Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62 64 01 02 NGUYỄN THU TÂM NGHIÊN CỨU BỆNH NHIẾM ĐỘC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI

Mã ngành: 62 64 01 02

NGUYỄN THU TÂM

NGHIÊN CỨU BỆNH NHIẾM ĐỘC TỐ BOTULIN CỦA VI

KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT TẠI MỘT SỐ

TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường

Họp tại:………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … giờ … ngày …… tháng … năm ………

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

1 Nguyễn Thu Tâm, Đặng Ngọc Lễ 2014 Khảo sát triệu trứng bệnh tích của chuột bạch khi tiêm dịch bệnh phẩm dịch ruột từ vịt chạy đồng nghi trúng độc botulin Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số Nông nghiệp 2014 107-110

2 Nguyễn Thu Tâm, Lý Thị Liên Khai, Nguyễn Đức Hiền 2016

Phân lập và định danh ci khuẩn Clostridium spp từ đất ruộng tại

huyện Phú Tân và Châu Phú, tỉnh An Giang Tạp chí NN & PTNT, chuyên đề Nông nghiệp xanh tháng 11/2016 73-77

3 Nguyễn Thu Tâm, Trần Thị Phận, Nguyễn Đức Hiền 2016 Phân

lập và định danh vi khuẩn Clostridium botulinum từ vịt bị liệt mềm

cổ tại huyện Tân Phú và Tri Tôn, tỉnh An Giang Tạp chí NN & PTNT, chuyên đề Nông nghiệp xanh, tháng 11/2016 147-150

4 Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu 2016 Chẩn đoán bệnh “Cúm cần” ở vịt bằng phương pháp thử nghiệm trên chuột bạch Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số Nông nghiệp 2016 125-130

5 Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu 2016

Phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum trên ốc bươu (Pila conica)

và cua đồng (Somannia theplusa) tại thành phố Cần Thơ, tỉnh An

Giang và Kiên Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ

Số Nông nghiệp 2016 131-134

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sông ngòi chằng chịt và khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, nhiều ánh sáng, diện tích trồng lúa lớn và rộng khắp, có nhiều động thực vật thủy sinh,… là những điều kiện thuận lợi để có thể chăn nuôi vịt quanh năm, đặc biệt là nuôi vịt chạy đồng Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạy đồng ở ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm hơn 70% đàn vịt trong vùng và chiếm 40% trong tổng đàn vịt cả nước Phương thức nuôi này có ưu điểm là tận dụng được thức ăn tự nhiên có sẵn là lúa rơi vãi sau thu hoạch của nông dân nhằm giảm đáng kể chi phí trong chăn nuôi Nhưng, điều này cũng là một mối

đe dọa lớn cho ngành thú y vì không thể kiểm soát được môi trường chăn thả dẫn đến nguy cơ xảy ra dịch bệnh rất cao Một trong những bệnh phổ biến trên đàn vịt chạy đồng ở Đồng bằng Sông Cửu Long hiện nay là bệnh “limberneck” hay bệnh “cúm cần” theo cách đặt tên của địa phương Bệnh cúm cần là bệnh trên thủy cầm do ngoại độc tố botulin của vi khuẩn

Clostridium botulinum gây ra; Thế nên, các nhà khoa học gọi là bệnh

botulism

Vi khuẩn Clostridium botulinum là vi khuẩn kị khí tuyệt đối, có

nha bào và sinh bào tử hình oval, thường tồn tại trong đất, nhất là các vùng bùn lắng trầm tích, trong xác các loài nhuyễn thể, trong ruột các loài động vật trên cạn và dưới nước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin rất mạnh, phá huỷ hoàn toàn thần kinh trung ương (Todar, 2009) Vịt ăn phải độc tố này sẽ xuất hiện các triệu chứng là liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân và tử số cao, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998)

Hiện nay, những nhà khoa học của nhân y và thú y trên thế giới đã

và đang nghiên cứu botulism trên con người và trên các loại gia cầm Tuy nhiên, những nghiên cứu và thông tin về tình hình về bệnh botulism, yếu

tố nguy cơ cũng như đặc điểm sinh học của vi khuẩn Clostridium

botulinum tại Việt Nam nói chung, Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng

còn khá hạn chế Với mong muốn, thông qua nghiên cứu này sẽ vẻ nên

một bức tranh toàn diện vi khuẩn Clostridium botulinum và bệnh botulism

trên vịt chay đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long Từ đó, đề tài “Nghiên

cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum

trên vịt tại một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long” được tiến hành

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của Đồng bằng sông Cửu Long

- Xác định sự hiện diện vi khuẩn C botulinum và xác định

type độc lực của botulin trên VCĐ

- Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C botulinum phân lập

trên môi trường nuôi VCĐ

- Xác định khả năng gây bệnh của các chủng C botulinum

phân lập được tại ĐBSCL

1.3 Những điểm mới của luận án

- Đã đưa ra những bằng chứng khoa học xác thực đầu tiên về sự

lưu hành của bệnh liệt mềm cổ và vi khuẩn C botulinum trên vịt ở một

số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

- Xác định các yếu tố nguy cơ gây bệnh botulinum trên vịt chạy

đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long

- Xác định được các type độc tố của vi khuẩn Clostridium

botulinum gây bệnh liệt cổ trên vịt

- Kỹ thuật mouse bioassay được áp dụng để xác định bệnh

nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn Clostridium botulinum trên vịt ở

Việt Nam

1.4 Ý nghĩa khoa học của luận án

Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản có hệ thống bệnh bệnh botulism trên vịt chay đồng ở Đồng bằng sông Cửu Long Từ đó xây dựng được quy trình khoa học trong chẩn đoán xác định bệnh, đồng thời là cơ sở khoa học trong việc xây dựng qui trình phòng trị bệnh botulism trên vịt chạy đồng ở Đồng bằng sông Cửu long nói riêng, cả nước nói chung

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến

hành từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 10 năm 2018

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu

Mẫu được thu thập tại 3 tỉnh và 1 thành phố của Vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang và thành phố Cần Thơ

3.1.2.2 Phân tích mẫu và nuôi chuột thí nghiệm

Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn và thử độc tố trên chuột tại phòng thí nghiệm Thú Y chuyên ngành 3, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ

3.1.2.3 Thí nghiệm trên thực địa

Thử nghiệm độc tố của vi khuẩn C botulinum trên vịt đẻ được

thực hiện tại Công ty TNHH Một thành viên chăn nuôi Vemedim, xã Thới Thạnh, huyện Ô Môn, Thành phố Cần Thơ

3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ và thiết bị

Mẫu phiếu điều tra (phần phụ lục)

- Thu thập thông tin từ niên giám thống kê và Chi cục chăn nuôi và Thú Y về tổng đàn gia cầm, thời tiết, khí hậu, tình hình chăn nuôi vịt và dịch bệnh ở địa điểm thu thập mẫu

- Dụng cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm vi sinh

Hóa chất và môi trường

- Cồn 96o, cồn 70o, nước cất, dầu cedar, Crystal violet, Lugol, Safranine, Bromocresole purple, Gelatin Phosphat Buffer… (Merck, Đức)

- Kháng sinh: sử dụng các loại kháng sinh amikacin, ampicillin, amoxicillin, ceftiofur, cephalexin, doxycycline, florfenicol, fosfomycin, marbofloxacin, norfloxacin (Oxoid, Anh)

- Ống chuẩn Mac Farland 0, 5 và 3 (Biorad)

- Môi trường

Môi trường NB: Nutrient broth (Merck, Đức)

Môi trường TSA: Tryptis Soy Agar (Merck, Đức)

Môi trường CMM: Cooked Meat Media (Oxoid, Anh)

Môi trường EYA: Egg Yorlk Agar (Merck, Đức)

Môi trường Thioglycollate (Merck, Đức)

Môi trường SFP Agar Base (Difco, Mỹ)

Môi trường MHA: Mueller Hinton Agar (Merck, Đức)

Các loại đường: Lactose, glucose, maltose, saccarose (Merck, Đức)

Bộ phản ứng sinh hóa API 20A (Biorad)

Máu cừu (công ty Nam Khoa- TP HCM)

Môi trường TPGY broth: 5% Trypticase, 0.5% Pepton, 0.4% Glucose, 2% Yeast extract, 0.1% Sodium thioglycolate

Môi trường CMM (Cooked Meat Medium) (Oxoid, Anh) Kháng độc tố dạng lỏng (antitoxins) type C, D, E (10UI/ml) (Statens Serum Institut, Đan Mạch)

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng

(VCĐ) ở Đồng bằng sông Cửu Long

3.3.1.1 Mục tiêu

Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism trên đàn vịt chạy đồng của Đồng bằng sông Cửu Long

3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Vịt chạy đồng mắc bệnh botulism được nuôi dưỡng tại địa bàn Đồng bằng sông Cửu Long Những vịt này được chia theo mục đích nuôi bao gồm vịt thịt và vịt đẻ Vịt thịt được nuôi thả đồng từ 4-18 tuần tuổi, vịt đẻ sẽ bắt đầu tính tuổi sau 24 tuần tuổi

3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu

a Tình hình chăn nuôi VCĐ ở ĐBSCL

- Điều tra hồi cứu tình hình chăn nuôi vịt chạy đồng tại Phòng thống kê của Chi cục Chăn nuôi và Thú y ở 4 địa điểm thu thập mẫu Tại đây, nhóm nghiên cứu sẽ thu thập thông tin về tổng đàn VCĐ, những thuận lợi và bất lợi của điều kiện tự nhiên trong chăn nuôi vịt theo phương thức chạy đồng từ năm 2012-1014

b Tình hình bệnh botulism trên vịt chạy đồng (VCĐ) ở Đồng bằng sông Cửu Long

- Điểu tra cắt ngang và tiến cứu về tình hình bệnh botilism trên VCĐ tại 4 địa điểm thu thập mẫu

- Cỡ mẫu nghiên cứu : Phân bố mẫu mỗi tỉnh cần khảo sát được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát tại 4 địa điểm lấy mẫu

Bước 1 Điều tra

Trong quá trình điều tra và thu mẫu trên từng địa bàn đều hợp tác với thú y địa phương để biết tình hình đàn VCĐ ở địa bàn quản

lý, hỏi chủ nuôi về tình hình sức khỏe của đàn vịt đồng thời quan sát trạng thái thần kinh cũng như quá trình vận động của vịt Nếu đàn vịt

có xuất hiện các triệu chứng của bệnh botulism như xù lông, giảm

ăn, yếu chân, liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân thì tiến hành lập phiếu điều tra (Phụ lục 1), đồng thời thương lượng mua mẫu vịt bệnh

để nghiên cứu

+ Bước 2: Lấy mẫu

Mẫu bệnh phẩm được lấy trên vịt bệnh còn sống hoặc vừa chết (1) Trên vịt bệnh còn sống, lấy khoảng 5-10 ml máu từ tỉnh mạch cổ, mổ khảo sát bệnh tích đại thể của nội quan, thu bệnh phẩm nội quan phân trong ống tiêu hóa và gan (2) trường hợp vịt vừa chết thì tiến hành mổ

kháo sát và lấy mẫu giống như trên Mỗi đàn vịt lấy từ 1-5 bệnh phẩm

3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi

3.3.2.1 Mục tiêu Xác định sự hiện diện vi khuẩn C botulinum và

xác định type độc lực của botulin trên VCĐ

3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu

Huyết thanh và bệnh phẩm của VCĐ bệnh botulism ở nộidung 1

3.3.2.3 Phương pháp tiến hành

a Phân lập vi khuẩn C botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh

Phân lập vi khuẩn C botulinum trên bệnh phẩm của vịt bệnh

theo Lindstrom and Korkeala (2006) và qui trình có cải tiến được trình bày trong Hình 3.1

(Tất cả các bước thực hiện đều được ủ yếm khí ở 37 0

C/24-48h)

Hình 3.1 Qui trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum (Lindstrom and

Korkeala, 2006) và qui trình có cải tiến

Hình 3.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn

C botulinum trên thạch máu

CMM

Chọn khuẩn lạc điển hình, khô dẹt

Nhuộm Gram (trực khuẩn,

Gr + , có nha bào, thuần)

Cấy thuần (các khuẩn lạc đồng nhất)

Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng API 20A

Xác định vk Clostridium botulinum và

giữ giống trong CMM/

thioglycolate

Hình 3.4: Hình ảnh nha bào của vi khuẩn C botulinum dưới KHV (X 100)

b Kiểm tra đặc tính sinh hóa bằng bộ API 20A (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn C botulinum trong bộ PI20A

c Xác định độc tố botulin của vi khuẩn C botulinum

- Chuẩn bị huyết thanh: Huyết thanh được rả đông, lọc qua

màng lọc 0,45 µm và thu dịch lọc vô trùng

- Chuẩn bị động vật thí nghiệm: chuột SPF có nguồn gốc từ

viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, tiếp tục nuôi 3 ngày để thích

nghi với môi trường sống trước khi tiến hành thí nghiệm

Dịch lọc huyết thanh được kiểm tra không có sự hiện diện của

vi khuẩn bằng cách cáy trên môi trường thạch máu và môi trường SFP,

ủ trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí ở 37oC trong 24 giờ Mẫu huyết thanh được sử dụng trong thí nghiệm phải đảm bảo vô trùng

Cách đọc kết quả

Nếu chuột thí nghiệm I xuất hiện các triệu chứng liệt chân, liệt

mí mắt, xù lông, thở bụng hoặc chết, đồng thời chuột ở thí nghiệm II

và III khỏe mạnh và không biểu hiện bệnh lý thì kết luận trong mẫu huyết thanh có độc tố botulin

d Định type độc tố botulin

Huyết thanh được xác định có mang độc tố ở thí nghiệm trên được chọn ra để định type độc tố Mỗi mẫu huyết thanh qua lọc được chia ra làm 3 phần bằng nhau, thử lần lượt với 3 loại kháng độc tố type C, D và E theo tỷ lệ 1:1, mỗi loại hỗn hợp huyết thanh và kháng độc tố tiêm cho 2 con chuột Kháng độc tố chuẩn được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/100 trước khi tiến hành thí nghiệm Bố trí chuột thí nghiệm định type độc tố botulin được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Bố trí chuột thí nghiệm định type độc tố botulin

Số mẫu TN type C

(con)

TN type D (con)

TN type E (con)

TN đối chứng (con)

Liều tiêm/con (ml)

TN: Thí nghiệm

TN type C: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type C; TN type D: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type D; TN type E: Tiêm huyết thanh + kháng độc tố type E; Để yên hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng 30-60 phút (CDC, 1998; TN đối chứng (không có kháng độc tố): Tiêm nước muối sinh lý 0,9%

Xác định độc tố botulin tố và định type độc tố được tóm trắt trong Hình 3.5

Hình 3.5 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt (CDC, 1998) Hình 3.5 Sơ đồ xác định type độc tố botulin trong huyết thanh vịt (CDC, 1998)

Huyết thanh + KĐT type C Huyết thanh + KĐT type D Huyết thanh + KĐT type E

Độc tố botulin trong dịch bệnh phẩm bị

phá hủy bởi nhiệt

Chuột chết hoặc biểu hiện bất thường Chuột bình thường

Những mẫu huyết thanh dương tính ở thí nghiệm 1, lọc qua màng lọc 0,45

µm, chia làm 3 phần bằng nhau để thử nghiệm với kháng độc tố

Tiêm xoang bụng cho 2

con chuột (1ml/con)

Tiêm xoang bụng cho 2 con chuột (1ml/con)

Tiêm xoang bụng cho 2 con chuột (1ml/con)

Chuột bình thường Chuột bình thường Chuột bình thường

Lô I dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang

bụng của chuột bạch 0,5 ml/con

(2 con/ mẫu)

Lô II dịch bệnh phẩm tiêm vào xoang bụng của chuột bạch 0,5 ml/con (2 con/ mẫu)

Xử lý nhiệt 100 0 C/10 phút Không xử lý nhiệt

Cách đọc kết quả

Sau 7 ngày nếu chuột ở thí nghiệm nào còn khỏe mạnh bình thường thì kết luận huyết thanh đã mang type độc tố tương ứng; nghĩa là độc tố trong huyết thanh đã bị trung hòa bởi kháng độc tố tương ứng thêm vào

Chuột ở thí nghiệm đối chứng: luôn luôn khỏe mạnh và không

có biểu hiện khác thường Phương pháp xác định type độc tố botulin

trong huyết thanh vịt theo CDC (1998) được trình bày tron Hình 3.7

3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi

-Tỷ lệ hiện diện vi khuẩn trong bệnh phẩm

-Tỷ lệ huyết thanh có độc tố

-Tỷ lệ lưu hành của các type độc tố

-Tần suất xuất hiện các triệu chứng lâm sàng đặc trưng trên chuột bị nhiểm độc tố botulin

-Tần xuất xuất hiện bệnh tích đại thể trên chuột bị nhiểm độc

Đánh giá sự lưu hành của vi khuẩn C botulisum và xác định

khả năng gây bệnh của các chủng phân lập được trên môi trường nuôi VCĐ

3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước,

Bảng 3.5 Phân bố mẫu trên môi trường nuôi

Địa điểm Bùn đất (mẫu) Nước (mẫu) Cua (mẫu) Ốc (mẫu) Tổng

An Giang 159 159 63 106 645 Cần Thơ 141 141 42 94 563 Hậu Giang 144 144 50 96 582 Kiên Giang 156 156 61 104 646