
các dự đoán về cách sử dụng của chất thử Thông tin này là cần thiết để đáp ứng tất cả những lo ngại rằng phép thử này có liên quan đến việc bảo vệ sức khỏe con người và sẽ giúp lựa chọn liều khởi đầu thích hợp nhất
5 Nguyên tắc
Phép thử dựa trên quy trình từng bước với việc sử dụng số lượng động vật tối thiểu trong mỗi bước, thông tin đầy đủ thu được dựa trên độc cấp tính của các chất thử nghiệm để tiến hành phân loại Chất được đưa vào qua đường miệng đến một nhóm động vật thử nghiệm với một trong những liều lượng
đã định Chất này được thử nghiệm bằng cách sử dụng quy trình từng bước, mỗi bước sử dụng ba động vật cùng giới (thường là giống cái) Việc có hay không những hợp chất liên quan đến số động vật
tử vong được định lượng ở một bước sẽ quyết định bước tiếp theo, nghĩa là;
– không cần thử nghiệm thêm,
– liều tương tự với ba động vật bổ sung,
– liều lượng của ba động vật bổ sung tiếp theo ở mức cao hơn hoặc thấp hơn
Trang 8Các chi tiết của quy trình thử được mô tả trong Phụ lục A Phương pháp này cho phép đánh giá đối với việc phân loại chất thử nghiệm thành một trong một loạt các nhóm độc tính được xác định bằng giá trị điểm cắt cố định LD50
6 Mô tả phương pháp
6.1 Chọn loài động vật
Đối tượng thử nghiệm thường được chọn là chuột, cũng có thể sử dụng các loài gặm nhấm khác, và thông thường là giống cái [9]
CHÚ THÍCH: Giống cái thường được chọn là do cơ sở lý thuyết của các thử nghiệm LD50 thông thường cho thấy, mặc dù có sự khác biệt về độ nhạy giữa các giới, nhưng trong những trường hợp khác nhau thì nữ giới thường nhạy cảm hơn một chút [11]
Tuy nhiên, nếu hiểu biết về độc tính của các hóa chất liên quan đến cấu trúc chỉ ra rằng giống đực có thể nhạy cảm hơn thì cần sử dụng giới tính này Khi thử nghiệm được tiến hành trên giống đực, cần có
sự biện minh đầy đủ
Cần sử dụng động vật trưởng thành, trẻ và khỏe mạnh, từ các loài thường được dùng trong phòng thử nghiệm Con cái chưa sinh đẻ và không mang thai Lúc bắt đầu dùng thuốc, mỗi con vật phải từ 8 đến
12 tuần tuổi và khối lượng của nó cần ở trong giới hạn ± 20% khối lượng trung bình của tất cả động vật
đã sử dụng liều trước đó
6.2 Điều kiện nuôi dưỡng
Nhiệt độ trong phòng thí nghiệm động vật cần trong khoảng 22 oC ± 3 oC Độ ẩm tương đối không nhỏ hơn 30 % và tốt hơn hết không lớn hơn 70%, và trong quá trình làm sạch phòng cần đạt từ 50 % đến
60 % Cần sử dụng ánh sáng nhân tạo, trình tự là 12 giờ sáng, 12 giờ tối Có thể sử dụng chế độ ăn uống thông thường trong phòng thử nghiệm và không hạn chế nguồn cung cấp nước uống Động vật
có thể được nhóm theo liều lượng sử dụng, nhưng số lượng động vật trong mỗi lồng không được cản trở sự quan sát rõ ràng của từng con vật
6.3 Chuẩn bị động vật
Các động vật được chọn ngẫu nhiên, được đánh dấu để cho phép nhận dạng riêng, và giữ trong lồng của chúng ít nhất 5 ngày trước khi dùng thuốc để thích nghi với điều kiện phòng thử nghiệm
6.4 Chuẩn bị liều
Các chất thử nghiệm nên dùng với thể tích không đổi trên phạm vi liều dùng và được kiểm tra bằng cách thay đổi nồng độ khi chuẩn bị liều lượng Tuy nhiên, khi sử dụng chất thử nghiệm không pha loãng, tức là ở nồng độ không đổi, điều này có thể phù hợp hơn với sự đánh giá rủi ro tiếp theo của chất đó và
Trang 9cũng là yêu cầu của một số cơ quan quản lý Trong cả hai trường hợp, không được dùng quá thể tích liều tối đa Do đó, thể tích tối đa của chất lỏng có thể được dùng cùng một lúc phụ thuộc vào kích thước của động vật thí nghiệm Đối với loài gặm nhấm, thể tích không nên vượt quá 1 mL/100 g khối lượng cơ thể, tuy nhiên có thể cân nhắc trường hợp dung dịch nước 2 mL/100 g khối lượng cơ thể Đối với công thức xác định liều lượng, sử dụng dung dịch nước/huyền phù/nhũ tương nếu có thể, ưu tiên sử dụng dung dịch/huyền phù/nhũ tương trong dầu (ví dụ: dầu ngô), có thể dùng dung dịch với dung môi khác Đối với các loại dung môi không phải là nước, cần biết rõ đặc tính độc học Các liều phải được chuẩn
bị ngay trước khi sử dụng, trừ khi cần giữ ổn định trước khi sử dụng
7 Cách tiến hành
7.1 Quản lý liều
Chất thử được dùng với một liều duy nhất bằng cách sử dụng ống dạ dày hoặc ống đặt nội khí quản thích hợp Trong trường hợp bất thường không thể dùng một liều duy nhất, có thể chia liều thành những phần nhỏ hơn trong một khoảng thời gian không quá 24 h
Động vật cần được cho nhịn ăn trước khi dùng thuốc (ví dụ: đối với chuột lớn, thức ăn ngoại trừ nước cần được thải hồi qua đêm, đối với chuột nhỏ hơn, thức ăn ngoại trừ nước cần được thải hồi trong vòng 3 h đến 4 h) Sau thời gian nhịn ăn, các con vật cần được cân và cho sử dụng chất thử nghiệm Sau khi sử dụng chất này, thức ăn có thể được thải hồi trong 3 h đến 4 h sau ở loài chuột lớn và 1 h đến 2 h ở chuột nhỏ Khi một liều được dùng theo những phần nhỏ trong một khoảng thời gian, việc cung cấp cho động vật thức ăn và nước uống tùy thuộc vào độ dài của chu kỳ
7.2 Số lượng động vật và mức liều dùng
Ba động vật được sử dụng cho mỗi bước Liều lượng sử dụng làm liều khởi đầu được lựa chọn từ một trong bốn mức cố định: 5, 50, 300 và 2000 mg/kg khối lượng cơ thể (thể trọng) Mức liều khởi đầu cần phải là mức có nhiều khả năng gây tử vong nhất ở một số động vật được định lượng Biểu đồ quá trình
mô tả quy trình cần áp dụng cho mỗi liều khởi đầu được nêu trong Phụ lục A
Khi thông tin có sẵn cho thấy tỷ lệ tử vong ở liều khởi đầu không ở mức cao nhất (2000 mg/kg thể trọng), cần phải tiến hành phép thử giới hạn Khi không có thông tin về một chất được thử nghiệm, vì lý
Khoảng thời gian giữa các nhóm điều trị được xác định bởi sự khởi đầu, quá trình và mức độ nghiêm trọng của các dấu hiệu độc hại Cần trì hoãn việc điều trị động vật ở liều kế tiếp cho đến khi có sự khẳng định về việc các động vật đã được định lượng trước đó đã sống sót
Đặc biệt , có thể xem xét việc sử dụng liều lượng bổ sung cao hơn 5000 mg/kg thể trọng (xem Phụ lục B) chỉ khi được chứng minh bằng các hoàn cảnh cụ thể theo quy định Vì lý do an sinh động vật, việc thử nghiệm động vật trong phạm vi hạng GHS 5 (từ 2000 mg/kg đến 5000 mg/kg) không được khuyến
Trang 10khích và chỉ xem xét khi có khả năng chắc chắn rằng, kết quả của thử nghiệm này có liên quan trực tiếp đến việc bảo vệ sức khỏe con người, sức khỏe động vật hoặc môi trường
7.3 Phép thử giới hạn
Phép thử giới hạn chủ yếu được sử dụng trong các tình huống mà người thử nghiệm có thông tin chỉ
ra rằng: chất thử nghiệm có khả năng không độc hại, tức là chỉ có độc tính trên liều giới hạn quy định Thông tin về độc tính của chất thử nghiệm có thể thu được từ kiến thức về các hợp chất thử nghiệm tương tự hoặc các hỗn hợp hoặc sản phẩm được kiểm tra tương tự, xem xét nhận dạng và tỷ lệ thành phần có ý nghĩa độc tính Trong những tình huống có ít hoặc không có thông tin về độc tính của chất thử nghiệm, hoặc trong đó chất thử nghiệm được cho là độc hại, những lần thử nghiệm chính cần được thực hiện
Phép thử giới hạn ở mức liều 2000 mg/kg thể trọng có thể được thực hiện với sáu con vật (ba động vật mỗi bước) Cá biệt, phép thử giới hạn ở mức liều 5000 mg/kg có thể được thực hiện với ba động vật (xem Phụ lục A) Nếu có tử vong liên quan đến chất thử nghiệm, cần thực hiện việc kiểm tra thêm ở cấp độ thấp hơn
8 Quan sát động vật
8.1 Khái quát
Động vật được quan sát riêng ít nhất một lần sau khi dùng liều trong 30 min đầu tiên, định kỳ trong 24 h đầu, với một sự chú ý đặc biệt trong 4 h đầu tiên và hàng ngày sau đó, tổng số là 14 ngày, trừ khi chúng được tìm thấy đã chết hoặc cần bị loại bỏ khỏi nghiên cứu và kết thúc sự sống vì lý do an sinh
được xác định bởi các phản ứng độc hại, thời gian bắt đầu và thời gian phục hồi, do đó có thể kéo dài khi cần thiết Thời gian mà các dấu hiệu của độc tính xuất hiện và biến mất rất quan trọng, đặc biệt là các dấu hiệu độc hại có chiều hướng trì hoãn [12] Tất cả các quan sát được ghi lại có hệ thống với hồ
sơ cá nhân được sử dụng cho từng con vật
8.2 Quan sát bổ sung
Các quan sát bổ sung sẽ cần thiết nếu động vật tiếp tục có dấu hiệu của độc tính Quan sát cần bao gồm những thay đổi về da và lông; mắt và niêm mạc; cũng như hệ thống hô hấp, tuần hoàn, hệ thần kinh tự chủ và hệ thần kinh trung ương; tập tính và chuyển động cơ thể Cần chú ý đến các quan sát
về tình trạng run, co giật, tiết nước bọt, tiêu chảy, ngủ và hôn mê Cần xem xét các nguyên tắc và tiêu chí được tóm tắt trong Tài liệu tham khảo [9] Động vật trong tình trạng hấp hối và động vật có những cơn đau dữ dội hoặc những dấu hiệu lâu dài của bệnh trầm trọng cần được giết nhân đạo Khi động vật đã chết hoặc bị giết vì lý do nhân đạo, thời gian chết cần được ghi lại chính xác nhất có thể